Name: Optyczna kwantyfikacja wewnątrzkomórkowego pH w nabłonku kanalików Malpighian Drosophila melanogaster z fluorescencyjnym genetycznie kodowanym wskaźnikiem pH (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Poznaj metodę optycznej kwantyfikacji wewnątrzkomórkowego pH w nabłonku kanalików Malpighian Drosophila melanogaster z wykorzystaniem fluorescencyjnego wskaźnika pHerry. Technika umożliwia ocenę transportu protonów w komórkach nabłonka in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIH DK092408 i DK100227 MFR. AJR był wspierany przez T32-DK007013. Autorzy pragną podziękować dr Julianowi A.T. Dowowi za akcje CapaR-GAL4 i c724-GAL4 Drosophila. Dziękujemy również Jacobowi B. Andersonowi za pomoc w utrzymaniu eksperymentalnych krzyżówek muchowych.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Powodzenie ilościowego oznaczania pHi w MT Drosophila zależy całkowicie od stanu wyekstrahowanych MT oraz jakości montażu i rozwarstwienia (ryc. A - C). Dlatego konieczne jest ostrożne obchodzenie się z tkanką zgodnie z opisem. Prowadnice świeżo pokryte powłoką PLL znacznie ułatwiają montaż MT, ponieważ są zwykle znacznie bardziej przyczepne niż prowadnice, które wcześniej były narażone na działanie roztworu. Staranny montaż pomoże również w identyfik...

Celem tego protokołu jest opisanie ilościowego oznaczania wewnątrzkomórkowego pH (pHi) za pomocą genetycznie kodowanego wskaźnika pH (GEpHI) i pokazanie, jak ta metoda może być wykorzystana do oceny podstawno-bocznego transportu H+ w modelowej strukturze nerkowej owada (D. melanogaster), kanaliku Malpighiego (MT). MT służą jako narządy wydalnicze muszki owocowej i są funkcjonalnie podobne do nefronu ssaków pod kilkoma kluczowymi względami1. MT są ułożone jako 2 pary kanalików (przedni i tylny) w klatce piersiowej i brzuchu muchy. Jednokomórkowa rurka nabłonkowa każdego MT składa się z metabolicznie aktywnych komórek głównych o wyraźnej polarności wierzchołkowej (luminalnej) i podstawno-bocznej (hemocoel), a także interkalowanych komórek gwiaździstych. Przednie MT składają się z 3 morfologicznie, funkcjonalnie i rozwojowo odrębnych segmentów, w szczególności początkowego segmentu rozszerzonego, segmentu przejściowego i głównego segmentu wydzielniczego, który łączy się z moczowodem2. W skali komórkowej transnabłonkowy transport jonów do światła odbywa się za pomocą wierzchołkowej błony plazmatycznej V-ATPase3 i wymiennika metalowo-alkalicznego/H+, a także podstawno-bocznego Na+-K+-ATPase4, kanałyxref">5, wymiennik Cl−/HCO3− sterowany Na+ (NDAE1)6 i Na+-K+-2Cl− kotransporter (NKCC; Ncc69)7, podczas gdy komórki gwiaździste pośredniczą w transporcie Cl- i wody8,9. Ten złożony, ale dostępny system fizjologiczny zapewnia doskonałe możliwości badania mechanizmów endogennego transportu jonów w połączeniu z różnorodnymi zestawami narzędzi genetycznych i behawioralnych Drosophila.
Uzasadnieniem dla tego protokołu było opisanie genetycznie plastycznego systemu do badania transportu jonów nabłonkowych z potencjałem integracji od komórki do zachowania i eksportu narzędzi do innych systemów modelowych. Wyrażenie pHerry10, GEpHI pochodzące z fuzji super-ekliptycznego pHhluorin11,12 (SEpH) i czerwonego pH-insensitive mCherry13, w MTs umożliwia ilościowe określenie transportu H+ w pojedynczych komórkach MT za pomocą techniki kalibracji o wysokiej zawartości K+/nigerycyny14. Ponieważ wiele transporterów jonów przenosi ekwiwalenty H+, kwantyfikacja wewnątrzkomórkowego pHi służy jako funkcjonalna reprezentacja ruchu jonów za pomocą różnych transporterów. System modelowy Drosophila MT oferuje również potężne narzędzia genetyczne w specyficznej dla tkanki transgene15 i interferencji RNA (RNAi)16, które można łączyć z obrazowaniem komórkowym i testami całego narządu17,18,19 funkcji kanalików, aby stworzyć solidny zestaw narzędzi z pionową integracją od cząsteczek do zachowania. Stoi to w sprzeczności z wieloma innymi protokołami oceny biologii nabłonka, ponieważ historycznie takie pomiary opierały się na skomplikowanej i zniechęcającej mikrosekcji, wyrafinowanych elektrodach jonoselektywnych20,21 i drogich barwnikach wrażliwych na pH22 z restrykcyjnymi wymaganiami dotyczącymi obciążenia i słabą swoistością komórkową w heterogenicznych tkankach. GEpHI były używane do szeroko zakrojonego pomiaru pHi w różnych typach komórek23. Wczesne prace wykorzystywały wrodzoną czułość pH białka zielonej fluorescencji (GFP) do monitorowania pHi w hodowanych komórkach nabłonkowych24, ale w ciągu ostatnich dwóch dekad GEpHI były stosowane w neuronach25, glia26, fungi27 i komórkach roślinnych28. Połączenie potencjału komórkowego celowania konstruktów genetycznych za pomocą systemu ekspresji GAL4/UAS15 oraz fizjologicznej dostępności Drosophila MT sprawia, że jest to idealne przygotowanie do badań nad regulacją pHi i nabłonkowym transportem jonów.
Regulacja pHi jest badana od dziesięcioleci i jest niezbędna do życia. Preparat MT oferuje solidny model do nauczania fizjologii regulacji pHi, ale także do wykonywania zaawansowanych badań regulacji pHi ex vivo i in vivo. Protokół ten opisuje kwantyfikację ruchu H+ przez błonę podstawno-boczną komórek nabłonkowych Drosophila MT przy użyciu techniki ładowania kwasem pulsacyjnym NH4Cl21, ale ponieważ wskaźnik pH jest kodowany genetycznie, metody te i ich ramy teoretyczne mogą być stosowane do dowolnego preparatu podatnego na transgenezę i obrazowanie na żywo.

