Name: Metody badania zmian w inherentnej agregacji białek wraz z wiekiem u Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Poznaj metodę badania agregacji białek wraz z wiekiem u Caenorhabditis elegans. Technika ta pozwala ocenić wpływ nokdaunu genów na markery starzenia i zrozumieć mechanizmy utraty proteostazy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez fundusze z DZNE oraz Międzynarodowy Grant Reintegracyjny Marie Curie (322120 dla D.C.D.)

<ol><li>Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adapting+proteostasis+for+disease+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adapting proteostasis for disease intervention.</a> Science. 319, 916-919 (2008).</li>
<li>David, D. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23181070">Aging and the aggregating proteome.</a> Frontiers in genetics. 3, 247(2012).</li>
<li>Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+chaperones+in+protein+folding+and+proteostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular chaperones in protein folding and proteostasis.</a> Nature. 475, 324-332 (2011).</li>
<li>Ayyadevara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-+and+Hypertension-Associated+Protein+Aggregates+in+Mouse+Heart+Have+Similar+Proteomic+Profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Age- and Hypertension-Associated Protein Aggregates in Mouse Heart Have Similar Proteomic Profiles.</a> Hypertension. 67, 1006-1013 (2016).</li>
<li>David, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+protein+aggregation+as+an+inherent+part+of+aging+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans.</a> PLoS biology. 8, 1000450(2010).</li>
<li>Demontis, F., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXO%2F4E-BP+signaling+in+Drosophila+muscles+regulates+organism-wide+proteostasis+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FOXO/4E-BP signaling in Drosophila muscles regulates organism-wide proteostasis during aging.</a> Cell. 143, 813-825 (2010).</li>
<li>Lechler, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+Insulin%2FIGF-1+Signaling+Restores+the+Dynamic+Properties+of+Key+Stress+Granule+Proteins+during+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Reduced Insulin/IGF-1 Signaling Restores the Dynamic Properties of Key Stress Granule Proteins during Aging.</a> Cell reports. 18, 454-467 (2017).</li>
<li>Reis-Rodrigues, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+age-dependent+changes+in+protein+solubility+identifies+genes+that+modulate+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+cell%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of age-dependent changes in protein solubility identifies genes that modulate lifespan.</a> Aging cell. 11, 120-127 (2012).</li>
<li>Tanase, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Carbonyl+Modifications+on+Aging-Associated+Protein+Aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Role of Carbonyl Modifications on Aging-Associated Protein Aggregation.</a> Scientific reports. 6, 19311(2016).</li>
<li>Walther, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+Proteome+Remodeling+and+Aggregation+in+Aging+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans.</a> Cell. 161, 919-932 (2015).</li>
<li>Lee, V. M., Wang, J., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+paired+helical+filament+tau+and+normal+tau+from+human+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Purification of paired helical filament tau and normal tau from human brain tissue.</a> Methods in enzymology. 309, 81-89 (1999).</li>
<li>Goudeau, J., Aguilaniu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbonylated+proteins+are+eliminated+during+reproduction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+cell%22%5BJournal%5D)">Carbonylated proteins are eliminated during reproduction in C. elegans.</a> Aging cell. 9, 991-1003 (2010).</li>
<li>Zimmerman, S. M., Hinkson, I. V., Elias, J. E., Kim, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+Aging+Drives+Protein+Accumulation+in+the+Uterus+and+Limits+Lifespan+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Reproductive Aging Drives Protein Accumulation in the Uterus and Limits Lifespan in C. elegans.</a> PLoS genetics. 11, 1005725(2015).</li>
<li>Uno, M., Nishida, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifespan-regulating+genes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Npj+Aging+And+Mechanisms+Of+Disease%22%5BJournal%5D)">Lifespan-regulating genes in C. elegans.</a> Npj Aging And Mechanisms Of Disease. 2, 16010(2016).</li>
<li>Sulston, J. H. <a target="_blank" href="NULL">The Nematode Caenorhabditis elegans</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 587-606 (1988).</li>
<li>Maine, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+As+a+tool+for+understanding+germline+development+in+Caenorhabditis+elegans%3A+uses+and+cautions%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">RNAi As a tool for understanding germline development in Caenorhabditis elegans: uses and cautions.</a> Developmental biology. 239, 177-189 (2001).</li>
