Name: Wysokoprzepustowy test wiązania MHC II do analizy ilościowej epitopów peptydowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-25T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Poznaj wysokoprzepustowy test wiązania peptydów z MHC II w formacie 384-well do analizy ilościowej epitopów immunogennych. Ta metoda wspiera projektowanie szczepionek i badania immunologiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty NIH R01-GM-098977 i R21-AI-098122 dla CBK i KEG. RSS był częściowo wspierany przez stypendium Luce Foundation, a częściowo przez stypendium Thayer Innovation Program Fellowship z Thayer School of Engineering.

Test wiązania peptydów z MHC II składa się z czterech głównych etapów: 1-Wiązanie: Peptydy testowe konkurują z znakowanymi peptydami kontrolnymi o wiązanie rozpuszczalnych białek MHC II w fazie ciekłej. Wiązanie jest mierzone dla szerokiego zakresu stężeń peptydów testowych. 2-Wychwytywanie: Po osiągnięciu stanu równowagi reakcji wiązania, kompleksy peptyd-MHC II są wychwytywane i oddzielane od niezwiązanego peptydu i białka poprzez rozpoznawanie zależne od konformacji za pomocą unieruchomionego przeciwciała. 3-Detekcja: Wychwycony peptyd kontrolny jest wykrywany ilościowo przy użyciu fluorescencji rozdzielonej w czasie. 4-Analiza: Dane spektroskopowe są przetwarzane, nanoszone na wykresy i analizowane w celu ustalenia zależnych od dawki właściwości wiązania peptydu testowego i białek MHC II.
Na różnych etapach poniższej procedury zaleca się użycie robota do pipetowania, jeśli taki jest dostępny. Szczególnie w formacie 384 dołków automatyczne dozowanie i rozcieńczanie cieczy minimalizuje błędy użytkownika, pozwala na uzyskanie bardziej spójnych objętości w poszczególnych dołkach i daje węższe 95% przedziały ufności dla wartości IC50 w porównaniu do manualnych testów w formacie 96 dołków (dane nie zostały przedstawione). Jeśli robot do pipetowania nie jest dostępny, kroki oznaczone adnotacją „(liquid handling robot)” można wykonać ręcznie. Podobnie, jeśli to możliwe, zaleca się użycie automatycznej myjki do płytek kompatybilnej z formatem 384 dołków. Pozwala to na skuteczną standaryzację procesu mycia płytek. Jeśli myjka do płytek nie jest dostępna, kroki oznaczone adnotacją „(plate washer)” można wykonać ręcznie.
1. Powlekanie płytki ELISA (Dzień 1)
<ol>
	<li>Rozcieńczyć roztwór stockowy przeciwciała L243 (0,5 mg/ml) w buforze boratowym do stężenia roboczego 10 µg/ml.
	<ol>
		<li>Aby pokryć jedną płytkę 384-dołkową, dodać 200 µl przeciwciała stockowego do 9,8 ml buforu boratowego. (Alternatywne skalowanie znajduje się w pomocniczym arkuszu kalkulacyjnym).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do każdego dołka białej płytki ELISA 384-dołkowej o wysokim wiązaniu dodać 25 µl roztworu przeciwciała L243 (za pomocą robota do obsługi cieczy).</li>
	<li>Uszczelnić płytkę folią poliestrową i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. 
	Uwaga: Każda płytka ELISA 384-dołkowa może pomieścić do 15 peptydów testowych w ośmiu rozcieńczeniach dla jednego allelu MHC II, a także kontrole pozytywne i negatywne. Pozwoli to ostatecznie na uzyskanie pomiarów w trzech powtórzeniach.</li>
</ol>
2. Przygotowanie rozcieńczeń peptydów testowych (Dzień 1)
<ol>
	<li>Wykorzystując 10 mM roztwór każdego peptydu testowego w DMSO, przygotuj następujące szeregi rozcieńczeń w buforze cytrynianowo-fosforanowym, używając polipropylenowych płytek 384-dołkowych (Tabela 1). (robot do obsługi cieczy) 
	Uwaga: Pełna polipropylenowa płytka 384-dołkowa wymaga zastosowania trzech oddzielnych płytek ELISA. Jedna trzecia polipropylenowej płytki wymaga jedynie jednej płytki ELISA (Rysunek 1).</li>
</ol>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody align="center">
		<tr>
			<td rowspan="2">Numer rozcieńczenia</td>
			<td>Objętość pobrana z poprzedniego rozcieńczenia/roztworu zapasowego</td>
			<td>Objętość dodanego buforu cytrynianowego</td>
			<td>Stężenie rozcieńczenia</td>
			<td>Stężenie w reakcji wiązania</td>
			<td>Stężenie w zneutralizowanym teście ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(μl)</td>
			<td>(μl)</td>
			<td>(μM)</td>
			<td>(μM)</td>
			<td>(μM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>0.7</td>
			<td>35.1</td>
			<td>195.531</td>
			<td>97.765</td>
			<td>48.883</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>14.3</td>
			<td>14.3</td>
			<td>97.765</td>
			<td>48.883</td>
			<td>24.441</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>7.1</td>
			<td>28.7</td>
			<td>19.389</td>
			<td>9.695</td>
			<td>4.847</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>14.3</td>
			<td>14.3</td>
			<td>9.695</td>
			<td>4.847</td>
			<td>2.424</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>7.1</td>
			<td>28.7</td>
			<td>1.923</td>
			<td>0.961</td>
			<td>0.481</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>14.3</td>
			<td>14.3</td>
			<td>0.961</td>
