Name: Strategia uczenia maszynowego oparta na obrazie żywych komórek do monitorowania różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Poznaj strategię uczenia maszynowego opartą na obrazowaniu żywych komórek do monitorowania różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych. Ta metoda umożliwia nieinwazyjną identyfikację linii komórkowych i optymalizację protokołów w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Qiushi Sun, Yao Wang, Yu Xia, Jinyu Yang, Chang Lin, Zimu Cen, Dongdong Liang, Rong Wei, Ze Xu, Guangyin Xi, Gang Xue, Can Ye, Li-Peng Wang, Peng Zou, Shi-Qiang Wang, Pablo Rivera-Fuentes, Salome Püntener, Zhixing Chen, Yi Liu i Jue Zhang za stworzenie podstaw tej strategii. Prace te były wspierane przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2018YFA0800504, 2019YFA0110000) oraz Projekt Kosmicznego Eksperymentu Medycznego Chińskiego Załogowego Programu Kosmicznego (HYZHXM01020) dla Yang Zhao. Rysunek 1 został utworzony za pomocą BioRender.com.

Monitoring Pluripotent Stem Cell Differentiation by Image-Based ML Strategy

<ol><li>Yoshida, Y., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+10+years+later%3A+for+cardiac+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells 10 years later: for cardiac applications.</a> Circ Res. 120 (12), 1958-1968 (2017).</li>
<li>Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+technology%3A+a+decade+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress.</a> Nat Rev Drug Discov. 16 (2), 115-130 (2017).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nat Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li>
<li>Mordwinkin, N. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+high-throughput+drug+discovery%2C+cardiotoxicity+screening%2C+and+publication+standards%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">A review of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for high-throughput drug discovery, cardiotoxicity screening, and publication standards.</a> J Cardiovasc Transl Res. 6 (1), 22-30 (2013).</li>
<li>Vanden Berg, C. W., Elliott, D. A., Braam, S. R., Mummery, C. L., Davis, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+under+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes under defined conditions.</a> Methods Mol Biol. 1353, 163-180 (2016).</li>
<li>Burridge, P. W., Holmström, A., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+culture+and+cardiomyocyte+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Hum Genet. 87, 1-15 (2015).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+tissue-like+constructs+for+repairing+the+infarcted+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived cardiac tissue-like constructs for repairing the infarcted myocardium.</a> Stem Cell Rep. 9 (5), 1546-1559 (2017).</li>
<li>Smith, A. S. T., Macadangdang, J., Leung, W., Laflamme, M. A., Kim, D. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-derived+cardiomyocytes+and+tissue+engineering+strategies+for+disease+modeling+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-derived cardiomyocytes and tissue engineering strategies for disease modeling and drug screening.</a> Biotechnol Adv. 35 (1), 77-94 (2017).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+to+assess+drug+cardiotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to assess drug cardiotoxicity.</a> Nat Protoc. 13 (12), 3018-3041 (2018).</li>
<li>Mehta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+targeted+and+testable+antiarrhythmic+therapy+for+long-QT+syndrome+type+2+using+a+patient-specific+cellular+model%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Identification of a targeted and testable antiarrhythmic therapy for long-QT syndrome type 2 using a patient-specific cellular model.</a> Eur Heart J. 39 (16), 1446-1455 (2018).</li>
<li>Cahan, P., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+implications+of+pluripotent+stem+cell+variability+and+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 357-368 (2013).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).</li>
<li>Rouhani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+drives+transcriptional+variation+in+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic background drives transcriptional variation in human induced pluripotent stem cells.</a> PLoS Genet. 10 (6), e1004432(2014).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+cell+type+can+influence+the+epigenome+and+differentiation+potential+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Donor cell type can influence the epigenome and differentiation potential of human induced pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (12), 1117-1119 (2011).</li>
<li>Garitaonandia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+risk+of+genetic+and+epigenetic+instability+in+human+embryonic+stem+cells+associated+with+specific+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions.</a> PLoS One. 10 (2), e0118307(2015).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Matoba, N., Yamashita, T., Takayama, K., Sakurai, F., Mizuguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+human+iPS+cell+culture+method+for+efficient+hepatic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Optimal human iPS cell culture method for efficient hepatic differentiation.</a> Differentiation. 104, 13-21 (2018).</li>
<li>Volpato, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+of+molecular+phenotypes+after+long-term+differentiation+to+human+iPSC-derived+neurons%3A+A+multi-site+omics+study%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Reproducibility of molecular phenotypes after long-term differentiation to human iPSC-derived neurons: A multi-site omics study.</a> Stem Cell Rep. 11 (4), 897-911 (2018).</li>
<li>Anderson, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+serendipity+and+reproducibility%3A+Pluripotent+stem+cells+as+experimental+systems+for+intellectual+and+developmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Balancing serendipity and reproducibility: Pluripotent stem cells as experimental systems for intellectual and developmental disorders.</a> Stem Cell Rep. 16 (6), 1446-1457 (2021).</li>
<li>Sepac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cardiomyogenic+potential+among+human+ESC+and+iPSC+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Comparison of cardiomyogenic potential among human ESC and iPSC lines.</a> Cell Transplant. 21 (11), 2523-2530 (2012).</li>
<li>Laco, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+inconsistencies+of+cardiac+differentiation+efficiency+induced+by+the+GSK3%CE%B2+inhibitor+CHIR99021+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Unraveling the inconsistencies of cardiac differentiation efficiency induced by the GSK3β inhibitor CHIR99021 in human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rep. 10 (6), 1851-1866 (2018).</li>
<li>Volpato, V., Webber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addressing+variability+in+iPSC-derived+models+of+human+disease%3A+guidelines+to+promote+reproducibility%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Addressing variability in iPSC-derived models of human disease: guidelines to promote reproducibility.</a> Dis Model Mech. 13 (1), 042317(2020).</li>
