Name: Kwantyfikacja proliferujących ludzkich limfocytów T CD4 + specyficznych dla antygenu przy użyciu estru sukcynimidylu karboksyfluoresceiny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji proliferujących limfocytów T CD4+ specyficznych dla antygenu przy użyciu estru sukcynimidylu karboksyfluoresceiny. Technika umożliwia wykrywanie rzadkich populacji komórek T związanych z autoimmunizacją.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez: The Juvenile Diabetes Research Foundation [JDRF 5-CDA-2014-210-A-N] (S. M.). Narodowa Rada Zdrowia i Badań Medycznych (NHMRC GNT123586) (SM), Nagroda Milenijna Diabetes Australia Research Trust (Y17M1-MANS) (S. M.), Program Wsparcia Infrastruktury Operacyjnej rządu Wiktorii (S. M., A. D., E. T., M. S.) oraz Stypendium Podyplomowe NHMRC APP1094337 i stypendium uzupełniające JDRF PhD (MS).

Wszyscy badani wyrazili świadomą zgodę przed pobraniem krwi obwodowej. Etyczna aprobata dla eksperymentów z użyciem PBMC została wydana przez St. Vincent's Hosptial (HREC-A 135/08 i HREC-A 161/15).
1. Przygotowanie odczynnika
<ol>
	<li>Pożywka dla ludzkich limfocytów T
	<ol>
		<li>Przygotuj pożywkę RP-5 do hodowli PBMC, która składa się z RPMI 1640, 1x aminokwasów endogennych, dipeptydu L-alanylo-L-glutaminy (2 mM), penicyliny (100 U/ml)/streptomycyny (0,1 mg/ml) i 5% puli ludzkiej surowicy (PHS).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwory podstawowe CFSE
	<ol>
		<li>Przygotować główny zapas, rozpuszczając 25 mg CFSE w ~9 ml DMSO, aby uzyskać końcowy roztwór podstawowy o stężeniu 5 mM.</li>
		<li>Przygotować materiał roboczy, rozcieńczając go w PBS do uzyskania stężenia roboczego 10 μM.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie ludzkich PBMC z krwi pełnej
<ol>
	<li>Na ogół jest to od 0,5 do 1,5 x 106 PBMC / ml ludzkiej krwi obwodowej. Dlatego wymagana ilość krwi zależy od pożądanej liczby PBMC. Rozcieńczyć ludzką krew obwodową PBS w stosunku co najmniej 1:2. Oddziel PBMC, dodając 15 ml pożywki o gradiencie gęstości do probówki o pojemności 50 ml, a następnie nałóż 35 ml rozcieńczonej krwi pełnej.</li>
	<li>Wirować przy 850 x g przez 15 minut bez zwalniania w temperaturze pokojowej (RT). W ten sposób powstaną trzy przezroczyste warstwy: dolna warstwa zawierająca osad czerwonych krwinek, środkowa warstwa pożywki o gradiencie gęstości z białymi krwinkami wyściełającymi jej górny interfejs oraz górna warstwa plazmy14.</li>
	<li>Usunąć około 20 ml wierzchniej warstwy osocza. Zebrać warstwę białych krwinek, uważając, aby uniknąć czerwonych krwinek osadu. Przemyć 3x PBS i policzyć żywotne komórki za pomocą wykluczenia błękitu trypanowego na hemocytometrze. Rozcieńczyć do 1 x 106 PBMCs/ml w PBS.</li>
	<li>Komórki niebarwione CFSE
	<ol>
		<li>Komórki te są używane jako kontrole kompensacyjne cytometrii przepływowej, składającej się z niebarwionych i pojedynczo barwionych komórek CD4+. Dodać 300 μl każdej zawiesiny PBMC próbki kontrolnej do probówki o pojemności 10 ml, przykryć PBS i odwirować przy 550 x g przez 5 minut w temperaturze suchej masy.</li>
		<li>Ponownie zawiesić 1 x 106 komórek/ml w pożywce RP-5. Inkubować te nieznakowane komórki przez 7 dni w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 z komórkami znakowanymi CFSE (krok 2.6.1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Komórki barwione CFSE
	<ol>
		<li>Przenieś komórki z kroku 2.3 do probówki o pojemności 50 ml. Dodać 1,0 μl roboczego roztworu podstawowego CFSE (10 μM) na 1 ml zawiesiny komórek z boku probówki. Szybko wymieszaj, kilkakrotnie odwracając rurkę. Końcowe stężenie CFSE wynosi 10 nM.</li>
		<li>Inkubować przez 5 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 . Aby zatrzymać barwienie, dodaj 5 ml pożywki RP-5, osadzaj komórki przez odwirowywanie przez 5 minut przy 550 x g. Ponownie zawiesić PBMC w 1 x 106/ml w pożywce RP-5.</li>
