Name: Kwantyfikacja swoistego dla tkanki spadku proteostazy u Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji spadku proteostazy w tkankach mięśniowych i neuronalnych u Caenorhabditis elegans za pomocą fluorescencyjnych reporterów poliglutaminowych. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów starzenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować byłym i obecnym członkom laboratorium Samuelsona za pomoc w udoskonaleniu tej metody i/lub dyskusję, która pomogła w rozwoju tego manuskryptu. Badania przedstawione w tej publikacji były wspierane przez National Institute on Aging of the National Institutes of Health w ramach numerów nagród RF1AG062593 i R21AG064519. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Starzenie się charakteryzuje się stopniowym spadkiem proteostazy. Proteostaza jest utrzymywana przez złożony system, sieć proteostatyczną, która zapewnia skoordynowaną, dynamiczną, reagującą na stres kontrolę fałdowania, degradacji i translacji białek. Dlaczego proteostaza zawodzi w trakcie starzenia się, jest słabo poznana, ale rozpadający się epigenom, malejąca indukowalność reakcji na stres i utrata kompensacyjnego przesłuchu zbiegają się z tym załamaniem. U C. elegans indukowalność transkrypcji wielu form re...

Homeostaza białek (proteostaza) jest definiowana jako komórkowa zdolność do utrzymania prawidłowego funkcjonowania i fałdowania proteomu. Nieodłącznym wyzwaniem dla proteostazy jest zapewnienie, że wszystkie białka są prawidłowo sfałdowane i utrzymywane w natywnej konformacji, która jest dodatkowo wzmacniana przez zróżnicowaną naturę wielkości białka, składu aminokwasowego, konformacji strukturalnej, stabilności, obrotu, ekspresji, kompartmentalizacji subkomórkowej i modyfikacji1. Proteostaza jest utrzymywana dzięki skoordynowanemu działaniu dużej sieci proteostatycznej, składającej się z około 2000 unikalnych białek, które regulują prawidłową syntezę, fałdowanie, transport i degradację w proteomie2,3. Składnikami sieci proteostatycznej jest dziewięć głównych rodzin molekularnych białek opiekuńczych4. Każda tkanka i typ komórki preferencyjnie wykorzystuje określone podzbiory molekularnych białek opiekuńczych, przypuszczalnie zgodnie z różnymi wymaganiami różnych proteomów5.
Jedną z cech charakterystycznych normalnego starzenia się organizmu jest postępujący spadek i załamanie proteostazy komórkowej, która jest uważana za podstawową podstawę początku i progresji rosnącej liczby chorób związanych z wiekiem. Na przykład choroba Alzheimera, choroba Parkinsona, choroba Huntingtona i stwardnienie zanikowe boczne (ALS) mają wspólną cechę: w każdym przypadku przejawy neurodegeneracji są napędzane przez zmiany genetyczne, które predysponują zmutowane białko do agregacji (amyloid-β/Tau, α-synukleina, HTT, FUS/TBD-43/SOD-1, odpowiednio)6,7,8,9,10. Podczas starzenia się zmniejsza się integralność i indukowalność sieci proteostatycznej, co powoduje akumulację agregatów proteotoksycznych, które skutkują dysfunkcją komórkową i neurodegeneracją. Warto zauważyć, że choroby konformacyjne białek nie są unikalne dla neuronów i występują w wielu tkankach, jak podkreślono w przypadku cukrzycy typu II, szpiczaka mnogiego i mukowiscydozy11,12,13,14. W związku z tym wyjaśnienie mechanizmów zdolnych do zachowania proteostazy ułatwi opracowanie ukierunkowanych interwencji w leczeniu chorób i będzie sprzyjać zdrowemu starzeniu się.