<li>Hu, B. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+follows+developmental+principles+but+with+variable+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107 (9), 4335-4340 (2010).</li>
<li>Huo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+batch+variations+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+human+cardiomyocytes+from+2+major+suppliers%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation of batch variations in induced pluripotent stem cell-derived human cardiomyocytes from 2 major suppliers.</a> Toxicol Sci. 156 (1), 25-38 (2017).</li>
<li>Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+based+machine+learning+for+identification+of+macrophage+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Image based machine learning for identification of macrophage subsets.</a> Sci Rep. 7 (1), 3521(2017).</li>
<li>Christiansen, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+labeling%3A+Predicting+fluorescent+labels+in+unlabeled+images%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In silico labeling: Predicting fluorescent labels in unlabeled images.</a> Cell. 173 (3), 792-803 (2018).</li>
<li>Buggenthin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+hematopoietic+lineage+choice+by+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of hematopoietic lineage choice by deep learning.</a> Nat Methods. 14 (4), 403-406 (2017).</li>
<li>Smith, Z. D., Nachman, I., Regev, A., Meissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+single-cell+imaging+of+direct+reprogramming+reveals+an+early+specifying+event%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Dynamic single-cell imaging of direct reprogramming reveals an early specifying event.</a> Nat Biotechnol. 28 (5), 521-526 (2010).</li>
<li>Fan, K., Zhang, S., Zhang, Y., Lu, J., Holcombe, M., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+machine+learning+assisted%2C+label-free%2C+non-invasive+approach+for+somatic+reprogramming+in+induced+pluripotent+stem+cell+colony+formation+detection+and+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A machine learning assisted, label-free, non-invasive approach for somatic reprogramming in induced pluripotent stem cell colony formation detection and prediction.</a> Sci Rep. 7 (1), 13496(2017).</li>
<li>Kusumoto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+deep+learning-based+system+to+identify+endothelial+cells+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Automated deep learning-based system to identify endothelial cells derived from induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rep. 10 (6), 1687-1695 (2018).</li>
<li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+learning-based+predictive+identification+of+neural+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Deep learning-based predictive identification of neural stem cell differentiation.</a> Nat Commun. 12 (1), 2614(2021).</li>
<li>Qian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+for+quality+control+of+cardiomyocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging for quality control of cardiomyocyte differentiation.</a> Nat Commun. 12 (1), 4580(2021).</li>
<li>Ounkomol, C., Seshamani, S., Maleckar, M. M., Collman, F., Johnson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+prediction+of+three-dimensional+fluorescence+images+from+transmitted-light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Label-free prediction of three-dimensional fluorescence images from transmitted-light microscopy.</a> Nat Methods. 15 (11), 917-920 (2018).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+live-cell+image-based+machine+learning+strategy+for+reducing+variability+in+PSC+differentiation+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discovery%22%5BJournal%5D)">A live-cell image-based machine learning strategy for reducing variability in PSC differentiation systems.</a> Cell Discovery. 9 (1), 53(2023).</li>
<li>Selvaraju, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grad-CAM%3A+Visual+explanations+from+deep+networks+via+gradient-based+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+IEEE+Int+Conf+Computer+Vision+%28ICCV%29%22%5BJournal%5D)">Grad-CAM: Visual explanations from deep networks via gradient-based localization.</a> Proc IEEE Int Conf Computer Vision (ICCV). , 618-626 (2017).</li>
<li>Isola, P., Zhu, J. -Y., Zhou, T., Efros, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-to-image+translation+with+conditional+adversarial+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+IEEE+Conf+Computer+Vision+Pattern+Recognition+%28CVPR%29%22%5BJournal%5D)">Image-to-image translation with conditional adversarial networks.</a> Proc IEEE Conf Computer Vision Pattern Recognition (CVPR). , 5967-5976 (2017).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ResNeSt%3A+Split-attention+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+IEEE%2FCVF+Conf+Computer+Vision+Pattern+Recognition+Workshops+%28CVPRW%29%22%5BJournal%5D)">ResNeSt: Split-attention networks.</a> Proc IEEE/CVF Conf Computer Vision Pattern Recognition Workshops (CVPRW). , 2735-2745 (2022).</li>
<li>Halabi, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-activatable+cell+tracker+for+controlled+and+prolonged+single-cell+labeling%29%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-activatable cell tracker for controlled and prolonged single-cell labeling).</a> ACS Chem. Biol. 15 (6), 1613-1620 (2020).</li>
<li>Hannan, N. R. F., Segeritz, C. -P., Touboul, T., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+hepatocyte-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production of hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 8 (2), 430-437 (2013).</li>
<li>Zhang, H., Shen, M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+quiescent+cardiac+fibroblasts+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of quiescent cardiac fibroblasts derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Methods Mol Biol. 2454, 109-115 (2022).</li>
<li>Harding, M. J., McGraw, H. F., Nechiporuk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+and+regulation+of+multicellular+rosette+structures+during+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The roles and regulation of multicellular rosette structures during morphogenesis.</a> Development. 141 (13), 2549-2558 (2014).</li>
<li>Najm, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+robust+generation+of+functional+oligodendrocyte+progenitor+cells+from+epiblast+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid and robust generation of functional oligodendrocyte progenitor cells from epiblast stem cells.</a> Nat Methods. 8 (11), 957-962 (2011).</li>
<li>Hogrebe, N. J., Maxwell, K. G., Augsornworawat, P., Millman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+insulin-producing+pancreatic+%CE%B2+cells+from+multiple+human+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of insulin-producing pancreatic β cells from multiple human stem cell lines.</a> Nat Protoc. 16 (9), 4109-4143 (2021).</li>
</ol>