		<li>Dodać 1,0 ml zawiesiny komórkowej do probówki o pojemności 10 ml. Do każdego testowanego antygenu należy użyć jednej probówki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stymulacja antygenowa ludzkich PBMC i hodowli komórkowych
	<ol>
		<li>Hodowla ludzkich PBMC znakowanych CFSE z antygenami w pożywce RP-5 przez 7 dni w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 . Hodowla 1 x 105 komórek/basenik (100 μl) na 96-dołkowej płytce ze 100 μl/basenik pożywki RP-5 zawierającej rozcieńczony antygen. 
		UWAGA: Zastosowane antygeny, w tym stężenia robocze, podsumowano w Tabeli 1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Barwienie anty-CD4 do analizy FACS
<ol>
	<li>Odpipetować 200 μl hodowanych komórek do probówek FACS, przepłukać komórki 1x w 1,0 ml PBS zawierającego 0,1% FCS i odwirować przez 5 minut przy 550 x g.</li>
	<li>Barwienie anty-ludzkim CD4 Alexa Fluor 647 (0,25 μg/ml) w 100 μl PBS/0,1% FCS. Trzymaj na boku próbkę komórek znakowanych CFSE, niebarwionych żadnymi innymi fluoroforami, do użycia do ustawienia kompensacji FACS CFSE. Inkubować komórki w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem przez 20 minut.</li>
	<li>Przemyć komórki, dodając 1 ml PBS/0,1% FCS, odwirować przy 550 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić w 100 μl PBS/0,1% FCS. Bezpośrednio przed analizą FACS dodać 1 μl jodku propidyny (PI, 0,1 mg/ml) do wszystkich probówek, aby umożliwić wykluczenie martwych komórek za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
4. Konfiguracja cytometrii przepływowej i strategia bramkowania
UWAGA: Rysunek 1 pokazuje konfigurację FACS, w tym kontrolę kompensacji i strategię bramkowania.
<ol>
	<li>Bramka populacji rozproszenia do przodu (FSC) i rozproszonego bocznego (SSC) (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A) w celu uwzględnienia wszystkich limfocytów.</li>
	<li>Bramka populacji FSC vs. PI (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B) na komórkach ujemnych PI, aby wykluczyć komórki apoptotyczne.</li>
	<li>Użyj niebarwionych komórek, aby ustawić linię bazową napięcia dla ogniw niefluorescencyjnych. Ustaw napięcia dla CD4-A647 i CFSE tak, aby sygnał fluorescencji był poniżej 1,000 dla każdego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). Użyj pojedynczych kontrolek kolorów CFSE (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D) i CD4-A647 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E), aby potwierdzić dodatnie sygnały fluorescencyjne (~10 000) dla każdego koloru, używając napięć ustawionych dla niebarwionych komórek.</li>
	<li>CFSE i PI mają pewne nakładanie się widmowe; dostosuj kompensację, aby odjąć fluorescencję PI od fluorescencji CFSE, aż próbka tylko CFSE nie da sygnału w kanale PI. 
	nuta: Bramki te zastosowano do wszystkich analizowanych w niniejszym dokumencie próbek.</li>
</ol>
5. Obliczanie wskaźnika podziału komórek w celu wyliczenia specyficznej dla antygenu proliferacji limfocytów T CD4+
UWAGA: Indeks podziału komórki (CDI) odnosi się do liczby podzielonych komórek (CD4+/CFSE dim) na 5 000 niepodzielonych komórek (CD4+/ CFSEbright). Gdy liczba niepodzielonych komórek CD4 + nie wynosi dokładnie 5,000, liczba podzielonych komórek jest korygowana, aby wyrazić liczbę podzielonych komórek na 5,000 niepodzielonych komórek. Na przykład, używając proliferacji specyficznej dla toksoidu tężcowego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D), było 4 930 niepodzielonych komórek (CFSE jasne) i 3 268 podzielonych komórek (CFSE dim); Dlatego skorygowana liczba podzielonych komórek wynosi (5 000/4 930) x 3 268 = 3 304,3.
<ol>
	<li>Obliczyć CDI (Tabela 1), dzieląc liczbę podzielonych komórek/5 000 niepodzielonych komórek z grupy stymulowanej antygenem przez średnią liczbę podzielonych komórek (na 5 000 niepodzielonych komórek) z komórek hodowanych bez antygenu (Tabela 2).</li>
</ol>

