Name: Wysoce czułe i ilościowe wykrywanie białek i ich izoform metodą kapilarnego ogniskowania izoelektrycznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Poznaj metodę kapilarnego ogniskowania izoelektrycznego do analizy białek i ich izoform w badaniach biomedycznych. Technika ta umożliwia wykrywanie biomarkerów, odkrywanie leków oraz diagnostykę chorób.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autor dziękuje prof. Lenie Claesson-Welsh, Uniwersytet w Uppsali, Szwecja za jej wsparcie w rozwoju tego projektu. Ponadto autor dziękuje Rossowi Smithowi i Lenie Claesson-Welsh z Uniwersytetu w Uppsali za ich krytyczną lekturę i sugestie dotyczące ulepszenia manuskryptu.

1. Hodowla komórkowa, stymulacja i liza
Uwaga: Ta metoda może być używana z wieloma typami komórek. Dla zobrazowania metody opisano przykład z wykorzystaniem ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC).
<ol>
	<li>Hodowla HUVEC na pokrytych żelatyną, 10 cm szalkach Petriego w pożywce bazowej komórek śródbłonka z odpowiednią suplementacją (patrz Tabela Materiałów), a także zawierająca 5% FCS, naskórkowy czynnik wzrostu (5 ng/ml), czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF: 0,5 ng/ml), zasadowy FGF (10 ng/ml), insulinopodobny czynnik wzrostu (20 ng/ml), hydrokortyzon (0,2 μg/ml) i kwas askorbinowy (1 μg/ml).</li>
	<li>Głodź komórki przez noc za pomocą podłoża podstawnego komórek śródbłonka uzupełnionego 1% FCS i bez suplementu czynnika wzrostu.</li>
	<li>Odessać całą pożywkę, dodać 2 ml pożywki do hodowli komórek śródbłonka bez czynników wzrostu (pożywka głodowa) do jednego naczynia (kontrola), a następnie dodać 50 ng/ml VEGF do 2 ml pożywki do hodowli głodowej w drugim naczyniu na 7 minut.</li>
	<li>Odessać pożywkę i przemyć komórki 2 razy 10 ml PBS o temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Upewnij się, że szalki Petriego znajdują się na lodzie i trzymaj je tam od tego kroku.</li>
	<li>Dodać 250-400 μl lodowatego buforu do lizy (Bicine/CHAPS; patrz tabela materiałów) zawierającego wodną mieszaninę inhibitorów proteazy i mieszaninę inhibitorów DMSO (inhibitory fosfatazy; patrz tabela materiałów) do każdej płytki o długości 10 cm. Zakręć talerzem, aby zapewnić odpowiednie pokrycie i trzymaj go przez 10 minut na lodzie. 
	UWAGA: Końcowe stężenie proteazy i mieszaniny inhibitorów DMSO powinno wynosić 1x.</li>
	<li>Zeskrob komórki z naczynia za pomocą skrobaka do komórek i przenieś do wstępnie schłodzonej probówki do mikrofuge. Pipetuj w górę i w dół 5 razy, aby zlizować komórki.</li>
	<li>Krótko poddać sonikację komórek w temperaturze 4 °C. Ustaw sonikator w następujący sposób: liczba cykli = 5, moc = NISKA, WŁĄCZONA = 5 sekund, WYŁĄCZONA = 30 s. Ten krok ma na celu rozbicie kwasów nukleinowych, a nie lizę komórek. 
	UWAGA: Sonikacja powinna być łagodna, aby zapobiec denaturacji białek.</li>
	<li>Wiruj rurkę przez 5 s (nie w sposób ciągły), 2 s na raz (3 razy) i trzymaj na lodzie.</li>
	<li>Klarować lizat przez odwirowanie przy 14 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, a następnie natychmiast przenieść supernatant do czystej, wstępnie schłodzonej probówki do mikrodymówki.</li>
	<li>Zmierz stężenie białka za pomocą zestawu do oznaczania białek kwasu bicunchoninowego (BCA)4.</li>
	<li>Przygotować 10 μl porcji, zamrozić błyskawicznie w suchym lodzie lub ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
2. Przygotowanie mieszanki próbek (obliczenia dla mieszanki próbek 150 μL)
<ol>
	<li>Najpierw przygotuj mieszaninę rozcieńczalników do próbek, dodając 1 μl mieszaniny inhibitorów DMSO (zapas 50x) i 2 μl inhibitorów proteazy (zapas 25x) do 47 μl rozcieńczalnika do próbki (patrz tabela materiałów), tak aby końcowe stężenie inhibitorów DMSO i inhibitorów proteazy wynosiło 1x. Następnie rozcieńczyć lizaty białkowe za pomocą mieszanki rozcieńczalników do próbek, aby uzyskać pożądane stężenia (patrz krok 2.3).</li>
	<li>Przygotować mieszaninę amfolitu/drabiny/inhibitora proteazy/inhibitora DMSO, dodając 3,325 μl standardowej drabinki (patrz tabela materiałów; zapas 60x), 6 μl inhibitora proteazy (25x), 3 μl inhibitora DMSO (50x) do 137,675 μl premiksu amfolitu (patrz tabela materiałów). Wiruj rurkę przez co najmniej 15 sekund, po 5 sekund na raz (3-4 razy) i trzymaj na lodzie.</li>
	<li>Wymieszaj roztwory z kroków 2.1 i 2.2 w stosunku 1:3, tak aby końcowe stężenia DMSO, inhibitorów proteazy i drabiny standardowej pI osiągnęły 1X, a białka w kapilarze osiągnęły ostateczne pożądane stężenia (np. 50 μg/ml użyto dla <klasa silna = "xfig" >Rysunek 2). 
	UWAGA: Stężenie białka w naczyniach włosowatych i studzienkach jest takie samo.</li>
	<li>Załaduj 10 μl mieszanki próbek do odpowiedniego dołka, zgodnie z układem szablonu do oznaczania płytek 384-dołkowych (patrz krok 3 i <silna klasa="xfig">Rysunek 1) i trzymaj płytkę na lodzie.</li>
	<li>Rozcieńczyć pierwszorzędowy (pERK1/2, 1:50; ERK1/2, 1:100; HSP 70, 1:500) i przeciwciała drugorzędowe (1:300) z rozcieńczalnikiem przeciwciał (patrz tabela materiałów) i odpipetować 10 μl przeciwciał pierwszorzędowych i 15 μl przeciwciał drugorzędowych do każdej studzienki. 
	UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, do testów cIEF wymagane jest wyższe stężenie przeciwciał w porównaniu z konwencjonalnymi zachodnimi plamami.</li>
	<li>Wymieszaj ze sobą Luminol i nadtlenek XDR (w stosunku 1:1; patrz Tabela Materiałów) i odpipetuj 15 μl do każdej studzienki. 
	UWAGA: Mieszaj te roztwory świeże za każdym razem przed użyciem i trzymaj na lodzie.</li>
	<li>Po odpipetowaniu próbek i wszystkich odczynników do płytki, należy odwirować płytkę o stężeniu 2 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu odwirowania cieczy i usunięcia pęcherzyków. Jeśli bąbelki nadal występują, usuń je ręcznie za pomocą cienkiej końcówki pipety. 
	UWAGA: Nie ładuj więcej niż 20 μl próbki lub odczynników na studzienkę; W przeciwnym razie pipety instrumentalnej nie będzie można prawidłowo umyć. Upewnij się, że postępujesz zgodnie z instrukcją obsługi producenta, aby przygotować wszystkie odczynniki.</li>