Yang Zhao, Jue Zhang, Xiaochun Yang, Yao Wang i Daichao Chen składają wniosek patentowy na strategię różnicowania PSC opisaną w tym dokumencie (202210525166.X).

W tym miejscu opisaliśmy szczegółowy protokół mający na celu przezwyciężenie jednego z głównych problemów związanych z obecnym zastosowaniem i translacją PSC - zmienności różnicowania komórek. Wykorzystując obrazowanie w jasnym polu żywych komórek i uczenie maszynowe, iteracyjnie zoptymalizowaliśmy różnicowanie PSC, aby osiągnąć niezmiennie wysoką wydajność na liniach komórkowych i partiach. Jednak w powyższym procesie różnicowania kilka krytycznych etapów protokołu ma decydujący wpływ na to, czy zróżnicowanie zakończy się sukcesem, czy nie. Ponieważ stan komórki w stadium PSC i stadium I jest kluczowy, eksperymentatorzy muszą zwrócić szczególną uwagę na wczesną morfologię komórki, zbieganie się komórek w dniu 0 oraz warunki leczenia CHIR. Dodatkowo eksperymentatorzy powinni starać się zachować oryginalną pożywkę i utrzymać objętość pożywki do hodowli komórkowej na niezmienionym poziomie, modulując dawkę CHIR w ciągu 0-48 godzin. Ponadto w procesie fotografowania i oczyszczania należy wziąć pod uwagę fototoksyczność. Uszkodzenia komórek można zmniejszyć, wybierając obrazowanie w jasnym polu zamiast obrazowania fluorescencyjnego; z tego powodu użyliśmy również UV do fotoaktywacji niechcianych komórek zamiast komórek docelowych. Co więcej, etapy oczyszczania, które opisaliśmy powyżej, oparte na informacjach o obrazie są kłopotliwe i wymagają przejścia przez wiele etapów przewidywania obrazu, regionalnej fotoaktywacji, przepływu i pasażowania, co utrudnia realizację oczyszczania dużej liczby komórek. Oczyszczanie in situ można rozważyć, jeśli dostępne są inne wybrane w regionie urządzenia do zabijania komórek, co eliminuje potrzebę etapu pasażowania komórek.
Jednak przy stosowaniu ML do modulowania procesu różnicowania należy również wziąć pod uwagę kilka kwestii. Jakość zestawów danych oraz wybór modeli i hiperparametrów mają ogromny wpływ na wydajność uczenia maszynowego. Nie ma gwarancji, że nasza konkretna implementacja będzie optymalna dla wszystkich systemów różnicowania i typów komórek; Tym samym doświadczeni inżynierowie ML powinni dostosować wdrożenie do własnych potrzeb. Podczas trenowania i testowania modeli uczenia maszynowego, jeśli wydajność testu pozostaje w tyle za wydajnością trenowania, model może być nadmiernie dopasowany; W takim przypadku spróbuj wzbogacić zestawy treningowe i ponownie wytrenować model. Jeśli model nie może działać dobrze nawet na zestawie treningowym, zbadaj zestaw danych i upewnij się, że cecha komórek docelowych może być łatwo zidentyfikowana. Pomocne może być również dostrajanie hiperparametrów. Ponadto, stosując modele ML w praktycznych scenariuszach, upewnij się, że parametry mikroskopu i obrazowania są identyczne z tymi podczas trenowania modelu; w przeciwnym razie wydajność wytrenowanych modeli uczenia maszynowego zostanie obniżona. Jeśli zmiana warunków obrazowania jest nieunikniona, uzyskaj oznaczone dane z nowych warunków i ponownie wytrenuj lub dostosuj modele uczenia maszynowego. Wreszcie, jeśli różnicowanie komórek nie powiedzie się po pomocy ML, należy wziąć pod uwagę takie aspekty, jak wrodzona tendencja do różnicowania linii PSC lub różnice w partiach odczynników eksperymentalnych, które mogą być bardziej fundamentalne i nie można ich rozwiązać za pomocą naszej strategii. Dołączony jest przewodnik rozwiązywania problemów, który pomaga w identyfikowaniu i rozwiązywaniu potencjalnych problemów (Tabela 1).
Metodologia ta ma potencjał do zastosowania w innych obszarach badań nad komórkami. Zmienność często występuje w procesie różnicowania PSC, takim jak neurony różnicowane przez PSC, hepatocyty, wyspy trzustkowe i jelita 40,41,42,43,44, poważnie zagrażając produkcji komórek na dużą skalę. Jednak komórki często ucieleśniają bogate i zróżnicowane cechy morfologiczne podczas przemian losów komórek, które dostarczają wskazówek do modulowania procesu różnicowania za pomocą uczenia maszynowego opartego na obrazie. Wcześniej wykazaliśmy wartość zastosowania tej strategii w systemach różnicowania komórek progenitorowych nerek i hepatocytów35. Miejmy nadzieję, że metoda ta zostanie zastosowana do standaryzacji innych systemów indukcji losu komórek, takich jak różnicowanie organoidów, bezpośrednia transdyferencjacja lub przeprogramowanie komórek, w szczególności w przypadku tych niestabilnych systemów wymagających wielu etapów i złożonych induktorów.

Pluripotencjalne komórki macierzyste (PSC) posiadają niezwykłą zdolność do różnicowania się w wiele typów komórek in vitro. Te zróżnicowane funkcjonalne komórki mogą być wykorzystywane do terapii komórkowej, modelowania chorób i opracowywania leków, a wszystko to jest cenne dla badań lub zastosowań klinicznych1,2,3. Na przykład opracowano różne metody różnicowania PSC w kardiomiocyty (CM)4,5,6,7. Te CM mogą być stosowane do badań kardiotoksyczności leków, modelowania chorób serca i przeszczepiania komórek8,9,10,11.
Jednak konwersja z PSC do końcowych komórek zróżnicowanych jest procesem stopniowym, a wielokrotne zakłócenia podczas procesu różnicowania mogą prowadzić komórki do rozbieżnych losów komórek. Różne tła genetyczne i cechy epigenetyczne linii PSC wpływają na potencjał różnicowania do określonej linii12,13,14,15; liczba pasaży PSC i skumulowane mutacje genów są również źródłem niejednorodności PSC; Różnice w operacjach eksperymentalnych stosowanych przez różnych eksperymentatorów mogą również prowadzić do zupełnie różnych wyników różnicowania16,17,18,19,20. Dlatego obecnie jednym z głównych problemów w produkcji komórek pochodzących z PSC jest niestabilność między liniami komórkowymi i partiami21,22,23,24,25. Niestabilność w różnicowaniu PSC często prowadzi do wielu powtarzających się eksperymentów, co pochłania znaczne ilości czasu i zasobów pracy. Aby rozwiązać ten problem, konieczne jest opracowanie strategii, która zminimalizuje zmienność między liniami komórkowymi i partiami, zwiększając w ten sposób stabilność i odporność różnicowania.
Ostatnio postępy w mikroskopii o wysokiej rozdzielczości i uczeniu maszynowym (ML) ułatwiły zastosowanie ilościowej analizy obrazu opartej na ML w biologii komórki, umożliwiając wykorzystanie cennych informacji w funkcjach obrazowania komórek26,27,28,29,30,31,32,33,34. W naszej poprzedniej pracy zaproponowaliśmy strategię uczenia maszynowego opartą na obrazie żywych komórek, aby monitorować i interweniować w stan różnicowania PSC w czasie rzeczywistym w celu poprawy stabilności i wydajności różnicowania PSC (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)35. Biorąc za przykład różnicowanie PSC do kardiomiocytów, oceniliśmy początkowy stan PSC za pomocą losowych modeli lasu, przewidzieliśmy optymalny warunek różnicowania za pomocą modeli regresji logistycznej i rozpoznaliśmy pomyślnie zróżnicowane komórki za pomocą opartego na głębokim uczeniu Grad-CAM36 i pix2pix37. Modele uczenia maszynowego nauczyły się identyfikować linie komórkowe na podstawie szeregu cech morfologicznych jasnego pola, w tym cech obszaru, obwodu, wypukłości, solidności, jasności, prędkości ruchu i innych niejawnych cech wyodrębnionych przez głębokie konwolucyjne sieci neuronowe. Opierając się na wnioskach z tych ustalonych modeli uczenia maszynowego, zrealizowaliśmy kontrolę początkowego stanu PSC, wczesną ocenę i interwencję w warunkach różnicowania oraz eliminację nieprawidłowo zróżnicowanego zanieczyszczenia komórek, zapewniając razem kompleksową i dokładną modulację procesu różnicowania serca. W tym miejscu przedstawiamy protokół krok po kroku dotyczący opracowania strategii.