<ol><li>Duque, A., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+effects+of+BrdU+and+3H-Thymidine+incorporation+into+DNA+on+cell+proliferation%2C+position+and+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Different effects of BrdU and 3H-Thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position and fate.</a> Journal of Neuroscience. 31, 15205-15217 (2011).</li>
<li>Mannering, S. I., Zhong, J. I. E., Cheers, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+activation%2C+proliferation+and+apoptosis+in+primary+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection.</a> Immunology. 106, 87-95 (2002).</li>
<li>Lyons, A. B., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+lymphocyte+division+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of lymphocyte division by flow cytometry.</a> Journal of Immunological Methods. 171, 131-137 (1994).</li>
<li>Mannering, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 283, 173-183 (2003).</li>
<li>Quah, B. J. C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+of+Carboxyfluorescein+Diacetate+Succinimidyl+Ester+%28CFSE%29+to+Monitor+Lymphocyte+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation.</a> Journal of Visualized Experiments. , 4-7 (2010).</li>
<li>Ten Brinke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+T-cell+responses+in+translational+studies%3A+Optimization+of+dye-based+proliferation+assay+for+evaluation+of+antigen-specific+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monitoring T-cell responses in translational studies: Optimization of dye-based proliferation assay for evaluation of antigen-specific responses.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1-15 (2017).</li>
<li>Gillespie, G. M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+TCR+Conservation+and+Altered+T+Cell+Cross-Reactivity+Characterize+a+B%2A57-Restricted+Immune+Response+in+HIV-1+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunolgy%22%5BJournal%5D)">Strong TCR Conservation and Altered T Cell Cross-Reactivity Characterize a B*57-Restricted Immune Response in HIV-1 Infection.</a> Journal of Immunolgy. 177, 3893-3902 (2006).</li>
<li>Tynan, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Resolution+Structures+of+Highly+Bulged+Viral+Epitopes+Bound+to+Major+Histocompatibility+Complex+Class+I%3A+Implications+for+t-cell+receptor+engagement+and+t-cell+immunodominance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High Resolution Structures of Highly Bulged Viral Epitopes Bound to Major Histocompatibility Complex Class I: Implications for t-cell receptor engagement and t-cell immunodominance.</a> Journal of Biological Chemistry. 280, 23900-23909 (2005).</li>
<li>Blanchard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+aminopeptidase+associated+with+antigen+processing+defines+the+composition+and+structure+of+MHC+class+I+peptide+repertoire+in+normal+and+virus-infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum aminopeptidase associated with antigen processing defines the composition and structure of MHC class I peptide repertoire in normal and virus-infected cells.</a> Journal of Immunology. 184, 3033-3042 (2010).</li>
<li>Glanville, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+specificity+groups+in+the+T+cell+receptor+repertoire+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identifying specificity groups in the T cell receptor repertoire repertoire.</a> Nature. 547, 94-98 (2017).</li>
<li>Wooldridge, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricks+with+tetramers%3A+how+to+get+the+most+from+multimeric+peptide+MHC%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide MHC.</a> Immunology. 126, 147-164 (2009).</li>
<li>Mannering, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+cloning+human+autoantigen-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">An efficient method for cloning human autoantigen-specific T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 298, 83-92 (2005).</li>
<li>So, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinsulin+C-peptide+is+an+autoantigen+in+people+with+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Proinsulin C-peptide is an autoantigen in people with type 1 diabetes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (2018).</li>
<li>Hui-Yuen, J., Mcallister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-Mcintosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+Epstein-Barr+Virus+Growth-transformed+Lymphoblastoid+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines.</a> Journal of Visualized Experiments. , 2-7 (2011).</li>
<li>Alexander-Miller, M. A., Leggatt, G. R., Berzofsky, J. A., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+expansion+of+high+or+low+avidity+cytotoxic+T+lymphocytes+and+efficacy+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Selective expansion of high or low avidity cytotoxic T lymphocytes and efficacy for adoptive immunotherapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 4102-4107 (1996).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Proliferacja oparta na CFSE jest prostą i solidną metodą wykrywania i zliczania ludzkich limfocytów T CD4 + specyficznych dla antygenu. Wcześniej wykazano, że stosowanie optymalnego stężenia CFSE jest niezbędne do uzyskania optymalnych wyników4. Zbyt duża ilość CFSE hamuje proliferację, podczas gdy zbyt mała nie pozwala na rozróżnienie komórek podzielonych i niepodzielonych. Natomiast stosunkowo wysokie stężenia (5,0 μM) CFSE są używane do znakowania oczyszczonych mysich limfocytów T<su...