<table><tbody><tr><td>Roztwór poli-L-lizyny (PLL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4832</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C, może być ponownie użyty.</td></tr><tr><td>Nigericin Sodium Salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143</td><td>UWAGA: Obnosić się w rękawiczkach. Przechowywać jako podwielokrotności 20 mM roztworu podstawowego w DMSO w temperaturze 4 °C.</td></tr><tr><td>Klejone pokrywy komór perfuzyjnych, rozmiar kleju 1 mm, średnica i grubość komory 9 mm i razy 0,9 mm, średnica portów 1,5 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GBL622105</td><td>Można zastąpić w razie potrzeby, aby dopasować do systemu perfuzyjnego.</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>Kleje Ellsworth</td><td>184 SIL ELAST KIT 0,5 KG</td><td>Dostępne u wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Pomocne dłonie Stojaki lutownicze</td><td>Narzędzia do frachtu portowego</td><td>60501</td><td>Dostępne u wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Otwarty grawitacyjny system perfuzyjny ze sterownikiem zaworu, kolektorem 8 do 1 i rezerwatorami</td><td>Bioscience Tools</td><td>PS-8S</td><td>Można zastosować dowolny porównywalny system perfuzyjny.</td></tr><tr><td>Regulator przepływu</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0221</td><td>Może być zastąpiony w razie potrzeby w celu dopasowania do systemu perfuzyjnego.</td></tr><tr><td>Schneider's Medium</td><td>Fisher Scientific 21720024</td><td></td><td>Store pod adresem 4 &deg; C w sterylnych podwielokrotnościach.</td></tr><tr><td>#5 Kleszcze ze stali nierdzewnej</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>Można zastąpić w zależności od komfortu eksperymentatora.</td></tr><tr><td>35 x 10 mm polistyrenowa szalka Petriego</td><td>Corning Life Sciences</td><td>Fisher Scientific 08-757-100A</td><td>Dokładna marka i rozmiar nie mają znaczenia.</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe 75 x 25 mm</td><td>Corning Life Sciences</td><td>2949-75X25</td><td>Dokładna marka i rozmiar mogą się różnić, o ile studzienki perfuzyjne są kompatybilne.</td></tr><tr><td>Filimentowane borokrzemianowe szkło kapilarne, ID 1,5 mm, OD 0,86 mm, grubość 0,32 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0796</td><td>Filiment nie jest konieczny, szkło można zastąpić w celu dopasowania do rurki perfuzyjnej i studzienek perfuzyjnych.</td></tr><tr><td>Rurka Tygon, ID 1/16", OD 1/8", grubość 1/32"</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-171-129</td><td>Dostępne u wielu dostawców, mogą być zastąpione w celu dopasowania do systemu perfuzji.</td></tr><tr><td>Próżniowy smar silikonowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273554</td><td>dostępny u wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Plastikowy zacisk kontroli przepływu</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-869</td><td>Dostępne u wielu dostawców, sterylność nie jest wymagana</td></tr><tr><td>Pręty szklane, średnica 5 mm</td><td>delphiglass.com</td><td>9198</td><td>Dokładny rozmiar to osobiste preferencje, dostępnych jest wielu dostawców</td></tr><tr><td>Długopis hydrofobowy PAP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821</td><td>Dostępne u wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Folia uszczelniająca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7668</td><td>Dostępna u wielu dostawców.</td></tr><tr><td>15 ml probówka Falcon</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>Dostępne u wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Probówka Falcon 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>Dostępne u wielu dostawców.</td></tr><tr><td>HEPES; Kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Dostępne u wielu dostawców.