Kwantyfikacja dynamiki sieci interakcji białek za pomocą multipleksowanej koimmunoprecypitacji
21 sierpnia 2019
Ilościowe Multiplex Immunoprecipitation (QMI) wykorzystuje cytometrię przepływową do czułego wykrywania różnic w obfitości docelowych interakcji białko-białko między dwiema próbkami. QMI można wykonać przy użyciu niewielkiej ilości biomateriału, nie wymaga genetycznie modyfikowanych znaczników i może być dostosowany do dowolnej wcześniej zdefiniowanej sieci interakcji białek.
Ilościowa multipleksowana koimmunoprecypitacja (QMI) umożliwia użytkownikom jednoczesny pomiar setek interakcji binarnych w predefiniowanej sieci interakcji białkowych. Wykonując jednocześnie wiele co-IP w tym samym lizacie, techniki bioinformatyczne mogą następnie zbadać, w jaki sposób grupy współasocjacji zmieniają się w skoordynowany sposób. Opracowanie testu jest czasochłonne, ale gdy panel QMI jest już w ręku, można zebrać dane o systemach transdukcji sygnału w stosunkowo prostym teście nocnym.
QMI wymaga dokładnego pipetowania różnych próbek i odczynników do płytek 96-dołkowych. Podczas ustawiania i uruchamiania każdego testu należy robić dokładne notatki, aby zapobiec błędom. W celu przygotowania próbki i immunoprecypitacji należy rozpocząć od lizy próbki w odpowiednim detergencie z inhibitorami proteazy i fosfatazy przez 15-minutową inkubację na lodzie.
Pod koniec inkubacji należy odwirować próbkę w celu usunięcia błon i zanieczyszczeń, a następnie przeprowadzić test BCA na supernatancie w celu określenia stężenia białka zgodnie ze standardowymi protokołami. Po normalizacji stężeń białek przygotuj główną mieszankę kulek magnetycznych, która zawiera około 250 kulek magnetycznych każdej klasy na studzienkę. Użyj separacji magnetycznej, aby dwukrotnie przemyć mieszankę kulek magnetycznych w buforze Fly P przed ponownym zawieszeniem kulek w 20 mikrolitrach buforu Fly P na próbkę.
Po dokładnym pipetowaniu podamy 20 mikrolitrów kulek do jednej lodowatej probówki do mikrowirówki na próbkę i dodaj równe objętości lizatu ze znormalizowanymi stężeniami białka do każdej probówki w celu immunoprecypitacji. Następnie podziel każdą próbkę lizatu na jedną probówkę dla każdej uruchamianej płytki i poddaj próbki immunoprecypitacji na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, chroniąc je przed światłem. Następnego ranka użyj magnetycznego stojaka na kulki, aby usunąć lizat z pierwszego zestawu probówek i umyj kulki dwa razy w 500 mikrolitrach lodowatego bufora Fly P na pranie.
Po obliczeniu objętości zawiesiny, ponownie zawiesić immunoprecypitaty w obliczonej objętości lodowatego buforu Fly P. Dokładnie zawiesić kulki magnetyczne przez delikatne pipetowanie i rozprowadzić 25 mikrolitrów kulek na studzienkę na płaskiej 96-dołkowej płytce na lodzie. Na innej 96-dołkowej płytce rozcieńczyć przeciwciałami z sondy do dwukrotnie większego stężenia roboczego.
Za pomocą pipety wielokanałowej rozprowadzić 25 mikrolitrów rozcieńczenia przeciwciał z każdej sondy do odpowiednich dołków płytki testowej zawierającej kulkę magnetyczną i wstrząsnąć z dużą prędkością na poziomej wytrząsarce płytkowej w celu wymieszania i ponownego zawieszenia kulek magnetycznych. Po wymieszaniu zmniejsz prędkość przez godzinę inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem. Pod koniec inkubacji umyć płytkę trzy razy świeżym buforem Fly P na każde przemycie na magnetycznej podkładce do płytek w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Po ostatnim praniu ponownie zawieś kulki w 50 mikrolitrach streptawidyny PE rozcieńczonej od 1 do 200 w buforze Fly P. Wstrząśnij mieszanką i ponownie zawieś kulki przed inkubacją płytki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut, chroniąc ją przed światłem. Pod koniec inkubacji umyć płytkę trzykrotnie buforem Fly P na magnetycznej podkładce płytkowej w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ponownie zawiesić kulki w 125 mikrolitrach buforu Fly P.