<li>Rauniyar, N., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isobaric+labeling-based+relative+quantification+in+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+proteome+research%22%5BJournal%5D)">Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics.</a> Journal of proteome research. 13, 5293-5309 (2014).</li>
<li>Brignull, H. R., Morley, J. F., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+polyglutamine+pathogenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Modeling polyglutamine pathogenesis in C. elegans.</a> Methods in enzymology. 412, 256-282 (2006).</li>
<li>Fay, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+genetic+methods%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Classical genetic methods.</a> WormBook. , 1-58 (2013).</li>
<li>Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorodeoxyuridine+enhances+the+heat+shock+response+and+decreases+polyglutamine+aggregation+in+an+HSF-1-dependent+manner+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans.</a> Mech Ageing Dev. 141, 1-4 (2014).</li>
<li>Angeli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+synthesis+inhibitor+is+protective+against+proteotoxic+stressors+via+modulation+of+fertility+pathways+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans.</a> Aging (Albany NY). 5, 759-769 (2013).</li>
<li>Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorodeoxyuridine+improves+Caenorhabditis+elegans+proteostasis+independent+of+reproduction+onset%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset.</a> PLoS One. 9, 85964(2014).</li>
<li>Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorodeoxyuridine+affects+the+identification+of+metabolic+responses+to+daf-2+status+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans.</a> Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).</li>
<li>Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+and+insulin+signaling+regulate+reproductive+aging+via+oocyte+and+germline+quality+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TGF-beta and insulin signaling regulate reproductive aging via oocyte and germline quality maintenance.</a> Cell. 143, 299-312 (2010).</li>
<li>Andux, S., Ellis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+maintains+oocyte+quality+in+aging+Caenorhabditis+elegans+females%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Apoptosis maintains oocyte quality in aging Caenorhabditis elegans females.</a> PLoS genetics. 4, 1000295(2008).</li>
<li>Vilchez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPN-6+determines+C.+elegans+longevity+under+proteotoxic+stress+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions.</a> Nature. 489, 263-268 (2012).</li>
<li>Ghazi, A., Henis-Korenblit, S., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcription+elongation+factor+that+links+signals+from+the+reproductive+system+to+lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">A transcription elongation factor that links signals from the reproductive system to lifespan extension in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS genetics. 5, 1000639(2009).</li>
<li>Shemesh, N., Shai, N., Meshnik, L., Katalan, R., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+the+Trade-Off+between+Somatic+Proteostasis+and+Reproduction+in+Caenorhabditis+elegans+Models+of+Polyglutamine+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Uncoupling the Trade-Off between Somatic Proteostasis and Reproduction in Caenorhabditis elegans Models of Polyglutamine Diseases.</a> Front Mol Neurosci. 10, 101(2017).</li>
<li>Kaletsky, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+adult+neuronal+IIS%2FFOXO+transcriptome+reveals+adult+phenotype+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The C. elegans adult neuronal IIS/FOXO transcriptome reveals adult phenotype regulators.</a> Nature. 529, 92-96 (2016).</li>
<li>Kawarabayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+changes+in+brain%2C+CSF%2C+and+plasma+amyloid+%28beta%29+protein+in+the+Tg2576+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Age-dependent changes in brain, CSF, and plasma amyloid (beta) protein in the Tg2576 transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 372-381 (2001).</li>
<li>Kraemer, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegeneration+and+defective+neurotransmission+in+a+Caenorhabditis+elegans+model+of+tauopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neurodegeneration and defective neurotransmission in a Caenorhabditis elegans model of tauopathy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 9980-9985 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiamy metodologię izolowania wysoce nierozpuszczalnych agregatów białkowych ze starzejących się C. elegans poddanych działaniu RNAi do analizy za pomocą spektrometrii mas i Western blot. Pokazujemy, że poprawa proteostazy poprzez zmniejszenie IIS znacznie zapobiega zależnej od wieku agregacji białek. Poprzez selekcję specyficznych białek podatnych na agregację do nadekspresji w C. elegans, możliwe jest dalsze przeanalizowanie mechanizmów modulujących naturalną agregację białek....