</td></tr><tr><td>MES; Kwas 4-morpholineethanosulfonowy monohydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69892</td><td>Dostępne u wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Zawory; Kwas N-[tris(hydroksymetylo)metylo]-3-aminopropanosulfonowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5130</td><td>Dostępne u wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Obiektyw powietrzny 10X/0,45</td><td>Zeiss</td><td>000000-1063-139</td><td>Można zastąpić porównywalne obiektywy. Obiektywy 40X mogą być używane do obrazowania pojedynczych komórek.</td></tr><tr><td>Stereoskop preparacyjny</td><td>Zeiss</td><td>Discovery.V8</td><td>Można użyć dowolnego stereoskopu preparacyjnego.</td></tr><tr><td>Transgeniczny Drosophila melagnogaster</td><td>Dostępne w Romero Lab</td><td></td><td>Po raz pierwszy opublikowano: Cytat 10</td></tr><tr><td>Linia sterownika capaR-GAL4 Drosophila melagnogaster</td><td>Dostępne w Romero Lab</td><td></td><td>Po raz pierwszy opublikowane: Cytat 32</td></tr><tr><td>linia sterownika c724-GAL4 Drosophila melagnogaster</td><td>Dostępne w Romero Lab</td><td></td><td>Po raz pierwszy opublikowane: Cytat 2</td></tr><tr><td>Monochromatyczny aparat cyfrowy o wysokiej czułości</td><td>Zeiss</td><td>Axiocam 506 mono</td><td>Dokładna marka i model mogą się różnić, można je zastąpić dowolnym monochromatycznym aparatem o wysokiej czułości przystosowanym do obrazowania komórkowego na żywo.</td></tr><tr><td>Zestaw filtrów GFP/FITC, np. 470/40 nm, długoprzepustowy em. 515 nm., dichroiczny 500 nm</td><td>Chroma</td><td>CZ909</td><td>Można wymienić dowolny zestaw filtrów GFP/FITC.</td></tr><tr><td>Zestaw filtrów RFP/TRITC, np. 546/10 nm, 590 nm długoprzepustowy em., 565 nm dichroiczny</td><td>Chroma</td><td>CZ915</td><td>Można zastąpić dowolny zestaw filtrów GFP/FITC.</td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop epifluescencyjny</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer Z.1</td><td>Można użyć dowolnego porównywalnego mikroskopu z silnikowym przełączaniem filtrów. Mikroskopy pionowe mogą być używane z otwartymi kąpielami perfuzyjnymi i obiektywami zanurzonymi w wodzie.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy statystycznej</td><td>Microcal</td><td>Origin 6.0</td><td>Można zastąpić dowolnym oprogramowaniem o porównywalnej funkcjonalności</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td><td>National Institutes of Health</td><td>ImageJ 1.50i</td><td>Można zastąpić dowolnym oprogramowaniem o porównywalnej funkcjonalności</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji obrazu</td><td>Zeiss</td><td>Zen 1.1.2.0</td><td>Można zastąpić</td></tr> <tr><td>dowolnym oprogramowaniem o porównywalnej funkcjonalnościJednosieczna żyletka ze stali węglowej</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>71960</td><td>Dostępne u wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Teczka na szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-04</td><td>Dostępne u wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Palnik Bunsena</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-110-1231</td><td>Dostępne u wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Polystrene Drosophila Fiolki do hodowli z Flugs</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-109BF</td><td>Porównywalne produkty można zastąpić.</td></tr><tr><td>Laboratoryjne wiadro na lód 2,5 l</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-129</td><td>Dostępne u wielu dostawców.</td></tr><tr><td>NMDG; N-metylo-D-glukamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>Dostępne u wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Barierowe końcówki do pipet 200 μ</td><td>MidSci</td><td>AV200</td><td>Dostępne u wielu dostawców.</td></tr><tr><td>200 &#956; L Pipeta o zmiennej objętości</td><td>Gilson Incorporated</td><td>PIPETMAN P200</td><td>Dostępne u wielu dostawców.</td></tr></tbody></table>