			<td>0.481</td>
			<td>0.24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>7.1</td>
			<td>28.7</td>
			<td>0.191</td>
			<td>0.095</td>
			<td>0.048</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>14.3</td>
			<td>14.3</td>
			<td>0.095</td>
			<td>0.048</td>
			<td>0.024</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="6">Należy pobrać i usunąć 7.1 μl roztworu peptydowego z rozcieńczenia numer 8.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Przygotowanie serii rozcieńczeń peptydów testowych.
<img alt="Schemat płytki ELISA; polietylen vs. high-bind; seria rozcieńczeń peptydów; porównawcze wyniki analizy." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51308/51308fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51308/51308fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Mapa płytki dla analizy wiązania peptydów. (A) Mapa rozcieńczeń peptydów w polipropylenowych płytkach 384-dołkowych. Każda płytka polipropylenowa może pomieścić trzy grupy po 15 peptydów w reakcjach wiązania konkurencyjnego przeciwko pojedynczemu allelowi MHC II. (B) Po osiągnięciu stanu równowagi w reakcji wiązania, każda grupa peptydów jest przenoszona, w trzech powtórzeniach, na oddzielną 384-dołkową płytkę ELISA, która została uprzednio pokryta przeciwciałami anty-MHC II.
3. Przygotowanie Master Mixu MHC II (Dzień 1)
<ol>
	<li>Przygotowanie buforu reakcyjnego
	<ol>
		<li>Do 3 920 µl buforu cytrynianowo-fosforanowego dodać 80 µl 1 mM Pefa Bloc oraz 60 µg octyl-β-D-glukopiranozidu. (Alternatywne skalowanie znajduje się w uzupełniającym arkuszu kalkulacyjnym).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybrane roztwory stokowe MHC II rozcieńczyć do stężenia 101 nM w buforze reakcyjnym, używając stożkowatej probówki 15 ml (Tabela 2). 
	Uwaga: Ostateczne stężenie MHC II wyniesie 50 nM w reakcji wiązania i 25 nM w zneutralizowanym teście ELISA. Stężenia stokowe MHC II będą się różnić w zależności od numeru partii producenta. (Patrz: uzupełniający arkusz kalkulacyjny).</li>
</ol>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="376">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Allele DRB1* MHC II:</td>
			<td>1501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stężenie roztworu zapasu MHC II (mg/ml)</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stężenie roztworu zapasowego MHC II (µM)</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Obj. zapasów MHC II do dodania (µl)</td>
			<td>14.65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Obj. buforu reakcyjnego do dodania (µl):</td>
			<td>2885.35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stężenie Master Mixu MHC II (nM)</td>
			<td>101</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Przygotowanie mieszaniny głównej (master mix) dla MHC II.
4. Przygotowanie kontroli negatywnej i pozytywnej (Dzień 1)
<ol>
	<li>Dodaj 21,5 µl buforu cytrynianowo-fosforanowego do dołka „negative control” w polipropylenowej płytce 384-dołkowej z kroku 2.1 (Rycina 1A).</li>
	<li>Dodaj 21,5 µl buforu cytrynianowo-fosforanowego do dołka „positive control” w polipropylenowej płytce 384-dołkowej. 
	Uwaga: przygotowanie „positive control” zostanie opisane w sekcji 5 poniżej.</li>
	<li>Pobierz 49,5 µl mieszaniny MHC II Master Mix z kroku 3.2 i przenieś pipetą do probówki Eppendorf 1,5 ml.</li>
	<li>Dodaj 0,5 µl buforu cytrynianowego do 49,5 µl mieszaniny MHC II Master Mix z kroku 4.3.</li>
	<li>Dodaj 21,5 µl mieszaniny MHC II Master Mix o skorygowanym stężeniu z kroku 4.4 do dołka „negative control” w polipropylenowej płytce 384-dołkowej (Rycina 1A). 
	Uwaga: próbka ta stanowi ujemną kontrolę sygnału zerowego, zawierającą białko MHC II, BEZ peptydu kontrolnego i BEZ peptydu testowego.</li>
</ol>
5. Dodanie odpowiedniego peptydu kontrolnego do mieszaniny głównej MHC II (Dzień 1)
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Allela MHC II DRB1*</td>
			<td>Biotynilowany peptyd kontrolny</td>
			<td>(resztki)</td>
			<td>Sekwencja</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0101</td>
			<td>Flu-HA-B</td>
			<td>(306-318)</td>
			<td>Biotin-(Ahx)(Ahx)PRYVKQNTLKLAT-amide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0301</td>
			<td>Mioglobina</td>
			<td>(137-148)</td>
			<td>Biotin-(Ahx)-(Ahx)-LFRKDIAAKYKE-OH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0401</td>
			<td>YAR-B</td>
			<td>(1-14)</td>
			<td>Biotin-(Ahx)(Ahx)YARFQSQTTLKQKT-OH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0701</td>
			<td>TetTox-B</td>
			<td>(830-843)</td>
			<td>Biotin-(Ahx)(Ahx)QYIKANSKFIGITE-OH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1101</td>
			<td>Flu-HA-B</td>
			<td>(306-318)</td>
			<td>Biotin-(Ahx)(Ahx)PRYVKQNTLKLAT-amide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1501</td>
			<td>MBP-B </td>
			<td>(84-102)</td>
			<td>Biotin-(Ahx)(Ahx)NPVVHFFKNIVTPRTPPPS-OH</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