Nieprawidłowe fałdowanie i agregacja białek są uznawane za cechę charakterystyczną wielu chorób neurodegeneracyjnych, takich jak AD, PD, stwardnienie zanikowe boczne (ALS), otępienie czołowo-skroniowe (FTD) i wiele innych. Na przykład α-synukleina łączy się w fibryle amyloidowe, które gromadzą się jako ciała Lewy'ego, szczególnie w istocie czarnej pacjentów z PD, podczas gdy u pacjentów z ALS TDP-43 lub FUS nieprawidłowo się fałdują, tworząc agregaty cytoplazmatyczne w degenerujących się neuronach ruchowych. W każdym z tych zaburzeń neurodegeneracyjnych mechanizmy utrzymujące homeostazę białek lub proteostazę nie zapobiegają akumulacji nieprawidłowo sfałdowanych białek, co w konsekwencji prowadzi do choroby.
Proteostaza jest niezbędna do zapewnienia funkcji komórkowych, a w normalnych warunkach te mechanizmy regulacyjne ściśle kontrolują tempo syntezy, fałdowania i degradacji białek. Kilka badań pokazuje, że wraz z wiekiem zdolność wielu komórek i narządów do zachowania homeostazy białek jest stopniowo zagrożona, a fizjologiczne pogorszenie sieci proteostazy wraz z wiekiem jest ważnym czynnikiem obciążającym choroby neurodegeneracyjne (przegląd w bibliografii1,2,3). Fakt, że kontrola jakości białek i odpowiedź komórkowa na stres związany z niespisanymi białkami są zaburzone wraz z wiekiem, sugeruje, że nieprawidłowe fałdowanie i agregacja białek może być ogólną konsekwencją starzenia się. Rzeczywiście, my i inni wykazaliśmy, że agregacja białek nie ogranicza się do choroby, a zamiast tego część proteomu staje się wysoce nierozpuszczalna w detergentach u starszych zwierząt4,5,6,7,8,9,10. Analiza obliczeniowa i in vivo ujawniła, że te fizjologiczne agregaty związane z wiekiem przypominają agregaty chorobowe pod kilkoma względami5. Odkrycie endogennej, zależnej od wieku agregacji białek daje nam możliwość przeanalizowania mechanizmów molekularnych i komórkowych, które regulują agregację białek, bez użycia ektopowo eksprymowanych białek związanych z chorobą ludzką. Obecnie istnieją jedynie ograniczone informacje na temat regulacji powszechnej nierozpuszczalności białek oraz na temat wpływu tej dysregulacji na zdrowie organizmu.
Nicień C. elegans jest jednym z najobszerniej badanych organizmów modelowych w badaniach nad starzeniem, ponieważ zwierzęta te mają stosunkowo krótką długość życia i wykazują wiele charakterystycznych cech starzenia obserwowanych u organizmów wyższych. Wpływ starzenia się na nierozpuszczalność białek został zbadany u C. elegans poprzez sekwencyjne frakcjonowanie biochemiczne oparte na zróżnicowanej rozpuszczalności, które jest szeroko stosowane do ekstrakcji agregatów chorobowych w dziedzinie badań nad neurodegeneracją11. Za pomocą ilościowej spektrometrii mas wykazano, że kilkaset białek staje się podatnych na agregację u C. elegans przy braku choroby5. Tutaj szczegółowo opisujemy protokół hodowli dużej liczby robaków w płynnej kulturze i sekwencyjnej ekstrakcji w celu wyizolowania zagregowanych białek do kwantyfikacji za pomocą spektrometrii mas i analizy za pomocą Western blot. Ponieważ nieprawidłowo sfałdowane i podatne na agregację białka gromadzą się w starzejących się gonadach C. elegans i maskują zmiany w innych tkankach somatycznych5,12,13, używamy mutanta bez gonad, aby skupić analizę na nierozpuszczalności białek w tkankach nierozrodczych. Przedstawiona metoda umożliwia analizę wysoce nierozpuszczalnych, dużych kruszyw, które są nierozpuszczalne w 0,5% SDS i granulowane przy stosunkowo niskiej prędkości odśrodkowej. Alternatywnie, mniej rygorystyczny protokół ekstrakcji w celu zbierania również mniejszych i bardziej rozpuszczalnych agregatów został opublikowany w innym miejscu10. Ponadto opisano metodę stosowaną do oceny agregacji in vivo u C. elegans.
Ogólnie rzecz biorąc, te metody w połączeniu z interferencją RNA (RNAi) mogą ocenić rolę interesującego genu w modulowaniu zależnej od wieku agregacji białek. W tym celu opisujemy analizę ekstraktów z młodych i starszych robaków z knockdownem i bez knockdownu określonego białka będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą RNAi. Metody te powinny być potężnym narzędziem do określenia, które składniki sieci proteostazy regulują nierozpuszczalność białek. Wykazano, że kilka interwencji, takich jak zmniejszona sygnalizacja insuliny/insulinopodobnego czynnika wzrostu (IGF) 1 (IIS), znacznie opóźnia starzenie się C. elegans14. Szlaki długowieczności często indukują mechanizmy kontroli jakości białek, a zatem szlaki te mogą aktywnie wpływać na tempo agregacji białek. Jako przykład pokazujemy zmniejszoną naturalną agregację białek u długowiecznych zwierząt po zahamowaniu szlaku IIS7.