optyczna kwantyfikacja wewnątrzkomórkowego ph w nabłonku kanalików malpighian drosophila melanogaster z fluorescencyjnym genetycznie kodowanym wskaźnikiem ph

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Nabłonkowy transport jonów jest niezbędny dla systemowej homeostazy jonów, jak również utrzymania niezbędnych komórkowych gradientów elektrochemicznych. Na pH wewnątrzkomórkowe (pHi) wpływa wiele transporterów jonów, dlatego monitorowanie pHi jest użytecznym narzędziem do oceny aktywności transportera. Nowoczesne genetycznie kodowane wskaźniki pH (GEpHI) zapewniają optyczną ocenę ilościową pHi w nienaruszonych komórkach w skali komórkowej i subkomórkowej. Protokół ten opisuje ilościowe oznaczanie w czasie rzeczywistym komórkowej regulacji pHi w kanalikach Malpighiego (MT) Drosophila melanogaster poprzez obrazowanie ex vivo na żywo pHerry, pseudoratiometrycznego GEpHI z pKdobrze nadającym się do śledzenia zmian pH w cytozolu. Wyekstrahowane dorosłe muchy MT składają się z morfologicznie i funkcjonalnie odrębnych odcinków nabłonka warstwy jednokomórkowej i mogą służyć jako dostępny i genetycznie wykonalny model do badania transportu nabłonkowego. GEpHI mają kilka zalet w porównaniu z konwencjonalnymi barwnikami fluorescencyjnymi wrażliwymi na pH i elektrodami jonoselektywnymi. GEpHI mogą znakować odrębne populacje komórek, pod warunkiem, że dostępne są odpowiednie elementy promotorowe. Oznakowanie to jest szczególnie przydatne w przypadku preparatów ex vivo, in vivo i in situ, które są z natury niejednorodne. GEpHI umożliwiają również ilościowe oznaczanie pHi w nienaruszonych tkankach w czasie bez konieczności wielokrotnego leczenia barwnikiem lub eksternalizacji tkanek. Podstawową wadą obecnych GEpHI jest tendencja do agregacji inkluzji cytozolowych w odpowiedzi na uszkodzenie tkanek i konstruowanie nadekspresji. Te niedociągnięcia, ich rozwiązania i nieodłączne zalety GEpHI zostały wykazane w tym protokole poprzez ocenę bazolateralnego transportu protonów (H+) w funkcjonalnie odrębnych komórkach głównych i gwiaździstych wyekstrahowanych MT much. Opisane techniki i analizy można łatwo dostosować do szerokiej gamy preparatów dla kręgowców i bezkręgowców, a wyrafinowanie testu można skalować od laboratoriów dydaktycznych do skomplikowanego określania strumienia jonów za pomocą określonych transporterów.

Zdrowe tkanki i prawidłowa identyfikacja przednich MT są kluczowe dla powodzenia tego protokołu. Podczas sekcji należy zachować ostrożność, aby nie dotykać bezpośrednio MT, a manipulować nimi wyłącznie za pomocą mocznika, ponieważ bezpośrednie chwyytanie MT doprowadzi do ich uszkodzenia (Ryc. 4A - B). Podczas rozkładania MT na szkiełku przedmiotowym, należy jak najmniej dotykać kanalików i unikać nadmiernych ruchów, gdyż może...

Komórkowy transport jonów często można ocenić poprzez monitorowanie wewnątrzkomórkowego pH (pHi). Genetycznie kodowane wskaźniki pH (GEpHIs) zapewniają optyczną kwantyfikację wewnątrzkomórkowego pH w nienaruszonych komórkach. Protokół ten szczegółowo opisuje ilościowe oznaczanie wewnątrzkomórkowego pH za pomocą komórkowego obrazowania na żywo ex vivo kanalików Malpighiego Drosophila melanogaster z pHerry, pseudoratiometrycznym genetycznie kodowanym wskaźnikiem pH.

Optyczna kwantyfikacja wewnątrzkomórkowego pH w nabłonku kanalików Malpighian Drosophila melanogaster z fluorescencyjnym genetycznie kodowanym wskaźnikiem pH

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu obrazowania jest opis ilościowego oznaczania pH wewnątrzkomórkowego przy użyciu genetycznie kodowanego wskaźnika pH oraz zademonstrowanie, w jaki sposób metoda ta może być wykorzystana do oceny bazolateralnego transportu protonów w modelu struktury nerkowej owada, jakim są cewki Malpighiego. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny transportu komórkowego, takie jak wpływ konkretnych białek transportowych na ruch protonów w nabłonku podczas regulacji pH wewnątrzkomórkowego. Główną zaletą tej techniki jest możliwość szybkiej i łatwej oceny transportu komórkowego w wielu funkcjonalnie odrębnych strefach nienaruszonego nabłonka.Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat regulacji pH i nabłonka owadów, można ją również zastosować w innych układach, takich jak nefron ssaków oraz hodowle komórek nabłonkowych. Aby rozpocząć procedurę, umieść dwa zestawy pomocego lutowniczego z zaciskami na stoliku mikroskopu obrazującego, tak aby jeden zacisk znajdował się po każdej stronie. Następnie włóż odpowiednie zgięte kapilary szklane oraz linię dopływową i linię odpływową podłączoną do pompy próżniowej.Następnie zamocuj je w uchwycie pomocniczym i wyrównaj z platformą obrazującą mikroskopu. Nałóż smar próżniowy na taśmę sufitową i dociśnij do niej klejący dzielnik studni perfuzyjnej, aby pokryć jego dno smarem. Odklej dzielnik studni perfuzyjnej i umieść go stroną natłuszczoną do dołu na szkiełku pokrytym poli-L-lizyną.Następnie należy usunąć przegrodę studzienki perfuzyjnej, pozostawiając poszczególne, konkretne studzienki obrysowane smarem hydrofobowym. Po tym czasie do wysmarowanej i okrągłej studzienki na szkiełku pokrytym poli-L-lizyną należy nalać 200 µL IPBS lub soli fosforanowej buforu dla owadów o temperaturze pokojowej. Następnie szkiełko należy umieścić pod stereomikroskopem, wlać lodowate medium Schneidera do naczynia sekcyjnego i przenieść do niego jedną znieczuloną samicę muchy.Przytrzymaj muchę za przedplecze za pomocą jednej pęsety, a drugą delikatnie uchwyć tylną część odwłoka. Rozchyl tylny koniec muchy krótkimi, zdecydowanymi ruchami. Po odsłonięciu tylnej osłony uchwyć jej dystalny koniec i uwolnij jelito oraz antesty z leżących pod nimi tchawików, odciągając tylną osłonę od ciała za pomocą powtarzalnych, krótkich pociągnięć.Następnie, gdy druga para przednich końców moczowodów zostanie uwolniona z jamy brzusznej, odciśnij przednie końce moczowodów za pomocą cienkich pincet. Podnieś wolne przednie końce moczowodów za pomocą szklanego pręta, wsunąwszy go pod moczowód w taki sposób, aby cewki opadły na obie strony. Następnie unieś końce moczowodów pionowo w górę, wyjmując je z roztworu, a następnie obróć szklany pręt tak, aby końce moczowodów i moczowód przylgnęły do jego dolnej strony.Opuść moczowód pionowo w dół na szkiełko, a następnie przymocuj go i uszczelnij końce dystalne, dociskając moczowód do szkiełka przedmiotowego. Używając cienkiego końca szklanej rurki, delikatnie przesuń każdą cewkę po powierzchni szkiełka. Przesuwaj rurkę tuż nad powierzchnią szkiełka, aby uniknąć zmiażdżenia cewki, prowadząc ją nad wierzchołkiem cewki od strony dystalnej do proksymalnej, aby przymocować całą długość każdej cewki do powierzchni szkiełka powleczonego poli-L-lizyną.Sukces tej techniki zależy całkowicie od dokładnej identyfikacji i ostrożnego obchodzenia się z przednimi cewkami malpighiego. Uszkodzone cewki doprowadzą do niespójnych wyników. Następnie należy ponownie umieścić na szkiełku dzielnik studzienki do perfuzji z klejem, aby utworzyć nad zamocowaną cewką małą, wypełnioną cieczą studzienkę.Następnie umieść preparat na stole mikroskopu. Ustaw kapilary doprowadzającą i odprowadzającą odpowiednio nad otworem wlotowym i wylotowym komory perfuzyjnej. W tej procedurze włącz mikroskop, źródło światła oraz system obrazowania, a następnie otwórz oprogramowanie do obrazowania.Patrząc przez okulary, ręcznie dostrój ostrość, aż światło tętnicy zostanie wyraźnie widoczne w świetle przechodzącym. Następnie kliknij zakładkę akwizycji i wybierz wartość 2x2 z menu rozwijanego przyciemniania w sekcji obciążenia akwizycji. Wstaw filtr neutralnej gęstości 5% do toru optycznego, aby zmniejszyć natężenie światła iluminacyjnego i zminimalizować fotoblaknięcie.Kliknij kanał GFP w menu kanałów, a następnie kliknij „live”, aby obserwować sygnał fluorescencyjny za pomocą kamery. Następnie przesuń suwak czasu, aby ustawić czas ekspozycji w taki sposób, aby najjaśniejsze wartości pikseli w histogramie intensywności wynosiły około 40% wartości maksymalnej. Następnie kliknij „stop”, aby zakończyć oświetlanie.Powtórz procedury w kanale RFP i potwierdź obecność rozszerzonego segmentu początkowego przedniego przedjelita oraz brak agregatów cytosolid m cherry, co wskazywałoby na uszkodzenie