Name: Różnicowa kalorymetria skaningowa – metoda oceny stabilności termicznej i konformacji antygenu białkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Poznaj różnicową kalorymetrię skaningową do oceny stabilności termicznej i konformacji białkowych antygenów szczepionek. Ta metoda pozwala bezpośrednio mierzyć temperaturę przejścia termicznego i energię denaturacji białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są bardzo wdzięczni Josephowi Manciniemu (dawniej w GE Healthcare), Pawłowi Czudecowi, Thomasowi Cage'owi (Malvern Instruments limited) za ich rolę w instalacji i szkoleniu na różnicowym kalorymetrze skaningowym, Sasmitowi Deshmukhowi i Websterowi Magcalasowi za ich dyskusje.

1. Uruchomienie instrumentu
<ol>
	<li>Włączyć różnicowy kalorymetr skaningowy i zwiększyć ciśnienie w komórkach, aby stłumić wrzenie próbek, a także zapobiec tworzeniu się pęcherzyków w podwyższonych temperaturach. Zazwyczaj osiąga się to poprzez dostarczanie azotu do systemu.</li>
	<li>W zależności od materiału, z którego wykonane jest ogniwo (np. tantal, złoto, platyna itp.), należy dostosować ciśnienie dopływu azotu zgodnie z ciśnieniem zalecanym przez producenta, aby uniknąć uszkodzenia ogniwa. Na przykład ustaw ciśnienie dopływu azotu gazowego na 45 psi dla instrumentu używanego do opracowania tej procedury, a ciśnienie powyżej 80 psi może uszkodzić komórkę.</li>
	<li>Upewnij się, że wszystkie zbiorniki środka czyszczącego są napełnione do wymaganej objętości. Wymagane środki czyszczące obejmują detergent i wodę do mycia i czyszczenia celi odpowiednio po każdym przebiegu próbki.</li>
	<li>Ustawić temperaturę w komorze na próbkę na odpowiednią wartość, najlepiej 5 °C, aby zachować integralność próbki przed eksperymentem.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Dializuj próbkę względem buforu, który będzie używany jako odniesienie w eksperymencie. Alternatywnie można zastosować bufor elucyjny zebrany na końcowym etapie oczyszczania białka (tj. elucji kolumnowej).</li>
	<li>Określić stężenie próbki białka przy użyciu najbardziej odpowiedniej metody oznaczania stężenia białka, takiej jak metoda Kjedahla 33 lub metoda Lowry'ego 34. W celu obiektywnego porównania wyników należy stosować tę samą metodę konsekwentnie w ramach tego samego badania. Wymagany zakres stężeń może się różnić w zależności od modelu przyrządu. Dla przyrządu używanego w tym protokole preferowany zakres roboczy wynosi 0,5 – 1 mg/ml.</li>
	<li>Odgazuj próbkę i bufor referencyjny w próżni, aby pozbyć się mikropęcherzyków, które mogą powodować nieścisłość objętości. Ten krok można pominąć w przypadku nowszych modeli kalorymetrów.</li>
	<li>Za pomocą mikropipety i sterylnych końcówek w komorze hermetycznej z przepływem laminarnym załaduj próbki i ich odpowiedni bufor parami do 96-dołkowych płytek kompatybilnych z urządzeniem. Napełnij pierwsze dwie pary studni buforem, a ostatnie dwie pary wodą odpowiednio dla bufora-bufora i skanowania wody. Skanowanie bufora i bufora weryfikuje przydatność przyrządu przed pomiarem próbki (tj. oceną błędu oprzyrządowania), a także ustala poziom bazowy; podczas gdy skany wody są uruchamiane w celu oczyszczenia komórek.</li>
	<li>Przykryj 96-dołkową płytkę folią uszczelniającą i upewnij się, że studzienki są odpowiednio uszczelnione przed wyjęciem płytki z szafy bezpieczeństwa biologicznego, aby uniknąć zanieczyszczenia próbki.</li>
	<li>Umieścić płytkę w komorze na próbkę we właściwej orientacji.</li>
</ol>
3. Eksperymentalna konfiguracja parametrów
Uwaga: W zależności od oprzyrządowania, próbki mogą być ładowane do komórki albo ręcznie za pomocą strzykawki, albo automatycznie za pomocą automatycznego podajnika próbek. W tym przypadku (tj. w warunkach przemysłowych) stosuje się automatyczny podajnik próbek w celu zaoszczędzenia czasu.
<ol>
	<li>Korzystając z oprogramowania do akwizycji, wprowadzić informacje o próbce w kolejności, w jakiej tabliczka została załadowana, zgodnie z sekcją 2.4. Wprowadzić stężenia, jeśli są dostępne, w przeciwnym razie należy wprowadzić wartości stężeń do oprogramowania analitycznego przed analizą danych (sekcja 4.2).</li>
	<li>Wybierz opcję, która zapewnia czyszczenie komórek detergentem przed każdym skanowaniem próbki, po którym należy wykonać wiele etapów płukania wodą, aby upewnić się, że w komórkach nie pozostały żadne pozostałości detergentu.</li>
	<li>Ustawić temperaturę początkową eksperymentu na 20 °C, ale może się ona różnić w zależności od wcześniejszej wiedzy o próbce. W przypadku znanych białek można zastosować z góry określoną temperaturę początkową, podczas gdy niższą temperaturę początkową można zastosować do nieznanych próbek.</li>
	<li>Ustaw ostateczną temperaturę eksperymentu, np. 100 °C. Temperatura końcowa może się różnić w zależności od wcześniejszej wiedzy o próbce.</li>
	<li>Ustaw szybkość skanowania eksperymentu, np. 60 °C/h, która jest typową szybkością skanowania. Jednak szybkość skanowania może się różnić w zależności od wcześniejszej wiedzy o próbce, np. 90 °C/h lub 120 °C/h. Zaleca się skanowanie nieznanych próbek z różnymi szybkościami skanowania, aby ocenić kinetykę rozwijania.</li>
	<li> Ponownie zeskanuj próbki, aby zbadać odwracalność rozwijania termicznego. Rozwijanie białka uważa się za odwracalne, jeśli entalpia uzyskana dla drugiego skanowania wynosi co najmniej 80% wartości entalpii dla pierwszego skanowania.</li>
	<li>Ustawić termostat po eksperymencie na 10 °C, aby zachować integralność komórek kalorymetru.</li>
	<li>Przed jego wykonaniem sprawdź, czy parametry konfiguracji eksperymentu są poprawne. Jeśli wszystko jest na swoim miejscu, rozpocznij eksperyment.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Pobierz surowe dane z eksperymentu i wybierz jedną próbkę na raz do analizy. Odejmij skanowanie referencyjne, tj. bufor, od próbki scan. 
	UWAGA: Odejmowanie referencji jest wykonywane automatycznie przez nowsze modele instrumentów DSC.</li>
	<li>Wpisać wartość stężenia próbki, jeżeli została pominięta zgodnie z ppkt 3.1.</li>
	<li>Dopasuj i odejmij linię bazową od uzyskanego termogramu, aby uwzględnić różnice w pojemnościach cieplnych stanów pofałdowania i rozłożenia białka, które są spowodowane wystawieniem grup hydrofobowych na działanie wody podczas rozkładania. Dopasowanie krzywej liniowej lub sześciennej może być stosowane w zależności od kształtu profilu DSC dla próbki. W celu zapewnienia spójności, ten sam typ okucia musi być używany podczas badania, np. badania stabilności w czasie rzeczywistym. Ten krok jest wymagany do przetworzenia krzywej całkowania piku w celu uzyskania entalpii przejścia.</li>
	<li>Wykonaj całkowanie szczytowe przy użyciu nieliniowego dopasowania metodą najmniejszych kwadratów. Opierając się na wiedzy o produkcie, zastosuj model dwustanowy lub niedwustanowy. Model dwustanowy może być stosowany do pojedynczych kooperacyjnych przemian termicznych, a w przypadku nieznanych białek należy stosować model niedwustanowy, dopóki nie będzie dostępna dalsza wiedza o produkcie. W razie potrzeby dostosuj dopasowanie krzywej za pomocą iteracyjnej funkcji dopasowywania krzywej w oprogramowaniu urządzenia, aż wartość chi-kwadrat pozostanie stała.</li>
	<li>Uzyskane wyniki pokażą wartości punktu środkowego temperatur przejścia (Tm), entalpii kalorymetrycznej (ΔH) i entalpii van t Hoffa (ΔHVH) próbki.</li>
</ol>

