Kwantyfikacja proliferujących ludzkich limfocytów T CD4 ⁺ specyficznych dla antygenu przy użyciu estru sukcynimidylu karboksyfluoresceiny

Protokół ten stanowi platformę do badania odpowiedzi komórek CD4T, które często są słabe i trudne do wykrycia. Technika ta pozwala na wykrycie, zliczenie i izolację komórek CD4T bez wcześniejszej wiedzy na temat prezentacji antygenu. Główną zaletą jest analiza komórek CD4T, które dość często są rzadkimi populacjami związanymi z chorobami autoimmunologicznymi, takimi jak cukrzyca typu pierwszego.

Po pobraniu próbki krwi obwodowej od zdrowego dawcy należy rozcieńczyć krew w PBS w co najmniej jednym do dwóch stosunków, a następnie nałożyć 35 mililitrów krwi na 15 mililitrów pożywki o gradiencie gęstości w probówce o pojemności 50 mililitrów. Oddziel komórki przez wirowanie w gradiacji gęstości i usuń około 20 mililitrów powstałej górnej warstwy plazmy. Następnie zbierz warstwę białych krwinek, uważając, aby uniknąć czerwonych krwinek i umyj komórki trzy razy w świeżym PBS.

Po zliczeniu rozcieńczyć komórki do ilości od 10 do szóstej komórki jednojądrzastej krwi obwodowej lub PBMC na mililitr stężenia PBS. Dodaj 300 mikrolitrów komórek dla każdej kontroli do pojedynczych 10-mililitrowych probówek. Po przykryciu każdej probówki PBS, osadnić komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić komórki w ilości od 10 do szóstych komórek na mililitr stężenia pożywki RP5.

Następnie umieść 100 mikrolitrów komórek na kontrolę w każdym z trzech dołków 96-dołkowej płytki zawierającej 100 mikrolitrów pożywki RP5 na studzienkę. Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na siedem dni. Następnie przenieś pozostałe PBMC do nowej 50-mililitrowej probówki i dodaj jeden mikrolitr roboczego roztworu podstawowego CFSE na jeden mililitr zawiesiny komórek z boku probówki.

Szybko odwróć probówkę kilka razy, aby wymieszać i umieścić komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych na pięć minut. Pod koniec inkubacji zatrzymać reakcję pięcioma mililitrami pożywki RP5 i zebrać komórki przez odwirowanie. Zawiesić osad raz od 10 do 6 PBMC na mililitr świeżej pożywki RP5 i dodać jeden mililitr komórek do jednej 10-mililitrowej probówki na antygen, który ma być testowany.

Następnie dodać 100 mikrolitrów komórek na antygen do każdej z trzech studzienek 96-dołkowej płytki zawierającej 100 mikrolitrów pożywki RP5 uzupełnionej rozcieńczonym antygenem będącym przedmiotem zainteresowania na studzienkę. Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na siedem dni. Aby wybarwić populacje komórek T CD4 + do analizy cytometrii przepływowej, na końcu hodowli przenieś całą objętość komórek z każdej studzienki do indywidualnych probówek do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją lub FACS.

Przemyj każdą próbkę jednym mililitrem PBS uzupełnionym 0,1% płodową surowicą cielęcą lub FCS. Zawiesić granulki w odpowiednim przeciwciałie anty-ludzkim CD4 w 100 mikrolitrach PBS plus FCS na probówkę. Inkubować komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut, chroniąc przed światłem.

Pod koniec inkubacji umyć próbki w jednym mililitrze świeżego PBS plus FCS na probówkę i ponownie zawiesić granulki w 100 mikrolitrach świeżego PBS plus FCS. Bezpośrednio przed analizą dodać jeden mikrolitr jodku propidyny do każdej probówki, aby umożliwić wykluczenie martwych komórek. Bramkować limfocyty zgodnie z ich obszarami rozproszenia do przodu i na boki.

Aby wykluczyć komórki apoptotyczne, należy przebramować obszar rozproszenia do przodu w stosunku do ujemnych komórek jodku propidyny i użyć niebarwionych komórek do ustawienia linii bazowej napięcia dla komórek niefluorescencyjnych. Ustaw napięcia dla fluoroforu przeciwciała CD4 i sygnału CFSE tak, aby sygnał fluorescencyjny był poniżej 1000 dla każdego z nich. Użyj pojedynczych próbek kontrolnych CFSE i CD4, aby potwierdzić dodatni sygnał fluorescencyjny dla każdego koloru przy użyciu napięć ustawionych dla niebarwionych komórek.

Ponieważ CFSE i jodek propidyny w pewnym stopniu pokrywają się spektralnie, dostosuj kompensację, aby odjąć fluorescencję jodku propidyny od fluorescencji CFSE, aż próbka tylko CFSE nie da sygnału w kanale jodku propidy. Po przeanalizowaniu wszystkich próbek obliczyć wskaźnik podziału komórek, dzieląc liczbę podzielonych komórek przez 5000 niepodzielonych komórek z grupy stymulowanej antygenem przez średnią liczbę podzielonych komórek na 5000 niepodzielonych komórek z komórek hodowanych bez antygenu. Prawie wszyscy dawcy wykazują silną odpowiedź komórek T na toksoid tężcowy po stymulacji in vitro, ponieważ dawcy zostali zaszczepieni, co sprawia, że toksoid tężcowy jest użytecznym antygenem kontroli pozytywnej.

Proliferacja limfocytów T CD4 + z niestymulowanych PBMC jest jednak minimalna. Po siedmiu dniach stymulacji ludzkim proinsulinowym peptydem C, we krwi obwodowej osoby z cukrzycą typu pierwszego można wykryć proinsulinowe limfocyty T CD4 + specyficzne dla peptydu C. PBMC stymulowane białkiem matrycy wirusa grypy A również wykazują proliferację.

Podsumowując, dane te pokazują, że test można przeprowadzić przy użyciu białek o pełnej długości, a także krótkich syntetycznych peptydów. Składnik FACS tej metody można wykonać za pomocą cytometru przepływowego do sortowania komórek. Za pomocą sortera komórek limfocyty T specyficzne dla antygenu można wyizolować na poziomie pojedynczej komórki w celu dalszej analizy.

Metoda ta pozwoliła na odkrycie odpowiedzi komórek CD4T u osób z cukrzycą typu pierwszego o wczesnym początku. Analiza tych rzadkich populacji limfocytów T przy użyciu innych metod wiąże się z różnymi wyzwaniami technicznymi.