</ol>
3. Projektowanie nowego szablonu testu za pomocą oprogramowania systemowego (Rysunek 1)
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie systemowe i kliknij "nowy" w menu Plik.</li>
	<li>Przejdź do okienka układu i przypisz lokalizacje odczynników i próbek na płytce 384-dołkowej. Użyć maksymalnie 96 dołków na płytkę 384-dołkową.</li>
	<li>Dokonaj przypisania odczynnika, klikając dołek w dowolnym miejscu bloku. Wybierz blok wiersza z 12 dołkami każdy. Studnie np. z zakresu 1-12 lub 13-24 są domyślnie przypisywane jako blok.</li>
	<li>Przejdź do paska narzędzi panelu układu i wstaw pusty blok wierszy lub blok wiersza próbnego, podstawowego, pomocniczego lub luminolu. Każdy blok ma przypisany inny kolor, dzięki czemu można je łatwo odróżnić. 
	UWAGA: Po kliknięciu studni można zobaczyć czarną ramkę wokół bloku, w którym nowy blok zostanie wstawiony w okienku. Blok wierszy można również usunąć.</li>
	<li>Przejdź do okienka protokołu i wybierz lokalizację odczynnika na tabliczce. Następnie kliknij komórkę w kolumnie próbki i wybierz odczynnik z menu rozwijanego.</li>
	<li>W ten sam sposób wybierz lokalizacje odczynników dla podstawowego, wtórnego i luminolu dla każdego cyklu.</li>
	<li>Kliknij komórki, pojedynczo, w kolumnie przeciwciał pierwszorzędowych lub drugorzędowych i w razie potrzeby zmień czas inkubacji. 
	UWAGA: Można również dodać uwagi do każdego cyklu.</li>
	<li>Dodaj cykle, klikając przycisk "dodaj" w sekcji protokołu. 1 cykl, 4 cykle lub wszystkie cykle (do protokołu można dodać maksymalnie 8 cykli). 
	UWAGA: Możliwe jest skopiowanie i wklejenie informacji o cyklu w tym kroku: wybierz cykl, przejdź do edycji, a następnie skopiuj i wklej.</li>
	<li>Wprowadź informacje dotyczące próbki, takie jak tożsamość przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych, ich numery katalogowe i rozcieńczenia itp., w okienku szablonu. Jest to opcjonalny krok, który jest przydatny podczas analizy po uruchomieniu.</li>
	<li>Zapisz nowy plik testu. Przed kliknięciem przycisku "start" szybko sprawdź układ, aby upewnić się, że wszystko jest poprawne.</li>
</ol>
4. Protokół ustawień przyrządów cIEF
<ol>
	<li>Ustaw warunki separacji kapilarnej izoelektrycznej elektroforezy ogniskowej. Powinny one wynosić 15 000 μW i 40 min, a czas unieruchomienia UV powinien wynosić 80 s. Jednak czas immobilizacji UV można ustawić w zakresie 80-140 s i może być konieczne zoptymalizowanie go pod kątem interesującego białka. 
	UWAGA: Punkt czasowy immobilizacji UV można ustawić dla każdego cyklu, ale nie dla każdej kapilary.</li>
	<li>Ustaw mycie od 1 do 2 prań, przez 150 s każde pranie (domyślnie) i inkubację przeciwciał pierwotnych przez 120 minut.</li>
	<li>Ustaw mycie na 2 do 2 prań, przez 150 s każde mycie (domyślnie) i wtórną inkubację przeciwciał przez 60 minut.</li>
	<li>Ustaw pranie 3, co powinno oznaczać 2 prania, na 150 s każde pranie (domyślnie).</li>
	<li>Ustaw czasy ekspozycji, w których zostanie wykryta chemiluminescencja; powinny to być 30, 60, 120, 240, 490 i 960 s. Wszystkie kroki (1-8) zostaną przeprowadzone w jednej kapilarze.</li>
</ol>
5. Uruchamianie pliku testowego
<ol>
	<li>Gdy wszystko będzie gotowe, kliknij start, aby rozpocząć bieg. Oprogramowanie poprosi Cię o usunięcie odpadów, ponowne napełnienie wody i kapilary, dodanie anolitu i katolitu do tacy zasobów, dodanie bufora do płukania i wreszcie załadowanie płytki do schłodzonej tacki na próbki. 
	UWAGA: Zdejmij pokrywkę z pudełka kapilarnego, ale nie zdejmuj pokrywki z płytki testowej. W razie potrzeby pokrywka z płyty może zostać automatycznie zdjęta przez instrument. Pomaga to zapobiec parowaniu odczynników.</li>
	<li>Kilka minut po rozpoczęciu biegu na ekranie komputera zostanie wyświetlony pasek stanu instrumentu. Komunikaty o stanie i paski postępu są widoczne w zależności od aktualnego etapu instrumentu. 
	UWAGA: Początkowo przyrząd sprawdzi, czy wszystko jest w porządku, zanim przystąpi do pipetowania anolitu i katolitu do tacki separacyjnej, pobrania pierwszego bloku 12 kapilarn, zdjęcia pokrywki płytki i umieszczenia próbek z płytki próbki w kapilarnach, a następnie w komorze separacji w celu elektroforezy.</li>
	<li>Kliknij ekran podsumowania uruchamiania, aby wyświetlić dwa okienka: stan i separacja. Użytkownicy mogą przeglądać postęp przebiegu, a filmy z separacji (12 kapilar każdego cyklu) mogą być przechowywane po zakończeniu etapu elektroforezy każdego cyklu. Aby obserwować separację metodą elektroforezy w kapilarze, odtwórz film z separacją dla tej kapilary, klikając żądany cykl, a następnie przycisk odtwarzania na panelu sterowania.</li>
	<li>Plik uruchamiania może być przechowywany automatycznie po zakończeniu przebiegu.</li>
</ol>
6. Analizuj dane (<silna klasa="xfig">Rysunek S1)
<ol>
	<li>Otwórz plik uruchamiania i wybierz zakładkę ekranu analizy. W <silnej klasie="xfig">Rysunek S1A, dane pokazane (piki) na wykresie próbki pochodzą z wybranej kapilary (tj. 4-tej kapilary z cyklu 1).</li>
	<li>Kliknij edytuj, a następnie analizę (<silna klasa="xfig">Rysunek S1B). Na tym etapie użytkownicy mogą zmienić zakres pI, zastosować odpowiedni standard pI dla danego eksperymentu, dodać dopasowanie piku i dodać nazwę piku. 
	UWAGA: W przypadku stosowania premiksu amfoliitowego o pH 5-8 (jak ma to miejsce w tym przypadku), zalecaną standardową drabiną do użycia jest drabina z peptydami znakowanymi fluorescencyjnie o pIs 4,9, 6,0, 6,4, 7,0 i 7,3, a w przypadku stosowania premiksu o pH 3-10 zalecana drabina to drabina o pIs 4,0, 4,9, 6,0, 6,4 i 7,3. 2</li>
	<li>Wyniki są wyświetlane w zakładce Peaks; wartości wyświetlane dla próbek to Position, pI, Peak Height and Area, % Area, Peak Width oraz Signal to noise (S/N) (<silna klasa="xfig">Rysunek S1C). Wybierz dane, które chcesz użyć, i wyeksportuj je do dalszej analizy. 
	UWAGA: Dane można eksportować tylko po oznaczeniu piku (<silna klasa="xfig">Rysunek S1C).</li>
</ol>