<ol><li>Gill, P., Moghadam, T. T., Ranjbar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+calorimetry+techniques%3A+applications+in+biology+and+nanoscience%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Tech%22%5BJournal%5D)">Differential scanning calorimetry techniques: applications in biology and nanoscience.</a> J. Biomol. Tech. 21 (4), 167-193 (2010).</li>
<li>Perkin Elmer Corp. Differential microcalorimeter. Patent. , US3263484A 02 August (1966).</li>
<li>O'Neill, M. J. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/231200637_The_Analysis_of_a_Temperature-Controlled_Scanning_Calorimeter">The Analysis of a Temperature-Controlled Scanning Calorimeter.</a> Anal. Chem. 36 (7), 1238-1245 (1964).</li>
<li>O'Neil, M. J. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac60242a011">Measurement of Specific Heat Functions by Differential Scanning Calorimetry.</a> Anal. Chem. 38 (10), 1331-1336 (1966).</li>
<li>Privalov, P. L., Monaselidze, D. R. Mol. Biol. 6, (in Russian) 7-33 (1975).</li>
<li>Privalov, P. L., Plotnikov, V. V. Adiabatic differential microcalorimeter. Адиабатический дифференциальный микрокалориметр. , Authorship certificate No 328776 (USSR), applied 1970 (1970).</li>
<li>Andronikashvili, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorimetric+study+of+the+nature+of+the+intramolecular+fusion+of+collagen%2C+isolated+from+transplantable+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Dokl.+Akad.+Nauk%22%5BJournal%5D)">Calorimetric study of the nature of the intramolecular fusion of collagen, isolated from transplantable tumor.</a> Dokl. Akad. Nauk. 183 (1), (In Russian) 212-214 (1968).</li>
<li>Andronikashvili, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndronikashvili%2C+EL+%22Conformational+Changes+of+Biopolymers+in+Solution%22">Conformational Changes of Biopolymers in Solution</a>. , Nauka Publishing House. Moscow. (In Russian) 171-173 (1973).</li>
<li>Andronikashvili, E. L. <a target="_blank" href="http://europepmc.org/abstract/med/3318939">Malignant transformation and changes in various physic-chemical properties of macromolecules and supramolecular structures.</a> Biofizika. 32 (5), (In Russian) 782-799 (1987).</li>
<li>Velicelebi, G., Sturtevant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+of+the+denaturation+of+lysozyme+in+alcohol-water+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics of the denaturation of lysozyme in alcohol-water mixtures.</a> Biochemistry. 18 (7), 1180-1186 (1979).</li>
<li>Sturtevant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+capacity+and+entropy+changes+in+processes+involving+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Heat capacity and entropy changes in processes involving proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 74 (6), 2236-2240 (1977).</li>
<li>Sturtevant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.pc.38.100187.002335">Biochemical applications of differential scanning calorimetry.</a> Annu. Rev. of Phys. Chem. 38, 463-488 (1987).</li>
<li>Jackson, W. M., Brandts, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+of+protein+denaturation.+A+calorimetric+study+of+the+reversible+denaturation+of+chymotrypsinogen+and+conclusions+regarding+the+accuracy+of+the+two-state+approximation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics of protein denaturation. A calorimetric study of the reversible denaturation of chymotrypsinogen and conclusions regarding the accuracy of the two-state approximation.</a> Biochem. 9 (11), 2294-2301 (1970).</li>
<li>Privalov, P. L., Khechinashvili, N. N., Atanasov, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+analysis+of+thermal+transitions+in+globular+proteins.+I.+Calorimetric+study+of+chymotrypsinogen%2C+ribonuclease+and+myoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic analysis of thermal transitions in globular proteins. I. Calorimetric study of chymotrypsinogen, ribonuclease and myoglobin.</a> Biopolymers. 10 (10), 1865-1890 (1971).</li>
<li>Privalov, P. L., Khechinashvili, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thermodynamic+approach+to+the+problem+of+stabilization+of+globular+protein+structure%3A+a+calorimetric+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A thermodynamic approach to the problem of stabilization of globular protein structure: a calorimetric study.</a> J. Mol. Biol. 86 (3), 665-684 (1974).</li>
<li>Privalov, P. L., Potekhin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+microcalorimetry+in+studying+temperature-induced+changes+in+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Scanning microcalorimetry in studying temperature-induced changes in proteins.</a> Methods Enzymol. 131, 4-51 (1986).</li>
<li>Veprintseva, O. D., Emelyanenko, V. I., Konstantinova, V. V., Shnyrov, V. L. The importance of structural changes in bacteriophage T4 tail proteins. Biofizika. 33, (In Russian) 954-961 (1988).</li>
<li>Shutilova, N., Semenova, G., Klimov, V., Shnyrov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-induced+functional+and+structural+transformations+of+the+photosystem+II+oxygen-evolving+complex+in+spinach+subchloroplast+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Mol.+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">Temperature-induced functional and structural transformations of the photosystem II oxygen-evolving complex in spinach subchloroplast preparations.</a> Biochem. Mol. Biol. Int. 35 (6), 1233-1243 (1995).</li>
<li>Sanina, N. M., Kostetsky, E. Y. a, Shnyrov, V. L. Calorimetric investigation of phosphatidyl choline from membranes of marine invertebrates. J. Evol. Biokhim. Physiol. 23, 451-460 (1987).</li>
<li>Oreshkin, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+in+the+muscle+proteins+of+cured+beef+during+heating%5BTitle%5D)+AND+%22Meat+Science%22%5BJournal%5D)">Conformational changes in the muscle proteins of cured beef during heating.</a> Meat Science. 16 (4), 297-305 (1986).</li>
<li>Kirkitadze, M., Hu, J., Tang, M., Carpick, B. <a target="_blank" href="http://www.future-science.com/doi/abs/10.4155/pbp.14.27">Qualification of a differential scanning calorimetry method for biophysical characterization of monoclonal antibodies and protein vaccine antigens.</a> Pharm. Bioprocess. 2 (6), 491-498 (2014).</li>
<li>Jiskoot, W., Daan, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJiskoot%2C+W+%22Methods+for+structural+analysis+of+protein+pharmaceuticals%22">Methods for structural analysis of protein pharmaceuticals</a>. 3, Springer Science & Business Media. (2005).</li>
<li>Plotnikov, V. V., Brandts, M., Lin, L. N., Brandts, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+ultrasensitive+scanning+calorimeter%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A new ultrasensitive scanning calorimeter.</a> Anal. Biochem. 250 (2), 237-244 (1997).</li>
<li>Plotnikov, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+autosampling+differential+scanning+calorimeter+instrument+for+studying+molecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev.+Technol%22%5BJournal%5D)">An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions.</a> Assay Drug Dev. Technol. 1 (1), 83-90 (2002).</li>
<li>Freire, E. Differential scanning calorimetry. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/book/10.1385%2F0896033015">Protein Stability and Folding: Theory and Practice. Method in Molecular Biology</a>. 40, 191-218 (1995).</li>
<li>Freire, E., van Osdol, W. W., Mayorga, O. L., Sanchez-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorimetrically+determined+dynamics+of+complex+unfolding+transitions+in+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biophys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Calorimetrically determined dynamics of complex unfolding transitions in proteins.</a> Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 19, 159-188 (1990).</li>
<li>Johnson, C. R., Morin, P. E., Arrowsmith, C. H., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+analysis+of+the+structural+stability+of+the+tetrameric+oligomerization+domain+of+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic analysis of the structural stability of the tetrameric oligomerization domain of p53 tumor suppressor.</a> Biochemistry. 34 (16), 5309-5316 (1995).</li>
<li>Kasimova, M. R., Sam, J. M., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conformational+equilibrium+of+human+growth+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The conformational equilibrium of human growth hormone.</a> J. Mol. Biol. 277 (2), 409-418 (1998).</li>
<li>Saboury, A. A., Moosavi-Movahedi, A. A. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1016/0307-4412(94)90013-2/full">Clarification of calorimetric and van't hoff enthalpies for evaluation of protein transition states.</a> Biochem Edu. 22 (4), 210-211 (1994).</li>
<li>Privalov, P. L. Microcalorimetry of proteins and their complexes. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9781588299543">Protein Structure, Stability, and Interactions. Method in Molecular Biology</a>. 490, 1-39 (2009).</li>
<li>Dehghan-Nayeri, N., Rezaei-Tavirani, M. <a target="_blank" href="http://www.ijapbs.com/admin/php/uploads/156_pdf.pdf">The Interpretation of Protein Structure Through Relationship of Melting Point (Tm) and Enthalpy of Unfolding (ΔHU).</a> Int J Anal Pharma Biomed Sci. 4 (1), 47-50 (2015).</li>
<li>Stability testing of new drug substances and products. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guideline%2C+ICH+Harmonised+Tripartite%22">Guideline, ICH Harmonised Tripartite</a>. 1 (2), current step. 4 (2003).</li>
<li>Kjeldahl, J. Neue Methode zur Bestimmung des Stickstoffs in organischen Körpern (New method for the determination of nitrogen in organic substances). Zeitschrift für analytische Chemie. 22 (1), 366-383 (1883).</li>
<li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14907713">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J. Biol. Chem. 193 (1), 265-275 (1951).</li>
<li>HÖhne, G., Hemminger, W., Flammersheim, H. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aH%C3%96hne%2C+G+%22Differential+Scanning+Calorimetry%22">Differential Scanning Calorimetry</a>. , Springer Science & Business Media. (2003).</li>
<li>Porter, L. L., George, D. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22635268">A thermodynamic definition of protein domains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (24), 9420-9425 (2012).</li>
<li>Frokjaer, S., Daniel, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+drug+stability%3A+a+formulation+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Protein drug stability: a formulation challenge.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4, 298-306 (2005).</li>
<li>Johnson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+calorimetry+as+a+tool+for+protein+folding+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability.</a> Arch. Biochem. Biophys. 531, 100-109 (2013).</li>
<li>Chiu, M. H., Elmar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+calorimetry%3A+an+invaluable+tool+for+a+detailed+thermodynamic+characterization+of+macromolecules+and+their+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Bioallied+Sci%22%5BJournal%5D)">Differential scanning calorimetry: an invaluable tool for a detailed thermodynamic characterization of macromolecules and their interactions.</a> J. Pharm. Bioallied Sci. 3 (1), 39-59 (2011).</li>
<li>Hirst, J. D., Charles, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicity%2C+circular+dichroism+and+molecular+dynamics+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Helicity, circular dichroism and molecular dynamics of proteins.</a> J. Mol. Biol. 243 (2), 173-178 (1994).</li>
<li>Kirkitadze, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+modules+of+the+vaccinia+virus+complement+control+protein+are+not+in+extensive+contact%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Central modules of the vaccinia virus complement control protein are not in extensive contact.</a> Biochem. J. 344 (1), 167-175 (1999).</li>
<li>Freire, E., SchÖn, A., Hutchins, B. M., Brown, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+denaturation+as+a+tool+in+the+formulation+optimization+of+biologics%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+disc+today%22%5BJournal%5D)">Chemical denaturation as a tool in the formulation optimization of biologics.</a> Drug disc today. 18 (19), 1007-1013 (2013).</li>
<li>Wen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+differential+scanning+calorimetry+for+thermal+stability+analysis+of+proteins%3A+qualification+of+DSC%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Applications of differential scanning calorimetry for thermal stability analysis of proteins: qualification of DSC.</a> J. Pharm. Sci. 101 (3), 955-964 (2012).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy są pracownikami Sanofi Pasteur. Praca została sfinansowana przez Sanofi Pasteur, a opłaty za publikację tego artykułu wideo zostały opłacone przez Sanofi Pasteur. Autorzy nie mają żadnych istotnych powiązań ani powiązań finansowych z żadną organizacją lub podmiotem, który ma konflikt finansowy z tematem lub materiałami omawianymi w manuskrypcie. Należą do nich zatrudnienie, doradztwo, posiadanie akcji lub opcji lub tantiemy.
Przy tworzeniu tego rękopisu nie korzystano z pomocy pisarskiej.