*Z uwagi na ekonomię zalecamy zamawianie w skali 10 mg. 
Tabela 3. Peptydy kontrolne dla różnych alleli MHC II.*
<ol>
	<li>Rozcieńczyć peptyd kontrolny (przechowywany w stężeniu 400 µM w DMSO) w stosunku 1:20 w świeżym DMSO, aby uzyskać roztwór zapasowy o stężeniu 20 µM.
	<ol>
		<li>Dodać 25 µl peptyd kontrolny 400 µM do 475 µl DMSO. Uwaga: jest to znaczna nadwyżka, która jednak umożliwia precyzyjne pipetowanie lepki roztworów DMSO.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dalej rozcieńczyć peptyd kontrolny z kroku 5.1 (20 µM) w stosunku 1:100 w MHC II Master Mix z kroku 3.2.
	<ol>
		<li>Dodać 28,8 µl peptyd kontrolny rozcieńczony w kroku 5.2 do pozostałych 2 850,5 µl MHC II Master Mix.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 21,5 µl MHC II Master Mix z peptydem kontrolnym (krok 5.2) do studni kontroli pozytywnej w polipropylenowej płytce 384-dołkowej (krok 4.2) (Rysunek 1A). Uwaga: próbka ta stanowi kontrolę pozytywną o wysokim sygnale, zawierającą białko MHC II, peptyd kontrolny i BRAK badanego peptydu.</li>
</ol>
6. Przeprowadzenie reakcji wiązania (Dzień 1)
<ol>
	<li>Dodaj MHC II Master Mix zawierający peptyd kontrolny (krok 5.2) do każdego z rozcieńczeń peptydów testowych (krok 2.1) w stosunku 1:1, aby przygotować reakcję wiązania.
	<ol>
		<li>Dodaj 21,5 µl MHC II Master Mix zawierającego peptyd kontrolny z kroku 5.2 do 21,5 µl każdego rozcieńczenia peptydów testowych z kroku 2.1. (robot do obsługi cieczy)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zabezpiecz reakcję wiązania folią poliestrową i inkubuj przez 12-24 h w inkubatorze bez kontroli poziomu CO2 w temperaturze 37 °C bez wytrząsania.</li>
</ol>
7. Neutralizacja i przeniesienie reakcji wiązania (Dzień 2)
<ol>
	<li>Wyjmij 384-dołkową płytkę polipropylenową zawierającą reakcję wiązania (krok 6.2) z inkubatora ustawionego na 37 °C.</li>
	<li>Rozcieńcz reakcję wiązania w stosunku 1:1 buforem neutralizującym. (robot do obsługi cieczy)
	<ol>
		<li>Dodaj 43 µl buforu neutralizującego do każdego dołka z reakcją wiązania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjmij płytkę ELISA (krok 1.3) z temperatury 4 °C i przemyj 3x za pomocą 60 ml/well PBS-0,05% Tween 20. (myjka do płytek)</li>
	<li>Przenieś 25 μl każdej zneutralizowanej reakcji wiązania z kroku 7.2 do dołków w trzech powtórzeniach na powleczonej przeciwciałami 384-dołkowej płytce ELISA z kroku 7.3. (Rycina 1) (robot do obsługi cieczy)</li>
	<li>Przykryj płytkę ELISA folią poliestrową i umieść w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 2,5 h lub w lodówce w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
</ol>
8. Opracowanie testu ELISA (Dzień 2 lub 3)
<ol>
	<li>Wyjąć płytkę ELISA z kroku 7.5 i przemyć 3 razy, używając 60 µl/well PBS-0,05% Tween. (myjka do płytek)</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór zapasowy Streptavidyny-Europu (0,1 mg/ml streptavidyny, 7 Eu3+/streptavidyna) 1000-krotnie w buforze do testu DELFIA (DELFIA Assay Buffer).
	<ol>
		<li>Dla jednej płytki 384-dołkowej rozcieńczyć 10 µl Streptavidyny-Europu w 10 ml buforu do testu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 25 µl rozcieńczonej Streptavidyny-Europu do każdej studni 384-dołkowej płytki ELISA z kroku 8.1. (robot do obsługi cieczy)</li>
	<li>Przykryć płytkę folią poliestrową i pozostawić w ciemności w temperaturze pokojowej na 1 hr. Uwaga: W czasie 1-godzinnej inkubacji wyjąć roztwór wzmacniający (Enhancement Solution) z lodówki i odstawić 10 ml/płytka w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po 1-godzinnej inkubacji przemyć 384-dołkową płytkę ELISA z kroku 8.3 3x, używając 60 µl/well PBS-0,05% Tween. (myjka do płytek)</li>
	<li>Dodać 25 µl roztworu wzmacniającego (Enhancement Solution) do każdej studni 384-dołkowej płytki ELISA z kroku 8.5. (robot do obsługi cieczy)</li>
	<li>Przykryć 384-dołkową płytkę ELISA folią poliestrową i pozostawić w ciemności w temperaturze pokojowej na 10-15 min.</li>
	<li>Po 10-15 minutowej inkubacji odczytać fluorescencję 384-dołkowej płytki ELISA z kroku 8.7, korzystając z czytnika płytek z rozdzielczością czasową (time resolved fluorescent plate reader) z ustawieniami dla Europu (na przykład, Start Int: 200, Stop Int: 1 000, Ex. 340, Em. 615, Cutoff: None, PMT: Auto, Reads/Well: 50).</li>
</ol>
9. Analiza danych
<ol>
	<li>Wprowadź dane do wykresu w formacie XY z trzema wartościami powtórzeniami w sąsiednich kolumnach (X=stężenie peptydu testowego; Y=pomiar fluorescencji).</li>
	<li>Wykonaj transformację logarytmiczną wartości X dla wszystkich danych: X=log(X)</li>
	<li>Dopasuj dane po transformacji logarytmicznej do modelu jednowarstwowego wiązania konkurencyjnego, aby wyznaczyć wartość IC50.</li>
	<li>Ogranicz wartość dolną (bottom) do średniej wartości kontroli negatywnej.</li>
	<li>Wykonaj globalne dopasowanie wartości górnej (top) i upewnij się, że parametr globalnego dopasowania jest mniejszy lub równy kontroli pozytywnej.</li>
</ol>

