Wysokoprzepustowy test wiązania MHC II do analizy ilościowej epitopów peptydowych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe określenie wiązania krótkich peptydów z ludzkimi białkami odpornościowymi MHC klasy II przy użyciu wysokoprzepustowego testu na płytce 384-dołkowej. Osiąga się to poprzez przeprowadzenie w pierwszym kroku testów wiązania konkurencyjnego w fazie roztworowej z wykorzystaniem wybranych peptydów. W drugim kroku zrównoważone kompleksy peptyd-MHC klasy II są wychwytywane za pomocą przeciwciała przeciwko MHC klasy II unieruchomionego na płytkach ELISA o wysokim wiązaniu.

Następnie uchwycone kompleksy inkubuje się ze streptawidyną znakowaną opium, po czym nie związaną streptawidynę wypłukuje się, a uchwycone opium aktywuje. Ostatecznie, do ilościowego oznaczenia poziomów MHC two uchwyconego peptydu kontrolnego można zastosować fluorymetrię z rozdzielczością czasową. Metoda ta może dostarczyć wstępnych informacji na temat potencjału immunogennego białek docelowych.

Jest to szczególnie przydatne do walidacji wyników predyktorów in silico. Procedurę należy rozpocząć od dodania 25 µL świeżo rozcieńczonego roztworu przeciwciała L 2 43 do każdego dołka białej płytki ELISA o wysokim powinowactwie (high binding) z 384 dołkami. Płytkę należy uszczelnić folią poliestrową i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Następnie, zaczynając od roztworu zapasowego o stężeniu 10 mM dla każdego testu.

Przygotować następujące serie rozcieńczeń peptydów i DMSO oraz buforu cytrynianowo-fosforanowego, wykorzystując trzy polipropylenowe płytki 84-dołkowe. Należy pamiętać, że pełna polipropylenowa płytka 84-dołkowa wymaga użycia trzech oddzielnych płytek EIA, zgodnie z ilustracją. Następnie, w 15 ml probówce stożkowej, rozcieńczyć wybrane roztwory stokowe MHC II do stężenia 101 nM w buforze reakcyjnym.

Następnie rozcieńczyć peptyd kontrolny z poziomu 20 µM w stosunku 1:100 w świeżo przygotowanej mieszaninie głównej MHC II i dodać 21,5 µL mieszaniny głównej MHC II z peptydem kontrolnym do studni kontroli pozytywnej. Do każdego z rozcieńczeń peptydów testowych na polipropylenowej płytce 384-dołkowej dodać mieszaninę główną MHC II zawierającą peptyd kontrolny w stosunku 1:1, aby w tym czasie utworzyć reakcję wiązania. Na koniec uszczelnić reakcję wiązania folią poliestrową i inkubować płytkę przez 12 do 24 godzin w inkubatorze bez kontroli poziomu CO2 w temperaturze 37 °C bez wytrząsania.

Następnego dnia rozcieńczyć studzienki z reakcją wiązania na płytce 384-dołkowej w stosunku jeden do jednego z buforem neutralizującym. Następnie wypłukać płytkę ELISA trzykrotnie, używając 60 µL PBS 0,05% na studzienkę. W kolejnym kroku przenieść 25 µL każdego zneutralizowanego roztworu reakcji wiązania z płytki 384-dołkowej w trzech powtórzeniach do płytki 384-dołkowej pokrytej przeciwciałami.

Napełnij dołki płytki ELISA, a następnie inkubuj płytkę ELISA przykrytą folią poliestrową w temperaturze 4 °C przez noc. Po inkubacji przemyj płytkę ELISA trzy razy, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, a następnie dodaj 25 µL świeżo rozcieńczonego streptawidyny-opium do każdego dołka. Inkubuj płytkę przykrytą folią poliestrową w ciemności w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.

Podczas inkubacji, po upływie jednej godziny, doprowadzić 10 mililitrów roztworu wzmacniającego na płytkę do temperatury pokojowej, również w ciemności, przemyć płytkę ELISA w sposób zademonstrowany, a następnie dodać 25 mikrolitrów roztworu wzmacniającego do każdej studni i inkubować płytkę przykrytą folią poliestrową przez 10 do 15 minut w ciemności. Na koniec odczytać fluorescencję za pomocą czytnika płytek do fluorescencji z rozdzielczością czasową z optymalnymi ustawieniami. W tym reprezentatywnym eksperymencie przeanalizowano dojrzałą sekwencję peptydową beta-laktamazy Enterobacter cloacae P99 pod kątem potencjalnych binderów peptydowych do allelu MHC II.

Zidentyfikowano peptydy DRB1*15:01 oraz HLA-DRB1*11:17, które posiadały obowiązkowy resztą kotwiczącą P1 w pozycji pierwszej, niezbędną do wiązania z MHC klasy II, wyłącznie przy progu 5%. Peptydy z wynikami większymi lub równymi 2,6 są prawdopodobnymi binderami. Zatem przy progu 5% przewiduje się, że tylko 11 najlepszych peptydów wiąże się z MHC klasy II DRB1*15:01.

Do analizy w tym teście wiązania MHC klasy II wybrano reprezentatywny panel przewidywanych epitopów. Fragmenty peptydowe beta-laktamazy o długości 15 reszt zostały zsyntetyzowane chemicznie w taki sposób, aby domniemane nonamerowe epitopy MHC klasy II były osadzone wewnątrz tych syntetycznych fragmentów białka. Następnie przeanalizowano zdolność tych syntetycznych peptydów do konkurowania z kontrolnym biotynylowanym peptydem B białka zasadowego mieliny o wiązanie z MHC klasy II DRB 1 15 0 1, zgodnie z wcześniejszą demonstracją.

Krzywe konkurencyjnego wiązania dla syntetycznych peptydów przedstawiono tutaj. Wartości IC 50 obliczono poprzez dopasowanie danych poddanych transformacji logarytmicznej przy użyciu nieliniowej funkcji dopasowania dla konkurencyjnego wiązania w jednym miejscu w programie Prism. Jak wynika z tabeli oraz wykresu, peptydy naturalnie podzieliły się na trzy grupy: silnie wiążące z IC 50 poniżej 1 µM, umiarkowanie wiążące z IC 50 większym lub równym 1 µM, ale mniejszym niż 100 µM, oraz słabo wiążące z IC 50 większym lub równym 100 µM po ich opracowaniu.

Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedzin immunologii molekularnej i projektowania bioterapeutyków do pełniejszego zgłębienia kluczowych zdarzeń rozpoznawania molekularnego, które leżą u podstaw odpowiedzi immunologicznych przeciwko białkom u pacjentów.