Name: Skuteczna metoda ukierunkowanej indukcji komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Poznaj metodę różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w hepatocytowate komórki przy użyciu Activin A i CHIR99021. Protokół zapewnia wydajną, powtarzalną indukcję dojrzałych hepatocytów do badań chorób i testowania leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (nr 81870432 i 81570567 do X.L.Z.), (nr 81571994 do P.N.S.); fundację nauk przyrodniczych prowincji Guangdong, Chiny (nr 2020A1515010054 do P.N.S.), Fundację Uniwersytetu Li Ka Shing Shantou (nr L1111 2008 do P.N.S.). Chcielibyśmy podziękować prof. Stanleyowi Linowi z Shantou University Medical College za przydatne rady.

1. Utrzymanie komórek macierzystych
UWAGA: Opisany poniżej protokół konserwacji komórek dotyczy linii komórkowej hES03 utrzymywanej w przylegającej monowarstwie. W przypadku wszystkich poniższych protokołów zawartych w tym manuskrypcie, komórki powinny być traktowane pod komorą bezpieczeństwa biologicznego.
<ol>
	<li>Przygotować 1x pożywkę do hodowli komórek macierzystych mTesR, rozcieńczając 5x pożywkę uzupełniającą do pożywki podstawowej mTesR.</li>
	<li>Przygotować 30 pożywek Matrigel z kwalifikacją hESC, rozcieńczając 5 ml Matrigelu z kwalifikacją hESC z 5 ml DMEM/F12 na lodzie. Przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować 1x pożywkę Matrigel z kwalifikacją hESC, rozcieńczając 33,3 μl 30x Matrigel z kwalifikacją hESC z 1 ml DMEM/F12.</li>
	<li>Sterylne 6-dołkowe płytki poddane kulturze tkankowej pokryć wcześniej 1 ml 1x Matrigel z kwalifikacją hESC w każdym dołku i przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc. Pozostawić w temperaturze pokojowej (RT) na co najmniej 30 minut przed użyciem.</li>
	<li>Rozmrażać kriokonserwowane hESC w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 3 minuty bez wstrząsania. Następnie natychmiast przenieść komórki przez pipetowanie do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 4 ml wstępnie podgrzanej pożywki mTesR o temperaturze 37 °C, delikatnie pipetować w górę i w dół 2 razy.</li>
	<li>Odwirować hESC przy 200 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać supernatant i delikatnie zawiesić komórki w 1 ml pożywki mTesR.</li>
	<li>Odessać pożywkę DMEM/F12 z płytki i zasiać komórki w dołku na płytce 6-dołkowej o gęstości 1 x 105 komórek w 2 ml mTesR.</li>
	<li>Inkubować w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 i utrzymywać komórki, codziennie zastępując je podgrzaną pożywką mTesR. Przejdź komórki przy około 70-80% zbiegu lub gdy kolonie komórkowe zaczną się stykać.</li>
</ol>
2. Przejście i różnicowanie komórek macierzystych
<ol>
	<li>W przypadku komórek pasażujących należy zassać pożywkę i inkubować komórki w ilości 1 ml roztworu enzymatycznego na studzienkę (np. Accutase przez 5 minut w temperaturze 37 °C). Następnie przenieść komórki przez pipetowanie do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 4 ml DMEM/F12 podgrzanej do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 200 x g w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.</li>
	<li>Odessać pożywkę i delikatnie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki mTesR.</li>
	<li>Przygotować płytki 24-dołkowe, pokrywając je wcześniej 250 μl 1x pożywki Matrigel z kwalifikacją hESC. Nasiona hESC, jak opisano powyżej, o gęstości 1 - 1,5 x 105 komórek na studzienkę w 500 μl pożywki mTesR.</li>
	<li>Pozostawić komórki do inkubacji przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 .</li>
</ol>
3. Formacja DE
<ol>
	<li>Przygotować roztwory podstawowe 100 μg/ml aktywiny A z DPBS zawierającym 0,2% BSA i 3 mM CHIR99021 z DMSO.</li>
	<li>Przygotuj podstawową pożywkę różnicującą Etap I, uzupełniając pożywkę RPMI o 1x B27.</li>
	<li>Dodać aktywinę A do końcowego stężenia 100 ng/ml i CHIR99021 do końcowego stężenia 3 μM w odpowiedniej objętości podgrzanej pożywki podstawowej do różnicowania etapu I.</li>
	<li>Odessać pożywkę mTesR z komórek i zastąpić pożywką różnicującą etapu I zawierającą dodane czynniki różnicujące (np. 0,5 ml na dołek 24-dołkowej płytki).</li>
	<li>Pozostawić komórki do inkubacji przez 3 dni w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 , zastępując codziennie pożywki etapu I świeżo dodanymi czynnikami różnicującymi (dni 0-2). 
	UWAGA: Po 3 dniach różnicowania zróżnicowane komórki powinny wyrażać markery komórek DE, takie jak FOXA2, SOX17, GATA4, CRCR4 i FOXA1 (minimum 80% SOX17 potrzebne do kontynuacji).</li>
</ol>
4. Różnicowanie komórek progenitorowych wątroby
<ol>
	<li>Przygotować podstawowe podłoża różnicujące etapu II, rozpuszczając zastępczą surowicę nokautującą (KOSR) do końcowego stężenia 20% w Knock Out DMEM.</li>
	<li>Przygotować pożywkę różnicującą etapu II zawierającą 1% DMSO, 1x GlutaMAX, 1x roztwór aminokwasów endogennych (NEAA), 100 μM 2-merkaptoetanolu i 1x penicylinę/streptomycynę (P/S) do odpowiedniej objętości KOSR/knockout DMEM.</li>
	<li>W 3 dniu różnicowania odessać pożywkę i zastąpić pożywką etapu II (np. 0,5 ml na dołek z płytki 24-dołkowej). Następnie inkubować przez 24 godziny.</li>
	<li>W 4 dniu różnicowania odessać pożywkę i zastąpić pożywką etapu II (np. 1 ml na dołek z płytki 24-dołkowej).</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę co drugi dzień (wymień pożywkę w 6 dniu). 
	UWAGA: Po 8 dniach różnicowania zróżnicowane komórki powinny wykazywać ekspresję odpowiednich markerów komórek progenitorowych wątroby, takich jak HNF4α, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA (minimum 80% HNF4α potrzebne do postępowania).</li>
</ol>
5. Różnicowanie hepatocytów
<ol>
	<li>Przygotować 10 μg/ml czynnika wzrostu hepatocytów (HGF), 20 μg/ml roztworów podstawowych onkostatyny (OSM) z DBPS (zawierającymi 0,2% BSA) i przefiltrować z membraną filtracyjną 0,22 μm.</li>
	<li>Przygotować pożywkę podstawową do różnicowania etapu III (pożywka HepatoZYME-SFM (HZM) uzupełniona 10 μM hydrokortyzonem-21-hemibursztynianem i 1x P/S).</li>
	<li>Dodać HGF do końcowego stężenia 10 ng/ml i OSM do końcowego stężenia 20 ng/ml do odpowiedniej objętości podgrzanego podłoża różnicującego etapu III.</li>
	<li>W 8 dniu różnicowania odessać pożywkę etapu II z komórek i zastąpić pożywką etapu III (np. 1 ml na dołek płytki 24-dołkowej).</li>
