Króliczy model przyspieszonej miażdżycy: perspektywa metodologiczna uszkodzenia balonika tętnicy biodrowej
October 3rd, 2017
Zwierzęce modele miażdżycy są niezbędne do zrozumienia mechanizmu i zbadania nowszych metod zapobiegania rozwojowi lub pękaniu płytki nazębnej, głównej przyczynie zgonów w uprzemysłowionym świecie. Protokół ten wykorzystuje połączenie uszkodzenia balonu i diety bogatej w cholesterol w celu wywołania blaszek miażdżycowych w tętnicy biodrowej królika.
Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie powstawania blaszek miażdżycowych u królików poprzez chirurgiczne przerwanie śródbłonka ich lewej tętnicy biodrowej i karmienie ich dietą aterogenną. Samotny uraz u królików jest często wykonywany w aorcie w celu zbadania składu płytki nazębnej. Jednak tętnica biodrowa jest bardzo podobna do ludzkiej tętnicy wieńcowej, co czyni ją atrakcyjnym miejscem do modelowania blaszek miażdżycowych.
Jednorodne zmiany w zawartości mięśni, aktywność czynnika tkanki oka i stałe wymiary naczynia tętnicy biodrowej królika są porównywalne z ludzką tętnicą wieńcową. Ostatecznie pozwala to na ocenę wyrobów produkowanych komercyjnie pod kątem morfometrycznych i angiograficznych punktów końcowych. Procedurę zademonstruje Aurelien Frobert, współpracownik z mojego laboratorium.
Pamiętaj, aby wysterylizować wszystkie narzędzia chirurgiczne za pomocą np. sterylizatora z kulkami szklanymi. Następnie przygotuj i sprawdź dwa zespoły cewnika balonowego. Do każdego z nich przymocuj jednomililitrową strzykawkę Luer lock wypełnioną zwykłą solą fizjologiczną, a następnie sprawdź, czy nie ma uwięzionych ukośnych za pomocą mechanizmu nadmuchiwania balonu.
Następnie ustaw podkładkę termiczną na platformie operacyjnej na 37 stopni Celsjusza. Następnie zważ królika. Następnie wstrzyknij buprenorfinę i znieczul królika za pomocą 5% izofluoranu w ilości pięciu litrów na minutę przez 10 do 15 minut.
Teraz umieść znieczulonego królika na poduszce grzewczej na platformie chirurgicznej. Zamocuj czujniki, aby monitorować temperaturę i oddech królika oraz zbierać elektrokardiogramy. Następnie załóż maskę na twarz, aby dostarczyć 4% izofluoranu w ilości 2,5 litra na minutę.
Następnie potwierdź odpowiedni poziom znieczulenia, badając się pod kątem utraty wymiotów i drobnych odruchów. Powszechnie rozluźnione napięcie mięśniowe jest również wskaźnikiem głębokiego znieczulenia. Następnie nałóż maść abtoniczną na oba oczy.
Następnie usuń włosy z obszaru brzusznego tuż pod stawami kolanowymi za pomocą maszynki do strzyżenia włosów zwierzęcych. Następnie usuń luźne włosy i oczyść odsłoniętą skórę trzema naprzemiennymi peelingami z 70% etanolu i betadyny i udrapuj zwierzę, pozostawiając odsłoniętą tylko kończynę dolną. Aby rozpocząć operację, zlokalizuj tętnicę odpiszczelową i wykonaj 1,5-centymetrowe nacięcie.
Następnie za pomocą małych zakrzywionych kleszczyków ostrożnie odsłoń niewielką część tętnicy odpiszczelowej. Uważaj, aby nie uszkodzić żyły udowej lub nerwu udowego. Dokładne oczyszczenie tętnicy jest bardzo ważne podczas tej ekspozycji.
Następnie umieść dwie luźne pętle ligatury pod tętnicą odpiszczelową i zawiąż jedną pętlę ligatury w pobliżu dystalnego końca tętnicy. Następnie umieść zacisk mikronaczyniowy wzdłuż tętnicy powyżej ligatury i zamknij zacisk, aby zatrzymać przepływ krwi. Natychmiast nałóż kroplę papaweryny, aby rozszerzyć tętnicę i zapobiec skurczom fazowym.
Następnie, za pomocą podwiązania, podnieś tętnicę odpiszczelową i wykonaj małe nacięcie arteriotomii za pomocą igły o rozmiarze 24. Następnie podnieś płatki do nacięcia i powoli wprowadź wytrych, wytrych dożylny lub igłę prowadzącą do światła tętnicy. Teraz ostrożnie wprowadź cewnik do embolektomii tętniczej do tętnicy odpiszczelowej.
Bądź delikatny, aby uniknąć pęknięć. Następnie usuń wskazówkę żylną i zwolnij zacisk mikronaczyniowy na tętnicy. Aby spowodować uraz, najpierw przesuń cewnik balonowy do trzeciego znaku.