Zdolność do wykrywania i badania limfocytów T specyficznych dla antygenu jest ważna w badaniach nad odpornością komórkową. Jest to jednak szczególnie trudne w przypadku odpowiedzi limfocytów T CD4+ specyficznych dla autoantygenu, które są bardzo słabe i trudne do wykrycia. Powszechną metodą stosowaną do wykrywania proliferacji limfocytów specyficznych dla antygenu jest [3H]-tymidyna, która jest znakowanym radioaktywnie nukleotydem wbudowanym w DNA proliferujących komórek. Chociaż test [3H]-tymidyny może wykryć syntezę DNA, metoda ta jest pośrednią miarą podziału komórki, ponieważ synteza DNA może rozpocząć się niezależnie od mitozy (tj. podczas duplikacji genów i apoptozy1). Problem ten potęguje fakt, że specyficzna dla antygenu proliferacja komórek może skutkować znaczną apoptozą2, co prowadzi do potencjalnego przeszacowania proliferacji specyficznej dla antygenu. Ponadto metoda [3H]-tymidyna nie dostarcza informacji fenotypowych dla proliferujących limfocytów, takich jak proliferacja linii CD4 + lub CD8 + w PBMC stymulowanych peptydami antygenowymi.
W 2003 roku opublikowaliśmy pierwszy test rozcieńczania barwnika przy użyciu CFSE, zwany testem proliferacji opartym na CFSE3,4. CFSE to barwnik fluorescencyjny, który stabilnie wiąże się z białkami wewnątrzkomórkowymi, tworząc wiązanie kowalencyjne z wewnątrzkomórkowymi resztami lizyny. Ponieważ białka znakowane CFSE są równo dzielone między komórki potomne3, komórki, które się podzieliły, można odróżnić od komórek niepodzielonych za pomocą cytometrii przepływowej, co pozwala również na ilościowe fenotypowanie populacji limfocytów. Rzeczywiście, liczba podziałów, jakie przeszła komórka od czasu barwienia CFSE, może być do pewnego stopnia zmierzona5. Niedawno opracowano wiele podobnych barwników, takich jak barwnik proliferacyjny CellTrace Violet (VPD) i barwnik CytoTrack, które działają w podobny sposób6. Protokół ten koncentruje się na CFSE, ale zasady mają zastosowanie w równym stopniu do innych powiązanych barwników.
Barwienie tetramerem peptydowo-MHC jest powszechnie stosowaną metodą wykrywania i klonowania limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu. Jest to sprawdzona metoda7,8,9,10; jednak klonowanie oparte na tetramerach wymaga istniejącej wiedzy na temat ograniczenia epitopu/MHC, a każdy epitop wymaga własnej klasy tetramer<sup="xref">11, co ogranicza zakres odkrywania i klonowania nowych limfocytów T specyficznych dla epitopów. Proliferacja oparta na CFSE może być stosowana z peptydami, białkami lub lizatami komórkowymi. Opisany tutaj protokół jest zarówno prosty, jak i solidny, a odpowiadające limfocyty T CD4 + można sortować do wykorzystania w dalszych testach charakterystyki funkcjonalnej i biochemicznej12,13.

