Enkapsulacja komórek ssaków w kulkach alginianowych za pomocą prostego naczynia z mieszadłem

Ten film opisuje metodę unieruchamiania komórek ssaków, takich jak wyspy trzustkowe w kulkach alginianowych, za pomocą prostego naczynia z mieszaniem. Zasada działania metody polega na wytwarzaniu kropelek alginianu za pomocą emulsji wodno-olejowej, a następnie wewnętrznym żelowaniu kropelek alginianu. Pierwszym etapem zabiegu jest wytworzenie emulsji, w której faza wodna zawierająca komórki alginianowe i węglan wapnia jest dyspersjonowana w fazie organicznej oleju mineralnego.

Drugim krokiem jest zakwaszenie emulsji poprzez dodanie kwasu rozpuszczalnego w oleju, takiego jak kwas octowy, który szybko rozdziela się na fazę wodną. Spadek pH prowadzi do rozpuszczenia węglanu wapnia i do wewnętrznego żelowania kropelek alginianu w kulki. Ostatni etap polega na odzyskaniu kulek z emulsji poprzez dodanie roztworu wodnego, oddzielenie faz przez odwirowanie, a następnie umycie i przefiltrowanie kulek.

Unieruchomione komórki mogą być następnie hodowane in vitro lub wykorzystywane do przeszczepu. Opisana przez nas metoda jest alternatywą dla stosowania enkapsulatorów komórkowych opartych na dyszach do generowania kulek alginianowych. Zostało to wyprowadzone z metody enzymów i immobilizacji komórek drobnoustrojów, po raz pierwszy opisanej przez Ponceleta i innych w 1992 roku.

Zastosowaniem, które interesuje nas najbardziej, jest kapsułkowanie alginianów jako środek do immunoizolacji przeszczepionych komórek, tak aby zmniejszyć lub nawet wyeliminować potrzebę stosowania leków zapobiegających odrzuceniu. Głównymi zaletami procesu opartego na emulsji w porównaniu z urządzeniami opartymi na dyszach są jego skalowalność i solidność. Ponieważ kropelki są wytwarzane prawie jednocześnie, bardzo duże ilości kulek mogą być wytwarzane w bardzo krótkich odstępach czasu, zarówno z bardzo rozcieńczonych, jak i bardzo skoncentrowanych roztworów alginianów.

Co więcej, proces jest bardzo solidny i nie jest podatny na awarie, a nawet w obecności cząstek, które mogłyby blokować dysze, a wreszcie sprzęt procesowy jest dość prosty, a więc jest dostępny, bardzo stosunkowo tani dla większości laboratoriów. Kluczowymi etapami przetwarzania są emulgacja w celu utworzenia kropelek alginianu oraz zakwaszenie w celu uwolnienia wewnętrznego źródła wapnia. Na wielkość kropli ma wpływ przede wszystkim konstrukcja wirnika, szybkość mieszania i czas mieszania.

Na właściwości mechaniczne kulek i przeżywalność komórek ma wpływ stopień i czas trwania zakwaszenia. W tym filmie pokazujemy metodę stosowaną do kapsułkowania komórek w 5% kulkach alginianowych do przeszczepu. Parametry te prawdopodobnie wymagałyby optymalizacji pod kątem innych potencjalnych zastosowań.

Aby wytworzyć 5% kulki alginianowe zawierające mieszaninę pół na pół alginianów LVM i MVG, odważ 583 miligramy LVM i 583 miligramy kwasu alginowego MVG w proszku. Umieść 20-mililitrowy bufor procesowy na magnetycznej płytce mieszającej. Do zastosowań transplantacyjnych używamy 10-milimolowego buforu HEPES zawierającego 170 milimolowy chlorek sodu o pH 7,4.

Stopniowo dodawaj kwas alginowy w proszku do roztworu. Pozostaw roztwór mieszając przez noc na niskich obrotach. W razie potrzeby przymocować kolbę do płytki mieszającej.

Następnego dnia, jeśli alginian nie jest całkowicie rozpuszczony, przymocuj słoik do miksera obrotowego i kontynuuj mieszanie przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy alginian całkowicie się rozpuści, wysterylizuj roztwór przez autoklawowanie przez 30 minut. Pozwól, aby temperatura spadła poniżej 50 stopni Celsjusza przed otwarciem autoklawu.

Przygotować zawiesinę węglanu wapnia, dodając jeden gram węglanu wapnia do 20 mililitrów buforu procesowego. Zawiesinę węglanu wapnia i mieszane naczynie używane do procesu emulsji należy przekierować w autoklawie. Przed użyciem należy usunąć wszelkie ślady skondensowanej wody z naczynia.

Bezpośrednio przed procesem emulsji rozpuść 44 mikrolitry lodowatego kwasu octowego w 11 mililitrowym oleju mineralnym umieszczonym w 50-mililitrowej stożkowej tubie. Częstym błędem jest niepełne rozpuszczenie kwasu octowego, unikanie pipetowania ilości mniejszych niż 10 mikrolitrów i upewnienie się, że kwas jest całkowicie rozpuszczony przez wielokrotne wirowanie. Poczekaj, aż wszystkie roztwory osiągną temperaturę pokojową przed przystąpieniem do enkapsulacji komórek.

