Name: Izolacja pośrednich białek filamentowych z wielu tkanek myszy w celu zbadania modyfikacji potranslacyjnych związanych ze starzeniem się (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Poznaj metodę izolacji białek filamentowych z tkanek myszy do badania modyfikacji potranslacyjnych związanych ze starzeniem. Protokół z automatyczną lizą umożliwia szybką analizę proteomiczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty NIH DK110355 R01, DK093776 [N.T.S.], DK102450 [N.T.S.] i P30 DK034987 [dla UNC-Chapel Hill]. Autorzy dziękują Deekshita Ramanarayanan za pomoc w eksperymentach z qPCR i western blot.

Protokół został zatwierdzony i wykonany zgodnie z Instytucjonalnym Komitetem ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Północnej Karoliny.
1. Przygotowania
<ol>
	<li>Przygotować bufor Triton-X (1% Triton X-100, 5 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), zwiększyć objętość w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), pH 7,4). Aby uzyskać 500 ml: wymieszaj po 5 ml Triton X-100 i 500 mM EDTA z 490 ml PBS o pH 7,4. Przechowywać roztwór buforowy Triton-X w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować bufor o wysokiej zawartości soli (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 140 mM NaCl, 1,5 M KCl, 5 mM EDTA, 0,5% Triton X-100, zwiększyć objętość w podwójnie destylowanym (dd) H2O). Aby przygotować 500 ml: wymieszaj 10 ml 0,5 M Tris-HCl (pH 7,6), 14 ml 5 M NaCl, 55,9 g KCl, 5 ml 0,5 M EDTA i 2,5 ml Triton X-100, dostosuj objętość do 500 ml za pomocą podwójnie destylowanej wody). Przechowywać roztwór buforowy o wysokiej zawartości soli w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Tuż przed użyciem należy uzupełnić odpowiednią ilość Triton-X i buforu o wysokiej zawartości soli (np. 1 ml na każdą próbkę tkanki o objętości 25 mg) koktajlem proteazy lub inhibitora proteazy/fosfatazy i wyrzucić wszelkie niewykorzystane zawierające inhibitory.</li>
	<li>Przygotuj 5 mM EDTA w 1x PBS, pH 7,4. Aby uzyskać 500 ml: wymieszaj 5 ml 0,5 M EDTA z 495 ml 1x PBS, pH 7,4.</li>
	<li>Izoluj różne narządy myszy (mózg, serce, płuca, wątrobę, trzustkę, okrężnicę, jelito, nerki, śledzionę) przy użyciu zatwierdzonych protokołów, które są zgodne z wytycznymi weterynaryjnymi i standardami instytucjonalnymi23. Procedura pobrania tkanek nie powinna trwać dłużej niż 5 minut, aby zachować integralność RNA i białek tkanek bogatych w proteazy (np. najpierw należy przetworzyć trzustkę).</li>
	<li>Wytnij niewielką ilość tkanki (~ 5-20 mg) i umieść w roztworze do przechowywania RNA w celu późniejszej ekstrakcji RNA, syntezy cDNA i ilościowej analizy PCR w czasie rzeczywistym pod kątem ekspresji genu IF. Umieścić probówki z roztworem do przechowywania RNA z tkanką w temperaturze 4 °C na noc i postępować zgodnie z protokołem producenta w celu przeprowadzenia dalszych etapów przechowywania i izolacji.</li>
	<li>Resztę tkanki pokrój na mniejsze fragmenty (np. 0,5 cm) i umieść w kriowalu. Fiolki należy zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C lub ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania.</li>
</ol>
2. Analiza ekspresji genów IF
<ol>
	<li>Ekstrahować RNA z tkanek zachowanych w odczynniku do przechowywania RNA. Użyj dowolnej odpowiedniej/preferowanej metody ekstrakcji RNA zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Określ ilościowo stężenie RNA i użyj 2 μg RNA do wygenerowania cDNA za pomocą odpowiedniego zestawu do odwrotnej transkrypcji zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Korzystając z wygenerowanego cDNA i mysich starterów specyficznych dla genu IF, przeprowadzono reakcje qPCR, w tym trzy powtórzenia techniczne każdej próbki, a także ślepą próbę kontrolną zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Określ ilościowo ekspresję genu IF jako zmianę fałdowania, porównując różne warunki (np. młoda i stara tkanka).</li>
</ol>
3. Przygotowanie całkowitych lizatów tkankowych dla immunoblot
<ol>
	<li>Homogenizować 25 mg tkanki w 1 ml 2x nieredukującego buforu próbki SDS. Należy pominąć niebieski barwnik bromofenolowy w buforze próbki, jeżeli ma być przeprowadzony kolorymetryczny test białka w celu ilościowego określenia stężenia białka.</li>