tkanki lub nadekspresję. Następnie włącz protokół obrazowania timelapse, zaznaczając pole wyboru serii czasowej. W sekcji serii czasowej w menu rozwijanym ustaw czas trwania na 10 minutes, a suwak interwału na zero, aby ustawić całkowity czas przechwytywania z maksymalną akwizycją obrazu.Następnie zaznacz pola GFP oraz RFP w sekcji kanałów. Otwórz linię IPBS systemu perfuzyjnego, aktywując odpowiedni sterownik zaworu, i rozpocznij protokół obrazowania, klikając przycisk start experiment. Po jednej minucie przełącz na roztwór końcowy z chlorkiem amonu na 20 sekund, otwierając odpowiedni zawór i zamykając linię IPBS.Następnie powróć do IPBS, zamykając linię z chlorkiem amonu i ponownie otwierając zawór IPBS. Aby przeprowadzić kalibrację dwupunktową, usuń przegrodę do dołków, odrywając ją od znajdującego się pod nią szkiełka, a następnie wyjmij kapilary perfuzyjne w zaciskach z dołka obrazowania. Po tym kroku nanieś 200 µL buforu kalibracyjnego IPBS o pH 7.4.Następnie należy usunąć roztwór z dołka obrazującego i zastąpić go kolejnymi 200 µL roztworu kalibracyjnego. Proces ten należy powtórzyć cztery razy, aby zapewnić całkowitą wymianę roztworu. Następnie preparat i roztwór kalibracyjny należy inkubować przez 30 minut przed obrazowaniem.Powtórz protokół obrazowania, stosując te same parametry określone wcześniej, z modyfikacją ograniczającą czas akwizycji obrazu do jednej minuty. Następnie dodaj 200 µL buforu kalibracyjnego IPBS o pH 9. Usuń roztwór z dołka obrazowania i zastąp go kolejnymi 200 µL roztworu kalibracyjnego.Następnie inkubować preparat w drugim roztworze kalibracyjnym przez 10 minut przed obrazowaniem, a następnie powtórzyć protokół obrazowania. Po tym czasie przejrzeć stos obrazów w oprogramowaniu do analizy obrazu, aby potwierdzić, klikając MeanROI, że żadne piksele w żadnym z kanałów nie są nasycone oraz że żadne wartości w histogramie intensywności nie osiągnęły maksymalnej wartości wykrywalnej, przesuwając suwak klatek przez stos obrazów. Następnie przeanalizować stos obrazów, wykreślając intensywność fluorescencji i stosunek fluorescencji jako funkcję czasu; tutaj widzimy oczekiwaną odpowiedź fluorescencyjną na impuls chlorku amonu w kanałach wskaźnika wrażliwym na pH i niewrażliwym na pH.Stosunek tych sygnałów ujawnia przejściowe zmiany pH wewnątrzkomórkowego. Aby przeprowadzić tę analizę, najpierw kliknij meanROI i wybierz narzędzie wolnej formy. Przytrzymaj lewy przycisk myszy, aby obrysować MT o rozmiarze 50 µm, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zakończyć rysowanie ROI.Następnie powtórz tę czynność w obszarze sąsiadującym z MT, aby zdefiniować ROI tła. Dalej, w sekcji pomiarów kliknij mean intensity, a następnie utwórz tabelę wartości intensywności, klikając export, data table, create. Kliknij ikonę koła zębatego konfiguracji i odznacz wszystkie parametry z wyjątkiem time oraz mean intensity.Kliknij prawym przyciskiem myszy kartę nowo utworzonej tabeli danych, wybierz opcję zapisz jako i wyeksportuj dane do pliku csv. Przedstawiony tutaj obraz to obraz w szerokim polu, obrazująca fluorescencję super-eliptyczną w komórkach zasadniczych przedniej części przedsionka oraz komórkach gwiaździstych przedniej części przedsionka. Należy zauważyć, że komórki gwiaździste mają kształt pręcikowy w segmencie początkowym, kształt zmienny w segmencie przejściowym i wykazują wyraźne wypustki komórkowe w segmencie głównym.Wykres ten przedstawia skalibrowane zmiany wewnątrzkomórkowego pH w odpowiedzi na 20-sekundowy impuls 40 milimolowego chlorku amonu w obszarach zainteresowania. Linie przerywane oznaczają dopasowania jednowykładnicze zastosowane do fazy regeneracji kwasowej po usunięciu chlorku amonu. Na ich podstawie wyznaczono wartości stałych zaniku.Ten wykres przedstawia szybkość ekstruzji kwasu w funkcji wewnątrzkomórkowego pH, a ten wykres przedstawia strumień kwasu w funkcji wewnątrzkomórkowego pH, wyznaczone na podstawie dopasowań wykładniczych z poprzedniej ryciny. Po opanowaniu techniki, ekstrakcja cewek malpighiego może zostać przeprowadzona w ciągu 10 minut, pod warunkiem właściwego wykonania procedury. Podczas próby realizacji tej procedury należy pamiętać, że sukces zależy całkowicie od jakości sekcji oraz dokładnej kalibracji wskaźnika pH.Tę preparację można połączyć z innymi genetycznie kodowanymi biosensorami, takimi jak fluorescencyjne wskaźniki wapnia i halogenków, aby badać ruch substancji rozpuszczonych i sygnalizację wewnątrzkomórkową w komórkach nabłonkowych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat tego, jak przygotować zdrowe cewki Malpighiego muszki owocówki drosophila, obrazować genetycznie kodowany wskaźnik pH oraz ilościowo określać ruch protonów w komórkach nabłonkowych. Należy pamiętać, że praca z nitroizenenem może być niebezpieczna i może uszkodzić preparaty, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zachować środki ostrożności, aby nie doprowadzić do zanieczyszczenia sprzętu przeznaczonego do ponownego użycia.