Procedura ta została z powodzeniem włączona do różnych pakietów badań charakterystyki, w tym do badań stabilności i porównywalności produktów 21. W badaniach stabilności w czasie rzeczywistym DSC jest używany domonitorowania TM, a także do szacowania Fa leków biologicznych w czasie w celu określenia ich okresu trwałości. Jeśli chodzi o porównywalność produktów, służy ona do oceny wpływu zmian w procesie i zakładzie, a także wpływu kluczowych etapów produkcji na konformację strukturalną produkowanych partii. Zazwyczaj wiąże się to z bezpośrednim porównaniem ΔH wyprodukowanej partii ze środkiem referencyjnym, który został wyznaczony jako produkt idealny. Ponadto DSC okazał się użytecznym narzędziem analitycznym do badań nad formułowaniem produktów 37. Tm białka w różnych i w różnych stężeniach można wykorzystać do określenia preparatu, który zapewnia największą stabilność białka.
Aby zapewnić wiarygodność tej metody i obiektywność jej wyników, ważne jest, aby parametry testowania były spójne z cyklu na etap w ramach tego samego badania (np. badania nad formułą szczepionki). Jednak procedura może być modyfikowana w celu uwzględnienia różnic we właściwościach fizycznych różnych białek. Przykładem modyfikacji, którą można wprowadzić, jest zmiana szybkości skanowania eksperymentu 38, 39. Białka, które miały skłonność do tworzenia agregatów po podgrzaniu, badano z większą szybkością skanowania (np . 120 °C/h), aby uniknąć udziału agregatów w profilu przemiany termicznej, a także zatkania kapilar kalorymetru. Warto zauważyć, że szybkość skanowania może mieć wpływ na wynik eksperymentu DSC 38. Zaobserwowano poszerzenie piku przejścia termicznego wraz ze wzrostem szybkości skanowania w niektórych białkach; jednak Tm pozostało dość stałe 38. Co więcej, etapy dializy i odgazowywania w celu przygotowania próbki są również bardzo ważne dla uzyskania dokładnych wyników 31. Dializa zapewnia, że jedyną różnicą w składzie próbki i buforu jest białko; W ten sposób cały nadmiar ciepła pochłoniętego przez próbkę można przypisać pojemności cieplnej białka. Odgazowanie zapewnia precyzyjną analizę objętościową, ponieważ ekstrapolacja parametru termodynamicznego zakłada, że zdarzenie rozwijające się zachodzi przy stałej objętości i ciśnieniu 31. Część założenia dotyczącą stałego ciśnienia jest uwzględniana przez zwiększenie ciśnienia azotu w układzie, zgodnie z sekcją 1.1 procedury.
W porównaniu z innymi metodami określania stabilności konformacji białek, takimi jak dichroizm kołowy (CD) i spektroskopia fluorescencyjna, DSC oferuje szereg korzyści w warunkach komercyjnych, w tym oszczędność kosztów i czasu. Po pierwsze, adiabatyczna konstrukcja różnicowego kalorymetru skaningowego pozwala na pomiar stabilności termicznej z lepszą precyzją temperatury w porównaniu z pomiarami za pomocą oprzyrządowania do spektroskopii CD i fluorescencji 6. Po drugie, w przeciwieństwie do CD, dokładność danych DSC nie zależy od heliczności białka 39, 40; jednak płyta CD dostarcza dodatkowych informacji na temat rozwoju struktury drugorzędowej, która byłaby uzupełnieniem DSC 41. Dodatkowo, zwiększenie ciśnienia w systemie DSC pozwala na testowanie w szerokim zakresie temperatur bez gotowania próbki; w ten sposób DSC może testować szeroką gamę białek.
Chociaż DSC jest stosunkowo szybkim i prostym podejściem do określania stabilności termicznej leków biologicznych, nie jest pozbawione ograniczeń. Po pierwsze, etap odejmowania linii bazowej wprowadza pewną formę ludzkiej niespójności do analizy surowych danych; W związku z tym można zaobserwować różnice w wynikach wśród różnych użytkowników. Po drugie, różnicowe kalorymetry skaningowe mają minimalne limity stężenia, które mogą być trudne do osiągnięcia na masową skalę produkcyjną. Po trzecie, ΔH nieodwracalnej denaturacji termicznej nie jest bezwzględna; co oznacza, że pochodny ΔG (wskaźnik stabilności białka) w podobnych scenariuszach może być mylący. Ponadto metoda ta najlepiej sprawdza się w przypadku próbek oczyszczonych. Obecność zanieczyszczeń może powodować przesunięcie Tm w przypadku interakcji z badanym białkiem lub pojawienie się nowych przemian termicznych w przypadku braku interakcji. W każdym razie te dodatkowe cechy termogramów mogą być błędnie przypisane próbkom, wpływając w ten sposób na interpretację wyników. Pomimo tych ograniczeń, DSC pozostaje niezawodną metodą, która może dostarczyć szczegółowych informacji termodynamicznych na temat procesu rozwijania białek, jeśli zostanie prawidłowo zaimplementowana 42.
Podsumowując, DSC oferuje znaczną przewagę jako narzędzie konformacyjnego odczytu produktów szczepionkowych i ich półproduktów. Dwa parametry, TM i ΔH, zebrane dla szeregu partii tego samego produktu mogą stać się empirycznym punktem odniesienia, który można wykorzystać do zbadania wpływu zmian w procesie, formułowania i warunków przechowywania na trzeciorzędową strukturę i stabilność antygenów białkowych i wirusowych 21, 43.

Różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC) jest metodą eksperymentalną, która bezpośrednio mierzy różnicę w poborze energii cieplnej zachodzącą w próbce w stosunku do referencji podczas regulowanej zmiany temperatury 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. Metoda ta, przeprowadzana w różnicowym kalorymetrze skaningowym, polega na jednoczesnym wprowadzaniu energii cieplnej do komórki z próbką i komórki referencyjnej, przy jednoczesnym identycznym zwiększaniu temperatury obu komórek w czasie 2, 13, 14. Ze względu na różnice w składzie próbki i referencji, do podniesienia temperatury komórek wymagana będzie różna ilość energii 2, 12, 13. W związku z tym mierzona jest nadmiarowa ilość energii potrzebna do zrekompensowania różnicy temperatur między komórkami, co jest bezpośrednio skorelowane ze specyficznymi właściwościami termodynamicznymi próbki 1, 3.
W latach 60. XX wieku M.J. O'Neil i E. Watson z firmy Perkin Elmer opracowali pierwszy różnicowy kalorymetr skaningowy do pomiaru przepływu ciepła w materiałach stałych 2, 3, 4. Równolegle P.L. Privalov i D.R. Monaseldze E.L. z Instytutu Fizyki w Republice Gruzji (dawne ZSRR) stworzyli unikalny różnicowy kalorymetr adiabatyczny, który może być wykorzystywany w badaniach biochemicznych 5, 6. Następnie zespół Andronikashviliego w Instytucie Fizyki w Republice Gruzji określił za pomocą DSC pojemność cieplną biomolekuł, takich jak białka włókniste i globularne, DNA oraz RNA 7, 8, 9. Kilka zespołów pod kierownictwem Sturtevanta 10, 11, 12, Brandtsa 13 i Privalova 14, 15, 16 skupiło się na rozwoju teorii i praktycznych zastosowaniach DSC do badania szczegółów termodynamicznych rozwijania białek. Doniesiono również o wartości DSC w badaniu dużych struktur supramolekularnych, takich jak fagi, chloroplasty, ciekłe kryształy fosfolipidowe oraz białka mięsne 17, 18, 19, 20.
Metoda DSC stała się obecnie powszechna w badaniach i rozwoju farmaceutycznym do oceny stabilności termicznej biomolekuł, zwłaszcza białek 1, 21, 22. Jest to głównie zasługa postępów w zakresie czułości i automatyzacji aparatury wykorzystywanej do przeprowadzania eksperymentu 23, 24. W tym przypadku końcowy wynik eksperymentu DSC, mianowicie molowa ciepło właściwe jako funkcja temperatury, jest wykorzystywany do oszacowania&#160; następujących parametrów termodynamicznych (zmiany ciepła właściwego (∆Cp), entalpii (∆H), entropii (∆S) oraz energii swobodnej Gibbsa (∆G)) przy użyciu poniższego równania:
<img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq1.jpg" /> &#160; (1)
<img alt="Równanie 2" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq2.jpg" />&#160;&#160; (2)
<img alt="Równanie 3" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq3.jpg" />&#160;&#160; (3)
<img alt="Równanie 4" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq4.jpg" /> &#160; (4)
<img alt="Równanie 5" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq5.jpg" />&#160;&#160; (5)
Gdzie Cp to zmierzona pojemność cieplna; q to strumień ciepła przekazywany do badanego materiału; T0 i T to odpowiednio temperatura początkowa i końcowa przejścia 22, 25. Warto również zauważyć, że powyższe równania mają zastosowanie do białek jednodomenowych, które mogą ulegać przejścia dwustanowemu i odwracalnemu rozfałdowaniu termicznemu 22. Analizy bardziej złożonych białek (np. białek nie dwustanowych oraz oligomerów) zostały przedstawione przez Friere et al. 26; Johnson et al. 27; oraz Kasimova et al. 28.
Aby ustalić, czy białko przechodzi przejście dwustanowe czy tworzy produkty pośrednie podczas denaturacji termicznej, eksperymentalnie wyznaczoną entalpię (ΔH; nazywaną również entalpią kalorymetryczną ΔHCal) porównuje się z entalpią wyznaczoną za pomocą poniższego równania van't Hoffa (nazywaną również entalpią van't Hoffa; ΔHVH):
<img alt="Równanie 6" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq6.jpg" /> &#160; (6)
Gdzie Tm to temperatura połowy przejścia, R to uniwersalna stała gazowa (1.987 cal mol-1 K-1), a Y to ułamek populacji białka w stanie rozfałdowanym 16, 29. Jeśli ΔHVH jest równa ΔHCal; lub ΔHVH/ΔHCal jest równa 1, białko przechodzi przejście typu „wszystko albo nic” (tj. przejście dwustanowe) 16, 25, 29. Jednakże, jeśli ΔHVH jest mniejsza od ΔHCal; lub ΔHVH/ΔHCal jest mniejsza od 1, białko przechodzi przejście nie-dwustanowe 16, 25, 29. Stosunek ΔHVH/ΔHCal odpowiada również proporcji struktury białka, która ulega topnieniu jako termodynamiczna jednostka kooperacyjna lub domena 26.
Wspomniane powyżej parametry termodynamiczne, takie jak ΔG i ΔH, dostarczają cennych informacji o stabilności termicznej białek, w tym leków biologicznych 30. W niniejszej publikacji szczególną uwagę poświęcono jednak Tm oraz ΔH, ponieważ są to wartości raportowane w tym protokole. Tm to temperatura środkowa przejścia, w której białka w stanie zwiniętym i rozwiniętym znajdują się w równowadze (tj. ΔG = 0) 25, 31. Im wyższa wartość Tm białka, tym większa jest jego stabilność termiczna 31. ΔH odpowiada polu pod pikiem (pikami) na wykresie pojemności cieplnej w funkcji temperatury (zwanym również termogramem), generowanym po zakończeniu eksperymentu DSC 16, 25. Jest to energia wymagana do denaturacji białek, która może być wykorzystana do oszacowania frakcji aktywnej (Fa) w formulacji białka (tj. proporcji białek o aktywnej konformacji w próbce) przy użyciu następującego równania:
<img alt="Równanie 7" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq7.jpg" /> &#160; (7)
Gdzie ΔH to eksperymentalnie wyznaczona entalpia próbki białka, a Q to entalpia określona dla dobrze scharakteryzowanego białka referencyjnego lub standaryzowanego 22. Oszacowanie Fa ma istotne znaczenie dla monitorowania stabilności produktów w czasie rzeczywistym, a także dla prowadzenia badań stabilności w warunkach stresowych, zgodnie z wymogami wytycznych ICH 32. Porównanie ΔH dostarcza również informacji o zwartości konformacji struktury trzeciorzędowej białka 31.
Niniejszy protokół szczegółowo opisuje procedurę oceny stabilności termicznej białek w warunkach przemysłowych, która była szeroko stosowana przy opracowywaniu formulacji szczepionek. Została ona opracowana z wykorzystaniem zautomatyzowanego różnicowego kalorymetru skanującego, który pozwala na uzyskanie powtarzalnych wyników dla stężeń białek tak niskich jak 300 µg/mL.