	<li>Dodać 5% (v/v) 2-merkaptoetanolu (2-ME) w celu uzyskania zredukowanych próbek. Do 200 μl próbek nieredukcyjnych dodać 10 μl 2-ME.</li>
	<li>Określić stężenie białka za pomocą testu białkowego kompatybilnego z detergentem i środkiem redukującym. Jeśli barwnik jest już zawarty w buforze próbki, ilość białka można oszacować po przeprowadzeniu żelu za pomocą wielu technik, w tym stain24 na bazie Coomassie.</li>
	<li>Zwirować wszystkie próbki i ogrzewać w temperaturze 95 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Wykonuj western blot zarówno w warunkach redukcyjnych, jak i nieredukcyjnych. Błona ekspozycyjna na krótko (<1 min) w celu ujawnienia gatunków monomerycznych i dłużej (>1 min) w celu ujawnienia kompleksów o dużej masie cząsteczkowej zawierających białka IF. W przypadku monitorowania agregacji należy zbadać cały żel/membranę (w tym dna studzienek żelowych).</li>
	<li>Uruchom równoległy żel i barwnik z barwnikiem białkowym jako kontrolę ładowania24. W modelach chorób lub eksperymentach z urazami całkowite barwienie białkowe powinno być używane jako kontrola obciążenia, w przeciwieństwie do immunoblotów dla białek "porządkowych" (np. aktyny, GAPDH), ponieważ te ostatnie zmieniają się w różnych warunkach stresu.</li>
</ol>
4. Przygotowanie rozpuszczalnych w detergentach i wysokosolnych ekstraktów IFs specyficznych dla tkanek
<ol>
	<li>Dodaj 1 ml lodowatego buforu Triton X-100 do homogenizatora ze szklaną rurką i umieść go na lodzie.</li>
	<li>Wyjmij mały kawałek tkanki (~25 mg) z magazynu ciekłego azotu i umieść bezpośrednio w szklanym homogenizatorze. Do homogenizacji użyj tłuczka z politetrafluoroetylenu (50 pociągnięć) i unikaj tworzenia pęcherzyków. Homogenizator i lizat powinny być zawsze chłodne.</li>
	<li>Przenieść lizat do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml na lodzie i odwirować przy 20 000 x g przez 10 minut we wstępnie schłodzonej wirówce (4 °C).</li>
	<li>Zebrać frakcję sklarowanej nad osadem do osobnej probówki. Jest to frakcja rozpuszczalna w Triton X, która może być stosowana do immunoprecypitacji (i.p.) i analizy rozpuszczalnej w detergentach puli białek IF. Należy pamiętać, że kroki 4.1-4.4 można powtórzyć, aby uzyskać czystszy ekstrakt IF z tkanki mózgowej.</li>
	<li>Dodaj 1 ml buforu o wysokiej zawartości soli do osadu tkankowego, przenieś do czystego homogenizatora i wykonaj 100 uderzeń. Przenieść homogenat z powrotem do probówki do mikrowirówki i umieścić probówkę na obracającej się wytrząsarce w chłodni na 1 godzinę.</li>
	<li>Odwirować homogenaty w temperaturze 20 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodaj 1 ml lodowatego buforu PBS/EDTA do granulki i homogenizuj granulkę (20 cykli) w czystym homogenizatorze jako końcowy etap czyszczenia*. Przenieść do nowej probówki i odwirować przy 20 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu uzyskania bogatego w białko ekstraktu o wysokiej zawartości soli (HSE) IF. 
	* Opcjonalnie wir zamiast homogenizacji na tym etapie.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i rozpuścić granulki w 300 μl nieredukującego buforu do próbek SDS, który został wstępnie podgrzany. Najpierw rozdrobnić osad przez pipetowanie i wirowanie, a następnie podgrzewać próbki przez 5 minut w temperaturze 95 °C.</li>
	<li>Wirować i pipetować w razie potrzeby, aby upewnić się, że osad się rozpuścił. Całkowite rozpuszczenie granulek może potrwać kilka minut.</li>
	<li>Wszystkie próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu analizy.</li>
</ol>
5. Zautomatyzowana liza tkanek do ekstrakcji białka IF w eksperymentach na dużą skalę
<ol>
	<li>W celu ekstrakcji RNA należy umieścić bufor do lizy (600 μl buforu na 25 mg tkanki) w probówce zawierającej matrycę lizującą D (wykorzystuje małe kulki ceramiczne) i pulsować dwukrotnie przez 25 s w lizerze tkankowym. Oddzielić lizat od matrycy przez odwirowanie przy 20 000 x g i przejść do następnego etapu w izolacji.</li>
