Izolacja pośrednich białek filamentowych z wielu tkanek myszy w celu zbadania modyfikacji potranslacyjnych związanych ze starzeniem się

Ogólnym celem tej procedury biochemicznej jest wyizolowanie frakcji wzbogaconych w włókna pośrednie z wielu tkanek myszy w celu zbadania modyfikacji potranslacyjnych różnych specyficznych dla tkanek białek pośrednich włókien. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie włókien pośrednich, takie jak to, w jaki sposób starzenie się ssaków wpływa na funkcję i regulację tych ważnych białek cytoszkieletu chroniących przed stresem. Główną zaletą tej techniki jest to, że włączenie zautomatyzowanego etapu lizy tkanek pozwala użytkownikom przetwarzać wiele próbek tkanek w szybki i wydajny sposób.

Na początek dodaj jeden mililitr lodowatego buforu Triton X-100 uzupełnionego inhibitorami proteazy do homogenizatora ze szklaną rurką i umieść go na lodzie. Wyjmij mały kawałek tkanki z magazynu ciekłego azotu i umieść go bezpośrednio w szklanym homogenizatorze. Następnie, trzymając homogenizator i próbkę przez cały czas na lodzie, należy użyć około 50 pociągnięć pastylki z politetrafluoroetylenu w celu homogenizacji próbki, jednocześnie minimalizując tworzenie się pęcherzyków.

Przenieś lizat do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej na lodzie i odwiruj próbkę w temperaturze 20 000 razy G w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Następnie zebrać rozpuszczalną frakcję supernatantu Triton X do osobnej probówki. Frakcja ta może być wykorzystana do immunoprecypitacji i analizy rozpuszczalnej w detergentach puli białek IF.

Następnie do osadu tkankowego dodać jeden mililitr buforu o wysokiej zawartości soli uzupełnionego inhibitorami proteazy. Przenieś go do czystego homogenizatora i wykonaj 100 uderzeń. Przenieść homogenat z powrotem do probówki mikrowirówkowej i umieścić probówkę na obracającej się wytrząsarce w chłodni na jedną godzinę.

Odwirować homogenaty w temperaturze 20 000 razy G w czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut i wyrzucić supernatant. Dodaj jeden mililitr lodowatego buforu PBS EDTA do granulki i przenieś ją do czystego homogenizatora jako ostatni etap czyszczenia. Po homogenizacji przenieś próbkę do nowej probówki i odwiruj ją w temperaturze 20 000 razy G w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut, aby uzyskać bogaty w białko ekstrakt o wysokiej zawartości soli IF lub HSC.

Odrzucić supernatant i rozpuścić osad w 300 mikrolitrach podgrzanego, nieredukującego buforu do próbek SDS. Początkowo rozdrobnić osad przez pipetowanie i wirowanie. A następnie podgrzewaj próbki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut.

W razie potrzeby odwiruj i odpipetuj pipetę, aby upewnić się, że osad jest całkowicie rozpuszczony, co może potrwać kilka minut. Wszystkie próbki należy przechowywać w temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza do czasu analizy. Aby przeprowadzić ekstrakcję RNA, dodaj bufor do lizy w probówce zawierającej matrycę lizynową D, a następnie dodaj próbkę tkanki do lizera tkankowego i pulsuj dwukrotnie przez 25 sekund każdy.

Oddzielić lizat od matrycy przez odwirowanie w ilości 20 000 razy G. W celu ekstrakcji białka dodać bufor do próbek Triton X-100 lub SDS, jeśli przygotowuje się całkowity lizat. Do probówki lizynowej z matrycą lizynową SS. Następnie dodaj próbkę tkanki. Krótko poddać próbkę impulsom w celu wymieszania.

Aby przygotować HSC, użyj magnesu, aby usunąć kulkę ze stali nierdzewnej z probówki i odwiruj probówki w temperaturze 20 000 razy G w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Oddziel frakcję supernatantu i osadu i postępuj tak, jak pokazano wcześniej w filmie. Przygotować bufor PBST, dodając 10 mikrolitrów T20 do 50 mililitrów PBS o pH 7,4.

