Wysoce czułe i ilościowe wykrywanie białek i ich izoform metodą kapilarnego ogniskowania izoelektrycznego
September 19th, 2018
Ogniskowanie izoelektryczne kapilarne to oparta na przeciwciałach, ultraczuła, wysokoprzepustowa technika, umożliwiająca szczegółową charakterystykę białek i ich izoform z bardzo małych próbek biologicznych. Poniżej opisano protokół wykrywania i oznaczania ilościowego określonych białek i ich izoform w sposób zautomatyzowany i zrobotyzowany.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań biomedycznych, takich jak odkrywanie biomarkerów, odkrywanie leków, diagnostyka i badania przesiewowe leków lub przeciwciał. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona wysokoprzepustowa i może wykrywać izoformy białek w wysoce powtarzalny sposób. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku diagnozowania wielu chorób, ponieważ może ona mierzyć dotknięte białka lub ich izoformy.
Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w szlaki sygnalizacji komórkowej, może być również stosowana w innych systemach, w których należy analizować określone białka. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy testu są trudne do nauczenia się ze względu na sztuczki, takie jak usuwanie pęcherzyków, ładowanie płytki i tak dalej. Najpierw przygotuj mieszaninę rozcieńczalników do próbek, dodając jeden mikrolitr mieszaniny inhibitorów DMSO i dwa mikrolitry inhibitorów proteazy do 47 mikrolitrów rozcieńczalnika próbki, tak aby końcowe stężenie DMSO i inhibitorów proteazy wynosiło jeden X.Rozcieńczyć wcześniej wyizolowane lizaty białkowe za pomocą mieszanki rozcieńczalników próbki, aby uzyskać pożądane stężenia.
Następnie dodaj 3,325 mikrolitra standardowej drabiny, sześć mikrolitrów inhibitora proteazy i trzy mikrolitry inhibitora DMSO do 137,675 mikrolitrów premiksu antolitowego. Wirować próbkę przez co najmniej 15 sekund i trzymać na lodzie. Wymieszaj dwa przygotowane roztwory w stosunku jeden do trzech, tak aby końcowe stężenia inhibitorów proteazy DMSO i drabiny wzorca izoelektrycznego punktu wynosiły jeden X, a białka w kapilarze osiągnęły końcowe pożądane stężenia.
Po dodaniu białek do mieszaniny próbek, wszystkie etapy zostaną wykonane na lodzie lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umieść 384-dołkową płytkę na lodzie. Załaduj dziesięć mikrolitrów mieszanki próbek do odpowiedniego dołka płytki, zgodnie z układem szablonu testowego zaprojektowanym za pomocą oprogramowania zautomatyzowanego systemu Western blotting.
Następnie rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe rozcieńczalnikiem przeciwciał. Następnie należy wprowadzić pipetę do każdej studzienki z dziesięciu mikrolitrów przeciwciał pierwszorzędowych i 15 mikrolitrów przeciwciał drugorzędowych. Następnie wymieszaj luminol i nadtlenek XDR w stosunku jeden do jednego.
Odpipetować 15 mikrolitrów nadtlenku luminolu wymieszać z każdym dołkiem. Po dodaniu próbek i reagantów do płytki odwirować przez dziesięć minut w temperaturze 2500 razy G i czterech stopniach Celsjusza, aby odwirować ciecz i usunąć pęcherzyki. Jeśli bąbelki nadal istnieją, usuń je ręcznie za pomocą cienkiej końcówki pipety.
Otwórz oprogramowanie zautomatyzowanego systemu Western blotting i kliknij nowy'z menu plików. Przejdź do panelu układu i przypisz lokalizacje dla reagantów i próbek w płytce 384-dołkowej. Wykonaj trafne przypisanie, klikając studnię w dowolnym miejscu bloku.
Wybierz blok wiersza z 12 dołkami każdy. Następnie przejdź do paska narzędzi panelu układu i wstaw blok wiersza próbki, podstawowego, wtórnego lub luminolu. Przejdź do okienka protokołu i wybierz lokalizację reaganta na tablicy.
Następnie kliknij komórkę w przykładowej kolumnie i wybierz reagant z menu rozwijanego. W ten sam sposób wybierz lokalizacje reagantów dla podstawowego, wtórnego i luminolu dla każdego cyklu. Kliknij komórki pojedynczo w kolumnie przeciwciał pierwszorzędowych lub drugorzędowych i w razie potrzeby zmień czasy inkubacji.
Następnie dodaj cykle, klikając przycisk Dodaj'przycisk w sekcji protokołu. W okienku szablonu wprowadź informacje dotyczące próbki, takie jak tożsamość przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych, ich numery katalogowe i rozcieńczenia. Zapisz nowy plik testu.
Zanim klikniesz przycisk Start, szybko sprawdź układ, aby upewnić się, że wszystko jest poprawne. Teraz kliknij start'aby rozpocząć bieg. Oprogramowanie poprosi użytkownika o usunięcie odpadów, ponowne napełnienie pojemnika na wodę i kapilary, dodanie anolitu i katolitu do tacy zasobów, dodanie buforu do płukania i załadowanie płytki do schłodzonej tacki na próbki.
Pasek stanu instrumentu zostanie wyświetlony na ekranie komputera kilka minut po rozpoczęciu biegu. Kliknij na podsumowanie przebiegu'ekran, aby wyświetlić panele stanu i separacji. Aby obserwować separację metodą elektroforezy w kapilarze, odtwórz film z separacją dla tej kapilary, klikając żądany cykl, a następnie klikając przycisk odtwarzania na panelu sterowania.
Otwórz plik uruchamiania i wybierz zakładkę ekranu analizy. Kliknij edytuj, a następnie analizę, aby zmienić zakres punktów izoelektrycznych. Zastosuj odpowiedni wzorzec punktu izoelektrycznego.
Dodaj dopasowanie szczytowe i dodaj nazwę szczytu. Na koniec wybierz dane do użycia w zakładce piki i wyeksportuj dane do dalszej analizy. Pokazano tutaj elektroferogram fosforylowanych kinaz regulowanych sygnałem zewnątrzkomórkowym z lizatów stymulowanych czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyniowego.
Obserwuje się bardzo wysoką indukcję fosforylowanych białek za pomocą czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego. Wstawka przedstawia endogenną kontrolę obciążenia, HSP 70, wskazującą na podobne obciążenie próbek zarówno dla próbek niepoddanych obróbce, jak i poddanych obróbce. W konwencjonalnym immunoblocie wykryto tylko dwa prążki, mimo że fosforylowane białka kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym zostały rozłożone na cztery piki za pomocą kapilarnej analizy ogniskowania izoelektrycznego.
Przedstawiono tutaj elektroferogram kinaz regulowanych sygnałem zewnątrzkomórkowym z lizatów stymulowanych czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyniowego. Wstawka pokazuje tę samą kontrolkę ładowania, która jest używana równolegle. Konwencjonalny immunoblot pokazuje tylko dwa prążki odpowiadające kinazie regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym jeden i kinazie regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym drugiej.
Natomiast przy ogniskowaniu izoelektrycznym kapilary, białka kinazy regulowane sygnałem zewnątrzkomórkowym zostały rozłożone na sześć pików, odpowiadających wszystkim czterem różnym pikom fosforylowanym i dwóm pikom nieufosforylowanym. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu kilku godzin, w zależności od liczby cykli, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o stosowaniu wyższych stężeń przeciwciał w porównaniu z konwencjonalnymi immunoblotami.
Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy testu są trudne do nauczenia się ze względu na sztuczki, takie jak usuwanie pęcherzyków, ładowanie płytki itp. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zaprojektować test, przygotować próbki, uruchomić test i przeanalizować dane, aby obserwować różne izoformy białka.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Kapilarny izoelektryczny focusing jest przeciwciało-opartym, ultrawrażliwym techniką charakteryzacji białek i ich izoform z małych próbek biologicznych. Ten protokół umożliwia zautomatyzowane wykrywanie i ilościowe określenie określonych białek.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biotechnologia
- Proteomika
- Badania biomedyczne
Tło
- Wysokowydajna technika analizy białek.
- Przydatna w odkrywaniu biomarkerów i leków.
- Może mierzyć otoczone białka w diagnostyce chorób.
- Wymaga starannego postępowania, aby uniknąć błędów w badaniu.
Cel badania
- Dostarczyć szczegółowy protokół do analizy izoform białek.
- Aby poprawić powtarzalność w wykrywaniu białek.
- Aby ułatwić wgląd w ścieżki sygnalizacyjne komórek.
Zastosowane metody
- Przygotowanie mieszanki rozcieńczalnika próbki z DMSO i inhibitorami proteazy.
- Rozcieńczanie izolowanych lizatów białkowych.
- Zautomatyzowane i zrobotyzowane kroki badania.
- Demonstracja wizualna, aby ułatwić naukę techniki.
Główne wyniki
- Wysokowydajna zdolność do wykrywania izoform białek.
- Powtarzalność w pomiarach między próbkami.
- Potencjalne zastosowania w diagnostyce i przesiewowym badaniu leków.
- Wgląd w specyficzną analizę białek w różnych systemach.
Wnioski
- Kapilarny izoelektryczny focusing jest cennym narzędziem w badaniach biomedycznych.
- Może znacząco pomóc w rozpoznawaniu chorób.
- Pomocne wizualne narzędzia są kluczowe dla opanowania techniki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Capillary isoelectric focusing (cIEF) addresses the discovery-stage challenge of detecting low-abundance protein isoforms from limited biological samples, such as tissue biopsies, with high sensitivity and reproducibility. By enabling quantitative, high-throughput analysis of protein charge variants, the method enhances predictive confidence in target validation and supports early go/no-go decisions in drug development pipelines. Its automation and minimal sample requirements reduce technical variability, improving data reliability for portfolio triage and mechanistic de-risking in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by resolving protein isoforms based on isoelectric point, clarifying post-translational modifications relevant to disease mechanisms.
- Operational Value: Supports functional target validation through reproducible detection of phosphorylated and unphosphorylated protein states in cell-signaling pathways.
- Predictive Value: Facilitates predictive confidence by quantifying isoform-specific expression changes in response to stimuli, such as vascular endothelial growth factor, aiding in pathway clarification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating quantitative electropherograms that can be analyzed for peak area and isoform ratios.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through automated capillary-based separation and chemiluminescent detection, minimizing manual variability.
- Scalability: Enables high-throughput screening of 96 samples per run, supporting scalable compound or antibody evaluation in drug discovery campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discusses disease relevance by measuring affected proteins or their isoforms, such as phosphorylated ERK, linking discovery to diagnostic applications.
- Preclinical Alignment: Describes continuity from discovery through preclinical validation by providing reproducible, quantitative data on protein modification states across experimental conditions.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports advancement decisions by delivering sensitive, reproducible measurements in the picogram range, reducing false negatives in low-sample scenarios.
Pipeline & Workflow Integration
Positioned within the discovery continuum, capillary isoelectric focusing supports hypothesis testing in early discovery, enables assay readiness for screening, and provides quantitative readouts that inform lead identification and preclinical validation stages.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving protein isoforms that conventional immunoblotting fails to detect, such as distinguishing four phosphorylated ERK peaks from two bands.
- Screening: Describes assay readiness through automation, reproducibility, and quantitative outputs, allowing reliable comparison of protein expression across treatment conditions.
- Analytics: Highlights measurements like peak area and electropherogram profiles that enable teams to quantify isoform-specific changes and compare experimental groups.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by enabling detection of disease-affected proteins and isoforms, such as HSP70 loading controls and VEGF-stimulated ERK phosphorylation.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique, due to its automation, standardization, and applicability across multiple targets and sample types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity through isoform-specific detection.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via automated capillary electrophoresis and chemiluminescent detection.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by detecting subtle isoform shifts early in discovery.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on sensitive, quantitative protein isoform data from limited samples.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in protein chemistry, electrophoresis, and immunoassay optimization.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs, including automated Western blotting systems, CCD cameras, and peak analysis software.
- Cross-team standardization requirements for sample preparation, antibody titration, and bubble removal to ensure assay consistency.
- Adaptation considerations across model systems, such as adjusting antibody concentrations and isoelectric point ranges for different protein targets.
- Practical limitations include the need for careful bubble removal, precise reagent mixing, and visual training due to assay complexity, as noted in the transcript.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:00
Sample Mix Preparation (Calculation for 150 L Sample Mix)
3:03
Designing a New Assay Template with System Software
4:33
Running the Assay File
5:20
Analyze the Data
5:46
Results: Characterization of Extracellular Signal Regulated Kinase Proteins by Capillary Isoelectric Focusing
7:08
Conclusion