	<li>Pozostawić komórki do inkubacji przez 10 dni w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 , zmieniając pożywkę etapu III co drugi dzień ze świeżo dodanymi czynnikami różnicującymi (dni 8-18). 
	UWAGA: Po 18 dniach różnicowania zróżnicowane komórki powinny wykazywać ekspresję charakterystycznych markerów hepatocytów, takich jak AAT, ALB, TTR, HNF4α, NTCP, ASGR1, CYP3A4. Odsetek komórek albuminowo-dodatnich zwykle wynosi ponad 90%.</li>
</ol>
6. Izolacja RNA, synteza cDNA i analiza RT-qPCR
<ol>
	<li>Odessać pożywkę z komórek i dodać odpowiednią ilość odczynnika RNAiso Plus (np. 0,3 ml na dołek płytki 24-dołkowej). Zebrać supernatant do probówki o pojemności 1,5 ml i odstawić w temperaturze pokojowej na 5 minut.</li>
	<li>Dodać 60 μl odczynnika chloroformowego i pozostawić w temperaturze pokojowej na 5 minut. Następnie odwirować przy 12 000 x g przez 15 minut.</li>
	<li>Zebrać 125 μl supernatantu i przenieść go do innej probówki wirówkowej. Dodać 160 μl izopropanolu, dobrze wymieszać i odstawić w temperaturze pokojowej na 10 minut.</li>
	<li>Wirować przy 12 000 x g przez 10 min.</li>
	<li>Usunąć sklarowany osad, dodać 75% etanolu do wytrąconego roztworu i odwirować przy 7 500 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Po wysuszeniu w temperaturze pokojowej dodaj 40 μl wody uzdatnionej DEPC do rozpuszczenia. W przypadku qPCR należy dokonać odwrotnej transkrypcji 2 μg całkowitego RNA za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Wykonaj RT-qPCR przy użyciu komercyjnego zestawu zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Normalizuj ekspresję genów w stosunku do nieindukowanych komórek macierzystych i określ zmienność fałdowania po normalizacji do GAPDH.</li>
</ol>
7. Immunofluorescencyjna walidacja różnicowania
<ol>
	<li>Przygotuj 1x bufor płuczący PBST, dodając 0,1% Tween-20 do PBS.</li>
	<li>Odessać pożywkę z przylegających komórek i krótko przemyć PBS w temperaturze RT na wytrząsarce.</li>
	<li>Odessać PBS i inkubować komórki z 500 μl lodowatego metanolu na dołek 24-dołkowej płytki w celu utrwalenia komórek w temperaturze -20 °C przez noc.</li>
	<li>Usunąć metanol i przemyć komórki 3 razy PBS na wytrząsarce przez 10 minut za każdym razem w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Blokuj komórki z 500 μL 5% BSA przygotowane w PBS przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w stosunku 1: 200 w tym samym roztworze, który jest używany do blokowania.</li>
	<li>Inkubować utrwalone komórki w 300 μl roztworu przeciwciał pierwszorzędowych przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce.</li>
	<li>Po całonocnej inkubacji przemywać komórki 3 razy PBST przez 10 minut za każdym razem w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.</li>
	<li>Przygotować drugorzędowy roztwór przeciwciała w roztworze blokującym w stosunku 1:1000.</li>
	<li>Inkubować w 300 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych, chronionego przed światłem, przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.</li>
	<li>Odessać roztwór przeciwciał drugorzędowych i przemywać komórki 3 razy PBST przez 10 minut za każdym razem w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.</li>
	<li>Inkubować komórki z 300 μl 1 μg/ml DAPI przez 3-5 minut, a następnie dwukrotnie przemyć PBST.</li>
	<li>Po odessaniu PBST należy dodać odpowiednią ilość PBS do wykonania zdjęć pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
</ol>
8. Analiza Western blot
<ol>
	<li>Przygotuj 1x TBST bufor do płukania, dodając 0,1% Tween-20 do soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS).</li>
	<li>Przygotuj bufor do elektroforezy SDS-PAGE i zachodni bufor transferowy przy użyciu komercyjnego zestawu zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Rozpuść całkowite białko komórkowe (40 μg) na 10% żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanu sodu i uruchom w buforze do elektroforezy SDS-PAGE przy stałym prądzie 15 mA przez około 2 godziny.</li>
	<li>Przenieść żel na membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) przy stałym prądzie 300 mA przez 2 godziny w niskiej temperaturze. 
	UWAGA: Czas pracy i czas transferu mogą się różnić w zależności od używanego sprzętu oraz rodzaju i procentowej zawartości żelu.</li>
	<li>Zablokować membranę 3% BSA przygotowanym w TBST przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.</li>
	<li>Inkubować w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego (rozcieńczenie 1:1000) przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce.</li>
	<li>Po całonocnej inkubacji przemyć błonę bibułkową 3 razy TBST przez 15 minut za każdym razem w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.</li>
	<li>Inkubować w drugorzędowym roztworze przeciwciał (rozcieńczenie 1:2000) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.</li>
	<li>Odrzucić roztwór przeciwciał drugorzędowych i przemyć membranę 3 razy TBST, za każdym razem przez 15 minut, w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.</li>
	<li>Wizualizacja pasm immunoreaktywnych za pomocą odczynnika chemiluminescencyjnego, a następnie autoradiografii. Użyj β-aktyny jako kontroli załadunku.</li>
</ol>
9. Wychwyt zieleni indocyjaninowej
<ol>
	<li>Przygotować 200 mg/ml roztworu podstawowego zieleni indocyjaninowej w DMSO.</li>
	<li>Przygotować roztwór roboczy, uzupełniając pożywkę różnicującą etapu III roztworem zieleni indocyjaninowej do końcowego stężenia 1 mg/ml.</li>
	<li>Inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 1-2 godziny.</li>
	<li>Odessać pożywkę i przemyć komórki 3 razy PBS.</li>
	<li>Zdjęcie pod mikroskopem.</li>
</ol>
10. Barwienie kwasem okresowym Schiffa (PAS) i barwienie Hematoksyliną-Eozyną (H&E)
<ol>
	<li>Odessać pożywkę z przylegających komórek i krótko przemyć dwukrotnie PBS.</li>
	<li>W celu utrwalenia komórek należy odessać PBS i inkubować komórki z lodowatym metanolem w temperaturze -20 °C przez noc.</li>
	<li>Wizualizacja magazynowania glikogenu przez barwienie PAS i obserwowanie komórek dwujądrowych przez barwienie H i E za pomocą zestawu zgodnego z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Rób zdjęcia za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
</ol>
11. Test aktywności CYP
<ol>
	<li>Zmierzyć aktywność CYP450 za pomocą dostępnych na rynku testów komórkowych (testy P450-Glo) zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Do testowania użyj trzech niezależnych powtórzeń. Dane są reprezentowane jako średnia ± SD.</li>
</ol>