	<li>W celu ekstrakcji białek należy umieścić Triton X-100 (lub bufor próbki SDS w przypadku przygotowywania całkowitego lizatu) w probówce do lizy z matrycą lizy SS (użyć pojedynczego koralika ze stali nierdzewnej). Po przetestowaniu wielu matryc wybrano tę matrycę, ponieważ wytwarza ona ekstrakty białkowe IF, które są podobnej jakości jak tradycyjna metoda douncingu. Należy pamiętać, że metoda automatyczna nie jest optymalna dla trzustki i śledziony, a dla tych tkanek należy zastosować standardowy protokół homogenizacji.</li>
	<li>Aby przystąpić do przygotowania ekstraktu o wysokiej zawartości soli, należy usunąć kulkę ze stali nierdzewnej z rurki za pomocą magnesu i odwirować probówki o sile 20 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Kontynuuj krok 4.4 (powyżej) protokołu ręcznego.</li>
	<li>Wszystkie próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu analizy.</li>
</ol>
6. Immuno-wzbogacenie potranslacyjnych zmodyfikowanych białek IF
<ol>
	<li>Przygotuj bufor PBST (0,02% Tween-20 w PBS). Aby uzyskać 50 ml, dodaj 10 μl Tween-20 do 50 ml PBS o pH 7,4.</li>
	<li>Przygotować roztwór przeciwciała PTM (1-10 μg przeciwciała w 200 μl PBST). Ogólnie rzecz biorąc, 3 μg przeciwciała/reakcji to dobry stan wyjściowy, który w razie potrzeby można jeszcze bardziej zoptymalizować.</li>
	<li>Dla każdej reakcji należy przelać 50 μl kulek magnetycznych do probówki mikrowirówkowej, umieścić na magnesie i zassać roztwór do przechowywania kulek.</li>
	<li>Sprzęgnij kulki z przeciwciałem immunoprecypitacyjnym, ponownie zawieszając je w roztworze przeciwciała i inkubując na rotatorze (koniec nad końcem, aby zapewnić mieszanie małych objętości) w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
	<li>Umieść probówki na magnesie i odessaj roztwór przeciwciała.</li>
	<li>Przepłukać kulki sprzężone z przeciwciałami raz na 200 μl PBST i usunąć bufor do mycia.</li>
	<li>Dodać 0,6-1 ml lizatu tkankowego do kulek, wymieszać delikatnym pipetowaniem i inkubować przez 3 godziny na rotatorze w chłodnym pomieszczeniu.</li>
	<li>Umieść probówki na magnesie, usuń lizat i umyj kulki pięciokrotnie 200 μl PBST. Po ostatnim etapie mycia zbierz kulki w 100 μl PBS (bez Tween-20) i przenieś do czystej nowej probówki. Umieść rurkę na magnesie.</li>
	<li>Odessać PBS i dodać 100 μl nieredukującego buforu do próbki. Usunąć 50 μl i dodać 2-ME (5%) w celu uzyskania próbek redukcyjnych. Podgrzewać próbki do temperatury 95 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Oddziel frakcję ip od koralików na magnesie i zbierz ją do nowej tuby.</li>
	<li>Przechowywać próbki w temperaturze -20 °C do czasu analizy.</li>
</ol>
7. Przygotowanie próbek białka IF do analizy metodą spektrometrii mas
<ol>
	<li>Umów się na konsultację z ekspertem w dziedzinie proteomiki przed rozpoczęciem badania, ponieważ analiza spektrometrii mas wiąże się ze znacznym czasem i kosztami.</li>
	<li>Podejmij specjalne środki ostrożności, aby uniknąć zanieczyszczenia. Ze wszystkimi żelami należy obchodzić się w czystych rękawiczkach i inkubować w czystych pojemnikach, mytych tylko przy użyciu ddH2O (unikać mydła).</li>
	<li>Przeprowadzić 20-50 μl próbki HSE (z sekcji 4 i 5) na żelu SDS-PAGE zgodnie ze standardowymi warunkami.</li>
	<li>Plamić barwnikiem białkowym przez 1 godzinę. Spłukać kilkakrotnie i usunąć plamę w ddH2O przez noc. Pasma białkowe IF powinny być dobrze widoczne po odbarwieniu.</li>
	<li>Umieść żel między plastikowymi ochraniaczami w arkuszach, zeskanuj i zaznacz pasma, które zostaną wycięte i wysłane do analizy.</li>
	<li>Wytnij pasma białkowe IF za pomocą nowej, czystej maszynki do golenia.</li>
	<li>Umieść opaski żelowe w czystych probówkach do mikrowirówek i przenieś do urządzenia do spektrometrii mas.</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Metody, które umożliwiają biochemiczną charakterystykę białek IF, mogą być przydatne do zrozumienia wielu zjawisk patofizjologicznych w układach ssaków, ponieważ białka IF są zarówno markerami, jak i modulatorami stresu komórkowego i tkankowego29. Zasada działania obecnej metody opiera się na początkowych procedurach opracowanych w latach siedemdziesiątych i osiemdziesiątych XX wieku w celu izolacji, separacji i rekonstytucji białek IF z komórek i tkanek, zwykle przy użyciu roztworów o niskiej i w...

