Oczyszczanie biotynylowanych białek powierzchniowych komórek z nabłonkowych komórek jelitowych Rhipicephalus microplus

Oczyszczanie biotynylowanego białka powierzchniowego komórek z nabłonkowych komórek jelitowych Rhipicephalus microplus. W tym badaniu zastosowano zmodyfikowaną metodologię opartą na gradiencie Percoll w celu wyizolowania pojedynczych komórek nabłonkowych z tkanki jelitowej Rhipicephalus microplus. Białka związane z powierzchnią poddano biotynylacji i oczyszczono za pomocą kulek magnetycznych streptawidyny w celu wykorzystania w dalszych zastosowaniach.

Wypreparowanie nabłonka jelitowego z częściowo nabrzmiałego Rhipicephalus microplus. Będziesz potrzebował następujących materiałów. Przyklej pasek taśmy klejącej do dna szalki Petriego.

Dodaj kroplę Super Glue do taśmy. Umieść kleszcza brzuszną stroną do dołu na Super Glue, pozwalając mu wyschnąć. Całkowicie zanurz kleszcza w 100 ml PBS.

Używając skalpela w rozmiarze 11, przeciąć od góry oczu do dolnych festonów po obu stronach kleszcza. Za pomocą sterylnych kleszczy całkowicie usuń scutum i alloscutum, aby odsłonić narządy wewnętrzne. Usuń cienkie, białe, nitkowate narządy i inne błony.

Usuń jelito za pomocą kleszczy. Przechowuj jelita w lodowatych HBSS i. Dysocjacja komórek nabłonkowych.

Będziesz potrzebował następujących materiałów. Wlej wypreparowane jelito na sitko o wielkości 70 mikronów w probówce Falcon o pojemności 50 ml. Ponieważ w rurze Falcon może wytworzyć się podciśnienie, podnieś filtr, aby umożliwić cyrkulację powietrza.

Przepłucz tkankę jelitową 50 ml lodowatego HBSS za pomocą. Zawieś wnętrzności w 30 ml lodowatego HBSS za pomocą. W razie potrzeby użyj sterylnego skrobaka, aby wspomóc ponowne zawieszenie jelit

Odwirować przy 500 g. Usunąć supernatant i powtórzyć proces mycia trzy razy. Ponownie zawiesić komórki jelitowe w 10 ml DMEM, 2% FCS, 5 milimolowym EDTA, jednym milimolowym TCEP i.

Delikatnie wymieszaj. Inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy powolnych obrotach za pomocą wałka. Przefiltruj zawiesinę przez sitko o wielkości 250 mikronów.

Wiruj przepływ. I przefiltruj przez sitko komórkowe o średnicy 70 mikronów, zbierając pozostały przepływ. Odwirować zawiesinę.

Izolacja pojedynczych komórek nabłonkowych za pomocą gradientu Percoll. Będziesz potrzebował następujących materiałów. Filtrując przez bibułę filtracyjną AP15, przygotuj 40% i 20% Percoll w wodzie Milli-Q.

Naładować sterylną strzykawkę roztworem Percoll. Nałóż go na zestaw filtrujący i powoli rozładuj Percoll. Schłodzić w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez godzinę przed nałożeniem gradientu.

Ustaw pompę perystaltyczną zgodnie z ilustracją. Używając pompy perystaltycznej ustawionej na najniższą prędkość, nałóż trzy ml 40% Percollu do probówki ultrawirówkowej o pojemności 16 ml. Pozostaw na lodzie na 15 minut.

Prędkość pompy powinna prowadzić do natężenia przepływu mniejszego niż jeden ml na minutę. Przechylając rurkę pod kątem 45 stopni, użyj pompy perystaltycznej, aby nałożyć 20% Percoll na warstwę 40%. Upewnij się, że rurka wyjściowa opiera się o probówkę wirówkową, aby zapobiec mieszaniu się kropelek z niższymi warstwami.

Prędkość pompy powinna prowadzić do natężenia przepływu mniejszego niż jeden ml na minutę. Pozwól warstwom osiąść na lodzie przez 15 minut. Za pomocą pompy perystaltycznej przy natężeniu przepływu mniejszym niż jeden ml na minutę do warstwy trzech ml roztworu DMEM zawierającego izolowane komórki nabłonkowe w gradiencie od 20 do 40%.