<table><tbody><tr><td>Różnicowy kalorymetr skaningowy</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>28428948 (za pośrednictwem GE Healthcare)</td><td>Posiada automatyczny podajnik próbek do automatycznego dozowania próbek do celi w celu zmniejszenia wysiłku ludzkiego i błędów.</td></tr><tr><td>Contrad 100</td><td>Decon Laboratories Inc</td><td>1504</td><td>Rozcieńczyć wodą do 20% przed użyciem</td></tr><tr><td>500 &mikro; L Polipropylenowa płytka 96-dołkowa z okrągłym dnem</td><td>Kanadyjskie</td><td>ML072100</td> Nauki przyrodnicze Można <td>również stosować równoważne płytki od innych dostawców (np. , VW)</td></tr><tr><td>MicroCal ThermoVac&nbsp;</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>N/Ap</td><td>wyposażony w szafę bezpieczeństwa biologicznego Cap VP DSC</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Labconco</td><td>Logic+ - Szafa</td><td>z przepływem laminarnym A2 do przygotowania próbki</td></tr><tr><td>Kaseta dializacyjna Slide-A-Lyzer</td><td>Thermo Scientific</td><td>66810 lub 66380</td><td>do równoważenia próbki i buforu</td></tr></tbody></table>

różnicowa kalorymetria skaningowa – metoda oceny stabilności termicznej i konformacji antygenu białkowego

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC) to technika analityczna, która mierzy molową pojemność cieplną próbek w funkcji temperatury. W przypadku próbek białek profile DSC dostarczają informacji o stabilności termicznej i do pewnego stopnia służą jako strukturalny "odcisk palca", który można wykorzystać do oceny konformacji strukturalnej. Wykonuje się go za pomocą różnicowego kalorymetru skaningowego, który mierzy temperaturę przemiany termicznej (temperatura topnienia; Tm) oraz energia potrzebna do zakłócenia oddziaływań stabilizujących trzeciorzędową strukturę (entalpię; ∆H) białek. Dokonuje się porównań między preparatami, a także partiami produkcyjnymi, a różnice w uzyskanych wartościach wskazują na różnice w stabilności termicznej i konformacji strukturalnej. Jako dowód skuteczności tego protokołu przedstawiono dane ilustrujące zastosowanie DSC w warunkach przemysłowych do badań stabilności, a także monitorowania kluczowych etapów produkcji. W porównaniu z innymi metodami oceny stabilności termicznej konformacji białek, DSC jest opłacalna, wymaga kilku etapów przygotowania próbki, a także zapewnia pełny profil termodynamiczny procesu rozwijania białka.