IFs to rodzina białek, które u ludzi są kodowane przez 73 geny i podzielone na sześć głównych typów: typy I-IV są cytoplazmatyczne (np. keratyny nabłonkowe i włosowe (K), miocyty desminy, neurofilamenty, białko fibrylarne gleju (GFAP) i inne); typ V to laminy jądrowe; a typ VI to IF-y w soczewce oka1. Pod względem organizacji molekularnej, białka IF mają trzy wspólne domeny: wysoce konserwatywną domenę "prętową" zwiniętą cewką oraz kuliste domeny "głowy" i "ogona". Tetramery białkowe IF łączą się, tworząc prekursory krótkich włókien, które ostatecznie są włączane do dojrzałych włókien, które kształtują dynamiczne struktury cytoszkieletu i nukleoszkieletu zaangażowane w ochronę mechaniczną2, stress sensing3,4, regulacja transkrypcji5 i wzrostu oraz inne krytyczne funkcje komórkowe1,6,7.
Funkcjonalne znaczenie systemu IF jest podkreślone przez istnienie wielu chorób ludzkich spowodowanych mutacjami typu missense w genach IF, w tym neuropatii, miopatii, zaburzeń łamliwości skóry, dysfunkcji metabolicznych i zespołów przedwczesnego starzenia8. Niektóre mutacje genu IF nie powodują, ale predysponują ich nosicieli do progresji choroby, jak na przykład proste keratyny nabłonkowe w chorobach wątroby9. To ostatnie wynika z krytycznych funkcji ochronnych przed stresem IF w nabłonku. Ogólnie rzecz biorąc, IFy są jednymi z najliczniejszych białek komórkowych w warunkach podstawowych, ale są dodatkowo silnie indukowane podczas różnych rodzajów stresu10. Na przykład ostatnie badania oceniające zmiany w całym proteomie u nicienia C. elegans wykazały, że wiele IF jest silnie regulowanych w górę i podatnych na agregację podczas starzenia się organizmu11,12. Ponieważ utrzymanie prawidłowej struktury IF jest niezbędne dla odporności komórek na różne formy stresu10, agregacja IF może również przyczyniać się do pogorszenia funkcjonalności podczas starzenia. Brakuje jednak badań na poziomie organizmów analizujących wiele białek IF ssaków w różnych tkankach poddawanych stresowi.
IFs to wysoce dynamiczne struktury, które dostosowują się do wymagań komórkowych. Keratyny, na przykład, przechodzą niezależny od biosyntezy cykl między rozpuszczalną (nienitkowatą) i nierozpuszczalną (nitkowatą) pulą białek13. W normalnych warunkach fizjologicznych około 5% całkowitej puli K8/K18 można wyekstrahować w buforze bez detergentów, w porównaniu do około 20%, które można rozpuścić w niejonowym detergencie Nonidet P-40, który jest biochemicznie porównywalny z Triton-X10014,15. Podczas mitozy następuje zauważalny wzrost rozpuszczalności nabłonka prostego typu K8 i K1814, co jest mniej widoczne w keratynach naskórka, ale bardziej widoczne w wimentynie i innych białkach IF typu III15,16. Właściwości rozpuszczalności białek IF są ściśle regulowane przez fosforylację, kluczową modyfikację potranslacyjną (PTM) dla przegrupowania włókien i rozpuszczalności17,18,19,20. Większość IF-ów jest poddawana szeroko zakrojonej regulacji przez szereg PTM w miejscach chronionych, co skutkuje zmianami funkcjonalnymi17.
Celem tej metody jest zapoznanie badaczy, którzy są nowicjuszami w dziedzinie IF, z biochemicznymi metodami ekstrakcji i analiz do badania białek IF w wielu tkankach myszy. W szczególności koncentrujemy się na izolacji białek IF przy użyciu metody ekstrakcji o wysokiej zawartości soli i ocenie zmian w PTM za pomocą spektrometrii mas i przeciwciał ukierunkowanych na PTM. Metody te opierają się na wcześniej opublikowanych procedurach21, ale zawierają modyfikacje ekstrakcji różnych typów białek IF w celu odkrycia wspólnego mechanizmu regulacji w całej rodzinie IF. Na przykład acetylacja K8 przy określonej reszcie lizyny reguluje organizację włókien, podczas gdy hiperacetylacja sprzyja nierozpuszczalności K8 i tworzeniu agregatów22. Ostatnie globalne badania profilowania proteomicznego wykazały dodatkowo, że większość specyficznych tkankowo białek IF jest również celami acetylacji i że większość miejsc acetylacji IF jest ograniczona do wysoce konserwatywnej domeny pręcików. Uwypukla to potrzebę opracowania metod odpowiednich do globalnego profilowania systemu IF. Wprowadzamy również szybką metodę izolacji białek IF z wielu tkanek za pomocą automatycznej homogenizacji w zoptymalizowanej matrycy lizy. Otrzymane preparaty nadają się do dalszej analizy PTM za pomocą spektrometrii mas i innych metod.