<ol><li>O'Neill, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoelectric+focusing+technology+quantifies+protein+signaling+in+25+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).</li>
<li>Aspinall-O'Dea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-based+detection+of+protein+phosphorylation+status+to+track+the+efficacy+of+novel+therapies+using+nanogram+protein+quantities+from+stem+cells+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines.</a> Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).</li>
<li>Fan, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanofluidic+proteomic+assay+for+serial+analysis+of+oncoprotein+activation+in+clinical+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens.</a> Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).</li>
<li>Padhan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+isoelectric+focusing+to+establish+a+signaling+biomarker+for+the+diagnosis+of+human+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer.</a> BMC Cancer. 16 (1), 683(2016).</li>
<li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGFR2+induces+c-Src+signaling+and+vascular+permeability+in+vivo+via+the+adaptor+protein+TSAd%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd.</a> J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).</li>
<li>Iacovides, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+quantification+of+AKT+isoforms+and+phosphoforms+in+breast+cancer+using+a+novel+nanofluidic+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).</li>
<li>Price, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+JAK-STAT+signaling+stimulates+adult+satellite+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function.</a> Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).</li>
<li>Unger, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoproteomic+analysis+of+ischemia-dependent+changes+in+signaling+protein+phosphorylation+in+colorectal+normal+and+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue.</a> J Transl Med. 14, 6(2016).</li>
<li>Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+uridine+administration+induces+fatty+liver+and+pre-diabetic+conditions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice.</a> PLoS One. 11 (1), e0146994(2016).</li>
<li>Schmidt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Case-specific+potentiation+of+glioblastoma+drugs+by+pterostilbene%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene.</a> Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).</li>
</ol>

Autor nie posiada żadnych ujawnień.

Czułość i rozdzielczość białek mają kluczowe znaczenie dla badań proteomicznych próbek biologicznych. Możliwość wykrywania białek, które są obecne w niewielkich ilościach w komórkach, ma ogromną wartość. cIEF może oferować lepszą czułość i rozdzielczość wykrywania białek i ich izoform4.
Technologia ta została z powodzeniem wykorzystana w wielu raportach z badań proteomicznych 5,6,7</...

Kapilarne ogniskowanie izoelektryczne (cIEF) to zautomatyzowany, kapilarny test immunologiczny, który rozdziela białka na podstawie ich ładunku1,2,3. Jest wysoce powtarzalny i zdolny do szybkiego i ilościowego rozdzielania białek i ich izoform modyfikowanych po translacji. Stanowi alternatywę dla konwencjonalnych metod, takich jak western blotting. Podczas gdy western blotting jest bardzo dobry do potwierdzania obecności obfitych białek w łatwo dostępnych próbkach; Zmienność, czasochłonność i dokładna ocena ilościowa stanowią wyzwanie, w szczególności podczas badania próbek tkanek biologicznych. Rzeczywiście, zmienność jest nieodłącznym problemem w western blot, ponieważ składa się z wielu etapów, takich jak ładowanie i uruchamianie żeli SDS-PAGE, przenoszenie białek na błonę, inkubacja z różnymi odczynnikami (np. przeciwciałami pierwszorzędowymi i wtórnymi, ECL) oraz opracowywanie na kliszy rentgenowskiej4. Obecnie technika western blotting ulega poprawie wraz z wdrożeniem cyfrowego zapisu sygnałów chemiluminescencyjnych (digital westerns). Ostatnio opracowano zautomatyzowany system western blott, a mianowicie capillary western, który jest systemem bardziej bezdotykowym i bezżelowym. Cały test jest zautomatyzowany po załadowaniu płytki z próbką (próbki ze wszystkimi niezbędnymi odczynnikami) do systemu3,4. Instrument wykona wszystkie etapy, takie jak separacja białek, immobilizacja białek na ścianie naczyń włosowatych, inkubacje przeciwciał, płukanie między różnymi etapami oraz rozwój i kwantyfikacja sygnałów chemiluminescencyjnych. Dzięki temu przedstawiona tutaj procedura cIEF zapewnia wyższą rozdzielczość i czułość.
Ta metoda jest wrażliwa, ponieważ sygnały mogą być generowane i określane ilościowo na podstawie pikogramów białek1. Wysoka czułość i doskonała powtarzalność sprawiają, że technologia ta jest bardzo przydatna do analizy próbek klinicznych. Może wykrywać i rozróżniać modyfikacje potranslacyjne (np. różne fosforylowane izoformy białek) białek. Technologia ta została z powodzeniem wykorzystana do analizy różnych szlaków sygnałowych4,5 w badaniach klinicznych mających na celu opracowanie nowych terapii w raku3, i ma ogromny potencjał w zakresie biomarkerów białkowych i odkrywania leków.

<table><tbody><tr><td>NanoPro 1000</td><td>ProteinSimple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Premix G2, pH 5&ndash; 8 (zagnieżdżony) gradient separacji, pH 2&ndash; 4 wtyczka</td><td>ProteinSimple</td><td>040-972</td><td>Ampholyte premix</td></tr><tr><td>DMSO</td> inhibitor mix <td>ProteinSimple</td><td>040-510</td><td>Inhibitory fosfatazy; do cIEF 1:50 rozcieńczenie</td></tr> stosowane <tr><td>Awaterous Inhibitor Mix</td><td>ProteinSimple</td><td>040-482</td><td>Inhibitor proteazy; do cIEF 1:25</td></tr><tr><td>stosuje się standardową drabinkę pI 3</td><td>ProteinSimple</td><td>040-646</td><td>Do cIEF stosuje się rozcieńczenie 1:60</td></tr><tr><td>Próbka rozcieńczalnik</td><td>ProteinSimple</td><td>040-649</td><td></td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik przeciwciał&nbsp;</td><td>ProteinSimple</td><td>040-309</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrat do prania</td><td>ProteinSimple</td><td>041-108</td><td></td></tr><tr><td>Anolyte Refill</td><td>ProteinSimple</td><td>040-337</td><td></td></tr><tr><td>Catholyte Refill</td><td>ProteinSimple</td><td>040-338</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek XDR</td><td>ProteinSimple</td><td>041-084</td><td></td></tr><tr><td>Luminol</td><td>ProteinSimple</td><td>040-652</td><td></td></tr><tr><td>Bicine/CHAPS Lysis Buffer</td><td>ProteinSimple</td><td>040-764</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary-Separacja ładunków (1 opakowanie) dla&nbsp;</td><td>ProteinSimple</td><td>CBS700</td><td></td></tr><tr><td>Płytka/zestaw pokrywek do testów</td><td>ProteinSimple</td><td>040-663</td><td></td></tr><tr><td>Peroksydaza-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>711-035-152</td><td>Do cIEF używany (1: 300)</td></tr><tr><td>Peroksydaza-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>715-035-150</td><td>Do zastosowania cIEF (1: 300)</td></tr><tr><td>Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>9101</td><td>Do zastosowania cIEF (1: 50)</td></tr> <tr><td>Sygnalizacja komórek</td> <td>przeciwciała pierwotnego Pan Erk</td><td>9102</td><td>Do cIEF (1: 100)</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Compass</td><td>ProteinSimple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-010</td><td></td></tr><tr><td>MV2 (EBM-2)</td><td>PromoCell</td><td>& nbsp; C-22221</td><td>Pożywka dla komórek</td></tr><tr><td>śródbłonka Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka MV2 SupplementPack</td><td>PromoCell</td><td>C-39221</td><td>Suplementacja do MV2 powyżej</td></tr><tr><td>VEGFA</td><td>PeproTech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>Long R3 IGF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85580C/I1146</td><td>Insulinopodobny czynnik wzrostu</td></tr><tr><td>Bioruptor (Sonicator)</td><td>Diagenode</td><td>B01020001</td><td></td></tr><tr><td>Białko BCA Zestaw do testów&nbsp;</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Żele białkowe</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer (20X)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>NP0006</td><td></td></tr><tr><td>Membrana Immobilon PVDF</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td></td><td></td><td></td>z rurką do mikrofuge</tr><tr><td>Wirówka Adapter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>płytki do mikromiareczkowania do pipet wirówek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Porady</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lód</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wysoce czułe i ilościowe wykrywanie białek i ich izoform metodą kapilarnego ogniskowania izoelektrycznego

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Immunoblotting stał się rutynową techniką w wielu laboratoriach do charakteryzacji białek z próbek biologicznych. Poniższy protokół zapewnia alternatywną strategię, kapilarne ogniskowanie izoelektryczne (cIEF), z wieloma zaletami w porównaniu z konwencjonalnym immunoblottingiem. Jest to oparta na przeciwciałach, zautomatyzowana, szybka i ilościowa metoda, w której pełna procedura western blot odbywa się w ultracienkiej kapilarze. Technika ta nie wymaga przenoszenia żelu na błonę, usuwania plam ani filmów rentgenowskich, które są zwykle wymagane w przypadku konwencjonalnego immunoblottingu. Tutaj białka są rozdzielane zgodnie z ich ładunkiem (punkt izoelektryczny; pI), przy użyciu mniej niż mikrolitra (400 nL) całkowitego lizatu białkowego. Po elektroforezie białka są unieruchamiane na ścianach naczyń włosowatych przez obróbkę światłem ultrafioletowym, a następnie inkubację przeciwciał pierwotnych i wtórnych (sprzężonych z peroksydazą chrzanową (HRP)) przeciwciał, których wiązanie wykrywa się poprzez zwiększoną chemiluminescencję (ECL), generując sygnał świetlny, który może być przechwycony i zarejestrowany przez kamerę urządzenia ze sprzężeniem ładunkowym (CCD). Obraz cyfrowy może być analizowany i określany ilościowo (obszar piku) za pomocą oprogramowania. Ta wysokowydajna procedura może obsłużyć 96 próbek jednocześnie; jest bardzo czuły, z wykrywaniem białek w zakresie pikogramów; i daje wysoce powtarzalne wyniki dzięki automatyzacji. Wszystkie te aspekty są niezwykle cenne, gdy czynnikiem ograniczającym jest ilość próbek (np. próbek tkanek i biopsji). Technika ta ma również szersze zastosowania, w tym badania przesiewowe leków lub przeciwciał, odkrywanie biomarkerów i cele diagnostyczne.

Projekt nowego testu: Układ płytki testowej przedstawiono na Rysunku 1A. Z płytki 384-dołkowej można wykorzystać maksymalnie 96 dołków, w blokach po 12 dołków dla każdego warunku (przeciwciała). Każdy blok 12 dołków może zaczynać się od A1-A12 lub A13-A24. Kolorowe oznaczenia rzędów pozwalają odróżnić od siebie poszczególne próbki lub odczynniki. W szablonie testu (Rysunek 1B) można zapisać istotne informacje dla...

Ogniskowanie izoelektryczne kapilarne to oparta na przeciwciałach, ultraczuła, wysokoprzepustowa technika, umożliwiająca szczegółową charakterystykę białek i ich izoform z bardzo małych próbek biologicznych. Poniżej opisano protokół wykrywania i oznaczania ilościowego określonych białek i ich izoform w sposób zautomatyzowany i zrobotyzowany.

Wysoce czułe i ilościowe wykrywanie białek i ich izoform metodą kapilarnego ogniskowania izoelektrycznego

