Name: Kwantyfikacja dynamiki sieci interakcji białek za pomocą multipleksowanej koimmunoprecypitacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: Poznaj metodę QMI do jednoczesnego pomiaru setek interakcji białkowych w sieciach sygnałowych. Technika ta umożliwia analizę danych na poziomie całej sieci przy minimalnym zużyciu biomateriału.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Tessie Davis za ważny wkład w rozwój testów QMI, a obecnym i byłym członkom laboratoriów Smith and Schrum za wskazówki techniczne i wkład intelektualny. Praca ta została sfinansowana z grantów NIMH R01 MH113545 i R00 MH 102244.

<ol><li>Pawson, T., Nash, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions+define+specificity+in+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions define specificity in signal transduction.</a> Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).</li>
<li>Rodríguez-Jorge, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+between+T+cell+receptor+and+Toll-like+receptor+5+signaling+for+CD4%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4.</a> Science Signaling. 12 (577), (2019).</li>
<li>Bugaj, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+mutations+and+targeted+drugs+can+disrupt+dynamic+signal+encoding+by+the+Ras-Erk+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway.</a> Science. 361 (6405), (2018).</li>
<li>Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+control+of+signaling+by+modular+adaptor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins.</a> Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).</li>
<li>Hamm, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+faces+of+G+protein+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The many faces of G protein signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).</li>
<li>Lohse, M. J., Hofmann, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+Temporal+Aspects+of+Signaling+by+G-Protein-Coupled+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors.</a> Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).</li>
<li>Eltschinger, S., Loewith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TOR+Complexes+and+the+Maintenance+of+Cellular+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis.</a> Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).</li>
<li>Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+cellular+signalling+networks+and+analysis+of+their+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).</li>
<li>Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+theoretical+framework+for+specificity+in+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">A theoretical framework for specificity in cell signaling.</a> Molecular Systems Biology. 1, 23(2005).</li>
<li>Schrum, A. G., Gil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustness+and+Specificity+in+Signal+Transduction+via+Physiologic+Protein+Interaction+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks.</a> Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).</li>
<li>De Las Rivas, J., Fontanillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions+essentials%3A+key+concepts+to+building+and+analyzing+interactome+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks.</a> PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807(2010).</li>
<li>Ron, D., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+integration+in+the+endoplasmic+reticulum+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).</li>
<li>Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+of+Iron+Homeostasis%3A+New+Players+in+Metabolism%2C+Cell+Death%2C+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).</li>
<li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+matrix+network+analysis+of+protein+complexes+in+the+human+TCR+signalosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome.</a> Science Signaling. 9 (439), 7(2016).</li>
<li>Schrum, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%27s+STKE%22%5BJournal%5D)">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Science's STKE. 2007 (389), (2007).</li>
<li>Brown, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustering+the+autisms+using+glutamate+synapse+protein+interaction+networks+from+cortical+and+hippocampal+tissue+of+seven+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Autism%22%5BJournal%5D)">Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models.</a> Molecular Autism. 9 (1), 48(2018).</li>
<li>Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activity+induces+input-specific+rearrangements+in+a+targeted+synaptic+protein+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network.</a> Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).</li>
<li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+protein+complexes+isolated+from+primary+human+skin-resident+T+cells+can+be+analysed+by+Multiplex+IP-FCM%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM.</a> Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).</li>
<li>Neier, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+proximal+%CE%B1%CE%B2+TCR+signalosome+specifies+thymic+selection+outcome+through+a+quantitative+protein+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">The early proximal αβ TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network.</a> Science Immunology. 4 (32), (2019).</li>
<li>Davis, T. R., Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IP-FCM%3A+immunoprecipitation+detected+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Expiriments%22%5BJournal%5D)">IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).</li>
<li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IP-FCM+measures+physiologic+protein-protein+interactions+modulated+by+signal+transduction+and+small-molecule+drug+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition.</a> PLoS One. 7 (9), 45722(2012).</li>
<li>Lautz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+changes+in+synaptic+protein+complex+composition+are+consistent+in+different+detergents+despite+differential+solubility%5BTitle%5D)+AND+%22BioRXiv%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility.</a> BioRXiv. , (2019).</li>
<li>Langfelder, P., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WGCNA%3A+an+R+package+for+weighted+correlation+network+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis.</a> BMC Bioinformatics. 9, 559(2008).</li>
<li>Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+functional+bivalency+observed+among+TCR%2FCD3+complexes+isolated+from+primary+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells.</a> Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Test QMI wymaga znacznych inwestycji w opracowanie panelu przeciwciał, sprzętu i odczynników, ale po ustaleniu testu można zebrać wielowymiarowe dane obserwujące sieci interakcji białek, gdy reagują one na bodźce kontrolowane eksperymentalnie. Z technicznego punktu widzenia QMI wymaga starannego pipetowania i śledzenia lokalizacji próbek i dołków przeciwciał. Przydatne jest staranne oznakowanie płytek testowych, a także wykonanie szczegółowego szablonu lokalizacji odwiertów na papierze, który jest następnie zapisywany do...