<ol><li>Steere, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic-refractory+Lyme+arthritis+is+associated+with+HLA-DR+molecules+that+bind+a+Borrelia+burgdorferi+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Antibiotic-refractory Lyme arthritis is associated with HLA-DR molecules that bind a Borrelia burgdorferi peptide.</a> J. Exp. Med. 203, 961-971 (2006).</li>
<li>Raddrizzani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+modes+of+peptide+interaction+enable+HLA-DQ+and+HLA-DR+molecules+to+bind+diverse+peptide+repertoires%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Different modes of peptide interaction enable HLA-DQ and HLA-DR molecules to bind diverse peptide repertoires.</a> J. Immunol. 159, 703-711 (1997).</li>
<li>Osipovitch, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+analysis+of+immune-evading+enzymes+for+ADEPT+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng.+Design%22%5BJournal%5D)">Design and analysis of immune-evading enzymes for ADEPT therapy.</a> Protein Eng. Design. 25, 613-623 (2012).</li>
<li>Moise, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico-accelerated+identification+of+conserved+and+immunogenic+variola%2Fvaccinia+T-cell+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">In silico-accelerated identification of conserved and immunogenic variola/vaccinia T-cell epitopes.</a> Vaccine. 27, 6471-6479 (2009).</li>
<li>Moise, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+HLA+DR+epitope+de-immunization+of+Factor+VIII+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Effect of HLA DR epitope de-immunization of Factor VIII in vitro and in vivo.</a> Clin. Immunol. 142, 320-331 (2012).</li>
<li>Aggarwal, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What%27s+fueling+the+biotech+engine-2011+to+2012%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">What's fueling the biotech engine-2011 to 2012.</a> Nat. Biotechnol. 30, 1191-1197 (2012).</li>
<li>Trombetta, E. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+antigen+processing+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo.</a> Ann. Rev. Immunol. 23, 975-1028 (2005).</li>
<li>Warmerdam, P. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+a+human+T-cell+region+in+staphylokinase+by+T-cell+screening+and+computer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Elimination of a human T-cell region in staphylokinase by T-cell screening and computer modeling.</a> Thrombosis Haemostasis. 87, 666-673 (2002).</li>
<li>Jones, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+removal+of+a+promiscuous+CD4%2BT+cell+epitope+from+the+C1+domain+of+factor+VIII%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thrombosis+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Identification and removal of a promiscuous CD4+T cell epitope from the C1 domain of factor VIII.</a> J. Thrombosis Haemostasis. 3, 991-1000 (2005).</li>
<li>Harding, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beta-lactamase+with+reduced+immunogenicity+for+the+targeted+delivery+of+chemotherapeutics+using+antibody-directed+enzyme+prodrug+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer%22%5BJournal%5D)">A beta-lactamase with reduced immunogenicity for the targeted delivery of chemotherapeutics using antibody-directed enzyme prodrug therapy.</a> Mol. Cancer. 4, 1791-1800 (2005).</li>
<li>Mazor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+elimination+of+an+immunodominant+T-cell+epitope+in+recombinant+immunotoxins+based+on+Pseudomonas+exotoxin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification and elimination of an immunodominant T-cell epitope in recombinant immunotoxins based on Pseudomonas exotoxin A.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E3597-E3603 (2012).</li>
<li>Cantor, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+enzyme+deimmunization+by+combinatorial+T-cell+epitope+removal+using+neutral+drift%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Therapeutic enzyme deimmunization by combinatorial T-cell epitope removal using neutral drift.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1272-1277 (2011).</li>
<li>Kern, F., LiPira, G., Gratama, J. W., Manca, F., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Ag-specific+immune+responses%3A+understanding+immunopathogenesis+and+improving+diagnostics+in+infectious+disease%2C+autoimmunity+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Measuring Ag-specific immune responses: understanding immunopathogenesis and improving diagnostics in infectious disease, autoimmunity and cancer.</a> Trends Immunol. 26, 477-484 (2005).</li>
<li>Li Pira, G., Ivaldi, F., Moretti, P., Manca, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+T+epitope+mapping+and+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High throughput T epitope mapping and vaccine development.</a> J. Biomed. Biotechnol. 2010, 325720(2010).</li>
<li>Hoffmeister, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+T+cell+epitopes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping T cell epitopes by flow cytometry.</a> Methods. 29, 270-281 (2003).</li>
<li>Singh, H., Raghava, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProPred%3A+prediction+of+HLA-DR+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ProPred: prediction of HLA-DR binding sites.</a> Bioinformatics. 17, 1236-1237 (2001).</li>
<li>Guan, P., Doytchinova, I. A., Zygouri, C., Flower, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHCPred%3A+bringing+a+quantitative+dimension+to+the+online+prediction+of+MHC+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MHCPred: bringing a quantitative dimension to the online prediction of MHC binding.</a> Appl. Bioinformatics. 2, 63-66 (2003).</li>
<li>Wan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SVRMHC+prediction+server+for+MHC-binding+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">SVRMHC prediction server for MHC-binding peptides.</a> BMC Bioinformatics. 7, 463(2006).</li>
<li>Bui, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+generation+and+evaluation+of+specific+MHC+binding+predictive+tools%3A+ARB+matrix+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Immunogenetics%22%5BJournal%5D)">Automated generation and evaluation of specific MHC binding predictive tools: ARB matrix applications.</a> Immunogenetics. 57, 304-314 (2005).</li>
<li>Nielsen, M., Lundegaard, C., Lund, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+MHC+class+II+binding+affinity+using+SMM-align%2C+a+novel+stabilization+matrix+alignment+method%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Prediction of MHC class II binding affinity using SMM-align, a novel stabilization matrix alignment method.</a> BMC Bioinformatics. 8, 238(2007).</li>
<li>Nielsen, M., Justesen, S., Lund, O., Lundegaard, C., Buus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NetMHCIIpan-2.0+-+Improved+pan-specific+HLA-DR+predictions+using+a+novel+concurrent+alignment+and+weight+optimization+training+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Immun.+Res%22%5BJournal%5D)">NetMHCIIpan-2.0 - Improved pan-specific HLA-DR predictions using a novel concurrent alignment and weight optimization training procedure.</a> Immun. Res. 6, 9(2010).</li>
<li>De Groot, A. S., Knopp, P. M., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De-immunization+of+therapeutic+proteins+by+T-cell+epitope+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">De-immunization of therapeutic proteins by T-cell epitope modification.</a> Dev. Biol. 122, 171-194 (2005).</li>
<li>Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+redesign+of+proteins+for+minimal+T-cell+epitope+content%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comput.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure-based redesign of proteins for minimal T-cell epitope content.</a> J. Comput. Chem. 34, 879-891 (2013).</li>
<li>Parker, A. S., Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-guided+deimmunization+of+therapeutic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure-guided deimmunization of therapeutic proteins.</a> J. Comput. Biol. 20, 152-165 (2013).</li>
<li>Parker, A. S., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+therapeutic+proteins+to+delete+T-cell+epitopes+while+maintaining+beneficial+residue+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bioinform.+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimization of therapeutic proteins to delete T-cell epitopes while maintaining beneficial residue interactions.</a> J. Bioinform. Comput. Biol. 9, 207-229 (2011).</li>
<li>Parker, A. S., Zheng, W., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+algorithms+for+functional+deimmunization+of+therapeutic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Optimization algorithms for functional deimmunization of therapeutic proteins.</a> BMC Bioinformatics. 11, 180(2010).</li>
<li>De Groot, A. S., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+risk%2C+improving+outcomes%3A+Bioengineering+less+immunogenic+protein+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Reducing risk, improving outcomes: Bioengineering less immunogenic protein therapeutics.</a> Clin. Immunol. 131, 189-201 (2009).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+assessment+of+MHC+class+II+peptide+binding+predictions+and+evaluation+of+a+consensus+approach%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach.</a> PLoS Comput. Biol. 4, e1000048(2008).</li>
<li>Sette, A., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+vaccinology%3A+developing+vaccines+in+the+era+of+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Reverse vaccinology: developing vaccines in the era of genomics.</a> Immunity. 33, 530-541 (2010).</li>
<li>Moise, L., Cousens, L., Fueyo, J., De Groot, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+power+of+genomics+and+immunoinformatics+to+produce+improved+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Harnessing the power of genomics and immunoinformatics to produce improved vaccines.</a> Expert Opin. Drug Discov. 6, 9-15 (2011).</li>
<li>Sturniolo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+tissue-specific+and+promiscuous+HLA+ligand+databases+using+DNA+microarrays+and+virtual+HLA+class+II+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices.</a> Nat. Biotechnol. 17, 555-561 (1999).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biologic+drugs+set+to+top+2012+sales%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Biologic drugs set to top 2012 sales.</a> Nat. Med. 18, 636(2012).</li>
<li>Seib, K. L., Zhao, X., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+vaccines+in+the+era+of+genomics%3A+a+decade+of+reverse+vaccinology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Infect%22%5BJournal%5D)">Developing vaccines in the era of genomics: a decade of reverse vaccinology.</a> Clin. Microbiol. Infect. 18, 109-116 (2012).</li>
<li>Jiang, W., Boder, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+engineering+and+analysis+of+peptide+binding+to+class+II+MHC%5BTitle%5D)+AND+%22+Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">High-throughput engineering and analysis of peptide binding to class II MHC.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13258-13263 (2010).</li>
<li>Justesen, S., Harndahl, M., Lamberth, K., Nielsen, L. -L. B., Buus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+recombinant+MHC+class+II+molecules+and+high-throughput+peptide-binding+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Immun%22%5BJournal%5D)">Functional recombinant MHC class II molecules and high-throughput peptide-binding assays.</a> Immun. 5, 1-20 (2009).</li>
</ol>