<table><tbody><tr><td>Kolba hodowlana Fernbacha&nbsp;</td><td>Corning</td><td>4425-2XL</td><td>Pyrex, Pojemność 2 800 ml, z 3 wgłębieniami na przegrodę</td></tr><tr><td>Membrana Zakrętka&nbsp;</td><td>Mieszalnik</td> nutacyjny Schott <td>1088655</td><td>GL45</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>444-0148</td><td></td></tr><tr><td>Lejek separacyjny</td><td>Nalgene</td><td>4300-1000</td><td>Pojemność 1.000 ml</td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml&nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>Szara igła, 27 G x &frac12; ", 0,4 mm x 13 mm</td><td>BD Microlance 3</td><td>300635</td><td></td></tr><tr><td>Filtry membranowe 0,025 &mikro; M</td><td>Millipore</td><td>VSWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Pasek pH</td><td>Machery-Nagel</td><td>92110</td><td>pH-Fix 0-14</td></tr><tr>Koktajl <td>inhibitorów</td><td>proteazy</td> Roche <td>4693132001</td><td>Kompletne mini tabletki wolne od EDTA&nbsp;</td></tr><tr><td>Oktoksynol-9&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A1388</td><td>Triton X-100</td></tr><tr><td>Kwas 4-morpholineetanosulfonowy (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1317</td><td></td></tr><tr><td>Nonylofenylopolietylenglikol</td><td>Applichem</td><td>A1694</td><td>Nonidet P40 (NP40)</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Roche</td><td>04716728001</td><td>rekombinowany, wolny od RNaz RNazaA</td></tr><tr><td></td><td>Promega</td><td>A7973</td><td>roztwór</td></tr><tr><td>Barwienie blot białkowy Całkowite barwienie blot białkowy</td><td>Thermofisher</td><td>S11791</td><td>Sypro Barwnik białkiem rubinowym Barwienie</td></tr><tr><td>w żelu białkowym</td><td>Thermofisher</td><td>S12001</td><td>Sypro Barwnik w żelu białkowym rubinowym</td></tr><tr><td>TCEP (chlorowodorek tris (2-karboksyetylo)fosfiny)Serva</td><td></td> <td>36970</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>Serva</td><td>26710</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Sekwencjonowanie Zmodyfikowana trypsyna</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Znaczniki izobaryczne do względnej i bezwzględnej oceny ilościowej</td><td>Odczynniki Sciex</td><td>4352135</td><td>iTRAQ Zestaw multipleksowy</td></tr><tr><td>Wirówka Avanti J-26XP</td><td>Ultrawirówka Beckmann Coulter</td><td>393126</td><td></td></tr><tr><td>Optima Max-XP</td> Wirówka <td>393315</td><td></td><td>redlic Beckmann</td></tr><tr><td>5424R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5404000413 Wirówka 5702</td><td>Eppendorf</td><td>5702000329</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Megafuge 40R</td><td>Thermo Scientific</td><td></td> Koncentrator 75004518 <td></td></tr><tr><td>Plus</td><td>Eppendorf</td><td>5305000304</td><td>Parownik odśrodkowy</td></tr><tr><td>Fluorescencyjny stereomikroskop M165 FC&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>z obiektywem Planapo 2.0x</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td>Mikroskop Leica S6E</td></tr><tr><td>o dużym powiększeniu Zeiss Axio Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td>z obiektywem PlanAPOCHROMAT 20x i Zeiss Axio Cam MRm</td></tr><tr><td>SoftwareImage</td> Analysis of mass spectrometr Prospector (Wyszukiwarka białków)<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Szczep http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm</td></tr><tr><td>E.coli</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAi bacteria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L4440</td><td>Julie Ahringer RNAi library</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C. elegans mutanty</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CF2253</td><td>CGC, nazwa szczepu: EJ1158&nbsp;</td><td></td><td>Genotyp: gon-2(q388)</td></tr><tr><td>C. elegans transgenics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DCD214</td><td>Laboratorium Della Davida w DZNE T&uuml; bingen</td><td></td><td>Genotyp: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]</td></tr><tr><td>DCD215</td><td>Laboratorium Della Davida w DZNE T&uuml; </td> Genotyp bingen<td></td><td>: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]</td></tr></tbody></table>

metody badania zmian w inherentnej agregacji białek wraz z wiekiem u caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