Powinno to umieścić około dwóch do pięciu centymetrów powyżej rozwidlenia biodrowego. Następnie napompuj balon 0,1 mililitra zwykłej soli fizjologicznej. Teraz przypnij cewnik i pociągnij go do tyłu o sześć centymetrów, obracając go, aby uszkodzić tkankę.
Po wycofaniu się opróżnij balon. Aby zapewnić całkowite rozszerzenie śródbłonka, powtórz ten proces jeszcze dwa razy. Następnie wyjmij cewnik i natychmiast zawiąż pętlę ligatury tuż nad miejscem arteriotomii, aby zatrzymać krwawienie.
Następnie nałóż odpowiedni środek antyseptyczny wokół perforacji rany i usuń skrzepy krwi. Na koniec zamknij nacięcie skóry i zdezynfekuj miejsce operacji roztworem jodu powidonu. Następnie powtórz cały zabieg chirurgiczny na przeciwległej tętnicy biodrowej za pomocą drugiego cewnika.
Po zabiegu należy najpierw oczyścić maść abtoniczną z boków królika. Następnie należy podać sulfadoksynę i trimetoprim. Następnie przenieś królika z podkładką do nagłówka do czystej klatki regeneracyjnej oraz plastra monitorującego i klipsów.
Gdy zwierzę odzyska zewnętrzną pozycję leżącą i zacznie się poruszać, wróć do klatki domowej. W celu leczenia bólu należy podać buprenorfinę. Teraz zacznij karmić zwierzę na diecie miażdżycowej tak długo, jak to konieczne.
Aby zebrać wczesny cienki len, dwa lub cztery tygodnie po operacji, najpierw znieczul królika, a następnie poddaj go eutanazji za pomocą nacięcia międzykardynalnego. Następnie otwórz brzuch i odsłoń zaotrzewnową. Następnie prześledź aortę w kierunku rozwidlenia biodrowego i zawiąż ją powyżej rozwidlenia.
Następnie ostrożnie usuń otaczające tkanki i wyizoluj obie tętnice biodrowe. Teraz wypreparuj obie tętnice i zanurz je w lodowatym PBS. Następnie usuń skrzepy za pomocą kleszczy i podziel każdą tętnicę na 46 segmentów.
Następnie natychmiast zanurz segmenty w formie zawierającej związek OCT i zatrzaskowo zamroź tkanki w ciekłym azocie. Przechowuj tkanki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, a następnie wybarwij skrawki o grubości pięciu mikronów przy użyciu standardowej metodologii. Balonowe uszkodzenie tętnic biodrowych zostało przeprowadzone pomyślnie bez komplikacji w czasie krótszym niż godzina.
Królik wyzdrowiał w ciągu godziny i/lub wyglądał na zdrowy bez znacznej utraty wagi. Nie stwierdzono powikłań pooperacyjnych. Po czterech tygodniach diety miażdżycowej wszystkie króliki miały hipercholesterolemię.
Połączenie urazu balonu i diety cholesterolowej spowodowało zmiany strukturalne w ścianie naczynia, które doprowadziły do rozwoju plax miażdżycowej w ciągu dwóch tygodni. Nieuszkodzone i uszkodzone przez balon tętnice biodrowe wyizolowano od tego samego zwierzęcia i porównano. Len charakteryzował się naciekaniem lipidów, a także migracją i proliferacją dźwięków mięśni gładkich.
Len nadal rośnie w uszkodzonych naczyniach, podczas gdy rozmiar światła nadal się zmniejsza. Wynikające z tego zmiany były bardzo wyraźne przez cztery tygodnie. Po dwóch i czterech tygodniach kwantyfikacja morfometryczna ujawniła zwiększoną grubość błony wewnętrznej środkowej, zwiększoną powierzchnię płytki nazębnej, zmniejszoną powierzchnię światła i wreszcie zwiększoną akumulację lipidów.
Barwienie przeciwciałem alfa aktyny mięśni gładkich reaguje z aktyną mięśniową, identyfikując w ten sposób komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych. Podczas barwienia więcej 11 przeciwciał monoklonalnych ujawnia cytoplazmę makrofagów. Razem plamy ujawniają stopień, w jakim zarówno komórki mięśni gładkich, jak i makrofagi namnażają się w blaszkę miażdżycową w uszkodzonych naczyniach.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć bezpieczeństwo samochodowe i łatwo wykonać gwałtowne obrażenia na tętnicach biodrowych królika. To uszkodzenie przy diecie miażdżycowej powoduje rozwój blaszki miażdżycowej w tętnicach biodrowych w jednorodny w czasie.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę wywołania blaszek miażdżycowych u królików poprzez chirurgiczne uszkodzenie śródbłonka ich lewej tętnicy biodrowej i karmienie ich dietą miażdżycową. Tętnica biodrowa została wybrana ze względu na jej podobieństwo do ludzkiej tętnicy wieńcowej, co czyni ją odpowiednim modelem do badania rozwoju blaszek.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Miażdżyca
- Modele zwierzęce
- Badania nad układem krążenia
Tło
- Miażdżyca jest jedną z głównych przyczyn śmierci w krajach uprzemysłowionych.