<table><tbody><tr><td>Anty-ludzki CD4-AlexaFluor647</td><td>Biolegend</td><td>317422</td><td>RRID:AB_2716180</td></tr><tr><td>Karboksyfluoresceina succinimidylo ester (CFSE)</td><td>ThermoFisher</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>71-7167-00</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (1x)</td><td>Gibco</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Grypa A H1N1 (PR8) Białko macierzy 1</td><td>Sino Biologiczne</td><td>40010- V07E Aminokwasy</td><td></td></tr><tr><td>endogenne (1x)</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna (1x)</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Zbiorcza surowica ludzka</td><td>Australijski Czerwony Krzyż</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Proinsulina C-peptyd PI33-63</td><td>Purar Chemicals</td><td>N/A</td><td>Custom wykonany syntetyczny peptyd</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Białko toksoidu tężcowego</td><td>Statens Serum Intitut</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja proliferujących ludzkich limfocytów t cd4 + specyficznych dla antygenu przy użyciu estru sukcynimidylu karboksyfluoresceiny

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Opisana jest prosta, in vitro, oparta na rozcieńczaniu barwnika metoda pomiaru proliferacji limfocytów T CD4+ specyficznych dla antygenu w komórkach jednojądrzastych ludzkiej krwi obwodowej (PBMC). Opracowanie stabilnych, nietoksycznych, fluorescencyjnych barwników, takich jak ester sukcynimidylowy karboksyfluoresceiny (CFSE), pozwala na odróżnienie rzadkich, specyficznych dla antygenu limfocytów T od osób postronnych poprzez zmniejszenie barwienia fluorescencyjnego, wykrytego za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta ma następujące zalety w porównaniu z alternatywnymi podejściami: (i) jest bardzo wrażliwa na limfocyty T o niskiej częstotliwości, (ii) nie jest wymagana wiedza na temat antygenu lub epitopu, (iii) można analizować fenotyp reagujących komórek oraz (iv) żywotne, reagujące komórki można sortować i wykorzystywać do dalszej analizy, takiej jak klonowanie limfocytów T.

Stymulacja in vitro ludzkich PBMC białkiem tężcowym (anatoksyną tężcową): PBMC zabarwiono CFSE i stymulowano przez 7 dni w obecności anatoksyny tężcowej. Prawie wszyscy dawcy wykazali silną odpowiedź limfocytów T na anatoksynę tężcową ze względu na przebyte szczepienia, co czyni anatoksynę tężcową użytecznym antygenem kontroli pozytywnej. Rysunek 2 pokazuje w trzech powtórzeniach, że proliferacja CFSE limfocytów T CD4+ z niestymulowanych PBMC była ...

