Różnicowa kalorymetria skaningowa – metoda oceny stabilności termicznej i konformacji antygenu białkowego

Ogólnym celem tej procedury jest ocena stabilności termicznej i konformacji strukturalnej białek w warunkach przemysłowych przy użyciu różnicowej kalorymetrii skaningowej. Różnicowa kalorymetria skaningowa mierzy molową pojemność cieplną próbek w funkcji temperatury i jest z powodzeniem stosowana do oceny stabilności termicznej i konformacji strukturalnej białek. Ta stosunkowo prosta procedura nie zależy od helicity strukturalnej ani wewnętrznych fluoroforów, jak ma to miejsce w przypadku innych metod biofizycznych.

Kolejną zaletą tej techniki jest to, że bezpośrednio mierzy temperaturę przemiany termicznej i energię potrzebną do zakłócenia oddziaływania, stabilizując trzeciorzędową strukturę białek. W połączeniu z entuzjazmem rozkładania, temperatura przemiany termicznej może służyć jako użyteczny parametr do monitorowania spójności procesów produkcyjnych dla partii biologicznych. Wizualna demonstracja tej metody może służyć jako interaktywne medium, aby skutecznie pomóc nowym użytkownikom w krytycznych krokach.

Aby rozpocząć, włącz różnicowy kalorymetr skaningowy. Następnie doprowadź azot do systemu. Zwiększy to ciśnienie w komórkach, aby stłumić wrzenie próbek, a także zapobiec tworzeniu się pęcherzyków w podwyższonych temperaturach.

W zależności od materiału, z którego wykonane jest ogniwo, należy dostosować ciśnienie dopływu azotu zgodnie z ciśnieniem zalecanym przez producenta, aby uniknąć uszkodzenia ogniwa. Upewnij się, że wszystkie zbiorniki środka czyszczącego są napełnione do wymaganej objętości. Wymagane środki czyszczące obejmują detergent do mycia celi i wodę do czyszczenia celi po każdym przebiegu próbki.

Ustawić temperaturę w komorze na próbkę na odpowiednią wartość, najlepiej pięć stopni Celsjusza, aby zachować integralność próbki przed eksperymentem. Ważne jest, aby zrównoważyć próbkę z buforem, aby upewnić się, że jedyną różnicą między roztworami jest białko. Dlatego zaobserwowaną różnicę w pojemności cieplnej można prawidłowo przypisać białku.

Oznaczyć stężenie próbki białka przy użyciu odpowiedniej metody oznaczania stężenia białka, takiej jak metoda Lowry'ego. W przypadku instrumentu używanego w tym protokole preferowany zakres roboczy wynosi od 0,5 do jednego miligrama białka na mililitr. Dializuj próbkę względem buforu, który będzie używany jako odniesienie w eksperymencie.

Odgazuj próbkę i bufor referencyjny w próżni, aby pozbyć się mikropęcherzyków, które mogą powodować nieścisłość objętości. Pracując w komorze hermetyzacji z przepływem laminarnym, użyj mikropipety i sterylnych końcówek, aby załadować próbki do odpowiedniego bufora parami do 96-dołkowych płytek. Napełnij pierwsze dwie pary studzienek buforem, aby wykonać skanowanie bufora buforowego w celu sprawdzenia przydatności przyrządu przed pomiarem próbki.

Napełnij dwie ostatnie pary studzienek wodą, aby skan wodny oczyścił komórki. Następnie przykryj płytkę 96-dołkową folią uszczelniającą. Upewnij się, że studzienki są odpowiednio uszczelnione przed wyjęciem płytki z szafy bezpieczeństwa biologicznego, aby uniknąć zanieczyszczenia próbki.

Na koniec umieścić płytkę w komorze na próbkę we właściwej orientacji. Korzystając z oprogramowania do akwizycji, wprowadź informacje o próbce w kolejności, w jakiej została załadowana płytka. Wprowadź stężenia białka, jeśli są dostępne.

W przeciwnym razie należy wprowadzić stężenie do oprogramowania analitycznego przed analizą danych. Wybierz opcję, która zapewnia czyszczenie celi detergentem przed każdym skanowaniem próbki. Po czyszczeniu należy wykonać wiele etapów płukania wodą, aby upewnić się, że w komórkach nie pozostały żadne pozostałości detergentu.

Ustaw temperaturę początkową eksperymentu na 20 stopni Celsjusza, która może się różnić w zależności od próbki. W przypadku znanych białek można zastosować z góry określoną temperaturę początkową, podczas gdy niższą temperaturę początkową można zastosować do nieznanych próbek. Następnie ustaw końcową temperaturę eksperymentu.

Temperatura końcowa może się również różnić w zależności od wcześniejszej wiedzy o próbce. Następnie ustaw szybkość skanowania eksperymentu. Zaleca się skanowanie nieznanych próbek z różnymi szybkościami skanowania, aby ocenić kinetykę rozwijania.

Skonfiguruj oprogramowanie do akwizycji, aby ponownie zeskanować próbki w celu zbadania odwracalności przemiany termicznej. Rozwijanie białka uważa się za odwracalne, jeśli entalpia uzyskana dla drugiego skanowania wynosi co najmniej 80% wartości entalpii z pierwszego skanowania. Ustaw termostat po eksperymencie na 10 stopni Celsjusza, aby zachować integralność celi kalorymetrycznej.

Przed jego wykonaniem sprawdź, czy parametry konfiguracji eksperymentu są poprawne. Jeśli wszystko jest na swoim miejscu, rozpocznij eksperyment. Po zakończeniu eksperymentu przeprowadź analizę danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Na potrzeby analizy odejmowanie linii bazowej jest wykonywane ręcznie. Konsekwencja na tym etapie ma kluczowe znaczenie dla uzyskania porównywalnych wyników. Pokazano tutaj reprezentatywne surowe dane z serii eksperymentalnej, w tym skany bufora i wody.

Analizowane próbki to toksyny w stanie naturalnym i detoksykowanym. Skany próbek są przetwarzane oddzielnie w celu wyprowadzenia temperatury topnienia i wartości entalpii dla każdej próbki. Dla stanu rodzimego temperatura topnienia wynosi 55,55 stopni Celsjusza, a entalpia toksyny wynosi 3,157 razy 10 do jednej piątej kalorii na mol.

I odwrotnie, temperatura topnienia toksyny w stanie detoksykacji wynosi 81,21 stopni Celsjusza, a entalpia wynosi 3,656 razy 10 do piątej kalorii na mol. Nałożenie przetworzonych danych toksyny w jej stanie natywnym i detoksykacji pokazuje, że odtruta próbka jest bardziej stabilna termicznie niż jej stan natywny zgodnie z wartościami temperatury topnienia. Wskazuje również, że proces detoksykacji wprowadza zmiany strukturalne w trzeciorzędowej strukturze toksyny.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zapewnieniu odpowiedniego zapasu detergentu i wody, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu ogniwa i strzykawki, ponieważ ich przejrzystość ma kluczowe znaczenie dla dokładnych wyników. Po obejrzeniu tego filmu będziesz miał dobrą wiedzę na temat różnicowej kalorymetrii skaningowej jako metody oceny stabilności termicznej i konformacji białek. Będziesz również w stanie dokonać znaczących odliczeń z wynikowych przebiegów termicznych.

Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak dichroizm kołowy, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące zmian w strukturach drugorzędowych podczas rozwijania. Dane zebrane dla szeregu partii tego samego produktu wykorzystano do stworzenia empirycznych punktów odniesienia w celu zbadania wpływu zmian w procesie, recepturze i warunkach przechowywania na konformację strukturalną antygenów białkowych do produkcji szczepionek.