Mały nicień glebowy Caenorhabditis elegans (C. elegans) odegrał kluczową rolę w odkryciu genów i wyjaśnieniu szlaków, które zmieniają proteostazę. Wiele elementów sieci proteostatycznej i szlaków transdukcji sygnału, które regulują proteostazę, jest ewolucyjnie zachowanych. Co więcej, C. elegans ma zmniejszoną złożoność i redundancję w porównaniu z systemami kręgowców, dzięki czemu jest bardziej podatny na analizę genetyczną i odkrywanie genów. Dodatkowe zalety C. elegans, które doprowadziły do jego szerokiego zastosowania jako systemu modelowego do badania proteostazy, obejmują: potężną genomikę genetyczną i funkcjonalną, krótki cykl życia (3 dni) i długość życia (3 tygodnie), zwarty i dobrze opisany genom, dostępność szerokiego asortymentu mutantów genetycznych oraz łatwość wizualizacji specyficznych dla tkanek zmian w biologii komórki za pomocą reporterów fluorescencyjnych.
Postępujący zanik proteostazy podczas starzenia się można łatwo określić ilościowo u C. elegans. Laboratorium Morimoto po raz pierwszy wykazało, że ekspandacja poliglutaminy połączona z żółtym białkiem fluorescencyjnym (polyQ::YFP) może być wykorzystana do ilościowego określenia spadku proteostazy u C. elegans podczas starzenia15,16,17,18. Fuzje YFP z 35 powtórzeniami glutaminy lub więcej powodują związane z wiekiem tworzenie ognisk fluorescencyjnych wraz z objawami patologii komórkowej. Warto zauważyć, że ten zakres ekspansji glutaminy odzwierciedla długość przewodu poliglutaminowego białka huntingtyny, przy którym patologia choroby Huntingtona zaczyna być obserwowana u ludzi (zazwyczaj >35 powtórzeń CAG)19. Szczepy z ekspresją polyQ::YFP w komórkach mięśniowych, jelitowych lub neuronalnych zostały wykorzystane do potwierdzenia, że związany z wiekiem spadek proteostazy występuje w różnych typach komórek i tkanek. Specyficzna dla mięśni ekspresja polyQ::YFP (tj. unc-54p::Q35::YFP) była najczęściej stosowanym reporterem specyficznym dla tkanki, ponieważ akumulujące ogniska fluorescencyjne są łatwe do ilościowego określenia w ciągu pierwszych kilku dni dorosłości za pomocą prostego fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A-1B). Dodatkowo, zwierzęta stają się sparaliżowane w wieku średnim, ponieważ proteom w mięśniu załamuje się z powodu proteotoksycznego działania reportera (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C). Podobnie, związany z wiekiem spadek proteostazy neuronalnej może być śledzony (rgef-1p::Q40::YFP) poprzez bezpośrednie ilościowe określanie powstawania ognisk/agregatów i związanych z wiekiem spadków skoordynowanych zgięć ciała po umieszczeniu zwierząt w płynie (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 2).
Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół, jak mierzyć zależny od wieku postęp akumulacji agregatów białkowych i związaną z tym proteotoksyczność wywołaną ekspresją powtórzeń poliglutaminy w tkance neuronalnej i mięśniowej u C. elegans. Podajemy przykłady typowych wyników uzyskanych przy użyciu tych szczepów i metod. Ponadto pokazujemy, w jaki sposób wykorzystaliśmy te metody do badania regulacji transkrypcji sieci proteostatycznej. Omawiamy dodatkowe sposoby, w jakie te reportery można łatwo zintegrować z innymi istniejącymi odczynnikami lub dostosować do większych ekranów.

