JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 2:57 min. • July 8th, 2025
Rozpocząć od kompatybilnej z fluorescencją płytki wielodołkowej zawierającej zawiesinę transgenicznych limfocytów T pochodzących od myszy.
Limfocyty te zawierają zielone białko fluorescencyjne lub kasetę ekspresyjną GFP, kontrolowane przez receptor limfocytów T lub zaangażowanie TCR ze związkami immunomodulującymi.
Każdą studzienkę należy potraktować roztworem zawierającym związki immunomodulujące o różnym potencjale.
Podczas inkubacji związki immunomodulujące oddziałują z TCR na limfocytach T.
Interakcja TCR ze związkiem stymulującym wyzwala aktywację kasety genu, zwiększając ekspresję GFP.
W przeciwieństwie do tego, interakcja TCR ze związkiem hamującym hamuje kasetę genu i zmniejsza ekspresję GFP.
Następnie nałóż komórki na barwnik fluorescencyjny kwasu nukleinowego, aby zabarwić jądra.
Odwirować płytkę, aby osadzić komórki w celu dokładnego pomiaru fluorescencji.
Pod mikroskopem fluorescencyjnym żywotne limfocyty T wykazują dwa sygnały fluorescencyjne odpowiadające jądrom komórkowym i zielonym białkom fluorescencyjnym.
Zintensyfikowana zielona fluorescencja oznacza udaną stymulację limfocytów T, natomiast słaby wewnątrzkomórkowy sygnał zielonej fluorescencji potwierdza hamujące działanie związków immunomodulujących na limfocyty T.
W przypadku wysokoprzepustowych badań przesiewowych małych cząsteczek należy umieścić 40 mikrolitrów komórek na studzience na płytce 384-dołkowej i potraktować odpowiednie studzienki wybranym lekiem lub nośnikiem przez żądany okres leczenia w inkubatorze hodowli komórkowych.
Na 30 minut przed analizą GFP należy wybarwić komórki roztworem Hoechsta o odpowiednim stężeniu, dokładnie rozprowadzając barwnik za pomocą delikatnego pipetowania. Gdy wszystkie studzienki zostaną zabarwione, odwirować płytki, aby zebrać komórki na dnie studzienek i pozostawić komórki na 15 minut w temperaturze pokojowej.
Załaduj płytę zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie ustaw obiektyw na 40X lub więcej. Ustaw kamerę numer 4 dla lampy UV, a następnie ustaw kamerę numer 1 dla lasera 488. Załaduj płytkę do systemu przesiewania o wysokiej zawartości. Następnie ustaw zautomatyzowany konfokalny system przesiewowy o wysokiej zawartości tak, aby odczytywał od 6 do 10 pól na studzienkę, z dwoma sekwencyjnymi odczytami na pole przy 488 nanometrach i świetle UV.