<table><tbody><tr><td>0,25% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>Rozcieńczone roztwory zostały użyte do trawienia CPC i CM</td></tr><tr><td>4% paraformaldehydu w PBS</td><td>KeyGEN BioTECH</td><td>KGIHC016</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>NEST</td><td>703001</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>NEST</td><td>701001</td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplement</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplement minus insulina</td><td>Gibco</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>GPC BIOTECH</td><td>AA904-100G</td><td></td></tr><tr><td>Celldiscoverer 7</td><td>Instrumenty Zeiss</td><td></td><td>używane do wykonywania obrazów w jasnym polu podczas różnicowania i końcowych obrazów cTnT</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Selleck</td><td>S1263</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie IgG (H + L) Wysoce adsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo</td><td>A-21202</td><td>Przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td>Sortownik cytometrii</td><td></td> przepływowej</tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>VISTECH</td><td>SE100-B</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>YEASEN</td><td>40732ES03</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka pluripotencjalna komórka macierzysta Podłoże</td> <td>zdefiniowane chemicznieCauliscell Inc</td><td>400105</td><td>Podstawowa pożywka do przygotowania PSC</td></tr><tr><td>iPS-18</td><td>TaKaRa</td><td>Y00300</td><td></td></tr><tr><td>iPS-B1</td><td>Cellapy</td><td>CA4025106</td><td></td></tr><tr><td>iPS-F</td><td>Nuwacell</td><td>RC01001-B</td><td></td></tr><tr><td>iPS-M</td><td>Nuwacell</td><td>RC01001-A</td><td></td></tr><tr><td>IWR1-1-endo</td><td>Selleck</td><td>S7086</td><td>IWR1</td></tr><tr><td>Jupyter Notebook</td><td>N/ Wersja</td><td>6.4.0</td><td><a href="https://jupyter.org/">https://jupyter.org/</a></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>Wersja R2020a</td><td>Oprogramowanie do obliczeń naukowych i adnotacji obrazów</td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Matrigel</td></tr><tr><td>Mysz monoklonalna IgG1 anty-cTnT</td><td>Thermo</td><td>MA5-12960</td><td>cTnT przeciwciało pierwotne</td></tr><tr><td>Normalny Osioł Serum</td><td>Jackson</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash 4.0 V3 cyfrowa kamera CMOS</td><td>Hamamatsu</td><td>C13440-20CU</td><td>Aparat cyfrowy zamontowany na Celldiscoverer7</td></tr><tr><td>PBS</td><td>NEB</td><td>21-040-CVR</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pluripotencja Growth Mater 1 podłoże podstawowe</td><td>Cellapy</td><td>CA1007500-1</td><td>Podłoże podstawowe PSC pożywka hodowlana</td></tr><tr><td>Pluripotencja Growth Mater 1 suplement</td><td>Cellapy</td><td>CA1007500-2</td><td>Suplement pożywki hodowlanej PSC</td></tr><tr><td>Prism</td><td>Graphpad</td><td>Wersja 8/9</td><td>Oprogramowanie statystyczne do analizy statystycznej i kreślenia</td></tr><tr><td>Python</td><td>N/A</td><td>wersja 3.6</td><td>Środowisko Python 3 do obliczeń naukowych, z pakietami pytorch (1.9.0), numpy, scipy, pandas, visdom, scikit-learn, scikit-image, OpenCV-Python i oprogramowanie Matplotlib do obliczeń naukowych i adnotacji obrazów.</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875176</td><td></td></tr><tr><td>Suplement hPSC-CDM (500x)</td><td>Cauliscell Inc</td><td>00015</td><td>Suplement pożywki do preparatu PSC</td></tr><tr><td>TiE</td><td>Nikon</td><td></td><td>Odwrócony mikroskop fluorescencyjny (z modyfikacją) do oczyszczania regionalnego</td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100</td><td>Amresco</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Versene Solution</td><td>Thermo</td><td>15040066</td><td>EDTA roztwór do mineralizacji PSC</td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Selleck</td><td>S6390</td><td></td></tr><tr><td>Zen</td><td>Zeiss</td><td>Version 3.1</td><td>Oprogramowanie wspomagające Celldiscoverer7 do&nbsp; akwizycji, przetwarzania i analizy obrazów</td></tr></tbody></table>

strategia uczenia maszynowego oparta na obrazie żywych komórek do monitorowania różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych

A Live-cell Image-Based Machine Learning Strategy to Monitor Pluripotent Stem Cell Differentiation

Technologie pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC) były szeroko stosowane w odkrywaniu leków, modelowaniu chorób i medycynie regeneracyjnej. Jednak dostępne systemy różnicowania komórek PSC do funkcjonalnego są utrudnione przez problemy z dużą zmiennością między liniami i między partiami. Dlatego tak ważna jest precyzyjna kontrola różnicowania komórek w czasie rzeczywistym. W tym protokole opisujemy nieinwazyjną i inteligentną strategię, która pokonuje zmienność różnicowania komórek za pomocą uczenia maszynowego opartego na obrazie w jasnym polu. Biorąc za przykład różnicowanie PSC do kardiomiocytów, metodologia ta dostarcza szczegółowych informacji na temat kontroli początkowego stanu PSC, wczesnej oceny i interwencji w warunkach różnicowania oraz eliminacji nieprawidłowo zróżnicowanego zanieczyszczenia komórek, razem realizując niezmiennie wysoką jakość różnicowania od PSC do funkcjonalnych komórek. Zasadniczo strategia ta może zostać rozszerzona na inne systemy różnicowania lub przeprogramowania komórek z wieloma etapami wspierającymi produkcję komórek, a także pogłębiającymi zrozumienie mechanizmów podczas przekształcania losu komórki.

