Kwantyfikacja dynamiki sieci interakcji białek za pomocą multipleksowanej koimmunoprecypitacji

Ilościowa multipleksowana koimmunoprecypitacja (QMI) umożliwia użytkownikom jednoczesny pomiar setek interakcji binarnych w predefiniowanej sieci interakcji białkowych. Wykonując jednocześnie wiele co-IP w tym samym lizacie, techniki bioinformatyczne mogą następnie zbadać, w jaki sposób grupy współasocjacji zmieniają się w skoordynowany sposób. Opracowanie testu jest czasochłonne, ale gdy panel QMI jest już w ręku, można zebrać dane o systemach transdukcji sygnału w stosunkowo prostym teście nocnym.

QMI wymaga dokładnego pipetowania różnych próbek i odczynników do płytek 96-dołkowych. Podczas ustawiania i uruchamiania każdego testu należy robić dokładne notatki, aby zapobiec błędom. W celu przygotowania próbki i immunoprecypitacji należy rozpocząć od lizy próbki w odpowiednim detergencie z inhibitorami proteazy i fosfatazy przez 15-minutową inkubację na lodzie.

Pod koniec inkubacji należy odwirować próbkę w celu usunięcia błon i zanieczyszczeń, a następnie przeprowadzić test BCA na supernatancie w celu określenia stężenia białka zgodnie ze standardowymi protokołami. Po normalizacji stężeń białek przygotuj główną mieszankę kulek magnetycznych, która zawiera około 250 kulek magnetycznych każdej klasy na studzienkę. Użyj separacji magnetycznej, aby dwukrotnie przemyć mieszankę kulek magnetycznych w buforze Fly P przed ponownym zawieszeniem kulek w 20 mikrolitrach buforu Fly P na próbkę.

Po dokładnym pipetowaniu podamy 20 mikrolitrów kulek do jednej lodowatej probówki do mikrowirówki na próbkę i dodaj równe objętości lizatu ze znormalizowanymi stężeniami białka do każdej probówki w celu immunoprecypitacji. Następnie podziel każdą próbkę lizatu na jedną probówkę dla każdej uruchamianej płytki i poddaj próbki immunoprecypitacji na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, chroniąc je przed światłem. Następnego ranka użyj magnetycznego stojaka na kulki, aby usunąć lizat z pierwszego zestawu probówek i umyj kulki dwa razy w 500 mikrolitrach lodowatego bufora Fly P na pranie.

Po obliczeniu objętości zawiesiny, ponownie zawiesić immunoprecypitaty w obliczonej objętości lodowatego buforu Fly P. Dokładnie zawiesić kulki magnetyczne przez delikatne pipetowanie i rozprowadzić 25 mikrolitrów kulek na studzienkę na płaskiej 96-dołkowej płytce na lodzie. Na innej 96-dołkowej płytce rozcieńczyć przeciwciałami z sondy do dwukrotnie większego stężenia roboczego.

Za pomocą pipety wielokanałowej rozprowadzić 25 mikrolitrów rozcieńczenia przeciwciał z każdej sondy do odpowiednich dołków płytki testowej zawierającej kulkę magnetyczną i wstrząsnąć z dużą prędkością na poziomej wytrząsarce płytkowej w celu wymieszania i ponownego zawieszenia kulek magnetycznych. Po wymieszaniu zmniejsz prędkość przez godzinę inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem. Pod koniec inkubacji umyć płytkę trzy razy świeżym buforem Fly P na każde przemycie na magnetycznej podkładce do płytek w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po ostatnim praniu ponownie zawieś kulki w 50 mikrolitrach streptawidyny PE rozcieńczonej od 1 do 200 w buforze Fly P. Wstrząśnij mieszanką i ponownie zawieś kulki przed inkubacją płytki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut, chroniąc ją przed światłem. Pod koniec inkubacji umyć płytkę trzykrotnie buforem Fly P na magnetycznej podkładce płytkowej w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ponownie zawiesić kulki w 125 mikrolitrach buforu Fly P.

Potrząsaj płytką przez minutę z prędkością 900 obrotów, aby dokładnie zawiesić kulki i załadować płytkę do cytometru przepływowego przechowywanego w lodówce. W oprogramowaniu cytometru przepływowego wybierz ustawienie Wysoki cel RP1, warunek zatrzymania 1 000 kulek na region i objętość próbki 80 mikrolitrów. Wstrzymaj bieg w połowie i ponownie zawieś koraliki, aby zapobiec osiadaniu.

Na końcu przebiegu wyeksportuj pliki danych w formacie XML. Aby przeprowadzić analizę ANC, wypełnij plik wejściowy ANC, aby odzwierciedlić szczegóły projektu eksperymentalnego i uruchom program, który zapisze plik CSV w usłudze Active Directory. Plik kończący się na trafienia.

CSV przedstawi koasocjacje białek, które znacznie różnią się przy fałszywie dodatnim poziomie 0,05 między warunkami kontrolnymi i eksperymentalnymi w co najmniej trzech z czterech kontrprób eksperymentalnych. W przypadku analizy sieci korelacji ważonej wklej tytuły kolumn danych wyjściowych pliku danych przez Matlaba kończące się na mfi. csv do pierwszej kolumny nowego arkusza kalkulacyjnego i dodaj kolumny Experiment (Eksperyment) dla numeru eksperymentu i Treatment (Leczenie) dla leczenia eksperymentalnego oraz wszelkie inne zmienne do analizy.

Zapisz ten plik jako traits. csv i otwórz R Studio. Ustaw katalog roboczy na folder zawierający plik mfi.

csv i traits. csv, podświetl sekcje kodu i naciśnij Enter polecenia, aby uruchomić polecenia języka R, jak wskazano w pliku polecenia z komentarzem. Moduły analizy sieci ważonej korelacji istotnie skorelowane z każdą cechą eksperymentalną zostaną wygenerowane w postaci pliku graficznego, a korelacja każdej interakcji z każdym modułem zostanie wyprowadzona w postaci pliku CSV.

Dla każdej interakcji w pliku wyjściowym ANC określ, czy ta interakcja jest również istotna dla CNA, i utwórz nową kolumnę, która wskazuje, czy każde trafienie ANC jest również trafieniem CNA. Przekonwertuj wartości na logowanie dwukrotnej zmiany i oblicz średnią wartość dla wszystkich trafień CNA unii ANC. Na koniec utwórz nowy arkusz kalkulacyjny z każdym trafieniem CNA w związku ANC wymienionym według celu immunoprecypitacji w jednej kolumnie, celu sondy w drugiej kolumnie i wartości zmiany krotności w trzeciej kolumnie.

Zaimportuj ten plik do Cytoscape jako sieć, aby utworzyć diagram krawędzi węzła. Interakcje białek o wysokim poziomie ufności zidentyfikowane za pomocą dwóch niezależnych podejść statystycznych są wizualizowane jako diagramy krawędzi węzłów za pomocą oprogramowania open source, Cytoscape, lub jako mapy cieplne przy użyciu kodu R i instrukcji analizy zawartych w materiale dodatkowym. Przez cały czas trwania protokołu użytkownicy muszą dbać o dokładne pipetowanie, skrupulatne prowadzenie dokumentacji i utrzymywanie próbek w niskiej temperaturze przez cały czas.

Wykorzystaliśmy QMI, aby zrozumieć, w jaki sposób szlaki transdukcji sygnału różnicują różne typy danych wejściowych i integrują informacje z wielu receptorów.