W ostatnich dziesięcioleciach częstość występowania zaburzeń neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera (AD) i choroba Parkinsona (PD), wzrosła. Te zaburzenia związane z wiekiem charakteryzują się pojawieniem się agregatów białkowych o strukturze fibrylarnej w mózgach tych pacjentów. Dokładny powód, dla którego normalnie rozpuszczalne białka przechodzą proces agregacji, pozostaje słabo poznany. Odkrycie, że agregacja białek nie ogranicza się do procesów chorobowych, a jest częścią normalnego procesu starzenia, umożliwia badanie mechanizmów molekularnych i komórkowych, które regulują agregację białek, bez użycia ektopowo eksprymowanych białek związanych z chorobą ludzką. W tym miejscu opisujemy metodologie badania inherentnej agregacji białek w Caenorhabditis elegans za pomocą podejść uzupełniających. Po pierwsze, badamy, jak hodować dużą liczbę zsynchronizowanych z wiekiem C. elegans w celu uzyskania dojrzałych zwierząt i przedstawiamy procedury biochemiczne izolowania wysoce nierozpuszczalnych dużych agregatów. W połączeniu z ukierunkowanym nokautem genetycznym możliwe jest przeanalizowanie roli interesującego genu w promowaniu lub zapobieganiu zależnej od wieku agregacji białek za pomocą kompleksowej analizy z ilościową spektrometrią mas lub analizy opartej na kandydatach z przeciwciałami. Odkrycia te są następnie potwierdzane przez analizę in vivo z transgenicznymi zwierzętami wykazującymi ekspresję białek podatnych na agregację znakowanych fluorescencyjnie. Metody te powinny pomóc w wyjaśnieniu, dlaczego niektóre białka mają skłonność do agregacji wraz z wiekiem i ostatecznie w jaki sposób utrzymać te białka w pełnej funkcjonalności.

Przedstawione tutaj metody wykorzystaliśmy do oceny, w jaki sposób długowieczne zwierzęta z obniżonym poziomem IIS modulują zależną od wieku agregację białek. Za pomocą techniki Western blot (patrz krok 2.2, Szybka ekstrakcja białek nierozpuszczalnych do analizy Western blot), przeanalizowaliśmy całkowitą oraz nierozpuszczalną zawartość białek u młodych (3. dzień dorosłości) i starych (18. dzień dorosłości) nicieni w grupie kontrolnej RNAi oraz w grupie RNAi skierowanej przeciwko receptor...

Celem przedstawionej tutaj metody jest zbadanie agregacji białek podczas normalnego starzenia się w modelowym organizmie C. elegans. Protokół stanowi potężne narzędzie do badania wysoce nierozpuszczalnych dużych agregatów, które tworzą się wraz z wiekiem i do określenia, w jaki sposób zmiany w proteostazie wpływają na agregację białek.