Upewnij się, że rurka wyjściowa opiera się o probówkę wirówkową, aby zapobiec mieszaniu się kropel z dolnymi warstwami, zakłócając gradient. Wirować przy 600 g przez 10 minut. Zbierz interfazy między DMEM, gradientem 20% Percoll i gradientami 20%40% Percoll, aby wyizolować pojedyncze komórki nabłonka.

Biotynylacja białek powierzchniowych komórek i izolacja biotynylowanych białek powierzchniowych. Będziesz potrzebował następujących materiałów. Biotynyluj 100 mikrolitrów jednokomórkowych komórek nabłonkowych za pomocą zestawu do koniugacji biotyny typu A zgodnie z instrukcjami producenta.

Dodaj 100 mikrolitrów PBS, 1% Triton X-100, 10% glicerolu, 100 mikromolowych utlenionych glutationów i do biotynylowanych komórek. Inkubować na lodzie przez godzinę z delikatnym mieszaniem co 10 minut. Odwirować ekstrakt komórkowy w temperaturze 20 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut i odstawić.

Przygotuj 50 mikrolitrów kulek magnetycznych streptawidyny, myjąc 1 000 mikrolitrów TBS 1%Tween-20. Delikatnie wymieszaj, przesuwając palcem. Umieść rurkę w stojaku magnetycznym, zbierając koraliki z boku tuby.

Usunąć i wyrzucić sklarowany osad. Połącz 300 mikrolitrów biotynylowanych białek powierzchniowych komórek z przemytymi kulkami magnetycznymi. Inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej z mieszaniem.

Zbierz koraliki za pomocą podstawki magnetycznej, wyjmij i wyrzuć supernatant. Dodaj 300 mikrolitrów TBS 1%Tween-20 do tuby, delikatnie mieszając, aby ponownie zawiesić kulki. Zbierz koraliki, usuń i wyrzuć supernatant.

Powtórz ten krok prania dwukrotnie. Dodaj 100 mikrolitrów 1 molowej glicyny o pH dwa do kulek magnetycznych. I inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Zebrać kulki i usunąć supernatant zawierający eluowane biotynylowane białka powierzchniowe. Rysunek pierwszy jest reprezentacją protokołu wykorzystywanego do izolowania komórek nabłonkowych i ich białek powierzchniowych od całego kleszcza. Korzystając z tego protokołu, około 1,2 na 10 do siedmiu komórek na ml o żywotności od 75 do 80% i 20 do 24 mikrogramów oczyszczonych biotynylowanych białek powierzchniowych można oczyścić z początkowej sekcji 50 kleszczy.

Reprezentatywne obrazy mikroskopii fluorescencyjnej komórek nabłonka kleszczy przygotowanych przy użyciu tego protokołu przedstawiono na rycinach 2A i 2B. Komórki pojawiają się jako pojedyncze, kuliste, gładkie morfologie powierzchni i stały rozmiar w całej próbce. Słabe izolacje są wizualizowane jako zawierające niepełną dysocjację poszczególnych komórek nabłonkowych z różnymi populacjami komórek zidentyfikowanymi na podstawie różnych rozmiarów i morfologii komórek.

Zanieczyszczenie krzyżowe białkami gospodarza, ryc. 3A, można zminimalizować poprzez odpowiednie płukanie wnętrzności kleszczy w celu wytworzenia białego lub przezroczystego gradientu Percoll, ryc. 3B. Porównanie białek za pomocą SDS-PAGE, ryc. 4A, barwienie srebrem, ryc. 4B, plama punktowa, ryc. piąta, i ELISA, ryc. szósta, wskazuje, że opisane metodologie skutecznie oczyściły biotynylowane białka powierzchniowe z pojedynczych komórek nabłonkowych wyizolowanych z jelit kleszczy Rhipicephalus microplus. Podsumowując, metody zastosowane w tym badaniu z powodzeniem wyizolowały pojedyncze komórki nabłonkowe z całego jelita Rhipicephalus microplus.

Białka z powierzchni komórek nabłonka Rhipicephalus microplus uzyskano do dalszych analiz i badań. Wreszcie, opracowany protokół wykazał potencjalną wydajność pojedynczych komórek nabłonkowych z jelita kleszcza oraz skuteczność biotynylowanych białek powierzchniowych komórki. Opracowany protokół może być stosowany u dowolnych gatunków kleszczy o znaczeniu gospodarczym w celu zbadania interakcji kleszcz-gospodarz poprzez badanie składu białek błonowych w jelitach.