<table><tbody><tr><td>Płytki do hodowli 24-dołkowych</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#662102</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Płytki 96-dołkowe</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#780286</td><td></td></tr><tr><td>600 &micro; L 96-dołkowe płytki</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#786261</td><td></td></tr><tr><td>96-pinowy replikator płytek</td><td>Nunc</td><td>250520</td><td></td></tr><tr><td>Przepuszczająca powietrze uszczelka płytkowa</td><td>VWR</td><td>60941-086</td><td></td></tr><tr><td>agar bakteriologiczny</td><td>Affymetrix/USB</td><td>10906</td><td></td></tr><tr><td>baktopepton</td><td>VWR</td><td>90000-368</td><td></td></tr><tr><td>Biblioteka klonów C. elegans RNAi w bakteriach HT115 - Ahringer</td><td>Źródło: Bioscience</td><td>C. elegans RNAi Collection (Ahringer)</td><td>Patrz także Kamath et al, Nature 2003.</td></tr><tr><td>Biblioteka klonów RNAi C. elegans w bakteriach HT115 - Vidal</td><td>Source Bioscience</td><td>C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)</td> <td>Zobacz także Rual i in., Badania nad genomem 2004. Ta biblioteka jest również dostępna w Dharmacon.</td></tr><tr><td>FuDR (5-Fluoro-2'-deoksyurydyna)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L16497</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe do mikroskopu</td><td>szklanego VWR</td><td>48404-455</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka podstawowe</td><td>VWR</td><td>160004-422</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (beta-digalaktopionozyd izopropylu)</td><td>Gold Bio</td><td>12481C100</td><td></td></tr><tr><td>Płytka jednodołkowa nieobrobiona, kątowa, niepoddana obróbce, 128x86mm</td><td>Thermo-Fisher</td><td></td><td></td>242811</tr><tr><td>Azek sodu, CAS #26628-22-8</td><td>Mikroskop Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Imager M2m z oprogramowaniem AxioVision v4.8.2.0</td><td>Zeiss</td><td>nieznany</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad</td><td>Zeiss</td><td>nieznany</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja swoistego dla tkanki spadku proteostazy u caenorhabditis elegans

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Zdolność do utrzymania prawidłowego funkcjonowania i fałdowania proteomu (homeostazy białek) spada podczas normalnego starzenia, co ułatwia pojawienie się coraz większej liczby chorób związanych z wiekiem. Na przykład, białka z ekspansją poliglutaminy są podatne na agregację, czego przykładem jest białko huntingtyny i jednoczesny początek choroby Huntingtona. Związane z wiekiem pogorszenie proteomu zostało szeroko zbadane dzięki zastosowaniu transgenicznych Caenorhabditis elegans wykazujących ekspresję powtórzeń polyQ połączonych z żółtym białkiem fluorescencyjnym (YFP). Ten transgeniczny model zwierzęcy polyQ::YFP ułatwia bezpośrednią kwantyfikację związanego z wiekiem spadku proteomu poprzez obrazowanie postępującego tworzenia ognisk fluorescencyjnych (tj. agregatów białkowych) i późniejszego wystąpienia wad lokomocyjnych, które rozwijają się w wyniku zapadnięcia się proteomu. Co więcej, ekspresja transgenu polyQ::YFP może być sterowana przez promotory specyficzne dla tkanki, co pozwala na ocenę proteostazy w tkankach w kontekście nienaruszonego organizmu wielokomórkowego. Model ten jest wysoce podatny na analizę genetyczną, zapewniając w ten sposób podejście do ilościowego określania starzenia się, które jest komplementarne do testów długości życia. Opisujemy, jak dokładnie zmierzyć powstawanie ognisk polyQ::YFP w neuronach lub mięśniach ściany ciała podczas starzenia się, a następnie wystąpienia defektów behawioralnych. Następnie podkreślamy, w jaki sposób podejścia te można dostosować do wyższej przepustowości i potencjalnych przyszłych zastosowań przy użyciu innych pojawiających się strategii analizy genetycznej C. elegans.

U C. elegans model powtórzeń poliglutaminowych odegrał kluczową rolę w identyfikacji genów regulujących sieć proteostatyczną. Przykładowo, wykazaliśmy wcześniej, że kinaza białkowa oddziałująca z domeną homeotyczną (hpk-1), będąca kofaktorem transkrypcyjnym, wpływa na proteostazę podczas starzenia się poprzez regulację ekspresji autofagii i chaperonów molekularnych31. Stwierdziliśmy, że utrata hpk-1, zarówno poprzez wyciszenie RNAi, jak i u zwierząt z mutacją null hp...

Spadek proteostazy jest cechą charakterystyczną starzenia się, ułatwiając wystąpienie chorób neurodegeneracyjnych. Przedstawiamy protokół do ilościowego pomiaru proteostazy w dwóch różnych tkankach Caenorhabditis elegans poprzez heterologiczną ekspresję powtórzeń poliglutaminy połączonych z fluorescencyjnym reporterem. Model ten umożliwia szybką analizę genetyczną proteostazy in vivo.

