Króliczy model przyspieszonej miażdżycy: perspektywa metodologiczna uszkodzenia balonika tętnicy biodrowej
3 października 2017
Zwierzęce modele miażdżycy są niezbędne do zrozumienia mechanizmu i zbadania nowszych metod zapobiegania rozwojowi lub pękaniu płytki nazębnej, głównej przyczynie zgonów w uprzemysłowionym świecie. Protokół ten wykorzystuje połączenie uszkodzenia balonu i diety bogatej w cholesterol w celu wywołania blaszek miażdżycowych w tętnicy biodrowej królika.
Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie tworzenia się blaszek miażdżycowych u królików poprzez chirurgiczne uszkodzenie śródbłonka ich lewych tętnic biodrowych oraz podawanie im diety aterogennej. Samowystarczalne uszkodzenie u królików jest często przeprowadzane w aorcie w celu badania składu blaszki miażdżycowej. Jednakże tętnica biodrowa jest bardzo podobna do ludzkiej tętnicy wieńcowej, co czyni ją atrakcyjnym miejscem do modelowania blaszek miażdżycowych.
Jednorodność zmian w obrębie tkanki mięśniowej, aktywność czynników tkankowych oka oraz spójne wymiary naczyń w tętnicy biodrowej wewnętrznej królika są porównywalne z parametrami tętnicy wieńcowej człowieka. W konsekwencji umożliwia to ocenę komercyjnie produkowanych urządzeń pod kątem punktów końcowych morfometrycznych i angiograficznych. Procedurę zaprezentuje Aurelien Frobert, współpracownik z mojego laboratorium.
Należy upewnić się, że wszystkie narzędzia chirurgiczne zostały wysterylizowane, na przykład za pomocą sterylizatora koralikowego. Następnie należy przygotować i sprawdzić dwa zestawy cewników balonowych. Do każdego z nich należy przymocować strzykawkę 1 mL z końcówką Luer-lock wypełnioną solą fizjologiczną, a następnie sprawdzić obecność pęcherzyków powietrza za pomocą mechanizmu pompowania balonu.
Następnie ustaw temperaturę podkładki termicznej na platformie chirurgicznej na 37 °C. Potem zważ królika. Następnie podaj zastrzyk buprenorfiny i znieczul królika, stosując 5% isofluran z przepływem pięciu litrów na minutę przez 10 do 15 minut.
Teraz należy umieścić znieczulonego królika na macie grzewczej na platformie chirurgicznej. Należy podłączyć czujniki do monitorowania temperatury i oddychania królika oraz do rejestracji elektrokardiogramów. Następnie należy założyć maskę twarzową w celu podawania 4% isofluranu z przepływem 2,5 litrów na minutę.
Następnie potwierdź odpowiedni poziom znieczulenia, sprawdzając zanik odruchu wymiotnego i rogówkowego. Wskaźnikiem głębokiej anestezji jest również ogólne rozluźnienie napięcia mięśniowego. W kolejnym kroku nanieś maść antybiotykową do obu oczu.
Następnie, za pomocą maszynki do strzyżenia zwierząt, usuń owłosienie z obszaru brzusznego tuż poniżej stawów kolanowych. Po tym usuń luźną sierść i oczyść odsłoniętą skórę, wykonując naprzemiennie trzy przemycia 70% ethanol oraz betadyną, a następnie odizoluj zwierzę sterylnymi obłożeniami, pozostawiając odsłoniętą jedynie kończynę dolną. Aby rozpocząć zabieg chirurgiczny, zlokalizuj tętnicę odpiszczelową i wykonaj nacięcie o długości 1,5 centymetra.
Następnie, używając małych zakrzywionych pęsety, ostrożnie odsłoń niewielki odcinek tętnicy saphénous. Należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić żyły udowej ani nerwu udowego. Podczas tego odsłaniania bardzo ważne jest dokładne oczyszczenie tętnicy.
Następnie umieść dwie luźne pętle ligatury pod tętnicą odpiszczelową i zawiąż jedną pętlę ligatury w pobliżu dystalnego końca tętnicy. Następnie umieść mikro clamp naczyniowy wzdłuż tętnicy powyżej ligatury i zamknij clamp, aby zatrzymać przepływ krwi. Natychmiast nanieś kroplę papaweryny, aby rozszerzyć tętnicę i zapobiec skurczom naczyń.