Prezentowany tutaj jest protokół pomiaru proliferacji limfocytów T CD4+ w odpowiedzi na antygenowe białka lub peptydy za pomocą rozcieńczenia barwnika. Test ten jest szczególnie czuły w przypadku rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu i może być modyfikowany w celu ułatwienia klonowania komórek specyficznych dla antygenu.

Kwantyfikacja proliferujących ludzkich limfocytów T CD4 + specyficznych dla antygenu przy użyciu estru sukcynimidylu karboksyfluoresceiny

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...

Protokół ten stanowi platformę do badania odpowiedzi komórek CD4T, które często są słabe i trudne do wykrycia. Technika ta pozwala na wykrycie, zliczenie i izolację komórek CD4T bez wcześniejszej wiedzy na temat prezentacji antygenu. Główną zaletą jest analiza komórek CD4T, które dość często są rzadkimi populacjami związanymi z chorobami autoimmunologicznymi, takimi jak cukrzyca typu pierwszego.Po pobraniu próbki krwi obwodowej od zdrowego dawcy należy rozcieńczyć krew w PBS w co najmniej jednym do dwóch stosunków, a następnie nałożyć 35 mililitrów krwi na 15 mililitrów pożywki o gradiencie gęstości w probówce o pojemności 50 mililitrów. Oddziel komórki przez wirowanie w gradiacji gęstości i usuń około 20 mililitrów powstałej górnej warstwy plazmy. Następnie zbierz warstwę białych krwinek, uważając, aby uniknąć czerwonych krwinek i umyj komórki trzy razy w świeżym PBS.Po zliczeniu rozcieńczyć komórki do ilości od 10 do szóstej komórki jednojądrzastej krwi obwodowej lub PBMC na mililitr stężenia PBS. Dodaj 300 mikrolitrów komórek dla każdej kontroli do pojedynczych 10-mililitrowych probówek. Po przykryciu każdej probówki PBS, osadnić komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić kom

quantification-proliferating-human-antigen-specific-cd4-t-cells-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejsza procedura demonstruje oczyszczanie i ekspansję in vitro antygenowo swoistych limfocytów T CD4+ z pełnej krwi obwodowej oraz ich wizualizację przy użyciu tetramerów MHC klasy II. Tetramery umożliwiają bezpośrednią wizualizację limfocytów T o pojedynczej swoistości antygenowej i określonym ograniczeniu MHC klasy II.<br...

Wizualizacja antygenowo swoistych limfocytów T CD4+ z wykorzystaniem tetramerów MHC klasy II

CFSE kowalencyjnie znakuje długożyjące cząsteczki wewnątrzkomórkowe barwnikiem fluorescencyjnym, karboksyfluoresceiną. W związku z tym, gdy komórka znakowana CFSE dzieli się, jej potomstwo posiada połowę ilości fluorescencji, co może być wykorzystane do oceny podziałów komórkowych. Niniejszy artykuł opisuje procedury zazwyczaj stosowane do znakowania limfocytów mysich przy użyciu CFSE.

Zastosowanie estru bursztynianowego diacetatu karboksyfluoresceiny (CFSE) do monitorowania proliferacji limfocytów

Komórki Treg są potężnymi supresorami układu odpornościowego. Brakuje unikalnych markerów powierzchniowych pozwalających na ich zdefiniowanie, dlatego definicje Treg opierają się przede wszystkim na ich funkcji. W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany test in vitro, który umożliwia identyfikację zaburzeń równowagi immunologicznej u osób zagrożonych rozwojem cukrzycy typu 1 (T1D).

Supresja ludzkich komórek in vitro jako narzędzie przesiewowe do rozpoznawania wczesnego stanu niezrównoważenia immunologicznego

Skuteczne zastosowanie barwników do śledzenia komórek w celu monitorowania funkcji i proliferacji komórek odpornościowych obejmuje kilka krytycznych etapów. Opisujemy metody: 1) uzyskiwania jasnego, jednorodnego i powtarzalnego znakowania barwnikami błonowymi; 2) wyboru fluorochromów i warunków akwizycji danych; oraz 3) wyboru modelu do ilościowego określania proliferacji komórek na podstawie rozcieńczenia barwnika.