Leonard Moise jest zatrudniony i posiada opcje na akcje EpiVax, Inc., prywatnej firmy biotechnologicznej z siedzibą w Providence, RI. Praca zawarta w tym raporcie badawczym jest wolna od jakichkolwiek uprzedzeń, które mogą być związane z celami komercyjnymi firmy.

Bioterapeutyki stały się kamieniem węgielnym nowoczesnej medycyny, stanowiąc cztery z pięciu najlepiej sprzedających się leków w 2012 r.32. Sektor biofarmaceutyczny od kilku lat wykazuje stały wzrost6 , a ciągły rozwój nowych leków, a także pojawienie się leków biopodobnych poszerzyły linie biofarmaceutyczne. Patrząc w przyszłość, ocena i łagodzenie immunogenności terapii białkowych stanie się integralną częścią wczesnego etapu rozwoju bioterapeutyków. Aby ułatwić ten proces, biotechnolodzy mogą sko...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/51308/a-high-throughput-mhc-ii-binding-assay-for-quantitative-analysis">A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes</a>.&#160; There were typos in the Protocol section and Table 2.
Step 3.1.1 in the Protocol was updated from:
Add 80 &#181;l of 1 mM Pefa Bloc and 60 mg of octyl-&#946;-D-glucopyranaside to 3,920 &#181;l of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).
to:
Add 80 &#181;l of 1 mM Pefa Bloc and 60 &#181;g of octyl-&#946;-D-glucopyranaside to 3,920 &#181;l of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).
Step 5.2&#160;in the Protocol was updated from:
Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 mM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.
to:
Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 &#181;M) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.
Table 2 was updated from:
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="376">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MHC II Allele DRB1*:</td>
			<td>1501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (mg/ml)</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (mM)</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. MHC II Stock to Add (ml)</td>
			<td>14.65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. Reaction Buffer to Add (ml):</td>
			<td>2885.35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Master Mix Concentration (nM)</td>
			<td>101</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
to:
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="376">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MHC II Allele DRB1*:</td>
			<td>1501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (mg/ml)</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (&#956;M)</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. MHC II Stock to Add (&#956;l)</td>
			<td>14.65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. Reaction Buffer to Add (&#956;l):</td>
			<td>2885.35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Master Mix Concentration (nM)</td>
			<td>101</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/51308/a-high-throughput-mhc-ii-binding-assay-for-quantitative-analysis">A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes</a>.&#160; There were typos in the Protocol section and Table 2.

Erratum: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Białka to najszybciej rosnąca klasa środków terapeutycznych6, a szybki rozwój linii bioterapeutycznych skupił coraz większą uwagę na wyzwaniach związanych z rozwojem i stosowaniem leków białkowych. Jedna wyjątkowa kwestia wynika z faktu, że w zdrowym i funkcjonującym układzie odpornościowym wszystkie białka zewnątrzkomórkowe są próbkowane przez komórki prezentujące antygen (APC). Po internalizacji przez APC, białko jest rozszczepiane na małe fragmenty peptydu, a przypuszczalne segmenty immunogenne są ładowane do rowka białek głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy II (MHC II). Kompleksy peptyd-MHC II są następnie wyświetlane na powierzchni APC, a prawdziwe peptydy immunogenne, zwane epitopami komórek T, tworzą trójskładnikowe kompleksy receptorów komórek T MHC II-peptyd-T z pokrewnymi receptorami powierzchniowymi komórek TCD4 7. To krytyczne zdarzenie rozpoznawania molekularnego inicjuje złożoną kaskadę sygnalizacyjną, która powoduje aktywację limfocytów T, uwalnianie cytokin, dojrzewanie limfocytów B za pośrednictwem limfocytów T CD4 i ostatecznie wytwarzanie krążących przeciwciał IgG, które wiążą się z obraźliwym białkiem egzogennym i usuwają je. W ten sposób białka immunogenne mogą być odimmunizowane poprzez identyfikację epitopów składowych limfocytów T i mutację kluczowych reszt odpowiedzialnych za tworzenie kompleksu MHC II. Należy jednak zauważyć, że epitopy limfocytów T mogą być liczne i szeroko rozpowszechnione w białkach immunogennych, a większość mutacji usuwających epitopy może powodować niezamierzoną utratę funkcji lub stabilności białka. W związku z tym inżynieria odimmunizowanych terapii biologicznych może być złożonym i technicznie trudnym celem, ale istnieje kilka przykładów udanych projektów delecji epitopów limfocytów T3,5,8-12. W przeciwieństwie do "humanizacji" opartej na szczepieniu, która jest w dużej mierze ograniczona do terapii przeciwciałami, delecja epitopu może być zastosowana do zasadniczo każdego celu białkowego, niezależnie od sekwencji, struktury, funkcji lub dostępności homologicznych ludzkich rusztowań. Pierwszym krokiem do wdrożenia takiego podejścia jest identyfikacja kluczowych epitopów peptydowych osadzonych w docelowej sekwencji białka.
Wysokoprzepustowe testy biochemiczne z wykorzystaniem syntetycznych peptydów i rekombinowanych ludzkich cząsteczek MHC II mogą dostarczyć szybkiego wstępnego wglądu w identyfikację epitopów i łagodzenie skutków1,3-5. Te testy typu ELISA mogą być potężnym uzupełnieniem innych narzędzi do projektowania i opracowywania białek/szczepionek. Na przykład jedno z dobrze ugruntowanych eksperymentalnych podejść do mapowania epitopów opiera się na czasochłonnych, pracochłonnych i zasobochłonnych testach proliferacji komórek ex vivo 15. Krótko mówiąc, pierwotna sekwencja białka docelowego jest najpierw dzielona na panel nakładających się peptydów, często 15-merów z 12 resztami nakładającymi się na sąsiednie peptydy. Panel peptydowy jest syntetyzowany chemicznie, a immunogenność każdego peptydu jest testowana w jednym z kilku różnych testów immunologicznych, które wykorzystują komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) wyizolowane od ludzkich dawców13,14. Aby zapewnić większą pewność wyników, peptydy są zwykle testowane w replikacji z PBMC od 50 lub więcej różnych dawców. W przypadkach, w których deimmunizacja jest ostatecznym celem, prace są dodatkowo komplikowane przez konieczność wyprodukowania dodatkowych paneli zmutowanych peptydów i przetestowania nowych paneli peptydowych w testach PBMC przed wprowadzeniem jakichkolwiek mutacji deimmunizujących do białka o pełnej długości w celu późniejszej analizy funkcjonalnej10. Chociaż te testy komórkowe pozostają złotym standardem w ocenie potencjału immunogennego u ludzi, skuteczność takiego wyczerpującego podejścia można poprawić poprzez wstępną filtrację przypuszczalnych epitopów immunogennych przy użyciu szybkiego i wysokoprzepustowego testu wiązania peptydów MHC II.
Podobnie, biochemiczne testy wiązania peptyd-MHC II mogą być połączone z metodami predykcyjnymi in silico, aby radykalnie przyspieszyć proces identyfikacji epitopów. Istnieje wiele narzędzi obliczeniowych do przewidywania epitopów limfocytów T; Przykłady obejmują ProPred16, MHCPred17, SVRMHC18, ARB19, SMM-align20, NetMHCIIpan21, a także zastrzeżone narzędzia, takie jak EpiMatrix firmy EpiVax22. Podobnie, predyktory epitopów zostały ostatnio połączone z innymi narzędziami bioinformatycznymi i modelowania molekularnego w celu uzyskania zintegrowanych algorytmów deimmunizacji białek zaprojektowanych w celu zmniejszenia ryzyka, że mutacje deimmunizujące mogą zakłócić strukturę i funkcję białka23-26. Podczas gdy kilka predyktorów epitopów okazało się dość dokładnych27,28, wyniki obliczeniowe niezmiennie wymagają walidacji eksperymentalnej. Szybkie, wysokowydajne i opłacalne metody eksperymentalne najlepiej nadają się jako filtr wstępny do przewidywania epitopów in silico.
Podobnie predyktory epitopów mogą kierować selekcją antygenów do odwróconej wakcynologii29,30. Na przykład postępy w bioinformatyce zaowocowały badaniami przesiewowymi całego genomu, które szybko identyfikują kandydatów na szczepionki w postaci całych białek lub epitopów peptydowych wyekstrahowanych z proteomów patogenów. Chociaż ta technologia wspomagająca zmienia proces odkrywania i opracowywania szczepionek ochronnych, wprowadza nowe wyzwanie w postaci nieubłaganie długich list kandydatów na szczepionki immunogenne. Wysokoprzepustowe testy wiązania peptydu-MHC II mogą kierować selekcją epitopów poprzez ilościowe określenie powinowactwa wiązania peptydów i rozwiązłości wiązania między wieloma allelami MHC II. Podobnie jak w przypadku deimmunizacji białek, takie metody eksperymentalne są ostatecznie wymagane do walidacji przewidywania obliczeniowego obiecujących potencjalnych szczepionek.
Tutaj opisany jest test wiązania peptyd-MHC II skalowany do formatu 384-dołkowego. Protokół jest wysoce zrównoleglony i zmniejsza koszty odczynników o 75% w porównaniu z wcześniej opisanymi formatami płytek 96-dołkowych1,3-5. Metoda ta, wykorzystująca jednego robota do obsługi cieczy, pozwala jednemu badaczowi łatwo przeanalizować około dziewięćdziesięciu peptydów testowych w trzech egzemplarzach w zakresie ośmiu stężeń i czterech typów alleli MHC II w czasie krótszym niż 48 godzin. W tym artykule opisano konfigurację jednej 384-dołkowej płytki ELISA do analizy siedmiu eksperymentalnych peptydów przeciwko jednemu allelowi MHC II, ale kalkulatory arkuszy kalkulacyjnych są dostarczane jako materiał dodatkowy, aby łatwo przeskalować eksperyment do dowolnej liczby pożądanych peptydów i / lub cząsteczek MHC II.