Następnie, używając ligatury, unieś tętnicę odpiszczelową i wykonaj niewielkie nacięcie tętnicy (arteriotomię) za pomocą igły 24 G. Następnie unieś brzegi nacięcia i powoli wprowadź zgłębnik do żył lub igłę prowadzącą do światła tętnicy. Teraz ostrożnie wprowadź cewnik do embolektomii tętniczej do tętnicy odpiszczelowej.
Postępuj delikatnie, aby uniknąć powstania pęknięć. Następnie wyjmij zgłębnik do żyły i zwolnij zacisk mikronaczyniowy na tętnicy. Aby wywołać uraz, najpierw wprowadź cewnik balonowy do trzeciej kreski.
Powinno to umieścić cewnik około dwóch do pięciu centymetrów powyżej rozwidlenia tętnic biodrowych. Następnie należy napompować balon 0,1 mililitra soli fizjologicznej. Teraz należy zacisnąć cewnik i cofnąć go o sześć centymetrów, obracając go w celu uszkodzenia tkanki.
Po wycofaniu, spuść powietrze z balonu. Aby zapewnić całkowite rozszerzenie śródbłonka, powtórz ten proces jeszcze dwukrotnie. Następnie usuń cewnik i niezwłocznie zawiąż pętlę ligatury tuż powyżej miejsca arteriotomii, aby zatamować krwawienie.
Następnie należy zastosować odpowiedni środek antyseptyczny wokół otworu rany i usunąć skrzepy krwi za pomocą gazika. Na koniec zamknąć nacięcie skóry i zdezynfekować miejsce operacyjne roztworem powidonu z jodem. Następnie powtórzyć całą procedurę chirurgiczną na przeciwległej tętnicy biodrowej, używając drugiego cewnika.
Po zabiegu w pierwszej kolejności należy oczyścić boki królika z maści abtonicznej. Następnie należy podać sulfadoksynę i trimetoprim. Po tym królika wraz z podkładką pod głowę należy przenieść do czystej klatki pooperacyjnej, zakładając plaster monitorujący i klipsy.
Gdy zwierzę odzyska zdolność do pionizacji i zacznie się poruszać, należy przenieść je z powrotem do klatki macierzystej. W celu uśmierzenia bólu należy podać buprenorfinę. Następnie należy rozpocząć karmienie zwierzęcia dietą aterogenną przez wymagany czas.
Aby pobrać wczesny cienki len, od dwóch do czterech tygodni po zabiegu, należy najpierw zznieczulić królika, a następnie poddać go eutanazji poprzez nacięcie międzysercowe. Następnie należy otworzyć jamę brzuszną i odsłonić przestrzeń zaotrzewnową. Potem należy odnaleźć aortę w kierunku rozwidlenia biodrowego i podwiązać ją powyżej rozwidlenia.
Następnie należy ostrożnie usunąć otaczające tkanki i wyizolować obie tętnice biodrowe. Teraz należy wypreparować obie tętnice i zanurzyć je w lodowatym PBS. Następnie, używając pęsety, należy usunąć skrzepy i podzielić każdą tętnicę na 46 segmentów.
Następnie niezwłocznie osadź segmenty w formie zawierającej związek OCT i zamroź tkanki gwałtownie w ciekłym azocie. Przechowuj tkanki w temperaturze -80 °C, a następnie zabarw przekroje o grubości 5 µm zgodnie ze standardową metodologią. Uszkodzenie balonowe tętnic biodrowych zostało przeprowadzone pomyślnie i bez powikłań w czasie krótszym niż godzina.
Króliki powróciły do pełnej sprawności w ciągu jednej godziny i/lub wydawały się zdrowe, bez znaczącej utraty masy ciała. Nie wystąpiły żadne powikłania pooperacyjne. Po czterech tygodniach diety aterogennej u wszystkich królików stwierdzono hipercholesterolemię.
Połączenie urazu balonowego i diety cholesterolowej doprowadziło do zmian strukturalnych w ścianie naczynia, co w ciągu dwóch tygodni skutkowało rozwojem blaszek miażdżycowych. Porównano tętnice biodrowe nieuszkodzone i uszkodzone balonowo, wyizolowane z tego samego zwierzęcia. Blaszki charakteryzowały się infiltracją lipidów, a także migracją i proliferacją komórek mięśni gładkich.