Kwantyfikacja swoistego dla tkanki spadku proteostazy u Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Zastosowanie specyficznej tkankowo ekspresji reportera fluorescencyjnego poliglutaminy u C. elegans jest znaczące, ponieważ pozwala na odkrycie i scharakteryzowanie regulatorów proteostazy w kontekście nienaruszonego organizmu wielokomórkowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia wizualizację i kwantyfikację związanego z wiekiem spadku proteostazy komórkowej in vivo, co jest niezbędne do uzyskania głębszego mechanistycznego wglądu w to, jak organizmy utrzymują prawidłowe fałdowanie i funkcję proteomu oraz skutki starzenia. Wyjaśnienie mechanizmów zdolnych do zachowania proteostazy ułatwi opracowanie ukierunkowanych interwencji w leczeniu chorób związanych ze starzeniem się, w których proteostaza jest zaburzona, oraz będzie promować zdrowe starzenie się.Załamanie proteostazy jest ogromnym problemem klinicznym, ponieważ leży u podstaw rozwoju chorób związanych z nieprawidłowym fałdowaniem białek, w tym choroby Alzheimera, Parkinsona, choroby Huntingtona i stwardnienia zanikowego bocznego. Zacznij od użycia płytek Petriego o średnicy 6 centymetrów, aby przygotować pięć płytek agarowych dla każdego warunku testowego. Do eksperymentów z RNAi indukuj produkcję dsRNA w przekształconym HT115 E.coli i użyj agaru RNAi.Użyj OP50 E.coli na standardowym agarze NGM do eksperymentów bez RNAi. Hoduj kultury E.coli przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 220 obr./min. Następnego dnia osadzać bakterie przez odwirowanie przy 2,400 G przez 15 do 20 minut, a następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w jednej dziesiątej początkowej objętości funta.Podać 200 mikrolitrów skoncentrowanych bakterii na każdą płytkę i pozostawić otwarte płytki do wyschnięcia w czystym środowisku, aż cała ciecz zostanie wchłonięta. Aby zsynchronizować C.Elegans z podchlorynem, przemyj grawitacyjne hermafrodyty dwukrotnie buforem M9, a następnie przenieś je do świeżej probówki i inkubuj w 5 mililitrach roztworu podchlorynu przez pięć minut, potrząsając nimi co minutę. Po inkubacji należy odwirować zwierzęta i umyć je trzykrotnie buforem M9.Pozwól zarodkom wykluć się w probówkach przez noc w 3 mililitrach roztworu M9 z rotacją w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Oblicz gęstość zwierząt L1, upuszczając trzykrotnie 10 mikrolitrów roztworu L1 na 6-centymetrową płytkę i licząc liczbę zwierząt L1. Okresowo mieszaj roztwory L1, aby zapobiec osiadaniu zwierząt.Wysiewaj 50 L1 po jednym zwierzęciu na każdą płytkę, policz i zapisz liczbę wysianych, a następnie przenieś płytki do inkubatora o temperaturze 20 stopni Celsjusza. Alternatywnie, aby zsynchronizować zwierzęta poprzez składanie jaj, umieść od pięciu do dziesięciu młodych, ciężarnych dorosłych zwierząt na każdej płycie na cztery do sześciu godzin i pozwól im złożyć jaja, aż na talerzu będzie około 50 jaj. Usuń wszystkie dorosłe osobniki i przenieś płytki z jajami do inkubatora o temperaturze 20 stopni Celsjusza.Hoduj zwierzęta do etapu L4, który zajmie około 40 godzin w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 50 mikrolitrów 160 razy FUDR. Aby zmierzyć spadek proteostazy w tkance mięśniowej, wybierz 20 zwierząt i zamontuj je na szkiełku mikroskopowym z 3% podkładką agarozową i 5 mikrolitrami kropli 10-milimolowego azydku sodu.Po unieruchomieniu wszystkich robaków wyobraź sobie całe ciała zwierząt za pomocą soczewki o 10-krotnym