- Rozumienie formowania się blaszek jest kluczowe dla opracowywania strategii zapobiegania.
- Królicza tętnica biodrowa służy jako odpowiedni model ze względu na jej anatomiczne podobieństwa do ludzkich tętnic wieńcowych.
- Celem tego badania jest ocena wpływu wywołanej miażdżycy na różne punkty końcowe.
Cel badania
- Wywołanie blaszek miażdżycowych u królików w celach badawczych.
- Zbadanie mechanizmów rozwoju i pękania blaszek.
- Ocena skuteczności nowych urządzeń terapeutycznych i interwencji.
Stosowane metody
- Chirurgiczne uszkodzenie śródbłonka w lewej tętnicy biodrowej.
- Karmienie królików dietą miażdżycową, aby promować tworzenie się blaszek.
- Porównanie składu blaszek w tętnicy biodrowej z blaskami w aorcie.
- Ocena punktów końcowych morfometrycznych i angiograficznych za pomocą komercyjnie produkowanych urządzeń.
Główne wyniki
- Udane wywołanie blaszek miażdżycowych w modelu królika.
- Demonstracja procedury przez Aurelien Frobert.
- Porównanie charakterystyki blaszek między tętnicami biodrowymi a aortalnymi.
- Wgląd w potencjalne działania terapeutyczne w miażdżycy.
Wnioski
- Królicza tętnica biodrowa jest wartościowym modelem do badania miażdżycy.
- Ta metoda może pomóc w ewaluacji nowych terapii w zarządzaniu blaszkami.
- Wymagane są dalsze badania, aby zbadać konsekwencje tych wyników.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
The rabbit iliac artery balloon injury model accelerates atherosclerotic plaque development, enabling rapid assessment of therapeutic interventions within a two-week timeframe. This approach supports target validation and mechanistic de-risking in cardiovascular drug discovery by providing a reproducible, disease-relevant system that mimics human coronary pathology. The model enhances predictive confidence in preclinical studies by delivering quantifiable morphometric and angiographic endpoints for evaluating drug efficacy and safety.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by inducing controlled endothelial injury and lipid accumulation in a clinically relevant arterial bed.
- Operational Value: Provides a standardized, reproducible method for generating consistent atherosclerotic lesions to support target engagement studies.
- Strategic Value: Accelerates target validation timelines, allowing rapid go/no-go decisions based on plaque morphology and biomarker expression.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable plaque metrics such as intima-media thickness, lipid area, and macrophage infiltration for assay readout standardization.
- Operational Value: Delivers high-success-rate lesion formation with low mortality, supporting scalable screening campaigns.
- Strategic Value: Facilitates assay readiness for evaluating drug effects on plaque stabilization, inflammation, and lipid accumulation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Offers a disease-relevant system with human-like plaque composition, including smooth muscle cell proliferation and macrophage-derived foam cells.
- Operational Value: Enables longitudinal monitoring of plaque progression via morphometric quantification at defined intervals (e.g., two and four weeks).
- Strategic Value: Supports translational biomarker alignment by correlating lesion characteristics with therapeutic response.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the cardiovascular discovery continuum, supporting early target validation through to preclinical efficacy assessment by providing a rapid, quantifiable atherosclerosis model.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of atherogenic pathways via inducible, time-dependent plaque formation in the iliac artery.
- Screening: Enables standardized compound evaluation through reproducible lesion development and measurable endpoints like lumen area reduction and intimal thickening.
- Analytics: Provides morphometric and angiographic outputs (e.g., plaque area, lipid accumulation) that allow objective comparison across treatment groups.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by modeling human coronary-like pathology and enabling assessment of device or drug effects on plaque composition.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative testing of cardiovascular therapeutics across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers mechanistic insight into plaque development pathways, reducing ambiguity in target validation.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization through defined surgical and dietary protocols with high success rates.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by accelerating preclinical timelines and reducing late-stage failure risk through early biological de-risking.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on plaque-modifying effects and safety profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent vascular surgery, anesthesia, and postoperative care.
- Dependent on access to balloon catheters, surgical platforms, and imaging or histology infrastructure for endpoint analysis.
- Necessitates standardization across teams for consistent injury length, diet duration, and tissue processing.
- Adaptation considerations include species-specific lipid metabolism and differences in plaque composition compared to human disease.
- Practical limitations include the two-week induction window, which may not capture chronic plaque complexity or calcification seen in advanced human atherosclerosis.