Len terus xuyên rosnąć w uszkodzonych naczyniach, podczas gdy rozmiar światła naczynia nadal się zmniejszał. Wynikowe zmiany były bardzo wyraźne po czterech tygodniach. Po dwóch i czterech tygodniach kwantyfikacja morfometryczna wykazała zwiększoną grubość kompleksu intima-media, zwiększoną powierzchnię blaszki miażdżycowej, zmniejszoną powierzchnię światła naczynia, a ostatecznie zwiększoną akumulację lipidów.
Barwienie przeciwciałem przeciwko alfa-aktynie mięśni gładkich reaguje z aktyną mięśniową, identyfikując w ten sposób komórki mięśni gładkich naczyń. Z kolei barwienie przeciwciałem monoklonalnym CD11 ujawnia cytoplazmę makrofagów. Razem oba barwienia pokazują stopień, w jakim komórki mięśni gładkich oraz makrofagi proliferują w blaszkę miażdżycową w uszkodzonych naczyniach.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać odpowiednią wiedzę z zakresu bezpieczeństwa oraz być w stanie bez trudności przeprowadzić wywołanie urazu gwałtownego w tętnicach biodrowych królika. Uraz ten, w połączeniu z dietą aterogenną, prowadzi do jednorodnego w czasie rozwoju blaszek miażdżycowych w tętnicach biodrowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę indukowania blaszek miażdżycowych u królików poprzez chirurgiczne uszkodzenie śródbłonka ich lewej tętnicy biodrowej oraz podawanie diety aterogennej. Wybór tętnicy biodrowej wynika z jej podobieństwa do ludzkiej tętnicy wieńcowej, co czyni ją odpowiednim modelem do badania rozwoju blaszek miażdżycowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Miażdżyca
- Modele zwierzęce
- Badania nad układem sercowo-naczyniowym
Wstęp
- Miażdżyca jest główną przyczyną zgonów w krajach uprzemysłowionych.
- Zrozumienie procesu tworzenia się blaszki miażdżycowej jest kluczowe dla opracowania strategii zapobiegawczych.
- Tętnica biodrowa królika stanowi odpowiedni model ze względu na podobieństwa anatomiczne do ludzkich tętnic wieńcowych.
- Celem niniejszego badania jest ocena wpływu indukowanej miażdżycy na różne punkty końcowe.
Cel badania
- W celu indukowania blaszek miażdżycowych u królików na potrzeby badawcze.
- W celu zbadania mechanizmów powstawania i pękania blaszek miażdżycowych.
- W celu oceny skuteczności nowych urządzeń terapeutycznych i interwencji.
Zastosowane metody
- Chirurgiczne uszkodzenie śródbłonka w lewej tętnicy biodrowej.
- Karmienie królików dietą aterogenną w celu promowania powstawania blaszki miażdżycowej.
- Porównanie składu blaszki w tętnicy biodrowej ze składem blaszki w aorcie.
- Ocena punktów końcowych morfometrycznych i angiograficznych przy użyciu urządzeń produkowanych komercyjnie.
Główne wyniki
- Skuteczna indukcja blaszek miażdżycowych w modelu królika.
- Prezentacja procedury przeprowadzona przez Aureliena Froberta.
- Porównanie charakterystyki blaszek w tętnicach biodrowych i aorcie.
- Analiza potencjału interwencji terapeutycznych w miażdżycy.
Wnioski
- Tętnica biodrowa królika jest cennym modelem do badania miażdżycy.
- Ta metoda może pomóc w ocenie nowych sposobów leczenia w celu kontroli blaszki miażdżycowej.
- Dalsze badania są niezbędne, aby zgłębić znaczenie tych wyników.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Model uszkodzenia balonowego tętnicy żylnej królika przyspiesza rozwój blaszki miażdżycowej, umożliwiając szybką ocenę interwencji terapeutycznych w ciągu dwóch tygodni. Podejście to wspiera walidację celów i ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesie odkrywania leków sercowo-naczyniowych, zapewniając powtarzalny, istotny chorobowo system, który naśladuje ludzką patologię tętnic wieńcowych. Model ten zwiększa pewność prognostyczną w badaniach przedklinicznych, dostarczając mierzalnych punktów końcowych morfometrycznych i angiograficznych do oceny skuteczności i bezpieczeństwa leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez indukowanie kontrolowanego uszkodzenia śródbłonka i akumulacji lipidów w klinicznie istotnym łożysku tętniczym.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowaną, powtarzalną metodę generowania spójnych zmian miażdżycowych w celu wsparcia badań nad angażowaniem celu terapeutycznego.
- Wartość strategiczna: Przyspiesza harmonogram walidacji celów, umożliwiając szybkie podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) na podstawie morfologii blaszki miażdżycowej i ekspresji biomarkerów.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje mierzalne parametry blaszki miażdżycowej, takie jak grubość kompleksu intima-media, obszar lipidowy i naciek makrofagów, w celu standaryzacji odczytów testowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia wysoką skuteczność powstawania zmian przy niskiej śmiertelności, co umożliwia prowadzenie skalowalnych kampanii przesiewowych.
- Wartość strategiczna: Ułatwia przygotowanie testów do oceny wpływu leków na stabilizację blaszki, stan zapalny oraz akumulację lipidów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Oferuje system istotny z punktu widzenia choroby z ludzkim składem blaszki miażdżycowej, obejmujący proliferację komórek mięśni gładkich oraz pochodzące z makrofagów komórki piankowe.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podłużne monitorowanie progresji blaszki poprzez kwantyfikację morfometryczną w określonych odstępach czasu (np. po dwóch i czterech tygodniach).
- Wartość strategiczna: Wspiera translacyjne dopasowanie biomarkerów poprzez korelację charakterystyki zmian z odpowiedzią terapeutyczną.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten wpisuje się w kontinuum odkryć w dziedzinie układu sercowo-naczyniowego, wspierając proces od wczesnej walidacji celu po przedkliniczną ocenę skuteczności, dzięki zapewnieniu szybkiego i mierzalnego modelu miażdżycy.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących szlaków aterogennych poprzez indukowalne, zależne od czasu tworzenie się blaszki w tętnicy biodrowej.
- Przesiewanie: Umożliwia standaryzowaną ocenę związków dzięki powtarzalnemu rozwojowi zmian i mierzalnym punktom końcowym, takim jak zmniejszenie powierzchni światła naczynia i pogrubienie intimy.
- Analityka: Dostarcza wyników morfometrycznych i angiograficznych (np. powierzchnia blaszki, akumulacja lipidów), które pozwalają na obiektywne porównanie grup badawczych.
- Badania translacyjne: Łączy z walidacją przedkliniczną poprzez modelowanie patologii przypominającej ludzką chorobę wieńcową i umożliwianie oceny wpływu urządzeń lub leków na skład blaszki.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę do iteracyjnego testowania terapeutyków sercowo-naczyniowych w wielu projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Dostarcza wglądu w mechanizmy szlaków rozwoju blaszek miażdżycowych, zmniejszając niejednoznaczność w walidacji celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność i standaryzację dzięki zdefiniowanym protokołom chirurgicznym i żywieniowym o wysokim wskaźniku sukcesu.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez przyspieszenie harmonogramów przedklinicznych i redukcję ryzyka niepowodzenia w późnych etapach dzięki wczesnej biologicznej ocenie ryzyka.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów w oparciu o dostosowane do ryzyka efekty modyfikujące blaszki oraz profile bezpieczeństwa.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie chirurgii naczyniowej gryzoni, anestezji oraz opieki pooperacyjnej.
- Zależność od dostępu do cewników balonowych, platform chirurgicznych oraz infrastruktury obrazowej lub histologicznej do analizy punktów końcowych.
- Konieczność standaryzacji działań między zespołami w celu zapewnienia spójnej długości uszkodzenia, czasu trwania diety oraz sposobu przetwarzania tkanek.
- Kwestie adaptacyjne obejmują specyficzny dla gatunku metabolizm lipidów oraz różnice w składzie blaszki miażdżycowej w porównaniu z chorobą u ludzi.
- Ograniczenia praktyczne obejmują dwutygodniowy okres indukcji, który może nie oddawać złożoności przewlekłej blaszki miażdżycowej lub zwapnień obserwowanych w zaawansowanej miażdżycy u ludzi.