Umieść 10 mililitrów oleju mineralnego w kolbie obrotowej i zacznij mieszać z prędkością 250 obr./min. Jeśli używane są komórki przylegające, takie jak komórki beta-tc3, trypsynizuj komórki. Zakończyć reakcję, dodając kompletną pożywkę i pobrać próbkę do zliczenia komórek.

Określ stężenie komórek ręcznie lub za pomocą automatycznego licznika komórek. Odwirować komórki przez siedem minut przy 300 g, a następnie ponownie zawiesić paletę komórek w pełnym pożywce. Powtórz etap wirowania, a następnie ponownie zawieś komórki w odpowiedniej objętości kompletnego podłoża, aby uzyskać 10 i 1/2 razy pożądane stężenie końcowe w kulkach.

Przenieś 9,9 mililitra roztworu alginianu do probówki o płaskim dnie, a następnie dodaj 1,1 mililitra zapasu komórek i 550 mikrolitrów zawiesiny węglanu wapnia. Wymieszaj alginian, węglan wapnia i zawiesinę komórkową przez łagodne wirowanie. Natychmiast przenieś 10,5 mililitra tej mieszaniny do oleju do mieszania za pomocą strzykawki.

Zwiększ szybkość mieszania, a następnie uruchom stoper. Aby określić szybkość mieszania, należy najpierw wygenerować standardową krzywą łączącą rozmiar ściegu z szybkością mieszania. Po 12 minutach dodaj 10 mililitrów roztworu oleju i kwasu octowego, aby zakwasić emulsję, uwolnić wapń z węglanu i uzyskać zżelowane kulki.

Odczekaj osiem minut na ten wewnętrzny etap żelowania. Zwróć uwagę na zmianę koloru zemulgowanych kropel, które zawierają wskaźnik pH czerwieni fenolowej. Zmniejsz szybkość mieszania do 400 obr./min, zneutralizuj kwas, dodając 40 mililitrów bufora procesowego zmieszanego z 10% pożywką, co prowadzi do odwrócenia faz.

Minutę później przerwij mieszanie i przenieś mieszaninę do stożkowych rurek. Przepłukać kolbę przędzalniczą dodatkowymi 20 mililitrami pożywki i dodać ją do probówek. Odessać jak najwięcej roztworu wodnego przed zasysaniem fazy olejowej.

Wirować probówki przez trzy minuty przy 630 g, aby przyspieszyć osiadanie kulek i separację faz. Usuń olej i nadmiar buforu procesowego, zasysając go pipetą Pasteura. Umyj kulki co najmniej raz podłożem, używając 630 g wirowania między praniami.

Przefiltruj zawiesinę kulek na 40-mikronowych sitkach nylonowych i odessaj nadmiar płynu do sitka od dołu. Przenieś kulki do znanej objętości podłoża za pomocą szpatułki. Zmierz objętość kulki i uzupełnij pożywkę, aby uzyskać pożądane stężenie kulek.

Typowe stężenie to jeden mililitr kulek na pięć mililitrów całkowitej objętości. Od tego momentu zawsze należy obchodzić się z koralikami za pomocą pipet o dużej średnicy, aby uniknąć ich uszkodzenia. Zamknięte w kapsułkach komórki można teraz przenieść do kolb T i wykorzystać do hodowli in vitro lub przeszczepu.

Pod koniec procesu emulsji należy otrzymać kulki alginianowe zawierające unieruchomione komórki. Po zakończeniu procesu należy rutynowo ocenić rozkład wielkości kulek i przeżywalność komórek. Aby określić rozkład wielkości kulek, koraliki można zabarwić błękitem toluidyny, a następnie przeprowadzić analizę obrazu.

W wyniku tego procesu oczekuje się szerokiego rozkładu wielkości ściegów. Aby ocenić przeżywalność komórek, kulki można inkubować z żywymi martwymi plamami, takimi jak kalceina-AM i homodimer etydyny. Korzystając z procesu opisanego w tym filmie, zmierzono przeżycie komórek beta-tc3 na poziomie 76%.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak unieruchamiać komórki ssaków w kulkach alginianowych za pomocą prostego systemu mieszania. Podstawowy protokół pokazany w tym filmie powinien być odpowiedni do unieruchamiania różnych typów komórek przy użyciu szerokiej gamy typów alginianów i kalcytacji. Zalecamy wygenerowanie standardowej krzywej łączącej średni rozmiar ściegu z szybkością mieszania przy każdej nowej partii alginianu lub oleju.

Opisany przez nas proces emulgowania jest obiecującą alternatywą dla enkapsulatorów komórkowych opartych na dyszach. Jest to solidna i prosta metoda unieruchamiania komórek ssaków w kulkach alginianowych. W miarę jak my i inni na całym świecie rozwijamy terapie komórkami dyszowymi, taka skala metod będzie potrzebna dla wielu tysięcy pacjentów z cukrzycą.

Opublikowaliśmy obiecujące wyniki przeszczepiania linii komórek beta w 5% kulkach alginianowych i kontynuujemy badania nad wydajnością in vivo tej ulepszonej bariery przed odrzuceniem przeszczepu.