<ol><li>Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+Acid+Metabolism+in+the+Liver%3A+Nutritional+and+Physiological+Significance%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).</li>
<li>Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+mechanisms+of+liver+dysfunction+in+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Discovery+Medicine%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular mechanisms of liver dysfunction in COVID-19.</a> Discovery Medicine. 30, 107-112 (2020).</li>
<li>Todorovic Vukotic, N., Dordevic, J., Pejic, S., Dordevic, N., Pajovic, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antidepressants-+and+antipsychotics-induced+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Antidepressants- and antipsychotics-induced hepatotoxicity.</a> Archives of Toxicology. , (2021).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+qualified+clinical-grade+functional+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells+in+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Generation of qualified clinical-grade functional hepatocytes from human embryonic stem cells in chemically defined conditions.</a> Cell Death & Disease. 10, 763(2019).</li>
<li>Rassouli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+Patterns+of+Royan+Human+Embryonic+Stem+Cells+Correlate+with+Their+Propensity+and+Culture+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Journal%22%5BJournal%5D)">Gene Expression Patterns of Royan Human Embryonic Stem Cells Correlate with Their Propensity and Culture Systems.</a> Cell Journal. 21, 290-299 (2019).</li>
<li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+endoderm+induction+from+human+pluripotent+stem+cells+by+logically+directing+signals+controlling+lineage+bifurcations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations.</a> Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).</li>
<li>Mukherjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox17+and+beta-catenin+co-occupy+Wnt-responsive+enhancers+to+govern+the+endoderm+gene+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Sox17 and beta-catenin co-occupy Wnt-responsive enhancers to govern the endoderm gene regulatory network.</a> Elife. 9, (2020).</li>
<li>Ang, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Roadmap+for+Human+Liver+Differentiation+from+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).</li>
<li>Carpentier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engrafted+human+stem+cell-derived+hepatocytes+establish+an+infectious+HCV+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model.</a> Journal of Clinical Investigation. 124, 4953-4964 (2014).</li>
<li>Gomez, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neural+crest+induction+by+temporal+modulation+of+WNT+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Human neural crest induction by temporal modulation of WNT activation.</a> Developmental Biology. 449, 99-106 (2019).</li>
<li>Lee, J., Choi, S. H., Lee, D. R., Kim, D. S., Kim, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Isthmic+Organizer-Like+Cells+from+Human+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+and+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of Isthmic Organizer-Like Cells from Human Embryonic Stem Cells.</a> Molecules and Cells. 41, 110-118 (2018).</li>
<li>Matsuno, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+definitive+endoderm+subtypes+by+robust+induction+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Redefining definitive endoderm subtypes by robust induction of human induced pluripotent stem cells.</a> Differentiation. 92, 281-290 (2016).</li>
<li>Mathapati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-Molecule-Directed+Hepatocyte-Like+Cell+Differentiation+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 38, 1-18 (2016).</li>
<li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+differentiation+of+hESCs+to+functional+hepatic+endoderm+requires+ActivinA+and+Wnt3a+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 12301-12306 (2008).</li>
<li>Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule-driven+hepatocyte+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 4, 939-952 (2015).</li>
<li>Yu, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K%2FmTORC2+regulates+TGF-beta%2FActivin+signalling+by+modulating+Smad2%2F3+activity+via+linker+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">PI3K/mTORC2 regulates TGF-beta/Activin signalling by modulating Smad2/3 activity via linker phosphorylation.</a> Nature Communications. 6, 7212(2015).</li>
<li>Borowiak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+efficiently+direct+endodermal+differentiation+of+mouse+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 348-358 (2009).</li>
<li>Tahamtani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+human+embryonic+stem+cells+with+different+combinations+of+priming+and+inducing+factors+toward+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Treatment of human embryonic stem cells with different combinations of priming and inducing factors toward definitive endoderm.</a> Stem Cells and Development. 22, 1419-1432 (2013).</li>
<li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+hepatocyte-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Research. 19, 1233-1242 (2009).</li>
<li>Sullivan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+human+hepatic+endoderm+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51, 329-335 (2010).</li>
<li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cell-derived+hepatocytes+as+a+model+for+hepatitis+B+virus+infection%2C+spreading+and+virus-host+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions.</a> Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+applications+of+human+hepatocyte-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Derivation and applications of human hepatocyte-like cells.</a> World Journal of Stem Cells. 11, 535-547 (2019).</li>
<li>Ogawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+and+cAMP+signaling+promote+the+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes.</a> Development. 140, 3285-3296 (2013).</li>
<li>Kim, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+drug-induced+immune-mediated+hepatotoxicity+using+hepatocyte-like+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells.</a> Toxicology. 387, 1-9 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiamy metodę krokową, która indukuje HLC z hESC w trzech etapach. W pierwszym etapie aktywinę A i CHIR99021 wykorzystano do różnicowania hESC w DE. W drugim etapie wykorzystano KO-DMEM i DMSO do różnicowania DE w komórki progenitorowe wątroby. W trzecim etapie zastosowano HZM plus HGF, OSM i sól sodową 21-hemibursztynianu hydrokortyzonu w celu dalszego różnicowania komórek progenitorowych wątroby w HLC.
Podczas korzystania z protokołu należy wziąć pod uwagę następujące kr...