optical-quantification-intracellular-ph-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Ten artykuł opisuje sekcję przednich kanalików Malpighiego (MT) od samicy muchy Drosophila oraz przykładowy protokół od Rossano et al. (2017), w którym MT są przygotowywane do obrazowania na żywo w komorze perfuzyjnej.

Wycięcie kanalików Malpighiego od dorosłej muchy: izolowanie narządu osmoregulacyjnego i wydalniczego

Ten film demonstruje test in vivo przeznaczony do pomiaru fagocytozy bakteryjnej u dorosłych muszek Drosophila. Po wstrzyknięciu fluorescencyjnie znakowanych bakterii do brzucha dorosłych muszek, hemocyty związane z naczyniem grzbietowym angażują się w fagocytozę. Wprowadzenie barwnika błękitu trypanowego służy wygaszeniu fluorescencji emitowanej przez zewnątrzkomórkowe, niefagocytozowane bakterie. Ten proces wygaszania poprawia identyfikację bakterii fagocytozowanych, gdy są obserwowane pod...

Test in vivo do ilościowego określenia fagocytozy bakteryjnej u dorosłych much Drosophila

Źródło: Wagner, K.  i inni., Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila przy użyciu białek znakowanych eGFP. J. Vis. Exp. (2022). Ten film przedstawia wizualizację transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorów Drosophila przy użyciu białek TRPL znakowanych eGFP. Szczegółowo opisano w nim przygotowanie transgenicznych muszek do obrazowania, przechwytywanie obrazów fluorescencyjnych komórek fotoreceptorowych oraz ilościowe określenie transportu TRPL...

Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila

Znakowanie domeny zewnątrzkomórkowej białka błonowego za pomocą wrażliwego na pH fluoroforu, superekliptycznej pHluoryny (SEP), pozwala na określenie subkomórkowej lokalizacji, ekspresji i transportu. Obrazowanie białek znakowanych SEP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) umożliwia ilościowe określenie poziomów białek w obwodowej ER i błonie plazmatycznej.

Wykorzystanie receptorów znakowanych pHluoryną do monitorowania lokalizacji subkomórkowej i transportu

Zapisy całokomórkowe z fotoreceptorów Drosophila melanogaster umożliwiają pomiar spontanicznych ciemnych guzków, wybrzuszeń kwantowych, makroskopowych reakcji na światło i zależności prąd-napięcie w różnych warunkach. W połączeniu z narzędziami manipulacji genetycznej D. melanogaster, metoda ta umożliwia badanie wszechobecnego szlaku sygnałowego inozytol-lipid i jego celu, czyli kanału TRP.

Metoda elektrofizjologiczna dla zapisów cęgów napięcia w całej komórce z fotoreceptorów Drosophila

Udostępniamy protokół obrazowania wewnątrzkomórkowego pH linii nabłonkowych komórek macierzystych w żywej tkance jajnika Drosophila. Opisujemy metody generowania transgenicznych muszek wykazujących ekspresję biosensora pH, mCherry::p Hluorin, obrazowania biosensora za pomocą ilościowego obrazowania fluorescencyjnego, generowania krzywych standardowych i konwersji wartości intensywności fluorescencji na wartości pH.

Metody obrazowania wewnątrzkomórkowego pH linii komórek macierzystych pęcherzyka w żywej tkance jajnika Drosophila

Ten protokół opisuje test fagocytozy in vivo u dorosłych Drosophila melanogaster w celu ilościowego określenia rozpoznawania fagocytów i usuwania infekcji mikrobiologicznych.

Ocena komórkowej odpowiedzi immunologicznej muszki owocowej, Drosophila melanogaster, przy użyciu testu fagocytozy in vivo

We wczesnym zarodku Drosophila wiele organelli jest ruchliwych. Zasadniczo można je obrazować na żywo za pomocą specjalnych sond fluorescencyjnych, ale skorupka jaja uniemożliwia bezpośrednie zastosowanie do zarodka. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wprowadzić takie sondy za pomocą mikroiniekcji, a następnie analizować ruch organelli masowych za pomocą prędkości obrazu cząstek.

Wizualizacja zależnego od cytoszkieletu transportu organelli zawierających lipidy w zarodkach Drosophila

Tutaj opisano nieinwazyjne metody lokalizacji białek błony fotoreceptorowej i oceny zwyrodnienia siatkówki w oku złożonym Drosophila za pomocą fluorescencji eGFP.

Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila przy użyciu białek znakowanych eGFP

Ten protokół opisuje spersonalizowane znakowanie fluorescencyjne oparte na przeciwciałach i wstrzykiwanie do wczesnych zarodków Drosophila, aby umożliwić obrazowanie na żywo białek o niskiej obfitości lub modyfikacji potranslacyjnych, które są trudne do wykrycia przy użyciu tradycyjnych metod GFP/mCherry-tag.

Wizualizacja białek o niskiej liczebności i modyfikacji potranslacyjnych w żywych zarodkach Drosophila poprzez wstrzyknięcie przeciwciał fluorescencyjnych

Poznaj metodę optycznej kwantyfikacji wewnątrzkomórkowego pH w nabłonku kanalików Malpighian Drosophila melanogaster z wykorzystaniem fluorescencyjnego wskaźnika pHerry. Technika umożliwia ocenę transportu protonów w komórkach nabłonka in vivo.

Optyczna kwantyfikacja wewnątrzkomórkowego pH w nabłonku kanalików Malpighian Drosophila melanogaster z fluorescencyjnym genetycznie kodowanym wskaźnikiem pH (Wideo) | JoVE Journal

Optyczna kwantyfikacja wewnątrzkomórkowego pH w nabłonku kanalików Malpighian Drosophila melanogaster z fluorescencyjnym genetycznie kodowanym wskaźnikiem pH

Przeglądaj więcej filmów