Metody badania zmian w inherentnej agregacji białek wraz z wiekiem u Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wykrycie zmian w nierozpuszczalności białek wraz z wiekiem u C. elegans i ocena, w jaki sposób ukierunkowany knockdown genu wpływa na ten marker starzenia. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie starzenia się i proteostazy, takie jak to, dlaczego organizmy nie utrzymują zdrowego proteomu wraz z wiekiem. Główną zaletą tej techniki jest możliwość badania agregacji białek podczas normalnego starzenia się przy braku procesów chorobowych.Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat agregacji białek u C. elegans, można ją również zaadaptować do innych organizmów modelowych, na przykład do badania nierozpuszczalności białek związanych z wiekiem u myszy. Aby rozpocząć leczenie, dodać 207,45 mililitrów pożywki S Basal z dodatkowymi odczynnikami, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym, do kolby hodowlanej Fernbacha o pojemności 2 800 mililitrów. Dodać końcowe stężenie 50 mikrogramów na mililitr karbenicyliny i jeden milimol IPTG i zamknąć kolbę zakrętką membranową.Wyjmij L1 z inkubatora o temperaturze 25 stopni Celsjusza i przenieś je do 15-mililitrowych probówek. Odwirować L1 przy 1 900 razy g przez trzy minuty. Po odwirowaniu usunąć supernatant.Pod mikroskopem policz L1 na dwa mikrolitry i uśrednij liczby uzyskane z co najmniej dziewięciu kropli. Następnie dodaj 50 000 robaków do kolekcji młodych robaków i 100 000 robaków do kolekcji starych robaków do czterech kolb hodowlanych Fernbacha przygotowanych w poprzednim kroku. Następnie dodaj kontrolne bakterie RNAi i bakterie RNAi dla interesującego genu proporcjonalnie do liczby robaków.Po dodaniu bakterii uzupełnij hodowlę robaków za pomocą S Basal, aby uzyskać całkowitą objętość do 300 mililitrów. Inkubować kulturę robaków w temperaturze 25 stopni Celsjusza w inkubatorze z wytrząsaniem z prędkością 150 obr./min, aż do zbioru. Zbierz młode robaki w drugim lub trzecim dniu, aby zmierzyć podstawowy poziom rozpuszczalności białka.Wlej robaki z jednej kolby do lejka rozdzielającego i pozwól robakom osiadać przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po osadzeniu się robaków otwórz kurek odcinający i wlej robaki do jednej 50-mililitrowej tuby. Następnie podziel granulkę robaka na dwie 15-mililitrowe rurki.Napełnij probówki do 15 mililitrów M9 i odwiruj robaki. Aby umyć robaki, usuń supernatant i napełnij probówkę do 15 mililitrów M9. Powtórzyć wirowanie. Po zakończeniu mycia przenieś robaki do dwóch 50-mililitrowych tubek i użyj lodowatego M9, aby napełnić całkowitą objętość do 20 mililitrów.Aby usunąć bakterie i martwe robaki, dodaj dwie 20-mililitrowe rozcieńczone granulki robaków do dwóch 50-mililitrowych probówek wypełnionych 20 mililitrami lodowatej 60% sacharozy. Szybko odwiruj probówki. Za pomocą pipety o pojemności 25 mililitrów ostrożnie usuń do 15 mililitrów górnej warstwy robaka.Umieść górną warstwę robaka bezpośrednio w 37 mililitrach M9 plus octoxynol-9 przygotowanych na lodzie. Następnie odwiruj probówki pod ciśnieniem 2700 g przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza, przyspieszeniu dziewiątym i zwalnianiu siódmym. Po odrzuceniu supernatantu przenieść osad do czterech 15-mililitrowych probówek i przemyć je dwukrotnie lodowatym M9 plus okoksynol-9.Następnie odwiruj probówki. Usuń supernatant i napełnij probówki do oznaczenia 15 mililitrów lodowatym M9 plus okoksynol-9. Umyj robaki lodowatym M9 i połącz cztery probówki w dwie tubki.Napełnij probówki do 15 mililitrów i odwiruj. Usunąć supernatant, napełnić dwie probówki M9 w temperaturze pokojowej do całkowitej objętości czterech mililitrów i obracać je na mieszalniku nutującym w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 40 minut. Po nutowaniu umyj robaki dwukrotnie lodowatym M9 i oktoksynolem-9.Następnie umyj je dwukrotnie M9 i przenieś robaki do jednej tubki. Przed zebraniem umyć robaki w ponownym montażu lub buforze do ekstrakcji soli o wysokiej zawartości soli RAB bez inhibitorów. Usunąć supernatant do momentu, gdy na wierzchu osadu robaka nie będzie płynu.Następnie oszacuj objętość osadu robaka i dodaj identyczną