Dynamiczne interakcje białko-białko tworzą molekularne kaskady sygnalizacyjne i ruchome struktury, które są funkcjonalną podstawą większości fizjologii komórkowej1. Procesy te są często przedstawiane jako liniowe ścieżki sygnałowe, które przełączają się między stanami ustalonymi na podstawie pojedynczych danych wejściowych, ale dane eksperymentalne i modelowe wyraźnie pokazują, że funkcjonują one jako zintegrowane sieci2,3,4. W przypadku białek G, różne receptory często mają zdolność do aktywacji tego samego białka G, a pojedynczy receptor może również aktywować więcej niż jeden typ białka G5,6. Aby stosunkowo niewielka liczba klas białek G mogła specyficznie modulować szeroki zakres funkcji komórkowych, takich jak transmisja synaptyczna, regulacja hormonów i migracja komórek, komórki muszą zarówno integrować, jak i różnicować te sygnały4,5. Dowody wykazały, że ta specyficzność sygnału, zarówno dla białek G, jak i innych, jest przede wszystkim uzyskiwana na podstawie precyzyjnie dostrojonych interakcji białko-białko i ich dynamiki czasowej1,3,4,5,6,7. Ponieważ sieci sygnalizacyjne składają się z dynamicznych kompleksów białkowych z wieloma wejściami, wyjściami i pętlami sprzężenia zwrotnego, pojedyncze zaburzenie może zmienić ogólną równowagę homeostatyczną fizjologii komórki4,7. Obecnie panuje powszechna zgoda co do tego, że sygnalizacja powinna być badana z perspektywy sieci, aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób integracja wielu wejść kontroluje dyskretne funkcje komórkowe w zdrowiu i chorobie7,8,9,10,11,12,13. W związku z tym opracowano ilościową immunoprecypitację multipleksową (QMI) w celu zebrania średnioprzepustowych, ilościowych danych na temat zmian fałdowania w dynamicznych sieciach interakcji białek.
QMI to test oparty na przeciwciałach, w którym lizat komórkowy jest inkubowany z panelem przeciwciał immunoprecypitacyjnych, które są kowalencyjnie sprzężone z kulkami magnetycznymi zawierającymi różne proporcje barwników fluorescencyjnych. Posiadanie specyficznych przeciwciał sprzężonych z różnymi klasami kulek magnetycznych pozwala na jednoczesną koimmunoprecypitację wielu docelowych białek z tego samego lizatu. Po immunoprecypitacji (IP) kulki magnetyczne są inkubowane z drugim, sprzężonym z fluoroforem przeciwciałem sondującym (lub przeciwciałem biotynylowanym w połączeniu ze streptawidyną sprzężoną z fluoroforem). Koasocjacje między białkami rozpoznawanymi przez każdą parę przeciwciało-sonda IP lub PiSCES (białka we wspólnych kompleksach wykrywane przez odsłonięte epitopy powierzchniowe) są następnie wykrywane za pomocą cytometrii przepływowej i mogą być ilościowo porównywane między różnymi warunkami próbki14. Ilustracje w Rysunek 1 pokazuje etapy związane z przeprowadzaniem testu QMI, w tym schemat kulek magnetycznych z immunoprecypitowanymi kompleksami białkowymi znakowanymi fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami sondy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).
Czułość QMI zależy od stężenia białka w lizacie w stosunku do liczby kulek magnetycznych używanych do immunoprecypitacji, a osiągnięcie rozdzielczości wykrywania 10% zmian krotności wymaga tylko niewielkiej ilości materiału wyjściowego w porównaniu z innymi metodami co-IP14,15. Na przykład ilość materiału wyjściowego użytego w QMI jest podobna do wymaganej w teście immunosorbentowym sprzężonym z enzymem kanapkowym (ELISA), ale w jednym teście QMI wykrywa się wiele interakcji. Testy QMI przy użyciu 20 IP i 20 celów sondy przeprowadzono przy użyciu 1-5 x 105 pierwotnych limfocytów T wyizolowanych z biopsji skóry 4 mm, preparatów synaptosomalnych P2 z 3 mm koronalnego odcinka kory przedczołowej myszy lub 3 x 106 hodowanych pierwotnych neuronów korowych myszy14,16,17. Ta czułość sprawia, że QMI jest przydatny do analizy komórek lub tkanek o ograniczonej dostępności, takich jak próbki kliniczne.
QMI może być dostosowany do dowolnej wcześniej zdefiniowanej sieci interakcji białek (pod warunkiem, że dostępne są przeciwciała) i do tej pory został opracowany do analizy sygnału receptora antygenu limfocytów T (TCR) i podzbioru białek w synapsach glutaminergicznym w neuronach17,18. W badaniach nad sygnalizacją receptora limfocytów T, QMI został najpierw wykorzystany do identyfikacji zmian wywołanych stymulacją w PiSCES, a następnie do odróżnienia pacjentów autoimmunologicznych od grupy kontrolnej, wykrycia endogennej sygnalizacji autoimmunologicznej, a na końcu do wygenerowania hipotezy obejmującej niezrównoważoną podsieć interakcji związanych z chorobą14. Niedawno ten sam panel QMI został użyty do określenia, że wybór tymocytów jest determinowany przez ilościowe, a nie jakościowe różnice w sygnalizacji białkowej związanej z TCR19. W neuronach QMI wykorzystano do opisania specyficznego dla danych wejściowych przegrupowania sieci interakcji białek dla różnych typów sygnałów wejściowych w sposób, który wspiera nowo pojawiające się modele plastyczności synaptycznej17. Dodatkowo, ten synaptyczny panel QMI został wykorzystany do zidentyfikowania różnic w siedmiu mysich modelach autyzmu, grupowania modeli w podgrupy na podstawie ich biosygnatur PiSCES i dokładnego postawienia hipotezy o wspólnym deficycie molekularnym, który wcześniej nie został rozpoznany w jednym z modeli16. Podobne podejście można zastosować do badań przesiewowych innych podgrup, które mogą reagować na różne terapie farmakologiczne, lub do przypisywania leków do określonych podgrup, które reagują. QMI ma potencjalne zastosowania w diagnostyce, podtypowaniu pacjentów i opracowywaniu leków, a także w naukach podstawowych.
Aby skompletować panel przeciwciał QMI, wstępne badania przesiewowe i protokoły selekcji przeciwciał są opisane w sekcji 1 poniżej. Po zidentyfikowaniu paneli przeciwciał w rozdziale 2 opisano protokoły koniugacji wybranych przeciwciał z kulkami magnetycznymi dla IP oraz biotynylacji wybranych przeciwciał sondowych. Protokół przeprowadzania testu QMI na lizatach komórkowych lub tkankowych opisano w sekcji 3. Wreszcie, ponieważ pojedynczy eksperyment może wygenerować ~5 x 105 indywidualnych punktów danych, instrukcje i kody komputerowe pomagające w przetwarzaniu, analizie i wizualizacji danych znajdują się w sekcji 4. Przegląd przepływu pracy opisany w sekcjach 2-4 jest pokazany w Rysunek 1.