Na podstawie obrazowania w jasnym polu i ML, cały proces różnicowania może być inteligentnie monitorowany i optymalizowany. Na etapie PSC opracowaliśmy model ML, który mógł przewidzieć ostateczną skuteczność różnicowania zgodnie z cechami morfologicznymi początkowych kolonii PSC, aby określić najbardziej odpowiedni lub odpowiedni punkt czasowy do zainicjowania różnicowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A,B). Efektywność różnicowania przewidywana przez model lasu losowego jest silnie skorelowana z rzeczywistą efektywnością różnicowania (r Pearsona = 0,76, P &lt; 0,0001) (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B). Wytrenowany model podkreśla również cechy, które są najważniejsze dla zróżnicowania. Spośród wszystkich cech morfologicznych kolonii, odchylenie standardowe, minimalny i minimalny/maksymalny stosunek odległości od środka do konturu (CCD), a także obwód, powierzchnia, stosunek powierzchni do obwodu, wypukłość i okrągłość, to 8 cech o największej wadze. Związek między tymi cechami a ostateczną wydajnością sugeruje, że początkowe kolonie PSC o umiarkowanej powierzchni i dłuższych, nieregularnych obrzeżach miały tendencję do posiadania wyższej wydajności różnicowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A), co inspiruje nas do poprawy wydajności różnicowania poprzez wydłużenie czasu przetwarzania roztworu mineralizacyjnego w celu uzyskania mniejszych kolonii o dłuższych, bardziej nieregularnych granicach (patrz krok protokołu 1.3.1). Monitorowanie kolonii PSC oparte na uczeniu maszynowym i zoptymalizowane operacje pasażowania komórek zapewniają optymalizację początkowego stanu komórki.</silna></silna></silna>
Na I etapie różnicowania serca, oceniliśmy i dostosowaliśmy dawkę CHIR (induktora wczesnego różnicowania serca) za pomocą ML. Korzystając z regresji logistycznej, dawka CHIR może być oceniona wcześnie za pomocą poklatkowych obrazów jasnego pola z 0-12 godzin. Klasyfikator regresji logistycznej osiąga 93,1% dokładności, 88,7% precyzji, 94,5% kompletności, 91,1% wyniku F1 i 97,2% AUC, gdy czas trwania CHIR jest wybrany jako 24 godziny. Wyniki odchylenia (przewidywany wynik) są silnie skorelowane ze "stężeniem ΔCHIR" (prawdziwym wynikiem) dla każdego warunku dawki CHIR w eksperymentach (r Pearsona = 0,82, P &lt; 0,0001) (<silna klasa="xfig">Rysunek 4C,D), co sugeruje, że przewidywanie ML może odzwierciedlać odchylenie dawek CHIR od optimum. Dzięki wczesnej ocenie dawek CHIR możemy dostosować czas trwania lub stężenie leczenia CHIR do optimum przed 48 godzinami, co pozwala nam szybko skorygować nieprawidłowo zróżnicowaną trajektorię komórek i utrzymać różnicowanie CM z wysoką wydajnością.</silna>
Zbudowaliśmy również modele ML, aby informacyjnie rozpoznawać CPC i CM na podstawie obrazów w jasnym polu na etapie II i III różnicowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 5A-D). Wprowadzając obrazy żywych komórek w jasnym polu, wytrenowane modele uczenia maszynowego mogą przewidywać regionalną dystrybucję CPC i CM oraz nieinwazyjnie oceniać ostateczną skuteczność różnicowania. W przypadku rozpoznawania CPC maski segmentacji CPC przewidywane przez ResNeSt i Grad-CAM są zgodne z maskami z adnotacjami ręcznymi (<silna klasa="xfig">Rysunek 5A), ze średnim IoU wynoszącym 59,0%. Przewidywana proporcja regionów CPC może również służyć jako wskaźnik końcowej skuteczności różnicowania (r Pearsona = 0,88, P &lt; 0,0001) (<silna klasa="xfig">Rysunek 5B). W celu rozpoznania CM model pix2pix może generować obrazy fluorescencyjne cTnT, które są podobne do prawdziwych (eksperymentalnie uzyskanych) obrazów fluorescencyjnych cTnT (<silna klasa="xfig">Rysunek 5C), z wysoką korelacją między przewidywanym a prawdziwym wskaźnikiem efektywności różnicowania całej studni (r Pearsona = 0,93, P &lt; 0,0001) (<silna klasa="xfig">Rysunek 5D). Takie podejście pozwala uniknąć nieodwracalnych uszkodzeń komórek spowodowanych barwieniem immunofluorescencyjnym lub sortowaniem przepływowym. Opierając się na sondzie aktywowanej fotoaktywem (DACT-1), udało nam się osiągnąć skuteczne, selektywne oczyszczanie CPC w regionie bez biomarkerów (<silna klasa="xfig"> Rysunek 5E,F), umożliwiając w ten sposób oczyszczanie w czasie rzeczywistym pożądanego typu komórki podczas procesu różnicowania.</silna></silna></silna></silna></silna></silna>
Tak więc, wykorzystując obrazowanie w jasnym polu żywych komórek i ML, metodologia umożliwia przewidywanie linii komórkowych w czasie rzeczywistym i ocenę wydajności w całym procesie różnicowania, modulując i stabilizując różnicowanie PSC.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66823/66823fig01.jpg"> 
Rysunek 1: Schemat przepływu pracy różnicowania CM wspomaganego przez ML. Eksperymentator przeprowadza różnicowanie serca i uzyskuje poklatkowe obrazy komórek w jasnym polu z mikroskopu; obrazy na każdym etapie różnicowania CM są przekazywane do wytrenowanych modeli uczenia maszynowego w celu przewidywania; Wykorzystując prognozę jako informację zwrotną, eksperymentatorzy modulują i optymalizują schemat różnicowania w czasie rzeczywistym, aby osiągnąć stabilne, wysokowydajne różnicowanie. Podziałka = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66823/66823fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66823/66823fig02.jpg"> 
Rysunek 2: Akwizycja obrazu komórki. (A) Przykład obrazu żywej komórki w jasnym polu ze stadium PSC z 70% konfluencją komórek. (B) Przykład obrazu żywej komórki w jasnym polu ze stadium PSC z 80-90% konfluencją komórek. (C) Przykład obrazu żywej komórki w jasnym polu ze etapu CPC. (D) Przykład obrazu na żywo w jasnym polu ze sceny CM. (E) Przykład jasnego pola i fluorescencji po barwieniu immunofluorescencyjnym z tego samego pola widzenia. (A-E) Podziałka = 250 μm. Skróty: PSC = pluripotencjalne komórki macierzyste; CPC = komórka progenitorowa serca; CM = kardiomiocyt; cTnT = sercowa troponina T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66823/66823fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66823/66823fig03.jpg"> 
Rysunek 3: Zrzuty ekranu dotyczące użycia ML. (A-C) Reprezentatywne zrzuty ekranu dla ML na etapie PSC, w tym (A) przygotowanie zestawu danych, (B) testowanie wydajności modelu i (C) interpretacja ważności funkcji. (D-F) Reprezentatywne zrzuty ekranu dla uczenia maszynowego na etapie I, w tym (D) przygotowanie zestawu danych i (E,F) OCENA MODELU. (G-I) Reprezentatywne zrzuty ekranu dla uczenia maszynowego na etapie II, w tym (G) przygotowanie zestawu danych, (H) trenowanie modelu i (I) ocena modelu. (J-L) Reprezentatywne zrzuty ekranu dla uczenia maszynowego na etapie III, w tym (J) szkolenie modelu i (K,L)) oceny modelu. Skróty: ML = uczenie maszynowe; PSC = pluripotencjalna komórka macierzysta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66823/66823fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66823/66823fig04.jpg"> 
Rysunek 4: Reprezentatywne wyniki na etapie PSC i etapie I dla różnicowania CM opartego na ML. (A) Wyniki wizualizacji cech na etapie PSC. Przedstawiono zależność między skutecznością różnicowania a ośmioma najważniejszymi cechami. Ważność funkcji jest określana przez wytrenowany model uczenia maszynowego. Zakres każdej funkcji jest podzielony na 20 pojemników. Wskaźniki efektywności różnicowania dla studzienek w każdym pojemniku są uśredniane i wyświetlane według kolorów. Trend zmiany koloru pokazuje, w jaki sposób każda cecha morfologiczna wpływa na ostateczną skuteczność różnicowania. Wyniki te razem sugerują, że umiarkowany obszar, dłuższe obwody, bardziej zróżnicowane odległości od środka konturu, mniejsza okrągłość i wyższa wypukłość bardziej sprzyjają różnicowaniu. (B) Ocena skuteczności uczenia maszynowego na etapie PSC poprzez analizę korelacji między prawdziwym a przewidywanym wskaźnikiem efektywności różnicowania. Wysoka korelacja wskazuje, że potencjał różnicowania kolonii PSC można przewidzieć na podstawie jego cech morfologicznych. n = 584 studzienki. (C) Ocena działania ML na etapie I z wykorzystaniem analizy korelacji między przewidywanymi wynikami odchylenia a rzeczywistymi stężeniami ΔCHIR dla każdego warunku dawki CHIR w partii. Wyniki odchylenia (w zakresie od -1 do 1) są przewidywane nieinwazyjnie przez ML przy użyciu strumieni obrazu w jasnym polu 0-12 godzin. Stężenia ΔCHIR (..., -4 μM, -2 μM, 0, 2 μM, 4 μM, ...) są oznaczane doświadczalnie na podstawie końcowych wyników różnicowania w celu zmierzenia rzeczywistego odchylenia od optymalnych warunków dla każdego warunku CHIR. Wyniki przewidywanego odchylenia w dużym stopniu wskazują na rzeczywiste stężenia ΔCHIR, co sugeruje, że przewidywanie ML może służyć jako sygnał do oceny i dostosowania dawki CHIR. Niebieskie i czerwone pola reprezentują odpowiednio stany przedawkowania i przedawkowania. (D) Ocena skuteczności uczenia maszynowego na etapie I z wykorzystaniem walidacji krzyżowej. W każdej rundzie jedna partia jest używana do testowania, podczas gdy inne są do trenowania, aby przetestować zdolność uogólniania modeli uczenia maszynowego w nowych partiach. Przeprowadzana jest analiza korelacji między przewidywanymi wynikami odchyleń a rzeczywistymi stężeniami ΔCHIR (przy czasie trwania CHIR wynoszącym 24 godziny). Kolor kropek reprezentuje różne partie testowe. n = 20 dawek CHIR. Ten rysunek został zaczerpnięty z Yang et al.35. Skróty: ML = uczenie maszynowe; PSC = pluripotencjalna komórka macierzysta; CHIR = CHIR99021. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66823/66823fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66823/66823fig05.jpg"> 
Rysunek 5: Reprezentatywne wyniki na etapie CPC i etapie CM dla zróżnicowania CM opartego na ML. (A) Typowy wynik ML dla rozpoznania CPC na etapie II. Pokazano prawdziwe obrazy fluorescencji cTnT w dniu 12 (po lewej), ręcznie opisane regiony CPC (w środku) oraz regiony CPC przewidywane przez ML przy użyciu obrazów jasnego pola w dniu 6 (po prawej). Przewidywane wyniki są bardzo zbliżone do rzeczywistych wyników eksperymentu. Podziałka liniowa = 1 mm. (B) Ocena wydajności ML na etapie II przy użyciu analizy korelacji między prawdziwym wskaźnikiem efektywności różnicowania (z 12 dnia znaczników fluorescencyjnych cTnT) a przewidywanym procentem regionów CPC (z 6 dnia obrazów jasnego pola). Wysoka korelacja sugeruje, że efektywność różnicowania można przewidzieć nieinwazyjnie na etapie II. Wskaźniki efektywności rzeczywistego zróżnicowania są znormalizowane w zakresie od 0% do 100%. n = 35 dołków. (C) Typowy wynik ML dla rozpoznania CM na etapie III. Pokazane są rzeczywiste wyniki fluorescencji cTnT (po lewej), przewidywane wyniki fluorescencji cTnT (w środku) oraz mapa cieplna służąca do porównywania przewidywanej i rzeczywistej intensywności fluorescencji w każdym pikselu (po prawej). Obrazy fluorescencyjne są zmieniane na 512 x 512 pikseli, a liczby w pojemnikach mapy