objętość RAB z inhibitorami. Przygotuj 50-mililitrową probówkę wypełnioną do połowy ciekłym azotem na suchym lodzie i za pomocą pipety Pasteura wyciągnij robaki i powoli wlej je do probówki. Pozwól ciekłemu azotowi odparować i przechowuj zamrożone robaki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszej obróbki.Schłodzić zaprawę ciekłym azotem i przeprowadzić rozbijanie zwierząt na suchym lodzie. Zamrożone robaki przenieś do wstępnie schłodzonej zaprawy i miel je przez 2,5 minuty. Dodaj 100 mililitrów ciekłego azotu do proszku i miel przez kolejne 2,5 minuty.Użyj mikroskopu, aby sprawdzić, czy ciała robaków są połamane na małe kawałki. Następnie przenieś proszek do dwóch mililitrowych probówek i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Na suchym lodzie odważ dwa razy 350 miligramów zmielonych robaków na punkt czasowy i na bakterie RNAi do dwumililitrowych probówek.Aby usunąć białka rozpuszczalne o wysokiej zawartości soli, dodaj dwie objętości na wagę już przygotowanego RAB z inhibitorami, jeden milimolowy PMSF, 200 jednostek na mililitr DNazy I i 100 mikrogramów na mililitr RNazy A do każdej probówki i rozpuścić proszek na lodzie. Pobrać zawiesinę do strzykawki o pojemności jednego mililitra 15 razy i inkubować na lodzie przez 10 minut. Wirować w temperaturze 18, 400 razy g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Przejdź przez warstwę tłuszczu i zbierz supernatant zawierający białka rozpuszczalne w soli do jednej dwumililitrowej probówki na warunek. Usuń tłuszcz i wyrzuć go. Podwielokrotność białek rozpuszczalnych w soli do zamrożenia w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Aby odrzucić lipidy, należy rozpuścić osad w 700 mikrolitrach RAB z inhibitorami zawierającymi jedną sacharozę molową bez DNazy I i RNazy A. Pobrać zawiesinę do strzykawki 10 razy i inkubować na lodzie przez pięć minut. Pamiętaj, aby usunąć cały sklaranty i lipidy i wyrzucić je. Aby usunąć białka rozpuszczalne w SDS, rozpuść osad za pomocą 700 mikrolitrów buforu RIPA.Pobrać zawiesinę do strzykawki 10 razy i inkubować przez 10 minut na lodzie. Wirować w temperaturze 18, 400 g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zebrać sklarowany nad osadem zawierający białka rozpuszczalne w SDS i podwielokrotność do zamrożenia w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Po rozpuszczeniu każdej granulki należy zebrać razem dwie próbki każdego stanu za pomocą 500 mikrolitrów buforu RIPA i pobrać zawiesinę do strzykawki 10 razy. Należy uważać, aby usunąć cały supernatant i wyrzucić go. Końcową osadkę zawierającą wysoce nierozpuszczalne białka rozpuścić w 400 mikrolitrach 70% kwasu mrówkowego i pobrać zawiesinę do strzykawki 20 razy.Inkubować zawiesinę przez 20 minut na lodzie. Odwiruj zawiesinę w probówkach ultrawirówek, aby usunąć resztki naskórka robaka. Zebrać supernatant zawierający wysoce nierozpuszczalne białka i zamrozić go w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Barwienie białka całkowitego zawartości białka nierozpuszczalnego u młodych i starszych robaków wykazało związany z wiekiem wzrost poziomu wysoce nierozpuszczalnego białka u zwierząt kontrolnych, a nie u zwierząt długowiecznych. Barwienie przeciwciałami PAB-1, białka wiążącego RNA z przewidywaną domeną podobną do prionów, potwierdziło dane ze spektrometrii mas, że długowieczne zwierzęta utrzymywały PAB-1 rozpuszczalny z wiekiem. Przeprowadzono analizę in vivo zwierząt transgenicznych wykazujących ekspresję tagRFP PAB-1 w mięśniach gardła.U młodych zwierząt tagRFP PAB-1 był głównie rozlany w całym gardle. Z wiekiem postępuje akumulacja jasnych puncta rozpoczynających się w tylnej opuszki gardłowej. Podczas starzenia się zaobserwowaliśmy również agregację w przedniej opuszki gardłowej u coraz większej liczby zwierząt.Kwantyfikacja różnych poziomów agregacji tagRFP PAB-1 wraz z wiekiem w tle dzikiego typu i zmutowanego daf-2 ujawnia silnie opóźnioną agregację tagRFP PAB-1 wraz z wiekiem u zwierząt długowiecznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zebrać dużą liczbę robaków do ekstrakcji białek i jak wyizolować wysoce nierozpuszczalne duże agregaty do dalszej analizy za pomocą spektrometrii mas lub strony SDS.

