Kwantyfikacja swoistego dla tkanki spadku proteostazy u Caenorhabditis elegans

Zastosowanie specyficznej tkankowo ekspresji reportera fluorescencyjnego poliglutaminy u C. elegans jest znaczące, ponieważ pozwala na odkrycie i scharakteryzowanie regulatorów proteostazy w kontekście nienaruszonego organizmu wielokomórkowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia wizualizację i kwantyfikację związanego z wiekiem spadku proteostazy komórkowej in vivo, co jest niezbędne do uzyskania głębszego mechanistycznego wglądu w to, jak organizmy utrzymują prawidłowe fałdowanie i funkcję proteomu oraz skutki starzenia. Wyjaśnienie mechanizmów zdolnych do zachowania proteostazy ułatwi opracowanie ukierunkowanych interwencji w leczeniu chorób związanych ze starzeniem się, w których proteostaza jest zaburzona, oraz będzie promować zdrowe starzenie się.

Załamanie proteostazy jest ogromnym problemem klinicznym, ponieważ leży u podstaw rozwoju chorób związanych z nieprawidłowym fałdowaniem białek, w tym choroby Alzheimera, Parkinsona, choroby Huntingtona i stwardnienia zanikowego bocznego. Zacznij od użycia płytek Petriego o średnicy 6 centymetrów, aby przygotować pięć płytek agarowych dla każdego warunku testowego. Do eksperymentów z RNAi indukuj produkcję dsRNA w przekształconym HT115 E.coli i użyj agaru RNAi.

Użyj OP50 E.coli na standardowym agarze NGM do eksperymentów bez RNAi. Hoduj kultury E.coli przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 220 obr./min. Następnego dnia osadzać bakterie przez odwirowanie przy 2,400 G przez 15 do 20 minut, a następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w jednej dziesiątej początkowej objętości funta.

Podać 200 mikrolitrów skoncentrowanych bakterii na każdą płytkę i pozostawić otwarte płytki do wyschnięcia w czystym środowisku, aż cała ciecz zostanie wchłonięta. Aby zsynchronizować C.Elegans z podchlorynem, przemyj grawitacyjne hermafrodyty dwukrotnie buforem M9, a następnie przenieś je do świeżej probówki i inkubuj w 5 mililitrach roztworu podchlorynu przez pięć minut, potrząsając nimi co minutę. Po inkubacji należy odwirować zwierzęta i umyć je trzykrotnie buforem M9.

Pozwól zarodkom wykluć się w probówkach przez noc w 3 mililitrach roztworu M9 z rotacją w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Oblicz gęstość zwierząt L1, upuszczając trzykrotnie 10 mikrolitrów roztworu L1 na 6-centymetrową płytkę i licząc liczbę zwierząt L1. Okresowo mieszaj roztwory L1, aby zapobiec osiadaniu zwierząt.

Wysiewaj 50 L1 po jednym zwierzęciu na każdą płytkę, policz i zapisz liczbę wysianych, a następnie przenieś płytki do inkubatora o temperaturze 20 stopni Celsjusza. Alternatywnie, aby zsynchronizować zwierzęta poprzez składanie jaj, umieść od pięciu do dziesięciu młodych, ciężarnych dorosłych zwierząt na każdej płycie na cztery do sześciu godzin i pozwól im złożyć jaja, aż na talerzu będzie około 50 jaj. Usuń wszystkie dorosłe osobniki i przenieś płytki z jajami do inkubatora o temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Hoduj zwierzęta do etapu L4, który zajmie około 40 godzin w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 50 mikrolitrów 160 razy FUDR. Aby zmierzyć spadek proteostazy w tkance mięśniowej, wybierz 20 zwierząt i zamontuj je na szkiełku mikroskopowym z 3% podkładką agarozową i 5 mikrolitrami kropli 10-milimolowego azydku sodu.

Po unieruchomieniu wszystkich robaków wyobraź sobie całe ciała zwierząt za pomocą soczewki o 10-krotnym powiększeniu. Użyj filtra FITC lub YFP i takiej samej ekspozycji dla każdego zwierzęcia. Po zakończeniu wyrzuć slajdy.