Potrząsaj płytką przez minutę z prędkością 900 obrotów, aby dokładnie zawiesić kulki i załadować płytkę do cytometru przepływowego przechowywanego w lodówce. W oprogramowaniu cytometru przepływowego wybierz ustawienie Wysoki cel RP1, warunek zatrzymania 1 000 kulek na region i objętość próbki 80 mikrolitrów. Wstrzymaj bieg w połowie i ponownie zawieś koraliki, aby zapobiec osiadaniu.
Na końcu przebiegu wyeksportuj pliki danych w formacie XML. Aby przeprowadzić analizę ANC, wypełnij plik wejściowy ANC, aby odzwierciedlić szczegóły projektu eksperymentalnego i uruchom program, który zapisze plik CSV w usłudze Active Directory. Plik kończący się na trafienia.
CSV przedstawi koasocjacje białek, które znacznie różnią się przy fałszywie dodatnim poziomie 0,05 między warunkami kontrolnymi i eksperymentalnymi w co najmniej trzech z czterech kontrprób eksperymentalnych. W przypadku analizy sieci korelacji ważonej wklej tytuły kolumn danych wyjściowych pliku danych przez Matlaba kończące się na mfi. csv do pierwszej kolumny nowego arkusza kalkulacyjnego i dodaj kolumny Experiment (Eksperyment) dla numeru eksperymentu i Treatment (Leczenie) dla leczenia eksperymentalnego oraz wszelkie inne zmienne do analizy.
Zapisz ten plik jako traits. csv i otwórz R Studio. Ustaw katalog roboczy na folder zawierający plik mfi.
csv i traits. csv, podświetl sekcje kodu i naciśnij Enter polecenia, aby uruchomić polecenia języka R, jak wskazano w pliku polecenia z komentarzem. Moduły analizy sieci ważonej korelacji istotnie skorelowane z każdą cechą eksperymentalną zostaną wygenerowane w postaci pliku graficznego, a korelacja każdej interakcji z każdym modułem zostanie wyprowadzona w postaci pliku CSV.
Dla każdej interakcji w pliku wyjściowym ANC określ, czy ta interakcja jest również istotna dla CNA, i utwórz nową kolumnę, która wskazuje, czy każde trafienie ANC jest również trafieniem CNA. Przekonwertuj wartości na logowanie dwukrotnej zmiany i oblicz średnią wartość dla wszystkich trafień CNA unii ANC. Na koniec utwórz nowy arkusz kalkulacyjny z każdym trafieniem CNA w związku ANC wymienionym według celu immunoprecypitacji w jednej kolumnie, celu sondy w drugiej kolumnie i wartości zmiany krotności w trzeciej kolumnie.
Zaimportuj ten plik do Cytoscape jako sieć, aby utworzyć diagram krawędzi węzła. Interakcje białek o wysokim poziomie ufności zidentyfikowane za pomocą dwóch niezależnych podejść statystycznych są wizualizowane jako diagramy krawędzi węzłów za pomocą oprogramowania open source, Cytoscape, lub jako mapy cieplne przy użyciu kodu R i instrukcji analizy zawartych w materiale dodatkowym. Przez cały czas trwania protokołu użytkownicy muszą dbać o dokładne pipetowanie, skrupulatne prowadzenie dokumentacji i utrzymywanie próbek w niskiej temperaturze przez cały czas.
Wykorzystaliśmy QMI, aby zrozumieć, w jaki sposób szlaki transdukcji sygnału różnicują różne typy danych wejściowych i integrują informacje z wielu receptorów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ilościowa wielokrotna ko-immunoprecypitacja (QMI) pozwala na jednoczesne pomiaru licznych interakcji białko-białko w obrębie zdefiniowanej sieci. Ta metoda jest wydajna, wymagając minimalnej ilości materiału biologicznego i nie wymaga genetycznie modyfikowanych tagów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biochemia
- Biologia komórki
Tło
- QMI umożliwia wykrycie różnic w interakcjach białkowych między próbkami.
- Test może być dostosowany do różnych sieci interakcji białkowych.
- Zezwala na zebranie danych w skali sieci dotyczących systemów transdukcji sygnałów.
- Opatrzność w pipetowaniu i przygotowaniu jest kluczowa, aby uniknąć błędów.
Cel badania
- Aby zmierzyć interakcje binarne w sieciach białkowych.
- Aby przeanalizować, jak ko-asocjacje zmieniają się w sposób skoordynowany.
- Aby opracować niezawodny test do badania złożonych systemów biologicznych.
Stosowane metody
- Wielokrotna ko-immunoprecypitacja w 96-wellowych płytkach.
- Lizys próbek przy użyciu odpowiednich detergentów z inhibitorami.
- Techniki bioinformatyczne do analizy danych.
- Testy przeprowadzane przez całą noc w celu zbierania danych.
Główne wyniki
- QMI zapewnia wrażliwe wykrywanie interakcji białkowych.
- Ułatwia badanie złożonych ścieżek sygnałowych.
- Zezwala na wysoko przepustową analizę sieci białkowych.
- Wykazuje skuteczność wielokrotnej immunoprecypitacji.
Wnioski
- QMI jest potężnym narzędziem do badania interakcji białkowych.
- Upraszcza proces analizy złożonych danych biologicznych.
- Przyszłe zastosowania mogą rozszerzyć się na różne dziedziny badań.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) enables biopharma R&D teams to simultaneously measure hundreds of binary protein interactions within a defined network, providing network-scale insights into signal transduction dynamics. By eliminating the need for genetic tagging and requiring minimal biomaterial, QMI supports early-stage target validation and mechanistic de-risking in discovery workflows. The method generates quantitative fold-change data that can be analyzed using independent statistical approaches (ANC and WGCNA) to increase predictive confidence in protein co-associations relevant to therapeutic hypothesis testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying fold changes in protein interactions across experimental conditions.
- Operational Value: Supports functional target validation without genetic manipulation, preserving native protein complexes.
- Predictive Value: Increases confidence in target selection through coordinated changes in co-associations detected by dual statistical validation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces quantitative, fluorescence-based readouts of Proteins in Shared Complexes (PiSCES) for reproducible interaction profiling.
- Operational Value: Uses MagBead spectral regions to multiplex immunoprecipitations, enabling parallel processing in 96-well format.
- Scalability Value: Adaptable to any defined protein interaction network, supporting reuse across projects and model systems.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Generates hypothesis-ready data from T cell and neuronal glutamate synapse networks, with direct relevance to immune and neurological disease areas.
- Mechanistic De-risking: Identifies condition-specific interaction changes that inform pathway modulation strategies.
- Preclinical Continuity: Outputs node-edge diagrams and heatmaps that visualize high-confidence interactions for downstream validation.
Pipeline & Workflow Integration
QMI fits within the discovery continuum from target engagement screening to lead optimization, providing interaction network context that informs compound mechanism of action and selectivity profiling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing how groups of co-associations change in response to stimuli or perturbations.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative interaction data suitable for hit confirmation and pathway elucidation.
- Analytics: Enables comparison of interaction strengths via log2 fold change and statistical significance (FDR < 0.05) across replicates.
- Translational Research: Connects discovery-phase interaction dynamics to disease-relevant systems such as immune synapses and neuronal signaling.
- Enterprise Reuse: Once developed, the QMI panel allows repeated overnight assays, reducing per-experiment time and reagent burden.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation through quantitative, multiplexed interaction measurements.
- Operational Value: Standardizes complex co-IP workflows using magnetic bead separation and flow cytometry readout.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by de-risking mechanistic assumptions early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on network-level interaction dynamics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in antibody validation, magnetic bead handling, and flow cytometry optimization.
- Dependent on access to a refrigerated flow cytometer capable of multiplexed bead region detection.
- Necessitates standardized lysis buffer optimization and careful protein normalization across samples.
- Involves multi-day assay development including antibody screening, bead conjugation, and probe biotinylation.
- Limited to soluble protein complexes; may not capture transient or membrane-embedded interactions without optimization.
