Wysokoprzepustowy test wiązania MHC II do analizy ilościowej epitopów peptydowych

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie wiązania krótkich peptydów z ludzkimi białkami odpornościowymi MHC przy użyciu wysokoprzepustowego testu płytkowego 3 84-dołkowego. Osiąga się to poprzez pierwsze wykonanie testów wiązania konkurencji w fazie roztworu z peptydami będącymi przedmiotem zainteresowania. W drugim etapie zrównoważone kompleksy peptydowe MHC two są wychwytywane za pomocą przeciwciała anty MHC two unieruchomionego na płytkach ELIZA o wysokim poziomie wiązania.

Następnie schwytane kompleksy są inkubowane z opium znakowanym streptawidyną, a następnie niezwiązana streptawidyna jest wypłukiwana, a wychwycone opium jest aktywowane. Ostatecznie fluorometria czasowo-rozdzielcza może być wykorzystana do ilościowego określenia poziomów wychwyconego peptydu kontrolnego MHC dwa. Metoda ta może dostarczyć wstępnych informacji na temat potencjału immunogennego docelowych białek.

Jest to szczególnie przydatne do walidacji wyników predyktorów in silico, Rozpocznij procedurę od dodania 25 mikrolitrów świeżo rozcieńczonego roztworu przeciwciała L 2 43 do każdej studzienki 3 84. Dobrze wiążąca biała płytka ELIZA uszczelniła płytkę folią poliestrową i inkubowała przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie zaczynając od 10-milimolowego zapasu każdego testu.

Peptyd i DMSO tworzą następującą serię rozcieńczeń i bufor fosforanu cytrynianu przy użyciu 3 84-dołkowych płytek polipropylenowych. Należy pamiętać, że pełna płyta polipropylenowa z 3 84 dołkami wymaga trzech oddzielnych płyt EIA, jak pokazano na ilustracji. Następnie rozcieńczyć wybrane roztwory podstawowe MHC do stężenia 101 nanomolowych w buforze reakcyjnym za pomocą 15-mililitrowej stożkowej probówki.

Następnie rozcieńczyć peptyd kontrolny od 20 mikromolów do stosunku jeden do 100 w świeżo przygotowanej mieszance MHC two master i dodać 21,5 mikrolitra mieszaniny MHC two master z peptydem kontrolnym do kontroli pozytywnej. Studzienka 3 84-dołkowej płytki polipropylenowej, dodać dwie główne mieszanki MHC zawierające peptyd kontrolny do każdego z rozcieńczeń peptydu testowego w stosunku jeden do jednego, aby wywołać reakcję wiązania również w tym czasie. Na koniec zamknąć reakcję wiązania folią poliestrową i inkubować płytkę przez 12 do 24 godzin w inkubatorze bez kontroli dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez wstrząsania.

Następnego dnia rozcieńczyć studzienki reakcji wiązania w 3 84. Płytka studzienkowa w stosunku jeden do jednego z buforem neutralizacyjnym. Następnie przemyć płytkę Eliza trzykrotnie 60 mikrolitrami PBS 0,05% na dołek między 20 następnymi przeniesieniami, 25 mikrolitrów każdego zobojętnionego roztworu reakcji wiązania z płytki 3 84 dołkowej w trzech powtórzeniach do przeciwciała pokrytego 3 84.

Cóż, płytka Eliza następnie inkubuje płytkę ELIZA pokrytą folią poliestrową w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc po inkubacji. Umyj płytkę ELIZA trzy razy, jak pokazano, a następnie dodaj do każdej z nich 25 mikrolitrów świeżo rozcieńczonego paciorkowca z opium. Dobrze inkubować płytkę pokrytą folią poliestrową w ciemności w temperaturze pokojowej przez godzinę.

Podczas inkubacji po godzinie doprowadzić 10 mililitrów roztworu wzmacniającego na płytkę do temperatury pokojowej również w ciemności, umyć płytkę ELIZA, jak pokazano, a następnie dodać 25 mikrolitrów roztworu wzmacniającego do każdej studzienki i inkubować płytkę pokrytą folią poliestrową przez 10 do 15 minut w ciemności. Na koniec odczytaj fluorescencję za pomocą czasowo-rozdzielczego czytnika płytek fluorescencyjnych z ustawieniami opium. W tym reprezentatywnym eksperymencie dojrzała sekwencja peptydowa enterobacter Cloe Cloe P dziewięć dziewięć beta-laktamazy została przeanalizowana pod kątem przypuszczalnych wiązań peptydowych z drugim allelem MHC.

DRB jeden piętnaście o jeden sto siedemnaście non lub peptydy zidentyfikowano z obowiązkową pozostałością kotwicy P jeden w pozycji pierwszej, która jest wymagana dla MHC dwa wiążące się tylko przy progu 5%. Peptydy z wynikami większymi lub równymi 2,6 są prawdopodobnymi spoiwami. W związku z tym przy progu 5% przewiduje się, że tylko 11 górnych peptydów zwiąże MHC dwa DRB 1 15 0 1.

Reprezentatywny panel przewidywanych epitopów został wybrany do analizy w tym teście wiązania MHC dwa. Fragmenty peptydu beta-laktamazy tych 15 reszt zostały zsyntetyzowane chemicznie w taki sposób, że przypuszczalne epitopy MHC dwa były osadzone w ich syntetycznych fragmentach białkowych. Zdolność tych syntetycznych peptydów do konkurowania z biotynylowanym podstawowym białkiem kontrolnym B mieliny w celu wiązania się z MHC dwa DRB 1 15 0 1 została następnie przeanalizowana, jak właśnie wykazano.

Konkurencyjne krzywe wiązania dla syntetycznych peptydów przedstawiono tutaj. Wartości IC 50 zostały obliczone przez dopasowanie danych transformacji logarytmicznej przy użyciu nieliniowej funkcji dopasowania pryzmatu w jednym miejscu. Jak pokazano w tabeli, jak widać na wykresie, peptydy naturalnie podzieliły się na trzy grupy, silne spoiwa o IC 50 mniejszym niż jeden mikromolowy, umiarkowane spoiwa o IC 50 większym lub równym jednemu mikromolowi, ale mniejszemu niż 100 mikromolowym i słabe spoiwa o IC 50 większym lub równym 100 mikromolowym Po jego opracowaniu.

Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się immunologią molekularną i projektowaniem bioterapeutycznym do pełniejszego zbadania kluczowych zdarzeń rozpoznawania molekularnego, które leżą u podstaw odpowiedzi immunologicznej na przeciwciała przeciwbiałkowe u ludzi.