<table><tbody><tr><td>Tetraboran sodu Dekahydrat</td><td>Sigma</td><td>221732</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Sigma</td><td>C1901</td><td></td></tr><tr><td>Dizasadowy fosforan sodu</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>Trizma HCl</td><td>OmniPur</td><td>9310</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>100% DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Oktyl-& beta;-D-Glucopyranaside</td><td>Fischer</td><td>29836-26-8</td><td></td></tr><tr><td>Pefa Bloc SCF</td><td>Roche</td><td>1158591600</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Invitrogen</td><td>14200-166</td><td></td></tr><tr><td>DELFIA Bufor</td> testowy <td>Perkin Elmer</td><td>4002-0010</td><td></td></tr><tr><td>DELFIA Enhancement Buffer</td><td>Perkin Elmer</td><td>4001-0010</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna znakowana europem</td><td>Perkin Elmer</td><td>1244-360</td><td></td></tr><tr><td>L243 przeciwciało anty-HLA-DR</td><td>Biolegend</td><td>307602</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowane Peptydy znacznikowe</td><td>21st Century Biochemicals</td><td>na zamówienie Peptydy</td><td></td></tr><tr><td>testowe (1-4 mg, czystość 85%)</td><td>Genscript</td><td>Na zamówienie</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczone monomery HLA-DRB1 (niebiotynylowane)</td><td>Instytut Badawczy Benaroya*</td><td>Zamówienie</td><td></td>niestandardowe</tr><tr><td>384-dołkowa biała płytka EIA/RIA</td><td>Thermo</td><td>460372</td><td></td></tr><tr><td>Polipropylenowa płytka 384-dołkowa</td><td>Costar</td><td>3656</td><td></td></tr><tr><td>Folia, AxySeal, 80 i mikro; m, Aplikator ELISA&nbsp;</td><td>Axygen Ascientific</td><td>PCR-SP</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ Water</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Epimotion Liquid Handler (lub podobny)</td><td>Eppendorf</td><td>5075</td><td></td></tr><tr><td>Select TS Plate Washer (lub podobny)</td><td>BioTek</td><td>405</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax Gemini Microplate Reader (lub podobny)</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">*Rekombinowane ludzkie cząsteczki MHC II można uzyskać w laboratorium Benaroya Tetramer Core Laboratory.&nbsp; Odesłanie: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory</td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowy test wiązania mhc ii do analizy ilościowej epitopów peptydowych

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Testy biochemiczne z rekombinowanymi ludzkimi cząsteczkami MHC II mogą dostarczyć szybkich, ilościowych wglądów w identyfikację, delecję lub projekt epitopów immunogennych1,2. W tym przypadku test wiązania peptydu-MHC II jest skalowany do formatu 384-dołkowego. Zmniejszony protokół zmniejsza koszty odczynników o 75% i zapewnia wyższą przepustowość niż wcześniej opisane protokoły 96-dołkowe1,3-5. W szczególności projekt eksperymentalny pozwala na solidną i powtarzalną analizę do 15 peptydów przeciwko jednemu allelowi MHC II na 384-dołkową płytkę ELISA. Wykorzystując jednego robota do obsługi cieczy, metoda ta pozwala jednemu badaczowi przeanalizować około dziewięćdziesięciu peptydów testowych w trzech egzemplarzach w zakresie ośmiu stężeń i czterech typów alleli MHC II w czasie krótszym niż 48 godzin. Inni pracujący w dziedzinie deimmunizacji białek lub projektowania i opracowywania szczepionek mogą uznać protokół za przydatny w ułatwianiu własnej pracy. W szczególności instrukcje krok po kroku i format wizualny JoVE powinny pozwolić innym użytkownikom na szybkie i łatwe wdrożenie tej metodologii w ich własnych laboratoriach.