<table><tbody><tr><td>96-dołkowe płytki płaskodenne</td><td>Bio Rad</td><td>171025001</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki do PCR</td> System <td>VWR</td><td>82006-704</td><td></td></tr><tr><td>Bioplex 200 z HTF</td><td>Bio Rad</td><td>171000205</td><td>zmodyfikowany w celu częściowego chłodzenia, szczegółowe informacje znajdują się na rysunku S1</td></tr><tr><td>Stacja mycia Bio-Plex Pro</td><td>Bio Rad</td><td>30034376</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koraliki CML</td><td>Invitrogen</td><td>C37481</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39256</td><td></td></tr><tr><td>MagPlex Microspheres</td><td>Luminex</td><td>MC12xxx-01</td><td>xxx to 3-cyfrowy obszar koralików</td></tr><tr><td>Melon Gel IgG Spin Purification Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>45206</td><td>używany do oczyszczania przeciwciał</td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>Folia do mikropłytek, niesterylna</td><td>USA Scientific</td><td>2920-0000</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów fosfotazy #2</td><td>Sigma</td><td>P5726</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Lodówka do przygotowywania kanapek</td><td>Norlake</td><td>SMP 36 15</td><td>do niestandardowego chłodzenia Bioplex 200</td></tr><tr><td>Sodium fluorek</td><td>Sigma</td><td>201154</td><td></td></tr><tr><td>Ortowanadan sodu</td><td>Sigma</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna-PE</td><td>BioLegend</td><td>405204</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo NHS</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39269</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja dynamiki sieci interakcji białek za pomocą multipleksowanej koimmunoprecypitacji