Surowe dane z większości eksperymentów DSC są przedstawiane w formie wykresu strumienia ciepła w funkcji temperatury, ponieważ kalorymetr mierzy w rzeczywistości różnicę w szybkości przepływu ciepła do roztworu próbki i buforu 35. W związku z tym, jeśli obie cazole (t.j. cela z próbką i cela referencyjna) zawierają identyczne roztwory podczas eksperymentu, surowe dane z pomiaru powinny tworzyć linię płaską, bez żadnych obserwowalnych pików. Każdy zaobserwowany pik można przypisać błędowi aparatury (np. uszkodzeniu lub zanieczyszczeniu cel), dlatego wykonanie pomiarów buforu przed analizą próbek stanowi odpowiedni test przydatności systemu. Rycina 1 ilustruje wynik typowego pomiaru buforu, wskazujący, że kalorymetr był w dobrym stanie technicznym przed analizą próbek.
Rysunek 2 przedstawia surowe dane z eksperymentu DSC przeprowadzonego na różnych partiach dwóch próbek białek. Jak wspomniano wcześniej, obserwowane piki są różnicami w strumieniu ciepła próbek i ich odpowiednich buforów. Różnice w stężeniu próbek mogą powodować zmienność pojemności cieplnej rejestrowanej przez kalorymetr; jednak zmienności te są normalizowane podczas analizy próbek zgodnie z sekcją 4.2 procedury. Wyższe stężenia mogą również ujawnić dodatkowe domeny termodynamiczne, które nie przyczyniają się do przejścia przy niższych stężeniach. Ponadto każde przejście reprezentuje domenę termodynamiczną, która może obejmować jedną lub więcej domen strukturalnych białka 36. W tym przypadku Protein 1 posiada trzy domeny strukturalne, które ulegają kooperatywnemu topnieniu.
Rysunek 3 przedstawia wyniki uzyskane z analizy surowych danych dla białek 1 i 2 zaprezentowanych na Rysunku 2, t.j. po odjęciu linii bazowej i iteracyjnym dopasowaniu krzywych. Uzyskane termogramy zostały znormalizowane pod kątem szybkości skanowania (wykonane automatycznie przez zaprogramowany algorytm w oprogramowaniu analitycznym) oraz stężenia; dzięki temu wyniki eksperymentu zostały przedstawione na porównywalnych wykresach zależności pojemności cieplnej od temperatury. Oprogramowanie analityczne wykorzystuje dane z wykresów zależności pojemności cieplnej od temperatury, takie jak Tm i ΔCp, do wyznaczenia innych parametrów termodynamicznych przy użyciu wariantów powyższych równań, w zależności od kooperatywności rozwijania białek.
Podczas badania nieznanych próbek kluczowe jest ustawienie odpowiedniego zakresu temperatur. W przeciwnym razie mogą powstać niepełne termogramy, co zilustrowano na Rysunku 4. Chociaż z takich profili można wyznaczyć Tm, nie jest możliwe dokładne określenie ΔH. Dlatego próbkę należy przebadać ponownie w szerszym zakresie temperatur, aby w pełni uchwycić przejście termiczne. Niektóre białka po całkowitej denaturacji łatwo tworzą agregaty, co skutkuje wzrostem pojemności cieplnej po przejściu; często objawia się to jako niepełny termogram, jak pokazano na Rysunku 2B. Ponowne badanie z wyższą temperaturą końcową może jednak pomóc potwierdzić, czy w tym obszarze termogramu występuje przejście konformacyjne, czy jest to jedynie efekt pochłaniania ciepła przez agregaty białkowe.
Stabilność termiczna jest jedną z najważniejszych właściwości fizycznych białek i produktów na ich podstawie stosowanych w przemyśle 37. W farmaceutyce wykorzystuje się ją do określania stabilności leków biologicznych w różnych warunkach, w tym w różnych buforach formulacyjnych oraz pod wpływem czynników środowiskowych, takich jak wilgotność i temperatura. Służy ona również do monitorowania kluczowych etapów produkcji (np. oczyszczania i detoksykacji), aby zapewnić spójność konformacyjną pomiędzy partiami produkcyjnymi. Rysunki 5 i 6 ilustrują zastosowanie DSC do badania wpływu odpowiednio detoksykacji chemicznej oraz warunków przechowywania na stabilność i konformację strukturalną dwóch różnych białek. Znaczące różnice w Tm i ∆H wskazują odpowiednio na zmiany konformacyjne oraz degradację białka. Ponadto zanik trzeciego przejścia na Rysunku 6 dodatkowo obrazuje degradację domeny, co zostało potwierdzone spadkiem masy cząsteczkowej podczas analizy próbek za pomocą chromatografii wykluczania rozmiarów z wielokątnym rozpraszaniem światła (SEC-MALS) (dane nie zostały przedstawione).
<img alt="Rycina 1" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig1.jpg" /> 
Rycina 1: Skanowanie buforów. Podobieństwo gradientu każdego skanu przy braku obserwowalnych pików wskazuje, że urządzenie jest w dobrym stanie technicznym i generuje powtarzalne wyniki. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 2" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig2.jpg" /> 
Rysunek 2: Surowe dane zebrane podczas eksperymentów DSC. Wykresy te stanowią reprezentację nieanalizowanych (surowych) danych uzyskanych po seriach pomiarowych (tzn. przed odjęciem linii bazowej i dopasowaniem krzywej). Każda linia reprezentuje partię produkcyjną. Białko 2 ma tendencję do łatwiejszej agregacji podczas ogrzewania, co skutkuje wzrostem pojemności cieplnej powyżej 100 °C w obszarze potransycyjnym termogramu. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 3" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig3.jpg" /> 
Rysunek 3: Przeanalizowane dane DSC. Wykresy te stanowią dobre odwzorowanie przeanalizowanych danych DSC (t.j. (po odjęciu tła i dopasowaniu krzywej). Niebieska linia przedstawia termogram po odjęciu tła, natomiast czerwona linia przedstawia krzywą najlepiej dopasowaną do termogramu. (A) Tm i &#916;Wartości H dla próbki nr 12 białka 1 wynoszą 80.16 &#176;C oraz 1,69 x 106 odpowiednio cal/mol. (B) Tm i &#916;Wartości H dla próbki nr 13 białka 1 wynoszą 80.15 &#176;C oraz 1,71 x 106 odpowiednio cal/mol. (C) Tm i &#916;Wartości H dla próbki nr 21 białka 2 wynoszą 75.01 &#176;C oraz 4,08 x 106 odpowiednio cal/mol. (D) Tm i &#916;Wartości H dla białka 2, próbka nr 22, wynoszą 75.67 &#176;C i 4,22 x 106 odpowiednio cal/mol. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Rycina 4" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig4.jpg" /> 
Rycina 4: Niepełny termogram. Surowe dane zebrane dla Białka 1 analizowanego w niewłaściwym zakresie temperatur. Końcowa temperatura eksperymentu została ustawiona na 90 °C, co nie pozwoliło na uchwycenie pełnego profilu przejścia białka w porównaniu do eksperymentu przedstawionego na Rycynie 2A, w którym temperatura została ustawiona na 120 °C. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig4large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 5" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig5.jpg" /> 
Rysunek 5: Analiza danych wykazująca wpływ detoksykacji chemicznej na strukturę trzeciorzędową Białka 1. (A) Białko 1 w swojej natywnej konformacji jest toksyną i charakteryzuje się wartością Tm wynoszącą 56,84 °C oraz ΔH wynoszącą 2,57 x 105 cal/mol. (B) Detoksykowana forma Białka 1 (tj. toksoid) posiada odpowiednio wartości Tm 81,01 °C oraz ΔH 1,89 x 106 cal/mol. Zatem można wywnioskować, że etap detoksykacji wprowadził pewną zmianę w konformacji strukturalnej Białka 1, która nadaje większą stabilność (wyższą Tm) jego formie detoksykowanej. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig5large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 6" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig6.jpg" /> 
Rycina 6: Analiza danych wykazująca wpływ warunków przechowywania na konformację białka 3. Wykresy te ilustrują wpływ temperatury przechowywania (2 - 8 &#176;C) na stabilność i strukturę trzeciorzędową Białka 3 w ciągu 30 tygodni. Tm i &#916;Wartości H dla białka 3 przy 8th (A) oraz 38th tydzień (B) warunki przechowywania podano w Tabela 1 Proszę podać tekst do tłumaczenia. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Próbka</td>
			<td >Tm 1 (°C)</td>
			<td >∆H 1 (cal/mol)</td>
			<td >Tm 2 (°C)</td>
			<td >∆H 2 (cal/mol)</td>
			<td >Tm 3 (°C)</td>
			<td >∆H 3 (cal/mol)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Białko 3 przechowywane w temp. 2-8 °C przez 8 tygodni</td>
			<td >61.91</td>
			<td >1.71 x 105</td>
			<td >75.54</td>
			<td >2.17 x 105</td>
			<td >90.29</td>
			<td >4.17 x 105</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Białko 3 przechowywane w temp. 2-8 °C przez 38 tygodni</td>
			<td >61.87</td>
			<td >1.66 x 105</td>
			<td >75.18</td>
			<td >1.46 x 105</td>
			<td >90.22</td>
			<td >5.76 x 105</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Tm i &#916;Wartości H dla białka 3 w 8th oraz 38th Tydzień przechowywania w temperaturze 2 - 8 &#176;C. Chociaż Tm wartości w obu punktach czasowych są zbliżone, różnica w &#916;Wartości H wskazują, że struktura trzeciorzędowa białka 3 uległa degradacji w ciągu 30 tygodni w określonych warunkach przechowywania.