Sekwencję dojrzałego peptydu beta-laktamazy (BLA) Enterobacter cloacae P99 (Genbank ID# X07274.1) przeanalizowano za pomocą programu ProPred16 w celu zidentyfikowania potencjalnych peptydów wiążących allel MHC II DRB1*1501 (Tabela 4). Program ProPred zidentyfikował 117 peptydów nonamerowych z obowiązkowym resztą kotwiczącą P1 (t.j. M, L, I, V, F, Y lub W w pozycji 1, co jest wymagane do wiązania z MHC II31). Przy progu 5%, prawdopodobnymi wiązadłami są tylko peptyd...

Testy biochemiczne z rekombinowanymi ludzkimi cząsteczkami MHC II mogą dostarczyć szybkich, ilościowych wglądów w identyfikację, delecję lub projektowanie epitopów immunogennych. Tutaj opisany jest test wiązania peptyd-MHC II skalowany do płytek 384-dołkowych. Ten opłacalny format powinien okazać się przydatny w dziedzinie deimmunizacji białek oraz projektowania i opracowywania szczepionek.

Wysokoprzepustowy test wiązania MHC II do analizy ilościowej epitopów peptydowych

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe określenie wiązania krótkich peptydów z ludzkimi białkami odpornościowymi MHC klasy II przy użyciu wysokoprzepustowego testu na płytce 384-dołkowej. Osiąga się to poprzez przeprowadzenie w pierwszym kroku testów wiązania konkurencyjnego w fazie roztworowej z wykorzystaniem wybranych peptydów. W drugim kroku zrównoważone kompleksy peptyd-MHC klasy II są wychwytywane za pomocą przeciwciała przeciwko MHC klasy II unieruchomionego na płytkach ELISA o wysokim wiązaniu.Następnie uchwycone kompleksy inkubuje się ze streptawidyną znakowaną opium, po czym nie związaną streptawidynę wypłukuje się, a uchwycone opium aktywuje. Ostatecznie, do ilościowego oznaczenia poziomów MHC two uchwyconego peptydu kontrolnego można zastosować fluorymetrię z rozdzielczością czasową. Metoda ta może dostarczyć wstępnych informacji na temat potencjału immunogennego białek docelowych.Jest to szczególnie przydatne do walidacji wyników predyktorów in silico. Procedurę należy rozpocząć od dodania 25 µL świeżo rozcieńczonego roztworu przeciwciała L 2 43 do każdego dołka białej płytki ELISA o wysokim powinowactwie (high binding) z 384 dołkami. Płytkę należy uszczelnić folią poliestrową i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Następnie, zaczynając od roztworu zapasowego o stężeniu 10 mM dla każdego testu.Przygotować następujące serie rozcieńczeń peptydów i DMSO oraz buforu cytrynianowo-fosforanowego, wykorzystując trzy polipropylenowe płytki 84-dołkowe. Należy pamiętać, że pełna polipropylenowa płytka 84-dołkowa wymaga użycia trzech oddzielnych płytek EIA, zgodnie z ilustracją. Następnie, w 15 ml probówce stożkowej, rozcieńczyć wybrane roztwory stokowe MHC II do stężenia 101 nM w buforze reakcyjnym.Następnie rozcieńczyć peptyd kontrolny z poziomu 20 µM w stosunku 1:100 w świeżo przygotowanej mieszaninie głównej MHC II i dodać 21,5 µL mieszaniny głównej MHC II z peptydem kontrolnym do studni kontroli pozytywnej. Do każdego z rozcieńczeń peptydów testowych na polipropylenowej płytce 384-dołkowej dodać mieszaninę główną MHC II zawierającą peptyd kontrolny w stosunku 1:1, aby w tym czasie utworzyć reakcję wiązania. Na koniec uszczelnić reakcję wiązania folią poliestrową i inkubować płytkę przez 12 do 24 godzin w inkubatorze bez kontroli poziomu CO2 w temperaturze 37 °C bez wytrząsania.Następnego dnia rozcieńczyć studzienki z reakcją wiązania na płytce 384-dołkowej w stosunku jeden do jednego z buforem neutralizującym. Następnie wypłukać płytkę ELISA trzykrotnie, używając 60 µL PBS 0,05% na studzienkę. W kolejnym kroku przenieść 25 µL każdego zneutralizowanego roztworu reakcji wiązania z płytki 384-dołkowej w trzech powtórzeniach do płytki 384-dołkowej pokrytej przeciwciałami.Napełnij dołki płytki ELISA, a następnie inkubuj płytkę ELISA przykrytą folią poliestrową w temperaturze 4 °C przez noc. Po inkubacji przemyj płytkę ELISA trzy razy, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, a następnie dodaj 25 µL świeżo rozcieńczonego streptawidyny-opium do każdego dołka. Inkubuj płytkę przykrytą folią poliestrową w ciemności w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.Podczas inkubacji, po upływie jednej godziny, doprowadzić 10 mililitrów roztworu wzmacniającego na płytkę do temperatury pokojowej, również w ciemności, przemyć płytkę ELISA w sposób zademonstrowany, a następnie dodać 25 mikrolitrów roztworu wzmacniającego do każdej studni i inkubować płytkę przykrytą folią poliestrową przez 10 do 15 minut w ciemności. Na koniec odczytać fluorescencję za pomocą czytnika płytek do fluorescencji z rozdzielczością czasową z optymalnymi ustawieniami. W tym reprezentatywnym eksperymencie przeanalizowano dojrzałą sekwencję peptydową beta-laktamazy Enterobacter cloacae P99 pod kątem potencjalnych binderów peptydowych do allelu MHC II.Zidentyfikowano peptydy DRB1*15:01 oraz HLA-DRB1*11:17, które posiadały obowiązkowy resztą kotwiczącą P1 w pozycji pierwszej, niezbędną do wiązania z MHC klasy II, wyłącznie przy progu 5%. Peptydy z wynikami większymi lub równymi 2,6 są prawdopodobnymi binderami. Zatem przy progu 5% przewiduje się, że tylko 11 najlepszych peptydów wiąże się z MHC klasy II DRB1*15:01.Do analizy w tym teście wiązania MHC klasy II wybrano reprezentatywny panel przewidywanych epitopów. Fragmenty peptydowe beta-laktamazy o długości 15 reszt zostały zsyntetyzowane chemicznie w taki sposób, aby domniemane nonamerowe epitopy MHC klasy II były osadzone wewnątrz tych syntetycznych fragmentów białka. Następnie przeanalizowano zdolność tych syntetycznych peptydów do konkurowania z kontrolnym biotynylowanym peptydem B białka zasadowego mieliny o wiązanie z MHC klasy II DRB 1 15 0 1, zgodnie z wcześniejszą demonstracją.Krzywe konkurencyjnego wiązania dla syntetycznych peptydów przedstawiono tutaj. Wartości IC 50 obliczono poprzez dopasowanie danych poddanych transformacji logarytmicznej przy użyciu nieliniowej funkcji dopasowania dla konkurencyjnego wiązania w jednym miejscu w programie Prism. Jak wynika z tabeli oraz wykresu, peptydy naturalnie podzieliły się na trzy grupy: silnie wiążące z IC 50 poniżej 1 µM, umiarkowanie wiążące z IC 50 większym lub równym 1 µM, ale mniejszym niż 100 µM, oraz słabo wiążące z IC 50 większym lub równym 100 µM po ich opracowaniu.Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedzin immunologii molekularnej i projektowania bioterapeutyków do pełniejszego zgłębienia kluczowych zdarzeń rozpoznawania molekularnego, które leżą u podstaw odpowiedzi immunologicznych przeciwko białkom u pacjentów.

a-high-throughput-mhc-ii-binding-assay-for-quantitative-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wysokoprężna metoda wiązania MHC II do ilościowej analizy epitopów peptydowych

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie tetramerów peptyd:MHC oraz magnetycznych mikrokulek do izolacji populacji limfocytów T specyficznych dla epitopu o niskiej częstotliwości oraz ich analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta umożliwia bezpośrednie badanie endogennych populacji limfocytów T w systemach eksperymentalnych in vivo.

Wzbogacanie limfocytów T swoistych dla epitopu z wykorzystaniem tetramerów peptyd-MHC

Ten film demonstruje technikę, która wykorzystuje technologię mikromacierzy peptydowych do profilowania specyficzności przeciwciał rozpoznających modyfikacje potranslacyjne (PTM) na peptydach histonowych. Szkiełko mikromacierzy zawierające unieruchomione peptydy histonowe sprzężone z fluoroforem ze znanymi kombinacjami PTM poddaje się działaniu docelowych przeciwciał specyficznych dla PTM. Proces ten pomaga zidentyfikować swoistość przeciwciała dla celu i jego potencjalną reaktywność krzyżową z...

Technologia mikromacierzy peptydowych do profilowania swoistości przeciwciał

Ten manuskrypt opisuje, jak przeprowadzić (pojedyncze cząsteczki) testy oparte na transferze energii rezonansu Förstera (FRET) w celu zmierzenia dynamiki wiązania między receptorem antygenu limfocytów T (TCR) a cząsteczkami MHC naładowanymi peptydami antygenowymi, które występują w synapsie immunologicznej limfocytu T w kontakcie z funkcjonalizowaną dwuwarstwą lipidową podpartą planarnie.

Pomiar wiązania TCR-pMHC in situ za pomocą testu mikroskopowego opartego na FRET

Tutaj opisujemy metody, które powszechnie stosujemy w laboratorium, aby określić, jak natura interakcji między receptorem limfocytów T a antygenami nowotworowymi, prezentowana przez ludzkie antygeny leukocytów, reguluje funkcjonalność komórek T; metody te obejmują produkcję białek, krystalografię rentgenowską, biofizykę i eksperymenty z funkcjonalnymi komórkami T.

Wykorzystanie krystalografii rentgenowskiej, biofizyki i testów funkcjonalnych do określenia mechanizmów rządzących rozpoznawaniem antygenów nowotworowych przez receptory komórek T

Tutaj opisujemy test chromatograficzny połączony z separacją ruchliwości jonów prekursorów peptydów, po której następuje detekcja MS w wysokiej rozdzielczości (~30 000) MS dla kwantyfikacji wzorców peptydów wzbogaconych w trawieniu przeciwciał monoklonalnych.

Test HS-MRM do oznaczania ilościowego białek komórek gospodarza w biofarmaceutykach białkowych za pomocą chromatografii cieczowej Mobilność jonów Spektrometria mas QTOF

Tutaj autorzy prezentują prosty i skuteczny protokół definiowania liniowego epitopu antygenowego za pomocą oczyszczonego przeciwciała monoklonalnego i skanowania peptydowego poprzez hybrydyzację kropkowo-plamową. Zidentyfikowany epitop może być następnie wykorzystany w zastosowaniach terapeutycznych i diagnostycznych.

Wspomagana skanowaniem peptydowym identyfikacja liniowego epitopu limfocytów B rozpoznanego przez przeciwciało monoklonalne

Biblioteki wyświetlania bakterii w biopanowaniu to sprawdzona technika odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego, solidna alternatywa dla przeciwciał. Półautomatyczna metoda sortowania usprawniła biopanoramowanie w celu zmniejszenia występowania wyników fałszywie dodatnich. Poniżej ilustrujemy proces myślowy i techniki stosowane w ocenie kandydatów i minimalizacji dalszej analizy.

Półautomatyczne biopanowanie bakteryjnych bibliotek wyświetlających w celu odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego i analizy otrzymanych izolatów

Qa-1 (HLA-E u człowieka) należy do grupy nieklasycznych cząsteczek głównego kompleksu zgodności tkankowej 1b. Wykazano, że immunizacja epitopami wiążącymi Qa-1 zwiększa tkankową regulację immunologiczną i łagodzi kilka chorób autoimmunologicznych. W niniejszym artykule opisujemy nakładającą się strategię biblioteki peptydów do identyfikacji epitopów Qa-1 w białku.

Nakładająca się biblioteka peptydów do mapowania epitopów Qa-1 w białku

Tutaj prezentujemy protokół jakościowego wykrywania ex vivo specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8+. Analiza jest możliwa w przypadku zawiesin pojedynczych komórek z narządów lub z niewielkich ilości krwi. Szeroki zakres badań wymaga analizy odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T (badania nad szczepieniami i immunoterapią nowotworów).

Jednoczesna kwantyfikacja limfocytów T CD8 + specyficznych dla antywektorów i anty-transgenów za pomocą barwienia tetramerem MHC I po szczepieniu wektorem wirusowym

Na podstawie matrycy peptydowej pochodzącej z wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV), odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficzne dla HBV mogą być oceniane równolegle z identyfikacją epitopów limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV.

Analiza odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV i identyfikacja epitopów komórek T CD4 ograniczonych do HLA-DR na podstawie matrycy peptydowej

Tutaj prezentujemy protokół oczyszczania kompleksów peptydowych MHC klasy I i klasy II z linii komórkowych myszy i ludzi, dostarczając wysokiej jakości danych immunopeptydomowych. Protokół koncentruje się na przygotowaniu próbki przy użyciu dostępnych na rynku przeciwciał.

Immunopeptydomika: izolacja mysich i ludzkich peptydów związanych z MHC klasy I i II do analizy spektrometrii mas

Poznaj wysokoprzepustowy test wiązania peptydów z MHC II w formacie 384-well do analizy ilościowej epitopów immunogennych. Ta metoda wspiera projektowanie szczepionek i badania immunologiczne.

Wysokoprzepustowy test wiązania MHC II do analizy ilościowej epitopów peptydowych

Przeglądaj więcej filmów