Wątroba jest organem wysoce metabolicznym, który pełni kilka ról, w tym odtlenianie, magazynowanie glikogenu oraz wydzielanie i syntezę białek1. Różne patogeny, leki i dziedziczność mogą powodować patologiczne zmiany w wątrobie i wpływać na jej funkcje2,3. Hepatocyty, jako główna jednostka funkcjonalna wątroby, odgrywają ważną rolę w sztucznych systemach wspomagania wątroby i eliminacji toksyczności leków. Jednak zasoby pierwotnych ludzkich hepatocytów są ograniczone w terapii komórkowej, a także w badaniach nad chorobami wątroby. Dlatego opracowanie nowych źródeł funkcjonalnych ludzkich hepatocytów jest ważnym kierunkiem badań w dziedzinie medycyny regeneracyjnej. Od 1998 roku, kiedy to powstały hESCs4, hESC są szeroko rozważane przez badaczy ze względu na ich doskonały potencjał różnicowania (mogą różnicować się w różne tkanki w odpowiednim środowisku) i wysoki stopień samoodnawialności, a tym samym stanowią idealne komórki źródłowe dla biosztucznych wątrob, przeszczepów hepatocytów, a nawet inżynierii tkankowej wątroby5.
Obecnie efektywność różnicowania wątroby można znacznie zwiększyć poprzez wzbogacenie endodermy6. W różnicowaniu linii komórek macierzystych w endodermę, poziomy szlaków sygnalizacyjnych transformującego czynnika wzrostu β (TGF-β) i szlaków sygnałowych WNT są kluczowymi czynnikami na etapie tworzenia endodermy. Aktywacja wysokiego poziomu sygnalizacji TGF-β i WNT może sprzyjać rozwojowi endoderm7,8. Aktywina A to cytokina należąca do nadrodziny TGF-β. Dlatego aktywina A jest szeroko stosowana w indukcji endodermy ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) i hESCs9,10. GSK3 jest kinazą białkową serynowo-treoninową. Naukowcy odkryli, że CHIR99021, specyficzny inhibitor GSK3β, może stymulować typowe sygnały WNT i może promować różnicowanie komórek macierzystych w określonych warunkach, co sugeruje, że CHIR99021 ma potencjał do indukowania różnicowania komórek macierzystych w endodermie 11,12,13.
Tutaj przedstawiamy efektywną i powtarzalną metodę skutecznego indukowania różnicowania hESC w funkcjonalne HLC. Sekwencyjne dodawanie aktywiny A i CHIR99021 wytworzyło około 89,7±0,8% komórek SOX17 (marker DE). Po dalszym dojrzewaniu in vitro, komórki te wykazywały ekspresję markerów specyficznych dla wątroby i wywierały morfologię podobną do hepatocytów (w oparciu o barwienie hematoksyliną i eozyną (H & E)) oraz funkcje, takie jak wychwyt zieleni indocyjaninowej (ICG), magazynowanie glikogenu i aktywność CYP3. Wyniki pokazują, że za pomocą tej metody hESC można z powodzeniem różnicować w dojrzałe funkcjonalne HLC i mogą one stanowić podstawę do badań związanych z chorobami wątroby i badań przesiewowych leków in vitro.

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td>Do różnicowania progenitorów wątroby</td></tr><tr><td>488 znakowana koza przeciwko myszy IgG</td><td>ZSGB-BIO</td><td>ZF-0512</td><td>Dla IF, drugie przeciwciało</td></tr><tr><td>488 znakowane koza przeciwko królikowi IgG</td><td>ZSGB-BIO</td><td>ZF-0516</td><td>Dla IF, drugie przeciwciało</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7920</td><td>Do pasażu komórkowego</td></tr><tr><td>Aktywina A</td><td>peproTech</td><td>120-14E</td><td>Do ostatecznego tworzenia endodermy</td></tr><tr><td>Anty albumina (ALB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6684</td><td>Dla IF i WB, pierwszorzędowe przeciwciało</td></tr><tr><td>Anti - Human Oct4</td><td>Abcam</td><td>Ab19587</td><td>Dla IF, pierwszorzędowe przeciwciało</td></tr><tr><td>Anty-&alfa;-Fetoprotein (AFP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8452</td><td>Dla IF i WB, pierwszorzędowe przeciwciało</td></tr><tr><td>Anti-SOX17</td><td>Abcam</td><td>ab224637</td><td>Dla IF, pierwszorzędowe przeciwciało</td></tr><tr><td>Anty-hepatocyty Czynnik jądrowy 4 alfa (HNF4&alpha;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB1412164</td><td>Dla IF, pierwszorzędowe przeciwciało</td></tr><tr><td>B-27 Suplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>Do definitywnego tworzenia endodermy</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Beyotime</td><td>ST023-200g</td><td>Do blokowania komórek</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML1046</td><td>Do definitywnego tworzenia endodermy</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Beyotime</td><td>C1006</td><td>Do barwienia jądrowego</td></tr><tr><td>DEPC-water</td><td>Beyotime</td><td>R0021</td><td>Do rozpuszczania RNA</td></tr><tr><td>DM3189</td><td>MCE</td><td>HY-12071</td><td>Do ostatecznego tworzenia endodermy</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td>Do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td>Do różnicowania progenitorów wątroby</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>Do różnicowania progenitorów wątroby</td></tr><tr><td>H& Zestaw do barwienia E</td><td>Beyotime</td><td>C0105S</td><td>dla H& Barwienie E Czynnik</td></tr><tr><td>wzrostu hepatocytów (HGF)</td><td>peproTech</td><td>100-39</td><td>Do różnicowania hepatocytów</td></tr><tr><td>HepatoZYME-SFM (HZM)</td><td>Gibco</td><td>17705-021</td><td>Do różnicowania hepatocytów</td></tr><tr><td>Hydrokortyzon-21-hemibursztynian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4881</td><td>Do różnicowania hepatocytów</td></tr><tr><td>Indocyanine</td><td>Sangon Biotech</td><td>A606326</td><td>Do barwienia indocyjaniny</td></tr><tr><td>Knock Out DMEM</td><td>Gibco</td><td>10829-018</td><td>Do różnicowania progenitorów wątroby</td></tr><tr><td>Knock Out SR Multi-Species</td><td>Gibco</td><td>A31815-02</td><td>Do różnicowania progenitorów wątroby</td></tr><tr><td>Matrigel z kwalifikacją hESC</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>MEM NeAA</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>Do różnicowania progenitorów wątroby</td></tr><tr><td>mTesR 5X Suplement</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>85852</td><td>Do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>mTesR Basal Medium</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>85851</td><td>Do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Oncostatin (OSM)</td><td>peproTech</td><td>300-10</td><td>Do różnicowania hepatocytów</td></tr><tr><td>P450 - CYP3A4 (Lucyferin - PFBE)</td><td>Promega</td><td>V8901</td><td>Do aktywności CYP450</td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia PAS</td><td>Solarbio</td><td>G1281</td><td>Do barwienia PAS</td></tr><tr><td>Pióro/paciorkowiec</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Do różnicowania komórek</td></tr><tr><td>Peroksydaza sprzężona z kozą anty-mysią IgG</td><td>ZSGB-BIO</td><td>ZB-2305</td><td>Dla WB, drugie przeciwciało</td></tr><tr><td>Bufor rozcieńczający przeciwciała pierwotne dla&nbsp; Western Blot</td><td>Beyotime</td><td>P0256</td><td>Do pierwotnego rozcieńczania przeciwciał</td></tr><tr><td>Zestaw ReverTraAce qPCR RT</td><td>TOYOBO</td><td>FSQ-101</td><td>Do syntezy cDNA</td></tr><tr><td>RNAiso Plus</td><td>TaKaRa</td><td>9109</td><td>Do izolacji RNA</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>Do ostatecznego tworzenia endodermy</td></tr><tr><td>Mleko odtłuszczone</td><td>Sangon Biotech A600669</td><td></td><td>Do przygotowania drugiego przeciwciała</td></tr><tr><td>SYBR Green Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25742</td><td>Do analizy RT-PCR</td></tr><tr><td>Torin2</td><td>MCE</td><td>HY-13002</td><td>Do ostatecznego tworzenia endodermy</td></tr><tr><td>Tween</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WXBB7485V</td><td>Do przygotowania buforu myjącego</td></tr></tbody></table>

skuteczna metoda ukierunkowanej indukcji komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells

Potencjalne funkcje komórek podobnych do hepatocytów (HLC) pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) są bardzo obiecujące dla zastosowań w modelowaniu chorób i badaniach przesiewowych leków. Przedstawiono tutaj wydajną i powtarzalną metodę różnicowania hESC na funkcjonalne HLC. Ustanowienie linii endodermy jest kluczowym krokiem w różnicowaniu się do HLC. Naszą metodą regulujemy kluczowe szlaki sygnałowe poprzez ciągłe uzupełnianie aktywiny A i CHIR99021 podczas różnicowania hESC w ostateczną endodermę (DE), a następnie generowanie komórek progenitorowych wątroby, a na końcu HLC o typowej morfologii hepatocytów w metodzie etapowej z całkowicie zdefiniowanymi odczynnikami. Otrzymane za pomocą tej metody HLC pochodzące z hESC wyrażają markery specyficzne dla danego etapu (w tym albuminę, receptor jądrowy HNF4α i polipeptyd kotransportujący taurocholan sodu (NTCP)) i wykazują szczególne cechy związane z dojrzałymi i funkcjonalnymi hepatocytami (w tym barwienie zielenią indocyjaninową, magazynowanie glikogenu, barwienie hematoksyliną-eozyną i aktywność CYP3) i mogą stanowić platformę do rozwoju zastosowań opartych na HLC w badaniu chorób wątroby.

Schemat ideowy indukcji HLC z hESC oraz reprezentatywne obrazy jasnego pola każdego etapu różnicowania są pokazane w Rysunek 1. W etapie I aktywinę A i CHIR99021 dodawano na 3 dni, aby skłonić komórki macierzyste do wytworzenia komórek endodermy. W stadium II komórki endodermy różnicowały się w komórki progenitorowe wątroby po leczeniu pożywką różnicującą przez 5 dni. W stadium III wczesne hepatocyty dojrzały i zróżnicowały się w HLC po 10 dniach w HGF i OSM (<silna klasa="xfig">Figura 1A). ...