Różnicowa kalorymetria skaningowa mierzy temperaturę(y) przemiany termicznej i całkowitą energię cieplną potrzebną do denaturacji białka. Uzyskane wyniki służą do oceny stabilności termicznej antygenów białkowych w formulacjach szczepionek.

Różnicowa kalorymetria skaningowa – metoda oceny stabilności termicznej i konformacji antygenu białkowego

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Ogólnym celem tej procedury jest ocena stabilności termicznej i konformacji strukturalnej białek w warunkach przemysłowych przy użyciu różnicowej kalorymetrii skaningowej. Różnicowa kalorymetria skaningowa mierzy molową pojemność cieplną próbek w funkcji temperatury i jest z powodzeniem stosowana do oceny stabilności termicznej i konformacji strukturalnej białek. Ta stosunkowo prosta procedura nie zależy od helicity strukturalnej ani wewnętrznych fluoroforów, jak ma to miejsce w przypadku innych metod biofizycznych.Kolejną zaletą tej techniki jest to, że bezpośrednio mierzy temperaturę przemiany termicznej i energię potrzebną do zakłócenia oddziaływania, stabilizując trzeciorzędową strukturę białek. W połączeniu z entuzjazmem rozkładania, temperatura przemiany termicznej może służyć jako użyteczny parametr do monitorowania spójności procesów produkcyjnych dla partii biologicznych. Wizualna demonstracja tej metody może służyć jako interaktywne medium, aby skutecznie pomóc nowym użytkownikom w krytycznych krokach.Aby rozpocząć, włącz różnicowy kalorymetr skaningowy. Następnie doprowadź azot do systemu. Zwiększy to ciśnienie w komórkach, aby stłumić wrzenie próbek, a także zapobiec tworzeniu się pęcherzyków w podwyższonych temperaturach.W zależności od materiału, z którego wykonane jest ogniwo, należy dostosować ciśnienie dopływu azotu zgodnie z ciśnieniem zalecanym przez producenta, aby uniknąć uszkodzenia ogniwa. Upewnij się, że wszystkie zbiorniki środka czyszczącego są napełnione do wymaganej objętości. Wymagane środki czyszczące obejmują detergent do mycia celi i wodę do czyszczenia celi po każdym przebiegu próbki.Ustawić temperaturę w komorze na próbkę na odpowiednią wartość, najlepiej pięć stopni Celsjusza, aby zachować integralność próbki przed eksperymentem. Ważne jest, aby zrównoważyć próbkę z buforem, aby upewnić się, że jedyną różnicą między roztworami jest białko. Dlatego zaobserwowaną różnicę w pojemności cieplnej można prawidłowo przypisać białku.Oznaczyć stężenie próbki białka przy użyciu odpowiedniej metody oznaczania stężenia białka, takiej jak metoda Lowry'ego. W przypadku instrumentu używanego w tym protokole preferowany zakres roboczy wynosi od 0,5 do jednego miligrama białka na mililitr. Dializuj próbkę względem buforu, który będzie używany jako odniesienie w eksperymencie.Odgazuj próbkę i bufor referencyjny w próżni, aby pozbyć się mikropęcherzyków, które mogą powodować nieścisłość objętości. Pracując w komorze hermetyzacji z przepływem laminarnym, użyj mikropipety i sterylnych końcówek, aby załadować próbki do odpowiedniego bufora parami do 96-dołkowych płytek. Napełnij pierwsze dwie pary studzienek buforem, aby wykonać skanowanie bufora buforowego w celu sprawdzenia przydatności przyrządu przed pomiarem próbki.Napełnij dwie ostatnie pary studzienek wodą, aby skan wodny oczyścił komórki. Następnie przykryj płytkę 96-dołkową folią uszczelniającą. Upewnij się, że studzienki są odpowiednio uszczelnione przed wyjęciem płytki z szafy bezpieczeństwa biologicznego, aby uniknąć zanieczyszczenia próbki.Na koniec umieścić płytkę w komorze na próbkę we właściwej orientacji. Korzystając z oprogramowania do akwizycji, wprowadź informacje o próbce w kolejności, w jakiej została załadowana płytka. Wprowadź stężenia białka, jeśli są dostępne.W przeciwnym razie należy wprowadzić stężenie do oprogramowania analitycznego przed analizą danych. Wybierz opcję, która zapewnia czyszczenie celi detergentem przed każdym skanowaniem próbki. Po czyszczeniu należy wykonać wiele etapów płukania wodą, aby upewnić się, że w komórkach nie pozostały żadne pozostałości detergentu.Ustaw temperaturę początkową eksperymentu na 20 stopni Celsjusza, która może się różnić w zależności od próbki. W przypadku znanych białek można zastosować z góry określoną temperaturę początkową, podczas gdy niższą temperaturę początkową można zastosować do nieznanych próbek. Następnie ustaw końcową temperaturę eksperymentu.Temperatura końcowa może się również różnić w zależności od wcześniejszej wiedzy o próbce. Następnie ustaw szybkość skanowania eksperymentu. Zaleca się skanowanie nieznanych próbek z różnymi szybkościami skanowania, aby ocenić kinetykę rozwijania.Skonfiguruj oprogramowanie do akwizycji, aby ponownie zeskanować próbki w celu zbadania odwracalności przemiany termicznej. Rozwijanie białka uważa się za odwracalne, jeśli entalpia uzyskana dla drugiego skanowania wynosi co najmniej 80% wartości entalpii z pierwszego skanowania. Ustaw termostat po eksperymencie na 10 stopni Celsjusza, aby zachować integralność celi kalorymetrycznej.Przed jego wykonaniem sprawdź, czy parametry konfiguracji eksperymentu są poprawne. Jeśli wszystko jest na swoim miejscu, rozpocznij eksperyment. Po zakończeniu eksperymentu przeprowadź analizę danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Na potrzeby analizy odejmowanie linii bazowej jest wykonywane ręcznie. Konsekwencja na tym etapie ma kluczowe znaczenie dla uzyskania porównywalnych wyników. Pokazano tutaj reprezentatywne surowe dane z serii eksperymentalnej, w tym skany bufora i wody.Analizowane próbki to toksyny w stanie naturalnym i detoksykowanym. Skany próbek są przetwarzane oddzielnie w celu wyprowadzenia temperatury topnienia i wartości entalpii dla każdej próbki. Dla stanu rodzimego temperatura topnienia wynosi 55,55 stopni Celsjusza, a entalpia toksyny wynosi 3,157 razy 10 do jednej piątej kalorii na mol.I odwrotnie, temperatura topnienia toksyny w stanie detoksykacji wynosi 81,21 stopni Celsjusza, a entalpia wynosi 3,656 razy 10 do piątej kalorii na mol. Nałożenie przetworzonych danych toksyny w jej stanie natywnym i detoksykacji pokazuje, że odtruta próbka jest bardziej stabilna termicznie niż jej stan natywny zgodnie z wartościami temperatury topnienia. Wskazuje również, że proces detoksykacji wprowadza zmiany strukturalne w trzeciorzędowej strukturze toksyny.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zapewnieniu odpowiedniego zapasu detergentu i wody, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu ogniwa i strzykawki, ponieważ ich przejrzystość ma kluczowe znaczenie dla dokładnych wyników. Po obejrzeniu tego filmu będziesz miał dobrą wiedzę na temat różnicowej kalorymetrii skaningowej jako metody oceny stabilności termicznej i konformacji białek. Będziesz również w stanie dokonać znaczących odliczeń z wynikowych przebiegów termicznych.Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak dichroizm kołowy, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące zmian w strukturach drugorzędowych podczas rozwijania. Dane zebrane dla szeregu partii tego samego produktu wykorzystano do stworzenia empirycznych punktów odniesienia w celu zbadania wpływu zmian w procesie, recepturze i warunkach przechowywania na konformację strukturalną antygenów białkowych do produkcji szczepionek.