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Dynamiczne interakcje białko-białko kontrolują zachowanie komórek, od ruchliwości, przez replikację DNA, aż po transdukcję sygnału. Jednak monitorowanie dynamicznych oddziaływań między wieloma białkami w sieci interakcji białkowych jest technicznie trudne. W tym miejscu przedstawiamy protokół ilościowej immunoprecypitacji multipleksowej (QMI), który umożliwia ilościową ocenę zmian fałdowania w oddziaływaniach białkowych na podstawie względnych pomiarów fluorescencji białek we wspólnych kompleksach wykrywanych przez epitopy odsłoniętej powierzchni (PiSCES). W QMI kompleksy białkowe z lizatów komórkowych są immunoprecypitowane na mikrosfery, a następnie badane za pomocą znakowanego przeciwciała dla innego białka w celu ilościowego określenia obfitości PiSCES. Przeciwciała immunoprecypitacyjne są sprzężone z różnymi obszarami spektralnymi MagBead, co pozwala cytometrowi przepływowemu różnicować wiele równoległych immunoprecypitacji i jednocześnie określać ilościowo ilość przeciwciał sondujących związanych z każdym z nich. QMI nie wymaga znakowania genetycznego i może być wykonywany przy użyciu minimalnej ilości biomateriału w porównaniu z innymi metodami immunoprecypitacji. QMI może być dostosowany do dowolnej zdefiniowanej grupy oddziałujących białek i do tej pory był używany do charakteryzowania sieci sygnałowych w komórkach T i neuronalnych synapsach glutaminianu. Wyniki pozwoliły na sformułowanie nowych hipotez o potencjalnych zastosowaniach diagnostycznych i terapeutycznych. Protokół ten zawiera instrukcje dotyczące wykonywania QMI, od wstępnego wyboru panelu przeciwciał po przeprowadzanie testów i analizowanie danych. Wstępny montaż testu QMI obejmuje badanie przesiewowe przeciwciał w celu wytworzenia panelu i empiryczne określenie odpowiedniego buforu do lizy. Późniejsze przygotowanie odczynnika obejmuje kowalencyjne sprzęganie przeciwciał immunoprecypitacyjnych z MagBeads oraz przeciwciała sondy biotynylowej, dzięki czemu można je znakować fluoroforem sprzężonym ze streptawidyną. Aby uruchomić test, lizat miesza się z MagBeads przez noc, a następnie kulki są dzielone i inkubowane z różnymi przeciwciałami sondy, a następnie etykietą fluoroforową i odczytywane za pomocą cytometrii przepływowej. Przeprowadza się dwa testy statystyczne w celu zidentyfikowania PiSCE, które znacznie różnią się w zależności od warunków eksperymentalnych, a wyniki są wizualizowane za pomocą map cieplnych lub diagramów krawędzi węzłów.