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) w funkcjonalne komórki podobne do hepatocytów (HLC) poprzez ciągłe uzupełnianie Activiny A i CHIR99021 podczas różnicowania hESC do ostatecznej endodermy (DE).

Skuteczna metoda ukierunkowanej indukcji komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug ...

Ludzkie embrionalne komórki macierzyste pochodzące z hepatocytów są przydatne w modelowaniu chorób i badaniach przesiewowych leków. Jest to wydajna i powtarzalna metoda skutecznego indukowania różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w funkcjonalne komórki podobne do hepatocytów. Niezróżnicowany status i odpowiednie zbieganie się ludzkich embrionalnych komórek macierzystych mają kluczowe znaczenie dla pomyślnego różnicowania się do komórek podobnych do hepatocytów.W celu utrzymania komórek macierzystych, należy pokryć sterylne płytki z sześcioma dołkami poddanymi kulturom tkankowym jednym mililitrem 1X Matrigel z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych na studzienkę i przechowywać je w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Pozostaw płytki w temperaturze pokojowej na 30 minut przed użyciem. Rozmrażaj kriokonserwowane HESE w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty bez wstrząsania, a następnie natychmiast przenieś komórki macierzyste, pipetując je do 15-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej cztery mililitry wstępnie podgrzanego podłoża mTESR o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Odwirować HESE i odessać supernatant, a następnie delikatnie ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze pożywki mTESR. Odessać pożywkę DMEM F-12 z płytki. Zasiać komórki na sześciodołkowej płytce o gęstości 1 x 10 do 5. komórek w dwóch mililitrach mTESR i inkubować w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla.Utrzymuj komórki, codziennie zastępując pożywkę wstępnie podgrzaną pożywką mTESR. Przechodź komórki w około 70 do 80% zbiegu lub gdy kolonie komórkowe zaczynają się stykać. W przypadku pasażowania komórek należy zassać pożywkę i inkubować komórki z jednym mililitrem roztworu enzymatycznego na studzienkę przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Przenieś komórki, pipetując je do 15-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej cztery mililitry DMEM F-12 wstępnie podgrzanego do 37 stopni Celsjusza. Przygotuj płytki 24-dołkowe, pokrywając je 250 mikrolitrami pożywki Matrigel 1X z kwalifikacją hESC. Wysiewaj hESC o gęstości od 1 do 1,5 razy od 10 do 5 komórek na studzienkę w 500 mikrolitrach pożywki mTESR.Dodać zarówno aktywinę A do końcowego stężenia 100 nanogramów na mililitr, jak i CHIR99021 do końcowego stężenia trzech mikromolów w odpowiedniej objętości podgrzanego etapu jednego podstawowego podłoża. Po trzech dniach różnicowania zróżnicowane komórki powinny wyrażać markery ostatecznych komórek endodermy, takich jak FOXA2, SOX17, GATA4, CXCR4 i FOXA1. W trzecim dniu różnicowania odessać pożywkę, zastąpić ją pożywką drugiego stopnia i inkubować przez 24 godziny.Zmieniaj podłoże co drugi dzień w dniach od czwartego do ósmego. Po ośmiu dniach różnicowania zróżnicowane komórki powinny wykazywać ekspresję odpowiednich markerów komórek progenitorowych wątroby, takich jak HNF4 alfa, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA. W ósmym dniu odessać pożywkę drugiego stopnia z komórek i zastąpić ją pożywką trzeciego etapu.Pozwól komórkom inkubować przez 10 dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla i zmieniaj pożywkę co drugi dzień ze świeżo dodanymi czynnikami różnicującymi. Po 18 dniach różnicowania w zróżnicowanych komórkach powinna wykazywać się ekspresja charakterystycznych markerów hepatocytów, takich jak AAT, ALB, TTR, HNF4 alfa, NTCP, ASGR1, CYP3A4. Przedstawiono schemat ideowy komórek podobnych do hepatocytów z hESC oraz obrazy w jasnym polu każdego etapu różnicowania.W pierwszym etapie aktywinę A i CHIR99021 dodawano na trzy dni, aby skłonić komórki macierzyste do utworzenia komórek endodermy. W drugim etapie komórki endodermy różnicowały się w komórki progenitorowe wątroby po traktowaniu pożywką różnicującą przez pięć dni. W trzecim etapie, po 10 dniach, wczesne hepatocyty dojrzały i zróżnicowały się w komórki podobne do hepatocytów w czynniku wzrostu hepatocytów i onkostatynie.W końcowej fazie różnicowania komórki wykazywały typowy fenotyp hepatocytów. RT-PCR, barwienie immunofluorescencyjne i western blotting zastosowano do wykrywania markerów komórek endodermy, komórek prekursorowych wątroby i dojrzałych hepatocytów. Zróżnicowane komórki wykazywały wysoki poziom ekspresji genów i białek związanych z różnicowaniem na każdym etapie, takich jak markery endodermy SOX17 w trzecim dniu, marker prekursorowy wątroby HNF4 alfa w ósmym dniu, AFP w 14 dniu i dojrzały marker hepatocytów ALB w 18 dniu.HLC wykazywały zielone zabarwienie i rozległe barwienie przesunięciem kwasu cytoplazmatycznego. Hepatocyty wykazywały typową morfologię dwujądrową. Aktywność enzymatyczna CYP3A4, niezbędnego metabolicznego CYP w wątrobie w HLC, została potwierdzona za pomocą testu enzymatycznego.Kluczowe znaczenie ma umiejscowienie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w odpowiedniej gęstości i rozpoczęcie różnicowania w następnym dniu. W pierwszym etapie delikatnie dotknij podłoża, ponieważ komórki mają skłonność do unoszenia się do góry. Połączenie aktywiny A i innych małych cząsteczek może jeszcze bardziej poprawić efektywność różnicowania i wytworzyć bardziej dojrzałe komórki podobne do hepatocytów w tej procedurze.Technika ta może stanowić platformę do badania transplantacji hepatocytów, inżynierii tkankowej wątroby, biosztucznych wątrob i modelowania chorób.

an-efficient-method-for-directed-hepatocyte-like-cell-induction-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten artykuł skupi się na generowaniu ludzkiej endodermy wątrobowej z populacji ludzkich embrionalnych komórek macierzystych.

Solidna generacja komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich embrionalnych populacji komórek macierzystych

Ten protokół opisuje efektywną indukcję hemogennego śródbłonka i wielopotencjalnych hematopoetycznych komórek progenitorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych.

Bezpośrednia indukcja hemogennego śródbłonka i krwi przez nadekspresję czynników transkrypcyjnych w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych

Przedstawiona tutaj metoda opisuje skalowalny i gotowy do stosowania w dobrej praktyce produkcyjnej (GMP) system różnicowania do generowania ludzkich komórek hepatocytowych z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Służy jako opłacalny i ustandaryzowany system do generowania ludzkich komórek podobnych do hepatocytów do podstawowych i stosowanych badań nad ludzką wątrobą.

Zdefiniowane i skalowalne generowanie komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przedstawiony tutaj protokół opisuje platformę do identyfikacji małych cząsteczek w leczeniu chorób wątroby. Przedstawiono szczegółowy opis szczegółowy różnicowania iPSC w komórki o charakterystyce hepatocytów na płytkach 96-dołkowych oraz wykorzystania komórek do badań przesiewowych w poszukiwaniu małych cząsteczek o potencjalnej aktywności terapeutycznej.

Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych do odkrywania leków

Ten protokół opisuje półautomatyczne podejście do produkcji komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w formacie płytki 96-dołkowej. Proces ten jest szybki i opłacalny, co pozwala na produkcję partii komórek podobnych do hepatocytów o gwarantowanej jakości do podstawowych i stosowanych badań na ludziach.

Półautomatyczna produkcja komórek podobnych do hepatocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje monowarstwową, pozbawioną surowicy metodę efektywnego generowania komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w ciągu 18 dni. Obejmuje to sześć etapów, w których hPSC sekwencyjnie różnicują się w pośrednie typy komórek, takie jak prymitywna smuga, ostateczna endoderma, tylne jelito przednie i progenitorzy zawiązków wątroby, zanim utworzą komórki podobne do hepatocytów.

Skuteczne różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki wątroby

Tutaj prezentujemy protokół precyzyjnego tworzenia hemogennego śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w stanie wolnym od karmów i kseno. Metoda ta będzie miała szerokie zastosowanie w modelowaniu chorób i badaniach przesiewowych pod kątem związków terapeutycznych.

Różnicowanie śródbłonka hemogennego od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w zdefiniowanym stanie wolnym od karmnika i ksenotypu

Celem tego artykułu jest dostarczenie ustandaryzowanego podejścia do indukowania różnicowania ludzkich komórek progenitorowych wątroby od pluripotencjalnych komórek macierzystych. Opracowanie tej procedury z gotowymi do użycia preparatami pożywek oferuje użytkownikowi łatwy system do generowania ludzkich komórek wątroby do badań biomedycznych i translacji.

Specyfikacja progenitorów wątroby z pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu zdefiniowanego systemu różnicowania

Prezentowany tutaj jest prosty protokół do bezpośredniego różnicowania hemogennych komórek śródbłonka od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w ciągu około 1 tygodnia.

Ukierunkowane różnicowanie hemogennych komórek śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Hepatocyty pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych mogą być oczyszczane poprzez sortowanie komórek, przy użyciu kombinacji barwienia mitochondriów i aktywowanej cząsteczki adhezyjnej komórek leukocytów (ALCAM, znanej również jako CD166).

Zastosowanie barwienia żywych mitochondriów w sortowaniu komórek w celu oczyszczenia hepatocytów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj metodę różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w hepatocytowate komórki przy użyciu Activin A i CHIR99021. Protokół zapewnia wydajną, powtarzalną indukcję dojrzałych hepatocytów do badań chorób i testowania leków.

Skuteczna metoda ukierunkowanej indukcji komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów