Optyczna kwantyfikacja wewnątrzkomórkowego pH w nabłonku kanalików Malpighian Drosophila melanogaster z fluorescencyjnym genetycznie kodowanym wskaźnikiem pH

Ogólnym celem tego protokołu obrazowania jest opisanie kwantyfikacji wewnątrzkomórkowego pH przy użyciu genetycznie kodowanego wskaźnika pH i pokazanie, w jaki sposób można wykorzystać tę metodę do oceny podstawno-bocznego transportu protonów w modelu struktury nerkowej owadów, kanaliku malpighiego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie transportu komórkowego, takie jak to, w jaki sposób specyficzne białka transportowe przyczyniają się do ruchu protonów nabłonka w wewnątrzkomórkowej regulacji pH. Główną zaletą tej techniki jest to, że transport komórkowy można szybko i łatwo ocenić w wielu funkcjonalnie odrębnych strefach nienaruszonego nabłonka.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w regulację pH i nabłonek owadów, można ją również zastosować do innych systemów, takich jak nefron ssaków i komórki nabłonkowe w hodowli. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść dwa zestawy zacisków pomocnych do na stoliku mikroskopu obrazowania, po jednym zacisku z każdej strony. Następnie włóż odpowiednie kapilary z giętego szkła i przewód dopływowy oraz przewód odpływowy podłączony do próżni.

Następnie zamontuj go w pomocnych dłoniach i wyrównaj je ze stolikiem obrazowania mikroskopu. Rozprowadź smar próżniowy na taśmie sufitowej i dociśnij dobrze przyklejoną rozdzielacz do taśmy, aby pokryć spód smarem. Zdejmij dobrze rozdzielacz perfuzyjny kleju i umieść go smarem do dołu, na szkiełku pokrytym polilizyną.

Następnie usuń przegrodę studzienki perfuzyjnej, aby pozostawić poszczególne specyficzne studzienki narysowane w smarze hydrofobowym. Następnie umieść 200 mikrolitrów IPBS o temperaturze pokojowej lub soli fizjologicznej z buforem fosforanowym owadów w natłuszczonym i dobrze zakreślonym kółku na szkiełku pokrytym polilizyną. Następnie umieść szkiełko pod steroskopem, wlej lodowatą pożywkę Schneidera do naczynia preparacyjnego i przenieś do niego pojedynczą znieczuloną samicę muchy.

Przytrzymaj muchę za klatkę piersiową za pomocą zestawu kleszczy, a drugim delikatnie chwyć tylną część brzucha. Otwórz tylny koniec muchy krótkimi, celowymi ruchami. Gdy tylna osłona jest widoczna, chwyć dystalny koniec i uwolnij jelito i antes z leżących poniżej tchawicy, odciągając tylną osłonę od ciała poprzez powtarzające się krótkie szarpnięcia.

Następnie uszczypnij przednie ante moczowodu drobnymi kleszczami, gdy drugi zestaw antes jest wolny od brzucha. Podnieś wolne ante przednie za pomocą szklanego pręta słupowego, wsuwając pręt pod moczowód, tak aby kanaliki opadły na dowolną stronę. Następnie podnieś ante prosto do góry, wyjmij z roztworu, a następnie obróć szklany pręt tak, aby antes i moczowód przylegały do spodu pręta.

Opuść moczowód prosto w dół na szkiełko, a następnie przymocuj moczowód i uszczelnij dystalne końce antesów, dalej dociskając moczowód do szkiełka. Użyj cienkiego końca szklanego pręta, aby delikatnie przesunąć każdą rurkę po powierzchni szkiełka. Opasuj pręt o szkiełko, aby uniknąć zmiażdżenia kanalika i przesuń pręt przez górną część kanalika, przesuwając się od dystalnego do bliższego, aby przymocować całą długość każdej rurki do powierzchni szkiełka pokrytego polilizyną.

Powodzenie tej techniki zależy całkowicie od dokładnej identyfikacji i ostrożnego obchodzenia się z kanalikami malpighiego przedniego. Uszkodzone kanaliki będą dawać niespójne wyniki. Następnie umieść rozdzielacz studni z klejem z powrotem na szkiełku, aby utworzyć mały płyn dobrze wypełniony nad zamontowaną rurką.

Następnie umieść próbkę na stoliku mikroskopu. Umieść kapilary wlotowe i odpływowe odpowiednio nad otworem wlotowym i wylotowym studni obfitości. W tej procedurze włącz mikroskop, źródło światła i system obrazowania, a następnie otwórz oprogramowanie do obrazowania.

Spójrz przez okulary i ręcznie wyreguluj ostrość, aż światło antes będzie wyraźnie widoczne w przechodzącym świetle. Następnie kliknij kartę akwizycji i wybierz 2x2 z menu rozwijanego ściemniania, w sekcji obciążenia akwizycji. Włóż filtr o neutralnej gęstości 5% do ścieżki światła, aby zmniejszyć światło świetlne i zminimalizować wybielanie zdjęć.

Kliknij kanał GFP w menu kanałów, a następnie kliknij na żywo, aby obserwować sygnał fluorescencyjny za pomocą kamery. Następnie wyreguluj suwak czasu, aby ustawić czas ekspozycji, tak aby najjaśniejsze wartości pikseli w histogramie intensywności wynosiły około 40% wartości maksymalnej. Następnie kliknij stop, aby zatrzymać podświetlenie.