Policz liczbę ognisk w mięśniach ściany ciała całego zwierzęcia. Ogniska to jaśniejsze sygnały punktowe, które można odróżnić od ciemniejszego sygnału rozpuszczalnego w tle. W dniach, w których odbywa się punktacja, spójrz na tabliczki ze zwierzętami i zapisz liczbę sparaliżowanych zwierząt, a następnie usuń sparaliżowane zwierzęta z talerza.

Po zakończeniu eksperymentu oblicz współczynnik paraliżu dla każdego stanu i wykreśl postęp paraliżu. Aby zmierzyć spadek proteostazy w tkance neuronalnej, zamontuj robaki na szkiełku, jak opisano wcześniej, i wykonaj zdjęcia głowy zwierząt w formacie Z na mikroskopie złożonym za pomocą soczewki o powiększeniu 40 razy. Wyrzuć slajdy po obrazowaniu.

Po uzyskaniu obrazów spłaszcz stosy Z i użyj ich do ilościowego określenia liczby ognisk w neuronach zlokalizowanych w obszarze pierścienia nerwowego. Wykreśl progresję akumulacji ognisk YFP od 4, 6, 8 i 10 dni. W drugim dniu dorosłości wybierz 10 zsynchronizowanych zwierząt z płytki i umieść je na 10-mikrolitrowej kropli buforu M9 na szkiełku mikroskopowym.

Powtórz ten krok co najmniej cztery razy, aby uzyskać próbkę 40 lub więcej zwierząt. Rejestruj ruchy zwierząt przez 30 sekund na mikroskopie stereoskopowym z kamerą obsługującą wideo. Po nagraniu wszystkich filmów ze zwierzętami do analizy odtwórz wideo i oceń zgięcia ciała każdego zwierzęcia.

Wykreśl liczbę zgięć ciała dla każdego zwierzęcia na wykresie kolumnowym, gdzie każda kropka reprezentuje liczbę zgięć ciała w ciągu 30 sekund na osi Y i różne warunki testowane na osi X. Model powtórzeń poliglutaminy odegrał zasadniczą rolę w identyfikacji genów regulujących sieć proteostatyczną. Specyficzna dla mięśni ekspresja polyQ-YFP powoduje akumulację ognisk fluorescencyjnych, które są łatwe do ilościowego określenia pod prostym fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym.

Zwierzęta zostają sparaliżowane w wieku średnim, ponieważ proteom w mięśniu zapada się z powodu proteotoksycznego działania reportera. Związany z wiekiem spadek proteostazy neuronów może być śledzony poprzez bezpośrednie ilościowe określenie tworzenia agregatów i spadku skoordynowanych zgięć ciała po umieszczeniu zwierząt w płynie. Metoda ta została wykorzystana do wykazania, że kinaza białkowa oddziałująca z domeną homeo, kofaktor transkrypcyjny, wpływa na proteostazę podczas starzenia się poprzez regulację ekspresji autofagii i molekularnych białek opiekuńczych.

Utrata HPK-1 zwiększa liczbę agregatów Q35-YFP, które gromadzą się podczas starzenia. Zwierzęta kontrolne wykazywały średnio 18 agregatów, podczas gdy zwierzęta z mutacją zerową HPK1 i RNAi z HPK1 wykazywały średnio odpowiednio 28 i 26 agregatów. Do ósmego dnia dorosłości od 77 do 78% zwierząt z niedoborem HPK1 było sparaliżowanych, w porównaniu z zaledwie 50% w grupie kontrolnej.

Ponadto wykazano, że nadekspresja HPK1 reguluje tworzenie agregatów białkowych i chroni starzejące się zwierzęta przed paraliżem związanym z Q35-YFP podczas starzenia. Ta metoda mierzy ogólny spadek proteomu w obrębie typu komórki. Istnieje wiele metod oceny zmian w określonych składnikach sieci gruczołu krokowego.

Razem tworzą one kompleksowy obraz. Pogarszająca się proteostaza jest cechą charakterystyczną starzenia się. Takie podejście pozwala naukowcom określić ilościowo ten spadek.

W połączeniu z analizą genetyczną jest to potężne narzędzie do odkrywania.