cieplnej reprezentują liczbę pikseli na 100. Duża część pikseli znajduje się wzdłuż ukośnej linii mapy cieplnej, co wskazuje, że przewidywana i rzeczywista intensywność fluorescencji są zbliżone. Podziałka liniowa = 1 mm. (D) Ocena wydajności uczenia maszynowego na etapie III przy użyciu analizy korelacji między prawdziwymi i przewidywanymi wskaźnikami efektywności różnicowania. Prawdziwe i przewidywane wskaźniki efektywności różnicowania są znormalizowane w zakresie od 0% do 100%. n = 36 studzienek. (E) Zidentyfikowany obrazowo efekt oczyszczania CPC w dniu 6. Po FACS i 6 dniach hodowli, nieznakowane CPC zidentyfikowane obrazem wykazują wysoką czystość CM w porównaniu z nieznakowanymi DACT-1 nie-CPC i komórkami grupy kontrolnej (CTL). Podziałka = 100 μm. (F) Analiza ilościowa efektu oczyszczania poprzez porównanie procentowej zawartości komórek cTnT+ w (E). Dane są średnimi ± SD. n = 5 obrazów. * P &lt; 0,05; P &lt; 0,0001 za pomocą jednoczynnikowej ANOVA, a następnie wielokrotnych testów porównawczych Dunnetta. Ten rysunek został zaczerpnięty z Yang et al.35. Skróty: ML = uczenie maszynowe; PSC = pluripotencjalna komórka macierzysta; CPC = komórka progenitorowa serca; CM = kardiomiocyt; cTnT = sercowa troponina T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66823/66823fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Zaobserwowano problem</td>
			<td colspan="4">Możliwy powód</td>
			<td colspan="5">Rozwiązanie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Modele ML nie działają dobrze na zbiorze treningowym.</td>
			<td colspan="4">1. Trenowanie modelu ML nie jest dobrze zbieżne. 
			2. W przypadku tradycyjnego uczenia maszynowego wyodrębnione cechy obrazu nie są wystarczająco pouczające, aby odzwierciedlić stany komórek i linie. 
			3. W przypadku głębokiego uczenia moc reprezentacji zaprojektowanej sieci neuronowej nie jest wystarczająca do wykonania zadania. 
			4. Samo zadanie jest trudne do nauczenia.</td>
			<td colspan="5">1. Dostosuj hiperparametry, np. zwiększ liczbę epok i zmodyfikuj tempo uczenia się. 
			2. Obserwuj obrazy, aby znaleźć morfologiczne wskazówki dotyczące stanów komórek. Projektowanie biologicznie wiarygodnych cech. 
			3. Zmodyfikuj architekturę sieci, aby zwiększyć jej złożoność. 
			4. Zbadaj zestaw danych i upewnij się, że cechy komórek docelowych można łatwo zidentyfikować. Jeśli model nie nauczy się zadania, spróbuj zastosować ML na etapie, na którym wskazówki obrazowe są bardziej przejrzyste lub zaprojektować prostsze zadanie.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Modele ML nie działają dobrze na zestawie treningowym, ale nie na zestawie testowym.</td>
			<td colspan="4">1. Model jest nadrzędny w stosunku do zestawu treningowego. </td>
			<td colspan="5">1. Wzbogać zestawy danych treningowych i ponownie wytrenuj model. Zwiększ różnorodność zestawów danych treningowych, uwzględniając więcej linii komórkowych, warunków różnicowania i warunków obrazowania. 
			W przypadku tradycyjnego uczenia maszynowego użycie wyboru funkcji w celu zmniejszenia liczby funkcji wejściowych może również zwiększyć zdolność uogólniania modelu.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Modele ML nie działają dobrze na nowych partiach lub nowych liniach komórkowych.</td>
			<td colspan="4">1. Zmiana parametrów mikroskopu i obrazowania. 
			2. Cechy morfologiczne różnych linii komórkowych mogą być różne.</td>
			<td colspan="5">1. Upewnij się, że urządzenie do obrazowania jest takie samo jak podczas trenowania modelu. 
			2. Zbierz oznakowane dane uzyskane z nowych linii komórkowych i/lub nowych warunków obrazowania, przetrenuj lub dostosuj modele uczenia maszynowego.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Modulacja procesu różnicowania pod kierunkiem ML nie wydaje się poprawiać wyniku różnicowania.</td>
			<td colspan="4">1. Dane wyjściowe ML są niedokładne. 
			2. Występują problemy z eksperymentalnymi odczynnikami lub procedurami. 
			3. Linia komórkowa ma podstawowe problemy, brak zdolności do różnicowania.</td>
			<td colspan="5">1. Spróbuj rozwiązać powyższe kroki. 
			2. Sprawdź odczynniki laboratoryjne i procedury eksperymentalne. 
			3. Zmień linie komórkowe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Zanieczyszczenie typu komórkowego nadal występuje po oczyszczeniu.</td>
			<td colspan="4">1. Niedokładne wyniki przewidywania. 
			2. Niektóre niechciane komórki znajdujące się na krawędzi oczyszczonego obszaru zostały zamknięte.</td>
			<td colspan="5">1. Zoptymalizuj wyniki przewidywane przez ML. 
			2. Stosuj wyniki przewidywane przez uczenie maszynowe bardziej konserwatywnie, tj. odpowiednie zmniejszenie rozmiaru regionu CM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Zły stan komórki po oczyszczeniu.</td>
			<td colspan="4">1. Fototoksyczność laserowa. 
			2. Powolny proces działania. 
			3. Uszkodzenie komórek spowodowane trawieniem. 
			4. Uszkodzenie komórek spowodowane procesem sortowania przepływowego.</td>
			<td colspan="5">1. Wyeliminuj niechciane komórki za pomocą promieniowania laserowego zamiast komórek docelowych. 
			2. Szybsza operacja. 
			3. Dostosuj metodę pasażu, taką jak zmniejszenie stężenia enzymów trawiennych. 
			4. Dostosuj metodę sortowania, na przykład zmniejszając prędkość przepływu komórek ustawioną podczas procesu sortowania.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Tabela rozwiązywania problemów.