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań biomedycznych, takich jak odkrywanie biomarkerów, odkrywanie leków, diagnostyka i badania przesiewowe leków lub przeciwciał. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona wysokoprzepustowa i może wykrywać izoformy białek w wysoce powtarzalny sposób. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku diagnozowania wielu chorób, ponieważ może ona mierzyć dotknięte białka lub ich izoformy.Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w szlaki sygnalizacji komórkowej, może być również stosowana w innych systemach, w których należy analizować określone białka. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy testu są trudne do nauczenia się ze względu na sztuczki, takie jak usuwanie pęcherzyków, ładowanie płytki i tak dalej. Najpierw przygotuj mieszaninę rozcieńczalników do próbek, dodając jeden mikrolitr mieszaniny inhibitorów DMSO i dwa mikrolitry inhibitorów proteazy do 47 mikrolitrów rozcieńczalnika próbki, tak aby końcowe stężenie DMSO i inhibitorów proteazy wynosiło jeden X.Rozcieńczyć wcześniej wyizolowane lizaty białkowe za pomocą mieszanki rozcieńczalników próbki, aby uzyskać pożądane stężenia.Następnie dodaj 3,325 mikrolitra standardowej drabiny, sześć mikrolitrów inhibitora proteazy i trzy mikrolitry inhibitora DMSO do 137,675 mikrolitrów premiksu antolitowego. Wirować próbkę przez co najmniej 15 sekund i trzymać na lodzie. Wymieszaj dwa przygotowane roztwory w stosunku jeden do trzech, tak aby końcowe stężenia inhibitorów proteazy DMSO i drabiny wzorca izoelektrycznego punktu wynosiły jeden X, a białka w kapilarze osiągnęły końcowe pożądane stężenia.Po dodaniu białek do mieszaniny próbek, wszystkie etapy zostaną wykonane na lodzie lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umieść 384-dołkową płytkę na lodzie. Załaduj dziesięć mikrolitrów mieszanki próbek do odpowiedniego dołka płytki, zgodnie z układem szablonu testowego zaprojektowanym za pomocą oprogramowania zautomatyzowanego systemu Western blotting.Następnie rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe rozcieńczalnikiem przeciwciał. Następnie należy wprowadzić pipetę do każdej studzienki z dziesięciu mikrolitrów przeciwciał pierwszorzędowych i 15 mikrolitrów przeciwciał drugorzędowych. Następnie wymieszaj luminol i nadtlenek XDR w stosunku jeden do jednego.Odpipetować 15 mikrolitrów nadtlenku luminolu wymieszać z każdym dołkiem. Po dodaniu próbek i reagantów do płytki odwirować przez dziesięć minut w temperaturze 2500 razy G i czterech stopniach Celsjusza, aby odwirować ciecz i usunąć pęcherzyki. Jeśli bąbelki nadal istnieją, usuń je ręcznie za pomocą cienkiej końcówki pipety.Otwórz oprogramowanie zautomatyzowanego systemu Western blotting i kliknij nowy'z menu plików. Przejdź do panelu układu i przypisz lokalizacje dla reagantów i próbek w płytce 384-dołkowej. Wykonaj trafne przypisanie, klikając studnię w dowolnym miejscu bloku.Wybierz blok wiersza z 12 dołkami każdy. Następnie przejdź do paska narzędzi panelu układu i wstaw blok wiersza próbki, podstawowego, wtórnego lub luminolu. Przejdź do okienka protokołu i wybierz lokalizację reaganta na tablicy.Następnie kliknij komórkę w przykładowej kolumnie i wybierz reagant z menu rozwijanego. W ten sam sposób wybierz lokalizacje reagantów dla podstawowego, wtórnego i luminolu dla każdego cyklu. Kliknij komórki pojedynczo w kolumnie przeciwciał pierwszorzędowych lub drugorzędowych i w razie potrzeby zmień czasy inkubacji.Następnie dodaj cykle, klikając przycisk Dodaj'przycisk w sekcji protokołu. W okienku szablonu wprowadź informacje dotyczące próbki, takie jak tożsamość przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych, ich numery katalogowe i rozcieńczenia. Zapisz nowy plik testu.Zanim klikniesz przycisk Start, szybko sprawdź układ, aby upewnić się, że wszystko jest poprawne. Teraz kliknij start'aby rozpocząć bieg. Oprogramowanie poprosi użytkownika o usunięcie odpadów, ponowne napełnienie pojemnika na wodę i kapilary, dodanie anolitu i katolitu do tacy zasobów, dodanie buforu do płukania i załadowanie płytki do schłodzonej tacki na próbki.Pasek stanu instrumentu zostanie wyświetlony na ekranie komputera kilka minut po rozpoczęciu biegu. Kliknij na podsumowanie przebiegu'ekran, aby wyświetlić panele stanu i separacji. Aby obserwować separację metodą elektroforezy w kapilarze, odtwórz film z separacją dla tej kapilary, klikając żądany cykl, a następnie klikając przycisk odtwarzania na panelu sterowania.Otwórz plik uruchamiania i wybierz zakładkę ekranu analizy. Kliknij edytuj, a następnie analizę, aby zmienić zakres punktów izoelektrycznych. Zastosuj odpowiedni wzorzec punktu izoelektrycznego.Dodaj dopasowanie szczytowe i dodaj nazwę szczytu. Na koniec wybierz dane do użycia w zakładce piki i wyeksportuj dane do dalszej analizy. Pokazano tutaj elektroferogram fosforylowanych kinaz regulowanych sygnałem zewnątrzkomórkowym z lizatów stymulowanych czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyniowego.Obserwuje się bardzo wysoką indukcję fosforylowanych białek za pomocą czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego. Wstawka przedstawia endogenną kontrolę obciążenia, HSP 70, wskazującą na podobne obciążenie próbek zarówno dla próbek niepoddanych obróbce, jak i poddanych obróbce. W konwencjonalnym immunoblocie wykryto tylko dwa prążki, mimo że fosforylowane białka kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym zostały rozłożone na cztery piki za pomocą kapilarnej analizy ogniskowania izoelektrycznego.Przedstawiono tutaj elektroferogram kinaz regulowanych sygnałem zewnątrzkomórkowym z lizatów stymulowanych czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyniowego. Wstawka pokazuje tę samą kontrolkę ładowania, która jest używana równolegle. Konwencjonalny immunoblot pokazuje tylko dwa prążki odpowiadające kinazie regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym jeden i kinazie regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym drugiej.Natomiast przy ogniskowaniu izoelektrycznym kapilary, białka kinazy regulowane sygnałem zewnątrzkomórkowym zostały rozłożone na sześć pików, odpowiadających wszystkim czterem różnym pikom fosforylowanym i dwóm pikom nieufosforylowanym. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu kilku godzin, w zależności od liczby cykli, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o stosowaniu wyższych stężeń przeciwciał w porównaniu z konwencjonalnymi immunoblotami.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy testu są trudne do nauczenia się ze względu na sztuczki, takie jak usuwanie pęcherzyków, ładowanie płytki itp. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zaprojektować test, przygotować próbki, uruchomić test i przeanalizować dane, aby obserwować różne izoformy białka.

highly-sensitive-quantitative-detection-proteins-their-isoforms

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Metoda SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies) łączy wzbogacanie peptydów metodą powinowactwa z masową spektrometrią z rozcieńczeniem izotopem stabilnym (MRM-MS), aby zapewnić ilościowe pomiary peptydów jako substytutów odpowiadających im białek. W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół z wykorzystaniem cząstek magnetycznych w formacie częściowo zautomatyzowanym.