<table><tbody><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10009</td><td>kulki immunoprecypitacyjne</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010049</td><td>do</td></tr><tr><td>Purelink RNA mini kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12183018</td><td>ekstrakcja RNA z tkanek</td></tr><tr><td>Purelink DNAzestaw</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12185010A</td><td>do mineralizacji kolumnowej DNA</td></tr><tr><td>Magnes Dynamag-2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12321D</td><td>do stosowania z dynabeads</td></tr><tr><td>Odczynnik GelCode Blue Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>24592</td><td>barwnik żelowy kompatybilny ze spektrometrią mas</td></tr><tr><td>Pierce ECL Western Blotting Substrate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>32106</td><td>do stosowania w western blot</td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4368813</td><td>do stosowania w analizie ekspresji genów</td></tr><tr><td>Proflex 3 x 32-dołkowy system PCR</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4484073</td><td>system PCR membrana</td></tr><tr><td>transferowa PVDF&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>88520</td><td>do western blot</td></tr><tr><td>Power Up SYBR master mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A25778</td><td>do analizy qPCR</td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM7020</td><td>roztwór do przechowywania tkanek przed izolacją RNA</td></tr><tr><td>Novex 4-20% Tris Glycine Gel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>XP04205BOX</td><td>Prefabrykowany żel białkowy</td></tr><tr><td>Anti-Keratin 8 przeciwciało (TS1)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MA514428</td><td>do wykrywania Western Blot K8</td></tr><tr><td>Anti-Vimentin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MA511883</td><td>do wykrywania western blot wimentyny</td></tr><tr><td>Tris Glycine Transfer Buffer (25x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC3675</td><td>do mokrego transferu żeli białkowych</td></tr><tr><td>2x SDS Sample Buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC2676</td><td>do przygotowania próbki żeli białkowych</td></tr><tr><td>Bufor do biegania Tris Glycine SDS (10x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC26755</td><td>do uruchamiania żeli białkowych</td></tr><tr><td>Kulki lizujące - Matrix D</td><td>MP Biomedicals</td><td>116913100</td><td>Kulki i rurki do lizy do rozbijania tkanek i ekstrakcji RNA Koraliki</td></tr><tr><td>lizujące - Matrix SS</td><td>MP Biomedicals</td><td>116921100</td><td>Kulki i rurki do lizy do rozbijania tkanek i ekstrakcji białek</td></tr><tr><td>Spektrofotometr NanoDrop Lite</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-LITE</td><td>pomiar białka i kwasu nukleinowego</td></tr><tr><td>Homogenizator Precellys 24</td><td>Bertin Instruments</td><td>EQ03119</td><td>Automatyczny homogenizator tkanek</td></tr></tbody></table>