Przesiewanie przeciwciał 
Rysunek 2B przedstawia wyniki przesiewania białka Connexin36. Większość kombinacji IP_probe nie generuje sygnału powyżej kontroli IgG. Immunoprecypitacja (IP) przeciwciałem monoklonalnym 1E5 i detekcja (probe) przeciwciałem 1E5 lub poliklonalnym 6200 powoduje przesunięcie rozkładu kulek w prawo w porównaniu z kontrolami IgG. W tym przypadku wybrano IP 1E5 i probe 6200poly, aby uniknąć stosowania tego samego przeciwciała do IP i d...

Ilościowe Multiplex Immunoprecipitation (QMI) wykorzystuje cytometrię przepływową do czułego wykrywania różnic w obfitości docelowych interakcji białko-białko między dwiema próbkami. QMI można wykonać przy użyciu niewielkiej ilości biomateriału, nie wymaga genetycznie modyfikowanych znaczników i może być dostosowany do dowolnej wcześniej zdefiniowanej sieci interakcji białek.

Kwantyfikacja dynamiki sieci interakcji białek za pomocą multipleksowanej koimmunoprecypitacji

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Ilościowa multipleksowana koimmunoprecypitacja (QMI) umożliwia użytkownikom jednoczesny pomiar setek interakcji binarnych w predefiniowanej sieci interakcji białkowych. Wykonując jednocześnie wiele co-IP w tym samym lizacie, techniki bioinformatyczne mogą następnie zbadać, w jaki sposób grupy współasocjacji zmieniają się w skoordynowany sposób. Opracowanie testu jest czasochłonne, ale gdy panel QMI jest już w ręku, można zebrać dane o systemach transdukcji sygnału w stosunkowo prostym teście nocnym.QMI wymaga dokładnego pipetowania różnych próbek i odczynników do płytek 96-dołkowych. Podczas ustawiania i uruchamiania każdego testu należy robić dokładne notatki, aby zapobiec błędom. W celu przygotowania próbki i immunoprecypitacji należy rozpocząć od lizy próbki w odpowiednim detergencie z inhibitorami proteazy i fosfatazy przez 15-minutową inkubację na lodzie.Pod koniec inkubacji należy odwirować próbkę w celu usunięcia błon i zanieczyszczeń, a następnie przeprowadzić test BCA na supernatancie w celu określenia stężenia białka zgodnie ze standardowymi protokołami. Po normalizacji stężeń białek przygotuj główną mieszankę kulek magnetycznych, która zawiera około 250 kulek magnetycznych każdej klasy na studzienkę. Użyj separacji magnetycznej, aby dwukrotnie przemyć mieszankę kulek magnetycznych w buforze Fly P przed ponownym zawieszeniem kulek w 20 mikrolitrach buforu Fly P na próbkę.Po dokładnym pipetowaniu podamy 20 mikrolitrów kulek do jednej lodowatej probówki do mikrowirówki na próbkę i dodaj równe objętości lizatu ze znormalizowanymi stężeniami białka do każdej probówki w celu immunoprecypitacji. Następnie podziel każdą próbkę lizatu na jedną probówkę dla każdej uruchamianej płytki i poddaj próbki immunoprecypitacji na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, chroniąc je przed światłem. Następnego ranka użyj magnetycznego stojaka na kulki, aby usunąć lizat z pierwszego zestawu probówek i umyj kulki dwa razy w 500 mikrolitrach lodowatego bufora Fly P na pranie.Po obliczeniu objętości zawiesiny, ponownie zawiesić immunoprecypitaty w obliczonej objętości lodowatego buforu Fly P. Dokładnie zawiesić kulki magnetyczne przez delikatne pipetowanie i rozprowadzić 25 mikrolitrów kulek na studzienkę na płaskiej 96-dołkowej płytce na lodzie. Na innej 96-dołkowej płytce rozcieńczyć przeciwciałami z sondy do dwukrotnie większego stężenia roboczego.Za pomocą pipety wielokanałowej rozprowadzić 25 mikrolitrów rozcieńczenia przeciwciał z każdej sondy do odpowiednich dołków płytki testowej zawierającej kulkę magnetyczną i wstrząsnąć z dużą prędkością na poziomej wytrząsarce płytkowej w celu wymieszania i ponownego zawieszenia kulek magnetycznych. Po wymieszaniu zmniejsz prędkość przez godzinę inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem. Pod koniec inkubacji umyć płytkę trzy razy świeżym buforem Fly P na każde przemycie na magnetycznej podkładce do płytek w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po ostatnim praniu ponownie zawieś kulki w 50 mikrolitrach streptawidyny PE rozcieńczonej od 1 do 200 w buforze Fly P. Wstrząśnij mieszanką i ponownie zawieś kulki przed inkubacją płytki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut, chroniąc ją przed światłem. Pod koniec inkubacji umyć płytkę trzykrotnie buforem Fly P na magnetycznej podkładce płytkowej w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ponownie zawiesić kulki w 125 mikrolitrach buforu Fly P.Potrząsaj płytką przez minutę z prędkością 900 obrotów, aby dokładnie zawiesić kulki i załadować płytkę do cytometru przepływowego przechowywanego w lodówce. W oprogramowaniu cytometru przepływowego wybierz ustawienie Wysoki cel RP1, warunek zatrzymania 1 000 kulek na region i objętość próbki 80 mikrolitrów. Wstrzymaj bieg w połowie i ponownie zawieś koraliki, aby zapobiec osiadaniu.Na końcu przebiegu wyeksportuj pliki danych w formacie XML. Aby przeprowadzić analizę ANC, wypełnij plik wejściowy ANC, aby odzwierciedlić szczegóły projektu eksperymentalnego i uruchom program, który zapisze plik CSV w usłudze Active Directory. Plik kończący się na trafienia.CSV przedstawi koasocjacje białek, które znacznie różnią się przy fałszywie dodatnim poziomie 0,05 między warunkami kontrolnymi i eksperymentalnymi w co najmniej trzech z czterech kontrprób eksperymentalnych. W przypadku analizy sieci korelacji ważonej wklej tytuły kolumn danych wyjściowych pliku danych przez Matlaba kończące się na mfi. csv do pierwszej kolumny nowego arkusza kalkulacyjnego i dodaj kolumny Experiment (Eksperyment) dla numeru eksperymentu i Treatment (Leczenie) dla leczenia eksperymentalnego oraz wszelkie inne zmienne do analizy.Zapisz ten plik jako traits. csv i otwórz R Studio. Ustaw katalog roboczy na folder zawierający plik mfi.csv i traits. csv, podświetl sekcje kodu i naciśnij Enter polecenia, aby uruchomić polecenia języka R, jak wskazano w pliku polecenia z komentarzem. Moduły analizy sieci ważonej korelacji istotnie skorelowane z każdą cechą eksperymentalną zostaną wygenerowane w postaci pliku graficznego, a korelacja każdej interakcji z każdym modułem zostanie wyprowadzona w postaci pliku CSV.Dla każdej interakcji w pliku wyjściowym ANC określ, czy ta interakcja jest również istotna dla CNA, i utwórz nową kolumnę, która wskazuje, czy każde trafienie ANC jest również trafieniem CNA. Przekonwertuj wartości na logowanie dwukrotnej zmiany i oblicz średnią wartość dla wszystkich trafień CNA unii ANC. Na koniec utwórz nowy arkusz kalkulacyjny z każdym trafieniem CNA w związku ANC wymienionym według celu immunoprecypitacji w jednej kolumnie, celu sondy w drugiej kolumnie i wartości zmiany krotności w trzeciej kolumnie.Zaimportuj ten plik do Cytoscape jako sieć, aby utworzyć diagram krawędzi węzła. Interakcje białek o wysokim poziomie ufności zidentyfikowane za pomocą dwóch niezależnych podejść statystycznych są wizualizowane jako diagramy krawędzi węzłów za pomocą oprogramowania open source, Cytoscape, lub jako mapy cieplne przy użyciu kodu R i instrukcji analizy zawartych w materiale dodatkowym. Przez cały czas trwania protokołu użytkownicy muszą dbać o dokładne pipetowanie, skrupulatne prowadzenie dokumentacji i utrzymywanie próbek w niskiej temperaturze przez cały czas.Wykorzystaliśmy QMI, aby zrozumieć, w jaki sposób szlaki transdukcji sygnału różnicują różne typy danych wejściowych i integrują informacje z wielu receptorów.

quantification-protein-interaction-network-dynamics-using-multiplexed

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przedstawiamy wariant metody QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown), wprowadzonej wcześniej w celu odróżnienia rzeczywistych od fałszywych oddziaływań białko-białko. Nasze podejście opiera się na znakowaniu metabolicznym 15N , modulowaniu powinowactwa oddziaływań białko-białko poprzez obecność lub brak ATP, immunoprecypitacji oraz ilościowej spektrometrii mas.

Protokół identyfikacji oddziaływań białko-białko w oparciu o znakowanie metaboliczne 15N, immunoprecypitację, ilościową spektrometrię mas oraz modulację powinowactwa

Eksperymenty immunoprecypitacji SILAC stanowią potężny sposób na odkrycie nowych interakcji białko-białko. Umożliwiając dokładną względną kwantyfikację obfitości białek zarówno w próbkach kontrolnych, jak i testowych, prawdziwe interakcje można łatwo odróżnić od zanieczyszczeń eksperymentalnych, a interakcje o niskim powinowactwie zachować dzięki zastosowaniu mniej rygorystycznych warunków buforowych.

Identyfikacja partnerów interakcji białkowych w komórkach ssaków za pomocą proteomiki ilościowej SILAC-immunoprecypitacji

Interakcje białko-białko mogą zachodzić zarówno w jądrze, jak i w cytoplazmie komórki. Aby zbadać te interakcje, stosuje się tradycyjną koimmunoprecypitację i nowoczesny test ligacji zbliżeniowej. W tym badaniu porównujemy te dwie metody wizualizacji rozkładu oddziaływań NF90-RBM3 w jądrze i cytoplazmie.

