Wysoce czułe i ilościowe wykrywanie białek i ich izoform metodą kapilarnego ogniskowania izoelektrycznego

Ogniskowanie izoelektryczne kapilarne to oparta na przeciwciałach, ultraczuła, wysokoprzepustowa technika, umożliwiająca szczegółową charakterystykę białek i ich izoform z bardzo małych próbek biologicznych. Poniżej opisano protokół wykrywania i oznaczania ilościowego określonych białek i ich izoform w sposób zautomatyzowany i zrobotyzowany.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań biomedycznych, takich jak odkrywanie biomarkerów, odkrywanie leków, diagnostyka i badania przesiewowe leków lub przeciwciał. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona wysokoprzepustowa i może wykrywać izoformy białek w wysoce powtarzalny sposób. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku diagnozowania wielu chorób, ponieważ może ona mierzyć dotknięte białka lub ich izoformy.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w szlaki sygnalizacji komórkowej, może być również stosowana w innych systemach, w których należy analizować określone białka. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy testu są trudne do nauczenia się ze względu na sztuczki, takie jak usuwanie pęcherzyków, ładowanie płytki i tak dalej. Najpierw przygotuj mieszaninę rozcieńczalników do próbek, dodając jeden mikrolitr mieszaniny inhibitorów DMSO i dwa mikrolitry inhibitorów proteazy do 47 mikrolitrów rozcieńczalnika próbki, tak aby końcowe stężenie DMSO i inhibitorów proteazy wynosiło jeden X.Rozcieńczyć wcześniej wyizolowane lizaty białkowe za pomocą mieszanki rozcieńczalników próbki, aby uzyskać pożądane stężenia.

Następnie dodaj 3,325 mikrolitra standardowej drabiny, sześć mikrolitrów inhibitora proteazy i trzy mikrolitry inhibitora DMSO do 137,675 mikrolitrów premiksu antolitowego. Wirować próbkę przez co najmniej 15 sekund i trzymać na lodzie. Wymieszaj dwa przygotowane roztwory w stosunku jeden do trzech, tak aby końcowe stężenia inhibitorów proteazy DMSO i drabiny wzorca izoelektrycznego punktu wynosiły jeden X, a białka w kapilarze osiągnęły końcowe pożądane stężenia.

Po dodaniu białek do mieszaniny próbek, wszystkie etapy zostaną wykonane na lodzie lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umieść 384-dołkową płytkę na lodzie. Załaduj dziesięć mikrolitrów mieszanki próbek do odpowiedniego dołka płytki, zgodnie z układem szablonu testowego zaprojektowanym za pomocą oprogramowania zautomatyzowanego systemu Western blotting.

Następnie rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe rozcieńczalnikiem przeciwciał. Następnie należy wprowadzić pipetę do każdej studzienki z dziesięciu mikrolitrów przeciwciał pierwszorzędowych i 15 mikrolitrów przeciwciał drugorzędowych. Następnie wymieszaj luminol i nadtlenek XDR w stosunku jeden do jednego.

Odpipetować 15 mikrolitrów nadtlenku luminolu wymieszać z każdym dołkiem. Po dodaniu próbek i reagantów do płytki odwirować przez dziesięć minut w temperaturze 2500 razy G i czterech stopniach Celsjusza, aby odwirować ciecz i usunąć pęcherzyki. Jeśli bąbelki nadal istnieją, usuń je ręcznie za pomocą cienkiej końcówki pipety.

Otwórz oprogramowanie zautomatyzowanego systemu Western blotting i kliknij nowy'z menu plików. Przejdź do panelu układu i przypisz lokalizacje dla reagantów i próbek w płytce 384-dołkowej. Wykonaj trafne przypisanie, klikając studnię w dowolnym miejscu bloku.

Wybierz blok wiersza z 12 dołkami każdy. Następnie przejdź do paska narzędzi panelu układu i wstaw blok wiersza próbki, podstawowego, wtórnego lub luminolu. Przejdź do okienka protokołu i wybierz lokalizację reaganta na tablicy.

Następnie kliknij komórkę w przykładowej kolumnie i wybierz reagant z menu rozwijanego. W ten sam sposób wybierz lokalizacje reagantów dla podstawowego, wtórnego i luminolu dla każdego cyklu. Kliknij komórki pojedynczo w kolumnie przeciwciał pierwszorzędowych lub drugorzędowych i w razie potrzeby zmień czasy inkubacji.

Następnie dodaj cykle, klikając przycisk Dodaj'przycisk w sekcji protokołu. W okienku szablonu wprowadź informacje dotyczące próbki, takie jak tożsamość przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych, ich numery katalogowe i rozcieńczenia. Zapisz nowy plik testu.

Zanim klikniesz przycisk Start, szybko sprawdź układ, aby upewnić się, że wszystko jest poprawne. Teraz kliknij start'aby rozpocząć bieg. Oprogramowanie poprosi użytkownika o usunięcie odpadów, ponowne napełnienie pojemnika na wodę i kapilary, dodanie anolitu i katolitu do tacy zasobów, dodanie buforu do płukania i załadowanie płytki do schłodzonej tacki na próbki.

Pasek stanu instrumentu zostanie wyświetlony na ekranie komputera kilka minut po rozpoczęciu biegu. Kliknij na podsumowanie przebiegu'ekran, aby wyświetlić panele stanu i separacji. Aby obserwować separację metodą elektroforezy w kapilarze, odtwórz film z separacją dla tej kapilary, klikając żądany cykl, a następnie klikając przycisk odtwarzania na panelu sterowania.

Otwórz plik uruchamiania i wybierz zakładkę ekranu analizy. Kliknij edytuj, a następnie analizę, aby zmienić zakres punktów izoelektrycznych. Zastosuj odpowiedni wzorzec punktu izoelektrycznego.

Dodaj dopasowanie szczytowe i dodaj nazwę szczytu. Na koniec wybierz dane do użycia w zakładce piki i wyeksportuj dane do dalszej analizy. Pokazano tutaj elektroferogram fosforylowanych kinaz regulowanych sygnałem zewnątrzkomórkowym z lizatów stymulowanych czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyniowego.

Obserwuje się bardzo wysoką indukcję fosforylowanych białek za pomocą czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego. Wstawka przedstawia endogenną kontrolę obciążenia, HSP 70, wskazującą na podobne obciążenie próbek zarówno dla próbek niepoddanych obróbce, jak i poddanych obróbce. W konwencjonalnym immunoblocie wykryto tylko dwa prążki, mimo że fosforylowane białka kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym zostały rozłożone na cztery piki za pomocą kapilarnej analizy ogniskowania izoelektrycznego.

Przedstawiono tutaj elektroferogram kinaz regulowanych sygnałem zewnątrzkomórkowym z lizatów stymulowanych czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyniowego. Wstawka pokazuje tę samą kontrolkę ładowania, która jest używana równolegle. Konwencjonalny immunoblot pokazuje tylko dwa prążki odpowiadające kinazie regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym jeden i kinazie regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym drugiej.

Natomiast przy ogniskowaniu izoelektrycznym kapilary, białka kinazy regulowane sygnałem zewnątrzkomórkowym zostały rozłożone na sześć pików, odpowiadających wszystkim czterem różnym pikom fosforylowanym i dwóm pikom nieufosforylowanym. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu kilku godzin, w zależności od liczby cykli, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o stosowaniu wyższych stężeń przeciwciał w porównaniu z konwencjonalnymi immunoblotami.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy testu są trudne do nauczenia się ze względu na sztuczki, takie jak usuwanie pęcherzyków, ładowanie płytki itp. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zaprojektować test, przygotować próbki, uruchomić test i przeanalizować dane, aby obserwować różne izoformy białka.