Następnie przygotuj roztwór przeciwciała PTM, dodając od jednego do 10 mikrogramów przeciwciała do 200 mikrolitrów PBST. Porcjować 50 mikrolitrów kulek magnetycznych do mikroprobówki wirówkowej. Umieść go na magnesie i zassaj roztwór do przechowywania koralików.

Sprzęgnąć kulki z przeciwciałem immunoprecypitacyjnym poprzez ponowne zawieszenie kulek w roztworze przeciwciała i inkubację próbki na rotatorze w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Umieść probówki na magnesie i odessaj roztwór przeciwciała. Następnie użyj 200 mikrolitrów PBST, aby raz przepłukać kulki sprzężone z przeciwciałami i usuń roztwór.

Dodaj 0,6 do jednego mililitra lizatu tkankowego do kulek. Wymieszać delikatnie pipetując i inkubować roztwór na rotatorze w chłodnym pomieszczeniu przez trzy godziny. Umieść probówki na magnesie i usuń lizat, a następnie użyj 200 mikrolitrów PBST, aby pięciokrotnie umyć kulki.

Po ostatnim etapie mycia zbierz kulki i 100 mikrolitrów PBS i przenieś granulki do nowej, czystej tuby. Umieść rurkę na magnesie, a następnie zassaj PBS. Wyjmij rurkę z magnesu i dodaj 100 mikrolitrów nieredukującego buforu do próbek.

Podniec 50 mikrolitrów z probówki i połącz je z 5%2ME, aby uzyskać próbki redukujące. Podgrzej próbki do 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Mając rurkę na magnesie, zbierz frakcję IP z kulek i przenieś ją do świeżej probówki.

Próbki należy przechowywać w temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza do czasu analizy. Aby uniknąć zanieczyszczenia próbek białek do analizy spektrometrii mas, należy używać czystych rękawic do obchodzenia się ze wszystkimi żelami i inkubować je w czystych pojemnikach, które zostały umyte wyłącznie DD H2O. Uruchom od 20 do 50 mikrolitrów próbki HSE na żelu na stronie SDS zgodnie ze standardowymi warunkami.

Po zabarwieniu żelu zgodnie z protokołem tekstowym, umieść żel między plastikowymi ochraniaczami na arkusze. Następnie zeskanuj i zaznacz pasma, które zostaną wycięte. Użyj nowej, czystej maszynki do golenia, aby wyciąć prążki białka IF i umieść je w czystych probówkach do mikrowirówek na lodzie przed przesłaniem ich do analizy spektrometrii mas.

Rysunek ten przedstawia typowy wynik HSE z dziewięciu tkanek myszy wyizolowanych metodą szybką. Należy pamiętać, że ta metoda nie działa dobrze na trzustkę i śledzionę i daje dodatkowe prążki w próbce jelita grubego. Ta analiza ekspresji genów pokazuje, że keratyna 8 jest regulowana w górę podczas starzenia.

Ponadto western blot pokazuje, że keratyna 8 jest silnie regulowana w górę w wątrobie starych myszy. W tym przypadku HSE wątroby uzyskane przy użyciu automatycznego protokołu wykazuje silne wzbogacenie keratyny 8 i 18 w żelu. Analiza spektrometrii mas pokazuje, że K8 i K18 w wątrobie starej myszy mają wiele miejsc fosforylacji i acetylacji, których nie ma w wątrobie młodej myszy.

Podobnie jak w przypadku zmian keratynowych w wątrobie, analiza tkanki mózgowej za pomocą QPCR ujawnia pięciokrotną indukcję mRNA GFAP w mózgach 24-miesięcznych myszy w porównaniu z trzymiesięcznymi. Wreszcie, analiza białek ekstraktów o wysokiej zawartości soli za pomocą barwienia Coomassie i immuno blot frakcji całkowitych i wzbogaconych w acetylolizynę ujawnia, że białko GFAP jest regulowane i acetylowane w starzejącym się mózgu myszy. Zgodnie z tą procedurą, inne metody, takie jak proteo mix oparty na spektrometrii mas, mogą być wykorzystane do udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak ważne modyfikacje potranslacyjne i partnerzy wiążący pośrednie białka włókien w różnych warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować pośrednie białka filamentowe z różnych tkanek ssaków.