powiększeniu. Użyj filtra FITC lub YFP i takiej samej ekspozycji dla każdego zwierzęcia. Po zakończeniu wyrzuć slajdy.Policz liczbę ognisk w mięśniach ściany ciała całego zwierzęcia. Ogniska to jaśniejsze sygnały punktowe, które można odróżnić od ciemniejszego sygnału rozpuszczalnego w tle. W dniach, w których odbywa się punktacja, spójrz na tabliczki ze zwierzętami i zapisz liczbę sparaliżowanych zwierząt, a następnie usuń sparaliżowane zwierzęta z talerza.Po zakończeniu eksperymentu oblicz współczynnik paraliżu dla każdego stanu i wykreśl postęp paraliżu. Aby zmierzyć spadek proteostazy w tkance neuronalnej, zamontuj robaki na szkiełku, jak opisano wcześniej, i wykonaj zdjęcia głowy zwierząt w formacie Z na mikroskopie złożonym za pomocą soczewki o powiększeniu 40 razy. Wyrzuć slajdy po obrazowaniu.Po uzyskaniu obrazów spłaszcz stosy Z i użyj ich do ilościowego określenia liczby ognisk w neuronach zlokalizowanych w obszarze pierścienia nerwowego. Wykreśl progresję akumulacji ognisk YFP od 4, 6, 8 i 10 dni. W drugim dniu dorosłości wybierz 10 zsynchronizowanych zwierząt z płytki i umieść je na 10-mikrolitrowej kropli buforu M9 na szkiełku mikroskopowym.Powtórz ten krok co najmniej cztery razy, aby uzyskać próbkę 40 lub więcej zwierząt. Rejestruj ruchy zwierząt przez 30 sekund na mikroskopie stereoskopowym z kamerą obsługującą wideo. Po nagraniu wszystkich filmów ze zwierzętami do analizy odtwórz wideo i oceń zgięcia ciała każdego zwierzęcia.Wykreśl liczbę zgięć ciała dla każdego zwierzęcia na wykresie kolumnowym, gdzie każda kropka reprezentuje liczbę zgięć ciała w ciągu 30 sekund na osi Y i różne warunki testowane na osi X. Model powtórzeń poliglutaminy odegrał zasadniczą rolę w identyfikacji genów regulujących sieć proteostatyczną. Specyficzna dla mięśni ekspresja polyQ-YFP powoduje akumulację ognisk fluorescencyjnych, które są łatwe do ilościowego określenia pod prostym fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym.Zwierzęta zostają sparaliżowane w wieku średnim, ponieważ proteom w mięśniu zapada się z powodu proteotoksycznego działania reportera. Związany z wiekiem spadek proteostazy neuronów może być śledzony poprzez bezpośrednie ilościowe określenie tworzenia agregatów i spadku skoordynowanych zgięć ciała po umieszczeniu zwierząt w płynie. Metoda ta została wykorzystana do wykazania, że kinaza białkowa oddziałująca z domeną homeo, kofaktor transkrypcyjny, wpływa na proteostazę podczas starzenia się poprzez regulację ekspresji autofagii i molekularnych białek opiekuńczych.Utrata HPK-1 zwiększa liczbę agregatów Q35-YFP, które gromadzą się podczas starzenia. Zwierzęta kontrolne wykazywały średnio 18 agregatów, podczas gdy zwierzęta z mutacją zerową HPK1 i RNAi z HPK1 wykazywały średnio odpowiednio 28 i 26 agregatów. Do ósmego dnia dorosłości od 77 do 78% zwierząt z niedoborem HPK1 było sparaliżowanych, w porównaniu z zaledwie 50% w grupie kontrolnej.Ponadto wykazano, że nadekspresja HPK1 reguluje tworzenie agregatów białkowych i chroni starzejące się zwierzęta przed paraliżem związanym z Q35-YFP podczas starzenia. Ta metoda mierzy ogólny spadek proteomu w obrębie typu komórki. Istnieje wiele metod oceny zmian w określonych składnikach sieci gruczołu krokowego.Razem tworzą one kompleksowy obraz. Pogarszająca się proteostaza jest cechą charakterystyczną starzenia się. Takie podejście pozwala naukowcom określić ilościowo ten spadek.W połączeniu z analizą genetyczną jest to potężne narzędzie do odkrywania.