izolacja pośrednich białek filamentowych z wielu tkanek myszy w celu zbadania modyfikacji potranslacyjnych związanych ze starzeniem się

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Filamenty pośrednie (IFs), wraz z filamentami aktynowymi i mikrotubulami, tworzą cytoszkielet - krytyczny element strukturalny każdej komórki. Normalnie funkcjonujące IF zapewniają komórkom odporność mechaniczną i stresową, podczas gdy dysfunkcyjny cytoszkielet IF zagraża zdrowiu komórkowemu i jest związany z wieloma chorobami ludzkimi. Modyfikacje potranslacyjne (PTM) krytycznie regulują dynamikę IF w odpowiedzi na zmiany fizjologiczne i w warunkach stresu. W związku z tym możliwość monitorowania zmian w sygnaturze PTM IF może przyczynić się do lepszego funkcjonalnego zrozumienia i ostatecznie uwarunkowania systemu IF jako reagowania na stres podczas uszkodzenia komórki. Jednak duża liczba białek IF, które są kodowane przez ponad 70 pojedynczych genów i ulegają ekspresji w sposób zależny od tkanki, stanowi poważne wyzwanie w ustaleniu względnego znaczenia różnych PTM. W tym celu metody, które umożliwiają monitorowanie PTM na białkach IF na poziomie całego organizmu, a nie dla izolowanych członków rodziny, mogą przyspieszyć postęp badań w tej dziedzinie. W tym miejscu przedstawiamy biochemiczne metody izolacji całkowitej, rozpuszczalnej w detergentach i odpornej na detergenty frakcji białek IF z 9 różnych tkanek myszy (mózgu, serca, płuc, wątroby, jelita cienkiego, jelita grubego, trzustki, nerek i śledziony). Ponadto demonstrujemy zoptymalizowany protokół szybkiej izolacji białek IF za pomocą matrycy lizy i automatycznej homogenizacji różnych tkanek myszy. Zautomatyzowany protokół jest przydatny do profilowania IFs w eksperymentach z dużą objętością próbki (np. w modelach chorób obejmujących wiele zwierząt i grup eksperymentalnych). Otrzymane próbki można wykorzystać do różnych dalszych analiz, w tym do profilowania PTM opartego na spektrometrii mas. Wykorzystując te metody, dostarczamy nowe dane, aby pokazać, że białka IF w różnych tkankach myszy (mózgu i wątroby) ulegają równoległym zmianom w odniesieniu do ich poziomów ekspresji i PTM podczas starzenia.

Nowa szybka metoda ekstrakcji białek do IF z wielu tkanek mysich z wykorzystaniem wysokiego stężenia soli i macierzy litycznej. 
Tradycyjna metoda25,26 izolowania głównej frakcji białek filamentów pośrednich z tkanki nabłonkowej została tutaj zmodyfikowana, aby objąć 9 różnych organów oraz szybszą procedurę lizy tka...

W tej metodzie prezentujemy procedury biochemiczne do szybkiej i efektywnej izolacji pośrednich białek filamentowych (IF) z wielu tkanek myszy. Izolowane IFs mogą być wykorzystywane do badania zmian w modyfikacjach potranslacyjnych za pomocą spektrometrii mas i innych testów biochemicznych.

Izolacja pośrednich białek filamentowych z wielu tkanek myszy w celu zbadania modyfikacji potranslacyjnych związanych ze starzeniem się

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Ogólnym celem tej procedury biochemicznej jest wyizolowanie frakcji wzbogaconych w filamenty pośrednie z wielu tkanek myszy w celu zbadania modyfikacji potranslacyjnych różnych specyficznych dla tkanek białek filamentów pośrednich. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie filamentów pośrednich, takie jak wpływ procesów starzenia ssaków na funkcję i regulację tych ważnych, ochronnych przed stresem białek cytoszkieletowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że zastosowanie automatycznego etapu lizy tkanek pozwala użytkownikom na szybkie i efektywne przetwarzanie wielu próbek tkanek.Na początek do szklanego homogenizatora dodaj 1 ml lodowatego buforu Triton X-100 uzupełnionego o inhibitory proteaz i umieść go na lodzie. Wyjmij niewielki fragment tkanki z przechowywania w ciekłym azocie i umieść go bezpośrednio w szklanym homogenizatorze. Następnie, utrzymując homogenizator i próbkę przez cały czas na lodzie, wykonaj około 50 ruchów pastylką z politetrafluoroetylenu, aby zhomogenizować próbkę, minimalizując jednocześnie powstawanie pęcherzyków powietrza.Przenieś lizat do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml na lodzie i odwiruj próbkę przy 20 000 ×g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Następnie zbierz rozpuszczalną w Triton X frakcję nadsączu do oddzielnej probówki. Tę frakcję można wykorzystać do immunoprecypitacji i analizy rozpuszczalnej w detergencie puli białek IF.Następnie do pelletu tkankowego należy dodać jeden mililitr buforu o wysokim zasoleniu z dodatkiem inhibitorów proteaz. Przenieś zawartość do czystego homogenizatora i wykonaj 100 uderzeń tłuczkiem Dounce. Przenieś homogenizat z powrotem do probówki do mikrocentryfugi i pozostaw probówkę na wytrząsarce rotacyjnej w chłodni na jedną godzinę.Odwiruj homogenaty przy 20 000 ×g w temperaturze 4 °C przez 20 minut i odlej nadsącz. Dodaj 1 mL schłodzonego do temperatury lodu buforu PBS EDTA do osadu i przenieś go do czystego homogenizatora w ramach końcowego etapu oczyszczania. Po homogenizacji przenieś próbkę do nowej probówki i odwiruj przy 20 000 ×g w temperaturze 4 °C przez 10 minut, aby uzyskać ekstrakt o wysokim zasoleniu, bogaty w białka IF, tzw. HSC.Odlej supernatant i rozpuść osad w 300 µL podgrzanego, nieredukującego buforu do próbek SDS. Rozbij osad początkowo poprzez pipetowanie i mieszanie w wirówce typu vortex. Następnie podgrzej próbki w temperaturze 95 °C przez pięć minut.Mieszaj w wibratorze i pipetuj w razie potrzeby, aby upewnić się, że osad jest całkowicie rozpuszczony, co może zająć kilka minut. Przechowuj wszystkie próbki w temperaturze -20 °C do czasu analizy. Aby przeprowadzić ekstrakcję RNA, dodaj bufor do lizy do probówki zawierającej macierz lizującą D, następnie dodaj tkankę próbkową do lizera tkankowego i wykonaj dwa impulsy po 25 s każdy.Oddziel lizat od matrycy poprzez wirowanie przy 20 000 ×g. W celu ekstrakcji białek dodaj Triton X-100 lub bufor do próbek SDS, jeśli przygotowywany jest lizat całkowity. Do probówki z matrycą lizynową SS. Następnie dodaj tkankę próbki. Krótko wymieszaj próbkę za pomocą impulsu.Aby przygotować HSC, należy użyć magnesu do usunięcia stalowej kulki z probówki, a następnie odwirować probówki z prędkością 20 000 ×g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Oddzielić frakcję nadpływu i osadu, a następnie postąpić zgodnie z instrukcjami przedstawionymi wcześniej w filmie. Przygotować bufor PBST, dodając 10 µL T20 do 50 mL PBS o pH 7,4.Następnie należy przygotować roztwór przeciwciał PTM, dodając od 1 do 10 µg przeciwciał do 200 µl PBST. Do probówki do mikrocentryfugi należy odmierzyć 50 µl kulek magnetycznych. Umieścić probówkę na magnesie i odessać roztwór do przechowywania kulek.Przeprowadź koniugację kulek z przeciwciałem do immunoprecypitacji, resuspending kulek w roztworze przeciwciał i inkubując próbkę na rotatorze w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Umieść probówki na magnesie i odessij roztwór przeciwciał. Następnie użyj 200 µL PBST, aby jednokrotnie wypłukać kulek skonjugowane z przeciwciałami, a następnie usuń roztwór.Do kulek dodać 0,6 ml lizatu tkankowego. Pomieszać poprzez delikatne pipetowanie, a następnie inkubować roztwór na rotatorze w pomieszczeniu chłodniczym przez trzy godziny. Umieścić probówki na magnesie i usunąć lizat, a następnie pięciokrotnie przemyć kulki 200 µl PBST.Po ostatnim etapie przemywania zebrać kuleczki wraz z 100 µL PBS i przenieść je do nowej, czystej probówki. Umieścić probówkę na magnesie, a następnie odessać PBS. Zdjąć probówkę z magnesu i dodać 100 µL buforu do próbek nieredukujących.Odmierz 50 µL z probówki i połącz z 5% 2ME, aby przygotować próbki redukujące. Podgrzewaj próbki w temperaturze 95 °C przez pięć minut. Umieść probówkę na magnesie, zbierz frakcję IP z kulek i przenieś ją do nowej probówki.Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu analizy. Aby uniknąć kontaminacji próbek białek przeznaczonych do analizy spektrometrią mas, podczas pracy z żelami należy używać czystych rękawiczek i inkubować je w czystych pojemnikach, które były myte wyłącznie wodą DD H2O. 20–50 µL próbki HSE należy nałożyć na żel SDS-PAGE zgodnie ze standardowymi warunkami.Po zabarwieniu żelu zgodnie z protokołem tekstowym, należy umieścić go pomiędzy plastikowymi arkuszami ochronnymi. Następnie należy przeskanować żel i zaznaczyć prążki przeznaczone do wycięcia. Używając nowej, czystej żyletki, należy wyciąć prążki białka IF i umieścić je w czystych probówkach do mikrocentryfugi na lodzie przed przekazaniem do analizy spektrometrią mas.Rysunek ten przedstawia typowy wynik HSE z dziewięciu tkanek mysich wyizolowanych przy użyciu metody szybkiej. Należy zauważyć, że metoda ta nie sprawdza się w przypadku trzustki i śledziony oraz powoduje pojawienie się dodatkowych prążków w próbce jelita grubego. Ta analiza ekspresji genów wykazuje, że Keratin 8 ulega nadekspresji podczas starzenia.Dodatkowo, analiza western blot wykazuje, że poziom keratyny 8 jest silnie zwiększony w wątrbach starych myszy. Tutaj, HSE wątroby otrzymany przy użyciu zautomatyzowanego protokołu wykazuje silne wzbogacenie keratyn 8 i 18 na żelu. Analiza spektrometrią mas wskazuje, że K8 i K18 w wątrobie starej myszy posiadają liczne miejsca fosforylacji i acetylacji, których nie stwierdzono w wątrobie młodej myszy.Podobnie jak w przypadku zmian keratyny w wątrobie, analiza tkanki mózgowej za pomocą QPCR wykazuje pięciokrotny wzrost indukcji mRNA GFAP w mózgach myszy w wieku 24 miesięcy w porównaniu do myszy w wieku trzech miesięcy. Wreszcie, analiza białek w ekstraktach o wysokim zasoleniu za pomocą barwienia Coomassie oraz immunobloting frakcji wzbogaconych o całkowitą i acetylowaną lizynę wykazują, że białko GFAP jest zwiększone i acetylowane w mózgu starej myszy. Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne metody, takie jak proteomika oparta na spektrometrii mas, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak jakie są istotne modyfikacje potranslacyjne i partnerzy wiążący białek filamentów pośrednich w różnych warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat tego, jak izolować białka filamentów pośrednich z różnych tkanek ssaków.

isolation-intermediate-filament-proteins-from-multiple-mouse-tissues

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film demonstruje test oparty na obrazowaniu in vivo, który pozwala określić spadek proteostazy spowodowany starzeniem się. W teście wykorzystuje Caenorhabditis elegans eksprymujące białko fuzyjne poliglutaminy YFP w mięśniach ścian ciała w celu zmierzenia związanej z wiekiem agregacji poliglutaminy i indukcji proteotoksyczności, co prowadzi do paraliżu.

Fluorescencyjny test paraliżu reporterowego: technika oceny związanego z wiekiem postępującego tworzenia się fluorescencyjnego reportera poliglutaminy i związanego z nim paraliżu w Caenorhabditis elegans

Izolacja i hodowla włókien mięśniowych to złoty standard systemu in vitro do badania przejścia komórek satelitarnych przez spoczynek, aktywację i różnicowanie.  Co ważne, system hodowli pojedynczych włókien mięśniowych zachowuje asocjację miofiber/komórki macierzyste, która jest niezbędnym składnikiem niszy komórek macierzystych mięśni.

Izolacja i hodowla poszczególnych włókien mięśniowych i ich komórek satelitarnych z dorosłych mięśni szkieletowych

Aby zbadać związek między homeostazą białek, stresem i starzeniem się, monitorowaliśmy zmiany w fałdowaniu białek, śledząc dysfunkcję białek, lokalizację białek w komórce i stabilność białek na poziomie organizmu, komórkowym i białkowym, używając genetycznie wykonalnego metazoanu Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego do badania homeostazy białek w organizmie wielokomórkowym

Celem przedstawionej tutaj metody jest zbadanie agregacji białek podczas normalnego starzenia się w modelowym organizmie C. elegans. Protokół stanowi potężne narzędzie do badania wysoce nierozpuszczalnych dużych agregatów, które tworzą się wraz z wiekiem i do określenia, w jaki sposób zmiany w proteostazie wpływają na agregację białek.

Metody badania zmian w inherentnej agregacji białek wraz z wiekiem u Caenorhabditis elegans

Ta metoda opisuje solidne i powtarzalne podejście do porównywania poziomów białek w różnych tkankach i w różnych punktach czasowych rozwoju przy użyciu standaryzowanego ilościowego podejścia western blotting.

Solidne porównanie poziomów białka w tkankach i podczas całego rozwoju przy użyciu standaryzowanego ilościowego Western blotting

Spadek proteostazy jest cechą charakterystyczną starzenia się, ułatwiając wystąpienie chorób neurodegeneracyjnych. Przedstawiamy protokół do ilościowego pomiaru proteostazy w dwóch różnych tkankach Caenorhabditis elegans poprzez heterologiczną ekspresję powtórzeń poliglutaminy połączonych z fluorescencyjnym reporterem. Model ten umożliwia szybką analizę genetyczną proteostazy in vivo.

Kwantyfikacja swoistego dla tkanki spadku proteostazy u Caenorhabditis elegans

Tutaj proponujemy metodę efektywnego pozyskiwania pojedynczych włókien mięśniowych we wczesnych stadiach rozwoju pourodzeniowego z homozygotycznego zmutowanego modelu myszy Lamin Δ8-11, bardzo ciężkiego modelu dystrofii mięśniowej Emery'ego-Dreifussa (EDMD).

Izolacja i hodowla pojedynczych włókien mięśniowych z mysiego modelu dystrofii mięśniowej Embergla-Dreifussa we wczesnym rozwoju poporodowym

Mikrotubule, które są polimerami tubuliny, odgrywają kluczową rolę jako składnik cytoszkieletu w komórkach eukariotycznych i są znane ze swojej dynamicznej niestabilności. W badaniu tym opracowano metodę frakcjonowania mikrotubul w celu rozdzielenia ich na stabilne mikrotubule, labilne mikrotubule i wolną tubulinę w celu oceny stabilności mikrotubul w różnych tkankach myszy.

Ilościowa technika frakcjonowania mikrotubul w celu oddzielenia stabilnych mikrotubul, labilnych mikrotubul i wolnej tubuliny w tkankach myszy

Protokół przedstawia proces obrazowania i obliczeniowy do wyodrębniania i weryfikacji chromatyny oraz epigenetycznego wieku (ImAge) opartego na obrazowaniu.

Pomiar starzenia pojedynczych komórek za pomocą biomarkera chromatyny i epigenetycznego starzenia się opartego na obrazowaniu

Opisana jest zmodyfikowana metoda northern blot do pomiaru modyfikacji N 6-metylodenozyny (m6A) w RNA. Obecna metoda może wykrywać modyfikacje w różnych RNA i kontrolach w ramach różnych projektów eksperymentalnych.

Metoda pomiaru modyfikacji RNA N 6-metyloadenozyny w komórkach i tkankach

Poznaj metodę izolacji białek filamentowych z tkanek myszy do badania modyfikacji potranslacyjnych związanych ze starzeniem. Protokół z automatyczną lizą umożliwia szybką analizę proteomiczną.

Izolacja pośrednich białek filamentowych z wielu tkanek myszy w celu zbadania modyfikacji potranslacyjnych związanych ze starzeniem się (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja pośrednich białek filamentowych z wielu tkanek myszy w celu zbadania modyfikacji potranslacyjnych związanych ze starzeniem się

Przeglądaj więcej filmów