Wizualizacja interakcji białko-białko we frakcjach jądrowych i cytoplazmatycznych za pomocą koimmunoprecypitacji i testu ligacji zbliżeniowej in situ

Połączenia międzykomórkowe są niezbędne do funkcjonowania i rozwoju gruczołu sutkowego. Manuskrypt ten zawiera szczegółowy protokół badania interakcji białko-białko (PPI) i kolokalizacji przy użyciu mysich gruczołów sutkowych. Techniki te pozwalają na badanie dynamiki fizycznego związku między połączeniami międzykomórkowymi na różnych etapach rozwoju.

Analiza oddziaływań białko-białko i kolokalizacji między składnikami połączeń szczelinowych, ścisłych i adherenowych w mysich gruczołach sutkowych

Opisany jest proces proteomiki do identyfikacji partnerów interakcji białkowych z frakcji subkomórkowej jądrowej za pomocą wzbogacenia immunopowinowactwa danego białka i bezznacznikowej spektrometrii mas. Przepływ pracy obejmuje frakcjonowanie subkomórkowe, immunoprecypitację, przygotowywanie próbek wspomagane filtrem, oczyszczanie offline, spektrometrię mas i dalszy potok bioinformatyczny.

Bezznacznikowa spektrometria mas immunoprecypitacji do profilowania interaktomii jądrowej na dużą skalę

Prezentujemy narzędzie do biologii systemów JUMPn do przeprowadzania i wizualizacji analizy sieci dla ilościowych danych proteomicznych, ze szczegółowym protokołem obejmującym wstępne przetwarzanie danych, grupowanie koekspresji, wzbogacanie szlaków i analizę sieci interakcji białko-białko.

JUMPn: Usprawniona aplikacja do grupowania koekspresji białek i analizy sieci w proteomice

Tutaj opisujemy metodę bakteryjnej koekspresji różnie znakowanych białek za pomocą zestawu kompatybilnych wektorów, a następnie konwencjonalne techniki pulldown do badania kompleksów białkowych, które nie mogą się składać in vitro.

Test pulldown w połączeniu z koekspresją w komórkach bakteryjnych jako efektywne czasowo narzędzie do testowania trudnych interakcji białko-białko

Ten protokół łączy masową fotometrię z nowatorskim systemem mikroprzepływowym do badania interakcji białko-białko o niskim powinowactwie. Podejście to opiera się na szybkim rozcieńczaniu silnie skoncentrowanych kompleksów w roztworze, co umożliwia pomiary o niskim powinowactwie i rozszerza zastosowanie fotometrii masowej.

Analiza tworzenia kompleksów białkowych w stężeniach mikromolowych poprzez sprzężenie mikrofluidyki z fotometrią masową

Interakcje białko-białko są ważne dla wyjaśnienia funkcji docelowych białek, a koimmunoprecypitacja (co-IP) może łatwo potwierdzić IPP. Przejściowo transfekowaliśmy plazmid kodujący białko znakowane epitopem do komórek HEK-293 i opracowaliśmy metodę immunoprecypitacji, aby łatwo potwierdzić wiązanie dwóch białek docelowych.

Immunoprecypitacja za pomocą żelu powinowactwa do znaczników antyepitopowych w celu zbadania interakcji białko-białko

Przedstawiamy protokół umożliwiający wychwytywanie i identyfikację specyficznych dla choroby interakcji białko-białko z komórek i tkanek rodzimych za pomocą sond chemicznych i spektrometrii mas. Uzyskane zbiory danych interakcji są analizowane za pomocą dedykowanej platformy internetowej, aby ujawnić dynamiczne dysfunkcje sieci oraz zmiany w ścieżkach związane z chorobą.

Mapowanie dysfunkcyjnych interakcji białko-białko w chorobach

Poznaj metodę QMI do jednoczesnego pomiaru setek interakcji białkowych w sieciach sygnałowych. Technika ta umożliwia analizę danych na poziomie całej sieci przy minimalnym zużyciu biomateriału.

Kwantyfikacja dynamiki sieci interakcji białek za pomocą multipleksowanej koimmunoprecypitacji

Przeglądaj więcej filmów