Kwantyfikacja białek za pomocą wzbogacania immunopowinowactwa peptydów w połączeniu ze spektrometrią mas

Ogólnym celem poniższej procedury jest wyizolowanie i ilościowe określenie peptydów w złożonej mieszaninie, które działają jako substytuty odpowiedniego białka. Najpierw duże białka w mieszaninie są trawione do peptydów składowych za pomocą enzymu, takiego jak trypsyna. Następnie docelowe anality peptydowe i wzorzec wewnętrzny znakowany stabilnym izotopem wzbogaca się za pomocą przeciwciał peptydowych antyp, unieruchomionych na cząstkach magnetycznych kodowanych białkiem G po izolacji.

Docelowe peptydy są nawiązywane do cząstek magnetycznych i analizowane za pomocą spektrometrii mas w celu oceny ilościowej w stosunku do wzorca wewnętrznego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak tradycyjne testy immunologiczne, jest to, że jest szybsza i bardziej opłacalna w tworzeniu dużej liczby testów. Ma wysoki wskaźnik sukcesu i jest łatwo multipleksowany, co pokazuje, że procedura zostanie ułożona.

Technik w laboratorium Haw 10 mikrolitrową plazmę Eloqua na mokrym lodzie. Przenieść próbkę na płytkę o pojemności 1000 mikrolitrów i przykryć folią przyrodzoną w celu denaturacji białek w 20 mikrolitrach świeżego dziewięciomolowego mocznika 30 milimolowego DTT do każdej próbki i inkubować przez 30 minut W temperaturze 37 stopni Celsjusza dodać trzy mikrolitry świeżego 500-milimolowego acetamidu I oto do każdej próbki i inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Teraz rozcieńczyć mocznik do 0,6 mola o 100 milimolowym tris pH osiem i dodać 10 mikrolitrów jednego mikrograma na mikrolitr i roztwór podstawowy, aby uzyskać stosunek enzymu do substratu od jednego do 50.

Po inkubacji reakcji w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc w trzech mikrolitrach czystego kwasu mrówkowego do końcowego stężenia 1%, kontynuuj dodawanie stabilnego wzorca izotopu lub wielu wzorców. W przypadku wykonywania testu multipleksowego dobrze umyj płytkę wkładu Oasis 500 mikrolitrami 0,1% kwasu mrówkowego w 80% nitrylu ACE, odrzucając przepływ. Następnie zrównoważyć płytkę wkładu, dodając 500 mikrolitrów 0,1% kwasu mrówkowego do wody i wyrzucić przepływ.

Załaduj próbki mineralizacji na płytkę wkładu i dostosuj podciśnienie tak, aby przepływ był bardzo wolny. Przemyć trzykrotnie 500 mikrolitrami 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie i odrzucić przepływ przez elucję, dwukrotnie wymyć peptydy 500 mikrolitrami 0,1% kwasu mrówkowego w 80% próbie aceto, następnie liofilizować lub przyspieszyć powrót eluatu do sucha i rozpuść wysuszone peptydy w 50 mikrolitrach PBS plus 0,03% Chaps, przenieść próbki do standardowej płytki Kingfisher 96 dołków, dodać jeden mikrogram przeciwciała i 1,5 mikrolitra białka G kodowane koraliki magnetyczne na cel. Zwiruj koraliki przed dodaniem.

Aby upewnić się, że koraliki są dobrze zawieszone. Przykryj płytkę folią i inkubuj przez noc w delikatnej wirówce bębnowej. Talerz z prędkością 400 obr./min przez 10 sekund, aby usunąć płyn z powierzchni folii.

Zdejmij foliową osłonę. Manipulacja próbką odbywa się na zautomatyzowanej platformie zimorodka na platformie Kingfisher. Umyj koraliki dwukrotnie 200 mikrolitrami PBS plus 0,03% czapsów i raz 200 mikrolitrami rozcieńczenia PBS do 10 plus 0,03% Chaps, teraz unikaj peptydów za pomocą 25 mikrolitrów 5% kwasu octowego plus 0,03% czapsów.

Umieść płytkę elucyjną na magnesie i przenieś eluat na płytkę 96-dołkową, uważając, aby nie przenieść resztek kulek. Przykryj płytkę matą sufitową, dostarczyć tę płytkę zawierającą eluat do potrójnego, poczwórnego spektrometru mas w celu analizy. Metoda MRM opiera się na uzyskaniu tandemowego widma masowego interesującego peptydu, a następnie wyborze i optymalizacji najlepszych przejściowych jonów fragmentacyjnych.

Zazwyczaj konfiguracja do analizy MRM wykorzystuje pułapkę C 18 i kolumny analityczne z dwiema fazami ruchomymi. Załadować 10 mikrolitrów próbki i wymyć za pomocą gradientu liniowego. Zintegruj obszary pików dla lekkich i ciężkich peptydów i oblicz stosunek powierzchni piku nieznakowanego do znakowanego peptydu w każdej próbce.

Lekkie i ciężkie peptydy eluują się w tym samym czasie, a dla każdego peptydu można monitorować wiele przejść Aby potwierdzić tożsamość, obszar piku endogennego peptydu mierzy się w stosunku do obszaru wzorca wewnętrznego, aby zapewnić ilościową miarę docelowego peptydu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wdrożyć tę technikę w swoim laboratorium. Może być stosowany do ilościowego oznaczania dowolnego białka będącego przedmiotem zainteresowania, dzięki czemu nadaje się do szerokiego zakresu zastosowań w badaniach biologicznych.