Powtórz procedury w kanale RFP i potwierdź obecność poszerzonego początkowego odcinka przedniego ante oraz brak cytostałych agregatów wiśniowych m, co wskazuje na uszkodzenie tkanki lub nadmierną ekspresję. Następnie włącz protokół obrazowania poklatkowego, klikając pole wyboru szeregów czasowych. Dostosuj czas trwania w menu rozwijanym, w sekcji szeregów czasowych na 10 minut, a suwak interwału na zero, aby ustawić całkowity czas przechwytywania z maksymalną akwizycją obrazu.

Następnie zaznacz zarówno pola GFP, jak i RFP w sekcji kanału. Otwórz linię IPBS systemu profuzji aktywując odpowiedni sterownik zaworu i uruchom protokół obrazowania, klikając, rozpocznij eksperyment. Po minucie przełączyć na roztwór końcowy chlorku amonu na 20 sekund, otwierając odpowiedni zawór i zamykając przewód IPBS.

Następnie wróć do IPBS, zamykając przewód chlorku amonu i ponownie otwierając zawór IPBS. Aby przeprowadzić kalibrację dwupunktową, usuń przegrodę studzienki, odrywając ją od leżącego poniżej szkiełka i usuń naczynia włosowate w zaciskach z dołka obrazowania. Następnie nałóż 200 mikrolitrów buforu kalibracyjnego IPBS do pH 7,4.

Następnie usuń roztwór ze studzienki obrazowej i zastąp go kolejnymi 200 mikrolitrami roztworu kalibracyjnego. Powtórz ten proces cztery razy, aby zapewnić pełną wymianę roztworu. Następnie inkubować roztwór przygotowawczy i kalibracyjny przez 30 minut przed obrazowaniem.

Powtórz protokół obrazowania, używając tych samych parametrów, które zostały określone wcześniej, z modyfikacją tylko jednej minuty przechwytywania obrazu. Następnie dodaj 200 mikrolitrów buforu kalibracyjnego IPBS do pH dziewiątego. Usuń roztwór ze studzienki obrazowania i zastąp go kolejnymi 200 mikrolitrami roztworu kalibracyjnego.

Następnie należy inkubować preparat w drugim roztworze kalibracyjnym przez 10 minut przed obrazowaniem i powtórzyć protokół obrazowania. Następnie przejrzyj przechwycony obraz ułożony w stos w oprogramowaniu do analizy obrazu, aby potwierdzić, że żadne piksele w żadnym kanale nie są nasycone, klikając MeanROI i że żadne wartości zgłoszone w histogramie intensywności nie osiągnęły maksymalnej wykrywalnej wartości, przewijając stos obrazów za pomocą suwaka ramki. Następnie przeanalizuj stos obrazów, wykreślając intensywność fluorescencji, a współczynnik fluorescencji jest funkcją czasu, tutaj widzimy oczekiwaną odpowiedź fluorescencyjną na impuls chlorku amonu w kanałach wskaźnika wrażliwych i niewrażliwych na pH.

Stosunek tych sygnałów ujawnia wewnątrzkomórkową przejściowość pH. Aby przeprowadzić tę analizę, najpierw kliknij meanROI i wybierz narzędzie do swobodnego formowania. Przytrzymaj lewy przycisk myszy myszy, aby prześledzić MT o długości 50 mikrometrów i kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zakończyć rysowanie ROI.

Następnie powtórz tę czynność w obszarze przylegającym do MT, aby zdefiniować ROI w tle. Następnie kliknij średnią intensywność pod pomiarami, utwórz tabelę wartości intensywności, klikając eksport, tabela danych, utwórz. Kliknij ikonę koła zegara konfiguracji i odznacz wszystkie parametry, z wyjątkiem czasu i średniej intensywności.

Kliknij prawym przyciskiem myszy kartę nowo utworzonej tabeli danych, wybierz Zapisz jako i wyeksportuj dane jako plik csv. Pokazany tutaj jest obraz szerokokątny, supereliptyczna fluorescencja fluorowa w głównych komórkach przedniego ante i gwiaździstych przedniego ante. Należy zauważyć, że komórki gwiaździste mają kształt pręta w segmencie początkowym, są zmienne w segmencie przejściowym i wykazują wyraźne projekcje komórkowe w segmencie głównym.

Ten wykres pokazuje skalibrowane międzykomórkowe zmiany pH w odpowiedzi na 20-sekundowy, 40-milimolowy impuls chlorku amonu w obszarach zainteresowania. Krzywe przerywane oznaczają pojedyncze pasowania wykładnicze zastosowane do fazy odzyskiwania kwasu, po wycofaniu chlorku amonu. Z czego wyprowadzane są wartości stałe zaniku.

Ten wykres przedstawia szybkość wytłaczania kwasu wykreśloną jako funkcję wewnątrzkomórkowego pH, a ten wykres przedstawia strumień kwasu wykreślony jako funkcja wewnątrzkomórkowego pH, uzyskany z wykładniczych dopasowań z poprzedniego rysunku. Po opanowaniu ekstrakcję kanalików malpighiana można wykonać w ciągu 10 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że sukces zależy wyłącznie od jakości sekcji i dokładnej kalibracji wskaźnika pH.

Preparat ten można łączyć z innymi genetycznie kodowanymi biosensorami, takimi jak fluorescencyjne wskaźniki wapnia i halogenków, w celu badania ruchu substancji rozpuszczonej i sygnalizacji wewnątrzkomórkowej w komórkach nabłonkowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować zdrowe kanaliki Drosophila malpighiana, zobrazować genetycznie zakodowany wskaźnik pH i określić ilościowo ruch protonów w komórkach nabłonkowych. Nie zapominaj, że praca z nitroizenem może być niebezpieczna i uszkadzająca, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy podjąć środki ostrożności, aby upewnić się, że nie zanieczyści ona żadnego sprzętu, który ma być ponownie użyty.