methods-to-study-changes-inherent-protein-aggregation-with-age

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film demonstruje test oparty na obrazowaniu in vivo, który pozwala określić spadek proteostazy spowodowany starzeniem się. W teście wykorzystuje Caenorhabditis elegans eksprymujące białko fuzyjne poliglutaminy YFP w mięśniach ścian ciała w celu zmierzenia związanej z wiekiem agregacji poliglutaminy i indukcji proteotoksyczności, co prowadzi do paraliżu.

Fluorescencyjny test paraliżu reporterowego: technika oceny związanego z wiekiem postępującego tworzenia się fluorescencyjnego reportera poliglutaminy i związanego z nim paraliżu w Caenorhabditis elegans

Aby zbadać związek między homeostazą białek, stresem i starzeniem się, monitorowaliśmy zmiany w fałdowaniu białek, śledząc dysfunkcję białek, lokalizację białek w komórce i stabilność białek na poziomie organizmu, komórkowym i białkowym, używając genetycznie wykonalnego metazoanu Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego do badania homeostazy białek w organizmie wielokomórkowym

Obrazowanie życia fluorescencji monitoruje, kwantyfikuje i rozróżnia tendencje agregacji białek w żywych, starzejących się i zestresowanych modelach choroby C. elegans.

Charakterystyka struktur amyloidowych u starzejących się C. elegans za pomocą obrazowania czasu życia fluorescencji

Spadek proteostazy jest cechą charakterystyczną starzenia się, ułatwiając wystąpienie chorób neurodegeneracyjnych. Przedstawiamy protokół do ilościowego pomiaru proteostazy w dwóch różnych tkankach Caenorhabditis elegans poprzez heterologiczną ekspresję powtórzeń poliglutaminy połączonych z fluorescencyjnym reporterem. Model ten umożliwia szybką analizę genetyczną proteostazy in vivo.

Kwantyfikacja swoistego dla tkanki spadku proteostazy u Caenorhabditis elegans

Tutaj przedstawiamy i opisujemy szeroko dostępne metodologie wykorzystujące niektóre wszechstronne modele nicieni, w tym nekrozę wywołaną hiperaktywowanym kanałem jonowym i neurotoksyczność wywołaną agregatem białkowym, do monitorowania i analizowania komórkowych i molekularnych podstaw chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem.

Modelowanie chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem w Caenorhabditis elegans

Poniższy protokół opisuje rozwój i optymalizację wysokoprzepustowego przepływu pracy dla hodowli robaków, obrazowania fluorescencyjnego i automatycznego przetwarzania obrazów w celu ilościowego określenia agregatów poliglutaminy jako oceny zmian w proteostazie.

Automatyzacja zagregowanej kwantyfikacji u Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentowana jest metoda analizy kinetyki agregacji białek u nicieni Caenorhabditis elegans. Zwierzęta z populacji zsynchronizowanej pod względem wieku są obrazowane w różnych punktach czasowych, a następnie następuje półautomatyczne zliczanie inkluzji w CellProfiler i dopasowywanie do modelu matematycznego w AmyloFit.

Monitorowanie kinetyki agregacji białek in vivo przy użyciu automatycznego zliczania inkluzji u Caenorhabditis elegans

Opisujemy nowy reporter w postaci czerwonego białka fluorescencyjnego (RFP), który jest specyficznie ekspresowany w oku Drosophila. Szczegółowo przedstawiamy metodologię preparowania tarczki wyobraźnej oka oraz sposób, w jaki reporter ten może pomóc w preparacji i identyfikacji konkretnych typów komórek w rozwijającym się oku.

Nowy reporter RFP wspomagający wizualizację tarczki wyobraźnej oka u Drosophila

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół przeprowadzania restrykcji dietetycznej na sztywnym podłożu u C. elegans z wykorzystaniem zabitych bakterii.

Ograniczenie kaloryczne na stałym podłożu u Caenorhabditis elegans

Niniejszy artykuł opisuje technikę wizualizacji wczesnych etapów embriogenezy u nicienia Caenorhabditis elegans.

Mikroskopia poklatkowa wczesnego embrionogenezy u Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę badania agregacji białek wraz z wiekiem u Caenorhabditis elegans. Technika ta pozwala ocenić wpływ nokdaunu genów na markery starzenia i zrozumieć mechanizmy utraty proteostazy.

Metody badania zmian w inherentnej agregacji białek wraz z wiekiem u Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów