Metody badania zmian w inherentnej agregacji białek wraz z wiekiem u Caenorhabditis elegans
November 26th, 2017
Celem przedstawionej tutaj metody jest zbadanie agregacji białek podczas normalnego starzenia się w modelowym organizmie C. elegans. Protokół stanowi potężne narzędzie do badania wysoce nierozpuszczalnych dużych agregatów, które tworzą się wraz z wiekiem i do określenia, w jaki sposób zmiany w proteostazie wpływają na agregację białek.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest wykrycie zmian w nierozpuszczalności białek wraz z wiekiem u C. elegans i ocena, w jaki sposób ukierunkowany knockdown genu wpływa na ten marker starzenia. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie starzenia się i proteostazy, takie jak to, dlaczego organizmy nie utrzymują zdrowego proteomu wraz z wiekiem. Główną zaletą tej techniki jest możliwość badania agregacji białek podczas normalnego starzenia się przy braku procesów chorobowych.
Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat agregacji białek u C. elegans, można ją również zaadaptować do innych organizmów modelowych, na przykład do badania nierozpuszczalności białek związanych z wiekiem u myszy. Aby rozpocząć leczenie, dodać 207,45 mililitrów pożywki S Basal z dodatkowymi odczynnikami, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym, do kolby hodowlanej Fernbacha o pojemności 2 800 mililitrów. Dodać końcowe stężenie 50 mikrogramów na mililitr karbenicyliny i jeden milimol IPTG i zamknąć kolbę zakrętką membranową.
Wyjmij L1 z inkubatora o temperaturze 25 stopni Celsjusza i przenieś je do 15-mililitrowych probówek. Odwirować L1 przy 1 900 razy g przez trzy minuty. Po odwirowaniu usunąć supernatant.
Pod mikroskopem policz L1 na dwa mikrolitry i uśrednij liczby uzyskane z co najmniej dziewięciu kropli. Następnie dodaj 50 000 robaków do kolekcji młodych robaków i 100 000 robaków do kolekcji starych robaków do czterech kolb hodowlanych Fernbacha przygotowanych w poprzednim kroku. Następnie dodaj kontrolne bakterie RNAi i bakterie RNAi dla interesującego genu proporcjonalnie do liczby robaków.
Po dodaniu bakterii uzupełnij hodowlę robaków za pomocą S Basal, aby uzyskać całkowitą objętość do 300 mililitrów. Inkubować kulturę robaków w temperaturze 25 stopni Celsjusza w inkubatorze z wytrząsaniem z prędkością 150 obr./min, aż do zbioru. Zbierz młode robaki w drugim lub trzecim dniu, aby zmierzyć podstawowy poziom rozpuszczalności białka.
Wlej robaki z jednej kolby do lejka rozdzielającego i pozwól robakom osiadać przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po osadzeniu się robaków otwórz kurek odcinający i wlej robaki do jednej 50-mililitrowej tuby. Następnie podziel granulkę robaka na dwie 15-mililitrowe rurki.
Napełnij probówki do 15 mililitrów M9 i odwiruj robaki. Aby umyć robaki, usuń supernatant i napełnij probówkę do 15 mililitrów M9. Powtórzyć wirowanie. Po zakończeniu mycia przenieś robaki do dwóch 50-mililitrowych tubek i użyj lodowatego M9, aby napełnić całkowitą objętość do 20 mililitrów.
Aby usunąć bakterie i martwe robaki, dodaj dwie 20-mililitrowe rozcieńczone granulki robaków do dwóch 50-mililitrowych probówek wypełnionych 20 mililitrami lodowatej 60% sacharozy. Szybko odwiruj probówki. Za pomocą pipety o pojemności 25 mililitrów ostrożnie usuń do 15 mililitrów górnej warstwy robaka.
Umieść górną warstwę robaka bezpośrednio w 37 mililitrach M9 plus octoxynol-9 przygotowanych na lodzie. Następnie odwiruj probówki pod ciśnieniem 2700 g przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza, przyspieszeniu dziewiątym i zwalnianiu siódmym. Po odrzuceniu supernatantu przenieść osad do czterech 15-mililitrowych probówek i przemyć je dwukrotnie lodowatym M9 plus okoksynol-9.
Następnie odwiruj probówki. Usuń supernatant i napełnij probówki do oznaczenia 15 mililitrów lodowatym M9 plus okoksynol-9. Umyj robaki lodowatym M9 i połącz cztery probówki w dwie tubki.
Napełnij probówki do 15 mililitrów i odwiruj. Usunąć supernatant, napełnić dwie probówki M9 w temperaturze pokojowej do całkowitej objętości czterech mililitrów i obracać je na mieszalniku nutującym w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 40 minut. Po nutowaniu umyj robaki dwukrotnie lodowatym M9 i oktoksynolem-9.
Następnie umyj je dwukrotnie M9 i przenieś robaki do jednej tubki. Przed zebraniem umyć robaki w ponownym montażu lub buforze do ekstrakcji soli o wysokiej zawartości soli RAB bez inhibitorów. Usunąć supernatant do momentu, gdy na wierzchu osadu robaka nie będzie płynu.
Następnie oszacuj objętość osadu robaka i dodaj identyczną objętość RAB z inhibitorami. Przygotuj 50-mililitrową probówkę wypełnioną do połowy ciekłym azotem na suchym lodzie i za pomocą pipety Pasteura wyciągnij robaki i powoli wlej je do probówki. Pozwól ciekłemu azotowi odparować i przechowuj zamrożone robaki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszej obróbki.
Schłodzić zaprawę ciekłym azotem i przeprowadzić rozbijanie zwierząt na suchym lodzie. Zamrożone robaki przenieś do wstępnie schłodzonej zaprawy i miel je przez 2,5 minuty. Dodaj 100 mililitrów ciekłego azotu do proszku i miel przez kolejne 2,5 minuty.
Użyj mikroskopu, aby sprawdzić, czy ciała robaków są połamane na małe kawałki. Następnie przenieś proszek do dwóch mililitrowych probówek i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Na suchym lodzie odważ dwa razy 350 miligramów zmielonych robaków na punkt czasowy i na bakterie RNAi do dwumililitrowych probówek.
Aby usunąć białka rozpuszczalne o wysokiej zawartości soli, dodaj dwie objętości na wagę już przygotowanego RAB z inhibitorami, jeden milimolowy PMSF, 200 jednostek na mililitr DNazy I i 100 mikrogramów na mililitr RNazy A do każdej probówki i rozpuścić proszek na lodzie. Pobrać zawiesinę do strzykawki o pojemności jednego mililitra 15 razy i inkubować na lodzie przez 10 minut. Wirować w temperaturze 18, 400 razy g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Przejdź przez warstwę tłuszczu i zbierz supernatant zawierający białka rozpuszczalne w soli do jednej dwumililitrowej probówki na warunek. Usuń tłuszcz i wyrzuć go. Podwielokrotność białek rozpuszczalnych w soli do zamrożenia w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
Aby odrzucić lipidy, należy rozpuścić osad w 700 mikrolitrach RAB z inhibitorami zawierającymi jedną sacharozę molową bez DNazy I i RNazy A. Pobrać zawiesinę do strzykawki 10 razy i inkubować na lodzie przez pięć minut. Pamiętaj, aby usunąć cały sklaranty i lipidy i wyrzucić je. Aby usunąć białka rozpuszczalne w SDS, rozpuść osad za pomocą 700 mikrolitrów buforu RIPA.
Pobrać zawiesinę do strzykawki 10 razy i inkubować przez 10 minut na lodzie. Wirować w temperaturze 18, 400 g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zebrać sklarowany nad osadem zawierający białka rozpuszczalne w SDS i podwielokrotność do zamrożenia w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
Po rozpuszczeniu każdej granulki należy zebrać razem dwie próbki każdego stanu za pomocą 500 mikrolitrów buforu RIPA i pobrać zawiesinę do strzykawki 10 razy. Należy uważać, aby usunąć cały supernatant i wyrzucić go. Końcową osadkę zawierającą wysoce nierozpuszczalne białka rozpuścić w 400 mikrolitrach 70% kwasu mrówkowego i pobrać zawiesinę do strzykawki 20 razy.
Inkubować zawiesinę przez 20 minut na lodzie. Odwiruj zawiesinę w probówkach ultrawirówek, aby usunąć resztki naskórka robaka. Zebrać supernatant zawierający wysoce nierozpuszczalne białka i zamrozić go w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
Barwienie białka całkowitego zawartości białka nierozpuszczalnego u młodych i starszych robaków wykazało związany z wiekiem wzrost poziomu wysoce nierozpuszczalnego białka u zwierząt kontrolnych, a nie u zwierząt długowiecznych. Barwienie przeciwciałami PAB-1, białka wiążącego RNA z przewidywaną domeną podobną do prionów, potwierdziło dane ze spektrometrii mas, że długowieczne zwierzęta utrzymywały PAB-1 rozpuszczalny z wiekiem. Przeprowadzono analizę in vivo zwierząt transgenicznych wykazujących ekspresję tagRFP PAB-1 w mięśniach gardła.
U młodych zwierząt tagRFP PAB-1 był głównie rozlany w całym gardle. Z wiekiem postępuje akumulacja jasnych puncta rozpoczynających się w tylnej opuszki gardłowej. Podczas starzenia się zaobserwowaliśmy również agregację w przedniej opuszki gardłowej u coraz większej liczby zwierząt.
Kwantyfikacja różnych poziomów agregacji tagRFP PAB-1 wraz z wiekiem w tle dzikiego typu i zmutowanego daf-2 ujawnia silnie opóźnioną agregację tagRFP PAB-1 wraz z wiekiem u zwierząt długowiecznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zebrać dużą liczbę robaków do ekstrakcji białek i jak wyizolować wysoce nierozpuszczalne duże agregaty do dalszej analizy za pomocą spektrometrii mas lub strony SDS.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie bada agregację białek podczas normalnego starzenia się u organizmu modelowego C. elegans. Metoda ta pozwala na badanie nierozpuszczalnych agregatów białek oraz wpływu proteostazy na starzenie się.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Badania nad starzeniem się
Tło
- Agregacja białek jest kluczowym markerem starzenia się.
- C. elegans służy jako cenny organizm modelowy do badania starzenia się.
- Rozumienie proteostazy jest kluczowe dla wglądu w choroby związane z wiekiem.
- Ta metoda może być zaadaptowana do użycia u innych organizmów, takich jak myszy.
Cel badania
- Wykryć zmiany w nierozpuszczalności białek wraz z wiekiem u C. elegans.
- Ocenić wpływ ukierunkowanego wyciszenia genów na agregację białek.
- Wyjaśnić, dlaczego organizmy mają trudności z utrzymaniem zdrowego proteomu w miarę starzenia się.
Stosowane metody
- Przygotowanie pożywki S Basal z określonymi reagentami.
- Użycie Karbenicyliny i IPTG w procesie hodowlany.
- Monitorowanie agregacji białek w czasie.
- Zastosowanie technik wyciszenia genów do oceny wpływu na markery starzenia.
Główne wyniki
- Identyfikacja wzorców agregacji białek w starzejącym się C. elegans.
- Ocenienie, w jaki sposób wyciszenie genów zmienia rozpuszczalność białek.
- Wgląd w mechanizmy załamania proteostazy wraz z wiekiem.
- Potencjał szerszego zastosowania w badaniach nad starzeniem się wśród różnych gatunków.
Konkluzje
- Metoda ta zapewnia solidną ramę do badania agregacji białek związanych ze starzeniem.
- Wyniki przyczyniają się do lepszego zrozumienia procesu starzenia się i proteostazy.
- Przyszłe badania mogą rozszerzyć to podejście na inne organizmy modelowe.
Często zadawane pytania
Chapters in this video
0:05
Title
0:53
Liquid Culture for Treatment with RNAi Starting at L1
2:40
Collection of Young and Aged Worms Subjected to RNAi in Liquid Culture
6:14
Disruption of Animals
6:58
Isolation of SDS-insoluble Proteins for Mass Spectrometry
10:03
Results: Reduced IIS Prevents Age-dependent Protein Aggregation
11:26
Conclusion