Ilościowe oznaczanie białek z wykorzystaniem immunoafinityjnego wzbogacania peptydów sprzężonego ze spektrometrią mas

Ten film demonstruje protokół testu immunologicznego elektroforezy kapilarnej do wykrywania biomarkera białkowego związanego ze stwardnieniem zanikowym bocznym (ALS) z płytek krwi ludzkiej. Potwierdzenie obecności białka biomarkerowego ALS uzyskuje się poprzez rozdzielenie białek płytek krwi na podstawie wielkości, a następnie detekcję chemiluminescencyjną.

Test immunologiczny elektroforezy kapilarnej do wykrywania biomarkerów białkowych

Tutaj prezentujemy kompleksowy protokół elektroforezy strefy kapilarnej do oceny wewnętrznej fizykochemicznej heterogeniczności przeciwciał monoklonalnych jako atrybutu jakości.

Elektroforeza kapilarna Separacja izoform przeciwciał monoklonalnych za pomocą neutralnej kapilary

Zademonstrowano test immunologiczny oparty na naczyniach włosowatych, wykorzystujący komercyjną platformę do pomiaru docelowych białek z całkowitych preparatów białkowych. Ponadto parametry testowe czasu ekspozycji, stężenia białka i rozcieńczenia przeciwciał są zoptymalizowane pod kątem systemu modelowego hodowli komórkowych.

Procedura i kluczowe strategie optymalizacyjne dla zautomatyzowanej metody immunologicznego opartego na elektroforetycznych naczyniach włosowatych

Szczegółowy protokół jest opisany do separacji, identyfikacji i charakterystyki proteoform w próbkach białek za pomocą elektroforezy strefy kapilarnej-elektrorozpylania jonizacji-tandemowej spektrometrii mas (CZE-ESI-MS/MS). Protokół może być wykorzystany do charakterystyki proteoform w prostych próbkach białkowych w wysokiej rozdzielczości oraz do identyfikacji proteoform na dużą skalę w złożonych próbkach proteomów.

Proteomika na dużą skalę z wykorzystaniem tandemowej spektrometrii mas z elektroforezą strefy kapilarnej

Celem jest frakcjonowanie i izolowanie bioaktywnych małych cząsteczek, peptydów z złożonego ekstraktu roślinnego oraz białek z drobnoustrojów chorobotwórczych za pomocą metody ogniskowania izoelektrycznego w fazie ciekłej (IEF). Ponadto zidentyfikowano oddzielone cząsteczki i potwierdzono ich bioaktywność.

Separacja bioaktywnych małych cząsteczek, peptydów ze źródeł naturalnych i białek od drobnoustrojów metodą preparatywnego ogniskowania izoelektrycznego (IEF)

Opisano procedurę elektroforezy kapilarnej, spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylania do bezwzględnego oznaczania ilościowego pirofosforanów inozytolu z ekstraktów komórkowych ssaków.

Bezwzględna ocena ilościowa pirofosforanów inozytolu za pomocą elektroforezy kapilarnej Spektrometria mas z jonizacją elektrorozpylania

Ten protokół opisuje szybką i bardzo czułą kwantyfikację danych z sensora rezonansu rezonansu (FRET) za pomocą przenośnego analizatora FRET wykonanego na zamówienie. Urządzenie zostało wykorzystane do wykrywania maltozy w krytycznym zakresie temperatur, który maksymalizuje czułość wykrywania, umożliwiając praktyczną i efektywną ocenę zawartości cukru.

Bardzo czuła i szybka detekcja fluorescencji za pomocą przenośnego analizatora FRET

Udało nam się ustalić metodę izolacji RNA z nasion roślin zawierających duże ilości olejów, białek i polifenoli, które mają działanie hamujące izolację RNA o wysokiej czystości. Nasza metoda jest odpowiednia do monitorowania ekspresji genów z transkryptami niskiego poziomu w nasionach.

Skuteczna metoda izolacji wysoce oczyszczonego RNA z nasion do zastosowania w ilościowej analizie transkryptomu

Wiele białek spełnia swoją funkcję, gdy są przyczepione do powierzchni błony. Wiązanie białek zewnętrznych na błonach nanodysków można pośrednio zobrazować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Pokazujemy, że charakterystyczne układanie (rouleau) nanodysków indukowane przez fosforungmian sodu o ujemnym barwieniu jest zapobiegane przez wiązanie białka zewnętrznego.

Metoda wizualizacji i analizy białek oddziałujących z błoną za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Poznaj metodę kapilarnego ogniskowania izoelektrycznego do analizy białek i ich izoform w badaniach biomedycznych. Technika ta umożliwia wykrywanie biomarkerów, odkrywanie leków oraz diagnostykę chorób.

Wysoce czułe i ilościowe wykrywanie białek i ich izoform metodą kapilarnego ogniskowania izoelektrycznego

Przeglądaj więcej filmów