differential-scanning-calorimetry-method-for-assessing-thermal

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film demonstruje różnicową kalorymetrię skaningową - technikę badania interakcji między biomolekułą a ligandem. Wiązanie aptameru DNA i liganda termolabilnego bada się poprzez zastosowanie powtarzających się cykli ogrzewania i chłodzenia do próbki oraz uzyskanie skanów do analizy termodynamicznej.

Różnicowa kalorymetria skaningowa do badania interakcji DNA aptamer-termolabilny ligand

Mieszanie to efektywne podejście do generowania biomateriałów o szerokim zakresie właściwości i połączonych cechach. Przewidując interakcje molekularne między różnymi naturalnymi białkami jedwabiu, można zaprojektować nowe platformy ze stopów białek jedwabiu i jedwabiu o regulowanej odporności mechanicznej, reakcji elektrycznej, przezroczystości optycznej, przetwarzalności chemicznej, biodegradowalności lub stabilności termicznej.

Projektowanie materiałów ze stopów białek jedwabiu i jedwabiu do zastosowań biomedycznych

Różnicowa fluorymetria skaningowa jest powszechnie stosowaną metodą badania bibliotek małych cząsteczek pod kątem interakcji z białkami. W tym miejscu przedstawiamy prostą metodę rozszerzenia tych analiz w celu oszacowania stałej dysocjacji między małą cząsteczką a jej białkiem partnera.

Oznaczanie oddziaływań białko-ligand za pomocą różnicowej fluorymetrii skaningowej

Przedstawiamy protokół do szybkiej charakterystyki biomolekularnych oddziaływań fałdowania i wiązania z termolabilnymi ligandami za pomocą różnicowej kalorymetrii skaningowej.

Pomiar biomolekularnych profili DSC za pomocą termolabilnych ligandów w celu szybkiego scharakteryzowania interakcji fałdowania i wiązania

A przedstawiono protokół do szybkiego testowania stabilności termicznej białek w różnych warunkach za pomocą testów przesunięcia termicznego i nano różnicowej fluorymetrii skaningowej. Systemy buforowe, sole i dodatki, składające się z trzech unikalnych ekranów stabilności, są testowane z białkami w celu zidentyfikowania odpowiednich do badań funkcjonalnych i strukturalnych.

Jak ustabilizować białko: badania przesiewowe stabilności do testów przesunięcia termicznego i nanoróżnicowej fluorymetrii skaningowej w projekcie Virus-X

Pomiary zaangażowania docelowego leku są kluczowe dla skutecznego rozwoju leków i walidacji sond chemicznych. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół pomiaru zaangażowania leku w cel za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości w kompatybilnej z mikropłytką adaptacji komórkowego testu przesunięcia termicznego (CETSA).

Wykorzystanie obrazowania o wysokiej zawartości do ilościowego określenia zaangażowania celu w przylegających komórkach

Monitorowanie zmian temperatury topnienia docelowego białka (np. test przesunięcia termicznego, TSA) jest efektywną metodą badania bibliotek fragmentów kilkuset związków. Przedstawiamy protokół TSA implementujący wspomaganą robotyką nanoróżnicową fluorymetrię skaningową (nano-DSF) do monitorowania wewnętrznej fluorescencji tryptofanu i rozpraszania wstecznego światła w celu badania przesiewowego fragmentów.

Nanoróżnicowa fluorymetria skaningowa do badań przesiewowych w wykrywaniu odprowadzeń na podstawie fragmentów

Ta publikacja pokazuje zastosowanie dyfrakcji rentgenowskiej i różnicowej kalorymetrii skaningowej jako złotych standardów do badania stanu stałego lipidowych substancji pomocniczych (LBE). Zrozumienie zmian w stanie stałym w LBE i ich wpływu na działanie produktów farmaceutycznych jest kluczowym czynnikiem w produkcji solidnych form dawkowania na bazie lipidów.

Pakiet uznanych narzędzi analitycznych do badania zmian w stanie stałym substancji pomocniczych na bazie lipidów

Ten protokół opisuje unikalną metodę wykrywania wiązania między związkami a cząsteczkami białka, oferując korzyści w postaci minimalnej utraty próbki białka i wysokiej dokładności danych.

Wykrywanie interakcji białko-baldaszek CD40 za pomocą różnicowej fluorescencji skaningowej

Interakcja między kanałami HCN a ich podjednostką pomocniczą została zidentyfikowana jako cel terapeutyczny w dużym zaburzeniu depresyjnym. W tym artykule przedstawiono opartą na polaryzacji fluorescencyjnej metodę identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów tej interakcji białko-białko.

Metoda identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów oddziaływania białko-białko między HCN1 i TRIP8b

Poznaj różnicową kalorymetrię skaningową do oceny stabilności termicznej i konformacji białkowych antygenów szczepionek. Ta metoda pozwala bezpośrednio mierzyć temperaturę przejścia termicznego i energię denaturacji białek.

Różnicowa kalorymetria skaningowa – metoda oceny stabilności termicznej i konformacji antygenu białkowego

Przeglądaj więcej filmów