Zoptymalizowane metody barwienia i modelowania proliferacji do monitorowania podziałów komórkowych przy użyciu barwników do śledzenia komórek

Ten film demonstruje test do analizy specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8+ na różnych etapach cyklu komórkowego. Znakowane fluorescencyjnie żywe komórki są wybierane za pomocą cytometrii przepływowej, a komórki na różnych etapach cyklu komórkowego są identyfikowane na podstawie zawartości DNA przy użyciu przeciwciał przeciwko białku jądrowemu związanemu z proliferacją komórek i barwienia kwasem nukleinowym.

Test do analizy cyklu komórkowego limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu

Ten film demonstruje technikę wytwarzania limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) ex vivo. Ludzkie limfocyty T są inkubowane za pomocą kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28, wraz z pożywką uzupełnioną interleukiną-2 (IL-2), co prowadzi do aktywacji i proliferacji limfocytów T. Wprowadzane są transgeniczne wektory lentiwirusowe, które umożliwiają transgenicznemu RNA integrację z genomem gospodarza i ekspresję transgenu. Powoduje to, że transdukowane...

Technika ex vivo do wytwarzania chimerycznych limfocytów T receptora antygenowego

Ten protokół opisuje czuły, komórkowy test cytotoksyczności. Wyliczając spadek częstości żywych docelowych limfocytów T CD4 + w obecności rosnącej liczby efektorowych limfocytów T CD8 +, test ten pozwala na bezpośrednią ocenę aktywności cytolitycznej limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu.

Test cytometrii przepływowej opartej na komórkach do pomiaru aktywności cytotoksycznej

Prezentujemy tutaj aplikację do standardowej techniki immunologicznej (proliferacja OT-I barwiona CFSE) przeznaczonej do szybkiego monitorowania wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T (CTL) za pośrednictwem adiuwantów in vivo. To szybkie oszacowanie zdolności CTL jest przydatne do opracowywania szczepionek profilaktycznych przeciwko patogenom wewnątrzkomórkowym, a także terapeutycznych szczepionek przeciwnowotworowych.

Szybka ocena in vivo zdolności wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T adiuwantu w celu opracowania szczepionki

Tutaj prezentujemy protokół szybkiego i powtarzalnego generowania biologicznie inspirowanych, biodegradowalnych komórek prezentujących antygen sztuczny (aAPC) o regulowanym rozmiarze, kształcie i prezentacji białka powierzchniowego do ekspansji limfocytów T ex vivo lub in vivo.

Wytwarzanie anizotropowych polimerowych sztucznych komórek prezentujących antygen do aktywacji limfocytów T CD8 +

Tutaj szczegółowo opisujemy prosty, szybki i niezawodny protokół wspomagany wieloparametryczną cytometrią przepływową i nowotworem na chipie, aby monitorować i charakteryzować etapy składające się na cykl rak-odporność. Rzeczywiście, dogłębne zrozumienie wzajemnych zależności między rakiem a komórkami odpornościowymi dostarcza kluczowych informacji, które pozwalają przechytrzyć nowotwory i kierować opieką kliniczną.

Systemy kohodowli in vitro w celu odtworzenia cyklu rak-odporność

Poznaj metodę kwantyfikacji proliferujących limfocytów T CD4+ specyficznych dla antygenu przy użyciu estru sukcynimidylu karboksyfluoresceiny. Technika umożliwia wykrywanie rzadkich populacji komórek T związanych z autoimmunizacją.

Kwantyfikacja proliferujących ludzkich limfocytów T CD4 + specyficznych dla antygenu przy użyciu estru sukcynimidylu karboksyfluoresceiny (Wideo) | JoVE Journal

Kwantyfikacja proliferujących ludzkich limfocytów T CD4 ⁺ specyficznych dla antygenu przy użyciu estru sukcynimidylu karboksyfluoresceiny

Przeglądaj więcej filmów