Skuteczna metoda ukierunkowanej indukcji komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) w funkcjonalne komórki podobne do hepatocytów (HLC) poprzez ciągłe uzupełnianie Activiny A i CHIR99021 podczas różnicowania hESC do ostatecznej endodermy (DE).

Ludzkie embrionalne komórki macierzyste pochodzące z hepatocytów są przydatne w modelowaniu chorób i badaniach przesiewowych leków. Jest to wydajna i powtarzalna metoda skutecznego indukowania różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w funkcjonalne komórki podobne do hepatocytów. Niezróżnicowany status i odpowiednie zbieganie się ludzkich embrionalnych komórek macierzystych mają kluczowe znaczenie dla pomyślnego różnicowania się do komórek podobnych do hepatocytów.

W celu utrzymania komórek macierzystych, należy pokryć sterylne płytki z sześcioma dołkami poddanymi kulturom tkankowym jednym mililitrem 1X Matrigel z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych na studzienkę i przechowywać je w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Pozostaw płytki w temperaturze pokojowej na 30 minut przed użyciem. Rozmrażaj kriokonserwowane HESE w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty bez wstrząsania, a następnie natychmiast przenieś komórki macierzyste, pipetując je do 15-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej cztery mililitry wstępnie podgrzanego podłoża mTESR o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Odwirować HESE i odessać supernatant, a następnie delikatnie ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze pożywki mTESR. Odessać pożywkę DMEM F-12 z płytki. Zasiać komórki na sześciodołkowej płytce o gęstości 1 x 10 do 5. komórek w dwóch mililitrach mTESR i inkubować w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla.

Utrzymuj komórki, codziennie zastępując pożywkę wstępnie podgrzaną pożywką mTESR. Przechodź komórki w około 70 do 80% zbiegu lub gdy kolonie komórkowe zaczynają się stykać. W przypadku pasażowania komórek należy zassać pożywkę i inkubować komórki z jednym mililitrem roztworu enzymatycznego na studzienkę przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Przenieś komórki, pipetując je do 15-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej cztery mililitry DMEM F-12 wstępnie podgrzanego do 37 stopni Celsjusza. Przygotuj płytki 24-dołkowe, pokrywając je 250 mikrolitrami pożywki Matrigel 1X z kwalifikacją hESC. Wysiewaj hESC o gęstości od 1 do 1,5 razy od 10 do 5 komórek na studzienkę w 500 mikrolitrach pożywki mTESR.

Dodać zarówno aktywinę A do końcowego stężenia 100 nanogramów na mililitr, jak i CHIR99021 do końcowego stężenia trzech mikromolów w odpowiedniej objętości podgrzanego etapu jednego podstawowego podłoża. Po trzech dniach różnicowania zróżnicowane komórki powinny wyrażać markery ostatecznych komórek endodermy, takich jak FOXA2, SOX17, GATA4, CXCR4 i FOXA1. W trzecim dniu różnicowania odessać pożywkę, zastąpić ją pożywką drugiego stopnia i inkubować przez 24 godziny.

Zmieniaj podłoże co drugi dzień w dniach od czwartego do ósmego. Po ośmiu dniach różnicowania zróżnicowane komórki powinny wykazywać ekspresję odpowiednich markerów komórek progenitorowych wątroby, takich jak HNF4 alfa, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA. W ósmym dniu odessać pożywkę drugiego stopnia z komórek i zastąpić ją pożywką trzeciego etapu.

Pozwól komórkom inkubować przez 10 dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla i zmieniaj pożywkę co drugi dzień ze świeżo dodanymi czynnikami różnicującymi. Po 18 dniach różnicowania w zróżnicowanych komórkach powinna wykazywać się ekspresja charakterystycznych markerów hepatocytów, takich jak AAT, ALB, TTR, HNF4 alfa, NTCP, ASGR1, CYP3A4. Przedstawiono schemat ideowy komórek podobnych do hepatocytów z hESC oraz obrazy w jasnym polu każdego etapu różnicowania.

W pierwszym etapie aktywinę A i CHIR99021 dodawano na trzy dni, aby skłonić komórki macierzyste do utworzenia komórek endodermy. W drugim etapie komórki endodermy różnicowały się w komórki progenitorowe wątroby po traktowaniu pożywką różnicującą przez pięć dni. W trzecim etapie, po 10 dniach, wczesne hepatocyty dojrzały i zróżnicowały się w komórki podobne do hepatocytów w czynniku wzrostu hepatocytów i onkostatynie.

W końcowej fazie różnicowania komórki wykazywały typowy fenotyp hepatocytów. RT-PCR, barwienie immunofluorescencyjne i western blotting zastosowano do wykrywania markerów komórek endodermy, komórek prekursorowych wątroby i dojrzałych hepatocytów. Zróżnicowane komórki wykazywały wysoki poziom ekspresji genów i białek związanych z różnicowaniem na każdym etapie, takich jak markery endodermy SOX17 w trzecim dniu, marker prekursorowy wątroby HNF4 alfa w ósmym dniu, AFP w 14 dniu i dojrzały marker hepatocytów ALB w 18 dniu.

HLC wykazywały zielone zabarwienie i rozległe barwienie przesunięciem kwasu cytoplazmatycznego. Hepatocyty wykazywały typową morfologię dwujądrową. Aktywność enzymatyczna CYP3A4, niezbędnego metabolicznego CYP w wątrobie w HLC, została potwierdzona za pomocą testu enzymatycznego.

Kluczowe znaczenie ma umiejscowienie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w odpowiedniej gęstości i rozpoczęcie różnicowania w następnym dniu. W pierwszym etapie delikatnie dotknij podłoża, ponieważ komórki mają skłonność do unoszenia się do góry. Połączenie aktywiny A i innych małych cząsteczek może jeszcze bardziej poprawić efektywność różnicowania i wytworzyć bardziej dojrzałe komórki podobne do hepatocytów w tej procedurze.

Technika ta może stanowić platformę do badania transplantacji hepatocytów, inżynierii tkankowej wątroby, biosztucznych wątrob i modelowania chorób.