quantifying-tissue-specific-proteostatic-decline-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym artykule przedstawiamy ogólny protokół pomiaru długości życia nicieni utrzymywanych na pożywkach stałych z bakteriami zneutralizowanymi za pomocą promieniowania UV.

Pomiar długości życia Caenorhabditis elegans na podłożach stałych

Ten film demonstruje test oparty na obrazowaniu in vivo, który pozwala określić spadek proteostazy spowodowany starzeniem się. W teście wykorzystuje Caenorhabditis elegans eksprymujące białko fuzyjne poliglutaminy YFP w mięśniach ścian ciała w celu zmierzenia związanej z wiekiem agregacji poliglutaminy i indukcji proteotoksyczności, co prowadzi do paraliżu.

Fluorescencyjny test paraliżu reporterowego: technika oceny związanego z wiekiem postępującego tworzenia się fluorescencyjnego reportera poliglutaminy i związanego z nim paraliżu w Caenorhabditis elegans

Aby zbadać związek między homeostazą białek, stresem i starzeniem się, monitorowaliśmy zmiany w fałdowaniu białek, śledząc dysfunkcję białek, lokalizację białek w komórce i stabilność białek na poziomie organizmu, komórkowym i białkowym, używając genetycznie wykonalnego metazoanu Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego do badania homeostazy białek w organizmie wielokomórkowym

Celem przedstawionej tutaj metody jest zbadanie agregacji białek podczas normalnego starzenia się w modelowym organizmie C. elegans. Protokół stanowi potężne narzędzie do badania wysoce nierozpuszczalnych dużych agregatów, które tworzą się wraz z wiekiem i do określenia, w jaki sposób zmiany w proteostazie wpływają na agregację białek.

Metody badania zmian w inherentnej agregacji białek wraz z wiekiem u Caenorhabditis elegans

Tutaj opisujemy metodę Replica Set, podejście do ilościowego pomiaru długości życia/przeżycia i zdrowia C. elegans w sposób wysoce wydajny i solidny, umożliwiając w ten sposób badanie wielu schorzeń bez poświęcania jakości danych. Protokół ten szczegółowo opisuje strategię i udostępnia narzędzie programowe do analizy danych zestawu replik.

Metoda zestawu replik: wysokoprzepustowe podejście do ilościowego pomiaru długości życia Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy protokół izolacji RNA, DNA i białka z tej samej próbki, w celu zmniejszenia zmienności, poprawy odtwarzalności i ułatwienia interpretacji.

Połączone ekstrakcje nukleotydów i białek w Caenorhabditis elegans

Tutaj charakteryzujemy komórkowe reakcje na stres proteotoksyczny u nicieni C. elegans, mierząc aktywację fluorescencyjnych reporterów transkrypcyjnych i oceniając wrażliwość na stres fizjologiczny.

Pomiary fizjologicznych reakcji na stres u C. elegans

Tutaj przedstawiamy i opisujemy nieradioaktywną i nieinwazyjną metodę oceny syntezy białek de novo in vivo, wykorzystując nicienie Caenorhabditis elegans i odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP). Metodę tę można połączyć z genetycznymi i/lub farmakologicznymi badaniami przesiewowymi w celu zidentyfikowania nowych modulatorów syntezy białek.

Ocena szybkości syntezy białek de novo w Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentowana jest metoda analizy kinetyki agregacji białek u nicieni Caenorhabditis elegans. Zwierzęta z populacji zsynchronizowanej pod względem wieku są obrazowane w różnych punktach czasowych, a następnie następuje półautomatyczne zliczanie inkluzji w CellProfiler i dopasowywanie do modelu matematycznego w AmyloFit.

Monitorowanie kinetyki agregacji białek in vivo przy użyciu automatycznego zliczania inkluzji u Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans służy jako doskonały system modelowy z solidnymi i tanimi metodami badania zdrowia, długości życia i odporności na stres.

Badanie tanich metod pomiaru długości życia i długości zdrowia u Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę kwantyfikacji spadku proteostazy w tkankach mięśniowych i neuronalnych u Caenorhabditis elegans za pomocą fluorescencyjnych reporterów poliglutaminowych. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów starzenia.

Kwantyfikacja swoistego dla tkanki spadku proteostazy u Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów