Różnicowa kalorymetria skaningowa – metoda oceny stabilności termicznej i konformacji antygenu białkowego
4 marca 2017
Różnicowa kalorymetria skaningowa mierzy temperaturę(y) przemiany termicznej i całkowitą energię cieplną potrzebną do denaturacji białka. Uzyskane wyniki służą do oceny stabilności termicznej antygenów białkowych w formulacjach szczepionek.
Ogólnym celem tej procedury jest ocena stabilności termicznej i konformacji strukturalnej białek w warunkach przemysłowych przy użyciu różnicowej kalorymetrii skaningowej. Różnicowa kalorymetria skaningowa mierzy molową pojemność cieplną próbek w funkcji temperatury i jest z powodzeniem stosowana do oceny stabilności termicznej i konformacji strukturalnej białek. Ta stosunkowo prosta procedura nie zależy od helicity strukturalnej ani wewnętrznych fluoroforów, jak ma to miejsce w przypadku innych metod biofizycznych.
Kolejną zaletą tej techniki jest to, że bezpośrednio mierzy temperaturę przemiany termicznej i energię potrzebną do zakłócenia oddziaływania, stabilizując trzeciorzędową strukturę białek. W połączeniu z entuzjazmem rozkładania, temperatura przemiany termicznej może służyć jako użyteczny parametr do monitorowania spójności procesów produkcyjnych dla partii biologicznych. Wizualna demonstracja tej metody może służyć jako interaktywne medium, aby skutecznie pomóc nowym użytkownikom w krytycznych krokach.
Aby rozpocząć, włącz różnicowy kalorymetr skaningowy. Następnie doprowadź azot do systemu. Zwiększy to ciśnienie w komórkach, aby stłumić wrzenie próbek, a także zapobiec tworzeniu się pęcherzyków w podwyższonych temperaturach.
W zależności od materiału, z którego wykonane jest ogniwo, należy dostosować ciśnienie dopływu azotu zgodnie z ciśnieniem zalecanym przez producenta, aby uniknąć uszkodzenia ogniwa. Upewnij się, że wszystkie zbiorniki środka czyszczącego są napełnione do wymaganej objętości. Wymagane środki czyszczące obejmują detergent do mycia celi i wodę do czyszczenia celi po każdym przebiegu próbki.
Ustawić temperaturę w komorze na próbkę na odpowiednią wartość, najlepiej pięć stopni Celsjusza, aby zachować integralność próbki przed eksperymentem. Ważne jest, aby zrównoważyć próbkę z buforem, aby upewnić się, że jedyną różnicą między roztworami jest białko. Dlatego zaobserwowaną różnicę w pojemności cieplnej można prawidłowo przypisać białku.
Oznaczyć stężenie próbki białka przy użyciu odpowiedniej metody oznaczania stężenia białka, takiej jak metoda Lowry'ego. W przypadku instrumentu używanego w tym protokole preferowany zakres roboczy wynosi od 0,5 do jednego miligrama białka na mililitr. Dializuj próbkę względem buforu, który będzie używany jako odniesienie w eksperymencie.
Odgazuj próbkę i bufor referencyjny w próżni, aby pozbyć się mikropęcherzyków, które mogą powodować nieścisłość objętości. Pracując w komorze hermetyzacji z przepływem laminarnym, użyj mikropipety i sterylnych końcówek, aby załadować próbki do odpowiedniego bufora parami do 96-dołkowych płytek. Napełnij pierwsze dwie pary studzienek buforem, aby wykonać skanowanie bufora buforowego w celu sprawdzenia przydatności przyrządu przed pomiarem próbki.
Napełnij dwie ostatnie pary studzienek wodą, aby skan wodny oczyścił komórki. Następnie przykryj płytkę 96-dołkową folią uszczelniającą. Upewnij się, że studzienki są odpowiednio uszczelnione przed wyjęciem płytki z szafy bezpieczeństwa biologicznego, aby uniknąć zanieczyszczenia próbki.
Na koniec umieścić płytkę w komorze na próbkę we właściwej orientacji. Korzystając z oprogramowania do akwizycji, wprowadź informacje o próbce w kolejności, w jakiej została załadowana płytka. Wprowadź stężenia białka, jeśli są dostępne.
W przeciwnym razie należy wprowadzić stężenie do oprogramowania analitycznego przed analizą danych. Wybierz opcję, która zapewnia czyszczenie celi detergentem przed każdym skanowaniem próbki. Po czyszczeniu należy wykonać wiele etapów płukania wodą, aby upewnić się, że w komórkach nie pozostały żadne pozostałości detergentu.
Ustaw temperaturę początkową eksperymentu na 20 stopni Celsjusza, która może się różnić w zależności od próbki. W przypadku znanych białek można zastosować z góry określoną temperaturę początkową, podczas gdy niższą temperaturę początkową można zastosować do nieznanych próbek. Następnie ustaw końcową temperaturę eksperymentu.
Temperatura końcowa może się również różnić w zależności od wcześniejszej wiedzy o próbce. Następnie ustaw szybkość skanowania eksperymentu. Zaleca się skanowanie nieznanych próbek z różnymi szybkościami skanowania, aby ocenić kinetykę rozwijania.
Skonfiguruj oprogramowanie do akwizycji, aby ponownie zeskanować próbki w celu zbadania odwracalności przemiany termicznej. Rozwijanie białka uważa się za odwracalne, jeśli entalpia uzyskana dla drugiego skanowania wynosi co najmniej 80% wartości entalpii z pierwszego skanowania. Ustaw termostat po eksperymencie na 10 stopni Celsjusza, aby zachować integralność celi kalorymetrycznej.
Przed jego wykonaniem sprawdź, czy parametry konfiguracji eksperymentu są poprawne. Jeśli wszystko jest na swoim miejscu, rozpocznij eksperyment. Po zakończeniu eksperymentu przeprowadź analizę danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Na potrzeby analizy odejmowanie linii bazowej jest wykonywane ręcznie. Konsekwencja na tym etapie ma kluczowe znaczenie dla uzyskania porównywalnych wyników. Pokazano tutaj reprezentatywne surowe dane z serii eksperymentalnej, w tym skany bufora i wody.
Analizowane próbki to toksyny w stanie naturalnym i detoksykowanym. Skany próbek są przetwarzane oddzielnie w celu wyprowadzenia temperatury topnienia i wartości entalpii dla każdej próbki. Dla stanu rodzimego temperatura topnienia wynosi 55,55 stopni Celsjusza, a entalpia toksyny wynosi 3,157 razy 10 do jednej piątej kalorii na mol.
I odwrotnie, temperatura topnienia toksyny w stanie detoksykacji wynosi 81,21 stopni Celsjusza, a entalpia wynosi 3,656 razy 10 do piątej kalorii na mol. Nałożenie przetworzonych danych toksyny w jej stanie natywnym i detoksykacji pokazuje, że odtruta próbka jest bardziej stabilna termicznie niż jej stan natywny zgodnie z wartościami temperatury topnienia. Wskazuje również, że proces detoksykacji wprowadza zmiany strukturalne w trzeciorzędowej strukturze toksyny.
Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zapewnieniu odpowiedniego zapasu detergentu i wody, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu ogniwa i strzykawki, ponieważ ich przejrzystość ma kluczowe znaczenie dla dokładnych wyników. Po obejrzeniu tego filmu będziesz miał dobrą wiedzę na temat różnicowej kalorymetrii skaningowej jako metody oceny stabilności termicznej i konformacji białek. Będziesz również w stanie dokonać znaczących odliczeń z wynikowych przebiegów termicznych.
Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak dichroizm kołowy, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące zmian w strukturach drugorzędowych podczas rozwijania. Dane zebrane dla szeregu partii tego samego produktu wykorzystano do stworzenia empirycznych punktów odniesienia w celu zbadania wpływu zmian w procesie, recepturze i warunkach przechowywania na konformację strukturalną antygenów białkowych do produkcji szczepionek.
Przegląd
Ten artykuł omawia zastosowanie różnicowej skaningowej kalorymetrii (DSC) do oceny stabilności termicznej i konformacji strukturalnej białek. Technika ta mierzy temperaturę przejścia termicznego oraz energię wymaganą do denaturacji białek, co jest kluczowe dla oceny formuł szczepionek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biofizyka
- Chemia białek
- Rozwój szczepionek
Tło
- Różnicowa skanująca kalorymetria mierzy iloczyn molowy pojemności cieplnej próbek w funkcji temperatury.
- Ta metoda nie opiera się na strukturalnej helicie ani intrinsycznych fluoroforach.
- Daje bezpośrednie pomiary temperatur przejść termicznych i energii wymaganej do denaturacji białka.
- DSC może monitorować spójność partii w produkcji biologów.
Cel badania
- Ocena stabilności termicznej antygenów białkowych w szczepionkach.
- Ocena konformacji strukturalnej białek w środowisku przemysłowym.
- Zapewnić wizualną demonstrację metody DSC dla nowych użytkowników.
Zastosowane metody
- Przygotowanie próbek białek i buforów.
- Zastosowanie różnicowej skaningowej kalorymetru do pomiaru pojemności cieplnej.
- Odjęcie linii bazowej podczas analizy danych dla dokładnych wyników.
- Ocenienie odwracalności odsłaniania białka poprzez wielokrotne skanowania.
Główne wyniki
- Wyznaczono temperatury topnienia i wartości entalpii dla stanów natywnych i odtoksyfikowanych toksyny.
- Odtoksyfikowane toksyny wykazywały wyższą stabilność termiczną w porównaniu z ich natywnymi odpowiednikami.
- Zmiany strukturalne w trzeciorzędowej strukturze toksyny zostały wskazane przez wyniki DSC.
Wnioski
- Różnicowa skanująca kalorymetria jest skuteczną metodą oceny stabilności białek.
- Technika ta może pomóc w zapewnieniu spójności w produkcji biologów.
- Wizyualne demonstracje mogą poprawić zrozumienie kluczowych etapów eksperymentu.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Differential scanning calorimetry (DSC) provides biopharma R&D teams with a robust, quantitative approach to assess protein antigen thermal stability and conformational integrity across manufacturing lots and formulations. This capability is critical for de-risking biologics development, supporting lot-to-lot consistency, and informing process changes or formulation optimization. DSC's direct thermodynamic readouts enable predictive confidence at key inflection points in the discovery-to-preclinical continuum.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative assessment of protein folding and stability for candidate selection.
- Supports mechanistic de-risking by revealing conformational changes due to modifications or processing.
- Facilitates empirical comparison of native versus engineered or detoxified protein states.
Screening & Assay Development
- Provides validated thermal stability profiles for assay system standardization.
- Enables reproducible, quantitative outputs for screening protein variants or formulations.
- Supports platform readiness by establishing baseline thermodynamic fingerprints for reference.
Translational & Preclinical Research
- Aligns protein stability data with process development and formulation studies for vaccines and biologics.
- Enables risk-adjusted advancement decisions by monitoring structural integrity under storage or process changes.
- Supports empirical baselining for translational continuity across manufacturing lots.
Pipeline & Workflow Integration
DSC integrates from early discovery through preclinical development, providing a reusable analytical capability for protein characterization, process monitoring, and formulation assessment.
- Discovery Biology: Quantifies thermal stability and conformational changes to support hypothesis testing and target validation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative melting temperature and enthalpy outputs for comparative analysis.
- Analytics: Enables direct measurement of protein unfolding transitions and lot-to-lot consistency.
- Translational Research: Empirically tracks the impact of process or formulation changes on protein structure for vaccine production.
- Enterprise Reuse: Establishes standardized thermodynamic baselines for ongoing manufacturing and quality control.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in protein stability and structural integrity.
- Operational Value: Streamlines standardization and reproducibility across lots and formulations.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage risk by providing actionable stability data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of biologics candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein chemistry and thermodynamic data interpretation.
- Needs access to a calibrated differential scanning calorimeter and validated cleaning protocols.
- Demands rigorous sample preparation and baseline subtraction for data comparability.
- Must ensure cross-team standardization of analysis parameters and reporting.
- Limited to thermal stability and tertiary structure; secondary structure changes may require complementary methods.