Dostępne systemy różnicowania komórek macierzystych pluripotencjalnych (PSC) do funkcjonalnych komórek są obecnie utrudnione przez problemy związane z poważną zmiennością między liniami i między partiami. Tutaj, używając różnicowania serca jako głównego przykładu, przedstawiamy protokół inteligentnego monitorowania i modulowania procesu różnicowania PSC w oparciu o uczenie maszynowe oparte na obrazie.

Strategia uczenia maszynowego oparta na obrazie żywych komórek do monitorowania różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych

Pluripotent stem cell (PSC) technologies have been widely used in drug discovery, disease modeling, and regenerative medicine.&#160;However, available ...

W tym badaniu, opartym na obrazach w jasnym polu z komórek na żywo, opracowaliśmy strategię, wykorzystując różne modele uczenia maszynowego. Strategia ta może nieinwazyjnie identyfikować linię komórkową, modulować proces różnicowania w czasie rzeczywistym i optymalizować protokół różnicowania, poprawiając niewrażliwość na funkcjonalne różnicowanie komórek PSC. Pluripotencjalne komórki macierzyste wykazują zdolność różnicowania się w wiele typów komórek in vitro, które mogą być wykorzystane do terapii komórkowej, modelowania chorób i opracowywania leków.Jednym z głównych problemów w produkcji komórek pochodzących z PSC jest niestabilność między liniami komórkowymi i partiami. Często prowadzi to do wielu powtarzających się eksperymentów, pochłaniając dużo czasu i pracy. Obecnie najnowocześniejsze technologie mikroskopowe mogą wspierać długoterminową, poklatkową, wysokoprzepustową akwizycję obrazów na żywych komórkach.Tymczasem szybko rozwijająca się metoda uczenia maszynowego jest coraz częściej stosowana w analizie obrazu komórkowego, co otwiera możliwości rozpoznawania określonych składników komórkowych lub obrazów komórek podczas różnicowania w hodowli komórkowej. Miejmy nadzieję, że metoda ta może zostać zastosowana do standaryzowanych innych systemów indukcji losu komórek, takich jak różnicowanie organoidów, bezpośrednia transdyferencjacja lub programowanie komórkowe, szczególnie w przypadku niestabilnych systemów wymagających wielu etapów i złożonych induktorów. Ponadto nasza strategia jest kompatybilna z innymi technologiami, które obiecująco można zintegrować z samoadaptacyjnym systemem o zamkniętej pętli do w pełni automatycznego przetwarzania różnicowania PSC in vitro.

a-live-cell-image-based-machine-learning-strategy-to-monitor

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Gómez-Villafuertes, R., et. al., Obrazowanie na żywo, a następnie śledzenie pojedynczych komórek w celu monitorowania biologii komórki i progresji linii wielu populacji neuronów. J. vis. exp. (2017){{}} . Film przedstawia proces przygotowania, obrazowania i śledzenia dorosłych nerwowych komórek macierzystych w czasie rzeczywistym w celu zbadania zachowań komórek, w tym podziału i różnicowania.

 Obrazowanie na żywo i śledzenie pojedynczych komórek w celu monitorowania linii neuronalnej w dorosłych nerwowych komórkach macierzystych

Protokół przedstawiony w tym badaniu opisuje metody monitorowania postępu przeprogramowania w czasie rzeczywistym poprzez pomiar kinetyczny dodatnich i ujemnych markerów pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Protokół obejmuje również obrazową ocenę morfologii oraz ekspresję markera lub reportera podczas generowania iPSC.

Pomiar kinetyczny i wizualizacja przeprogramowania somatycznego w czasie rzeczywistym

Opisany jest solidny protokół do monitorowania populacji neuronów za pomocą wideomikroskopii poklatkowej, a następnie przetwarzania końcowego opartego na oprogramowaniu. Metoda ta stanowi potężne narzędzie do identyfikacji zdarzeń biologicznych w wybranej populacji podczas eksperymentów obrazowania na żywo.

Obrazowanie na żywo, a następnie śledzenie pojedynczych komórek w celu monitorowania biologii komórki i progresji linii wielu populacji neuronalnych

Pokazujemy automatyzację indukowanych przez człowieka hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) i różnicowanie neuronów zgodne z automatycznym obrazowaniem i analizą.

Zautomatyzowana produkcja indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronów korowych i dopaminergicznych pochodzących z komórek macierzystych ze zintegrowanym monitorowaniem żywych komórek

Opisujemy protokół oparty na małych cząsteczkach służący do różnicowania mysich embrionalnych komórek macierzystych w komórki prekursorowe oligodendrocytów (OPC). Protokół ten pozwala na wysokowydajne generowanie komórek OPC Olig2+NG2+ w ciągu 30 dni różnicowania. Opisujemy również metodę generowania „spiking” OPC, które są zdolne do generowania potencjałów czynnościowych.

Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych w prekursory oligodendrocytów

Celem niniejszej pracy jest przeszkolenie czytelnika w obsłudze zintegrowanego mikroskopu sił atomowych i obrazowania optycznego do stymulacji mechanicznej żywych komórek w hodowli. Przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku. Zaprezentowano reprezentatywny zestaw danych obrazujący odpowiedź żywych komórek na stymulację mechaniczną.

Badanie odpowiedzi żywych komórek na stymulację mechaniczną za pomocą zintegrowanej mikroskopii optycznej i sił atomowych

Pomimo niedawnych postępów w modyfikacjach genetycznych, transfekcja ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (HESCs) pozostaje procesem nieprzewidywalnym. Według naszej wiedzy, w literaturze nie opisano systematycznych i wydajnych metod transfekcji ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSCs). W niniejszej pracy opisujemy niezawodne protokoły wydajnej transfekcji i nukleofekcji ludzkich iPSCs.

Transfekcja i nukleofekcja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Opisano metodę generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) poprzez transdukcję retrowirusową prowadzącą do ektopowej ekspresji czynników OCT4, SOX2, KLF4 i MYC. Omówiono również praktyczny sposób identyfikacji kolonii ludzkich iPSC na podstawie ekspresji GFP.

Reprogramowanie ludzkich komórek somatycznych w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) przy użyciu wektora retrowirusowego z GFP

Pluripotencjalne komórki macierzyste, zarówno embrionalne, jak i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS), stanowią cenne źródło ludzkich zróżnicowanych komórek, w tym kardiomiocytów. Tutaj skupimy się na indukcji komórek iPS w sercu, pokazując, jak wykorzystać je do uzyskania funkcjonalnych ludzkich kardiomiocytów za pomocą protokołu opartego na ciałach embrionalnych.

Generowanie ludzkich kardiomiocytów: protokół różnicowania od indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych bez karmienia

Mikroskopia poklatkowa markerów autofagii znakowanych fluorescencyjnie umożliwia monitorowanie dynamicznej odpowiedzi autofagii z wysoką rozdzielczością czasową. Korzystając ze specyficznych markerów autofagii i organelli w kombinacji 3 różnych kolorów, możemy śledzić wkład białka w tworzenie autofagosomów w solidnym kontekście przestrzennym i czasowym.

Obrazowanie na żywych komórkach wczesnych zdarzeń autofagii: omegasomy i nie tylko

Poznaj strategię uczenia maszynowego opartą na obrazowaniu żywych komórek do monitorowania różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych. Ta metoda umożliwia nieinwazyjną identyfikację linii komórkowych i optymalizację protokołów w czasie rzeczywistym.

Strategia uczenia maszynowego oparta na obrazie żywych komórek do monitorowania różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal

Strategia uczenia maszynowego oparta na obrazie żywych komórek do monitorowania różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów