Ocena internalizacji docelowych białek powierzchniowych za pomocą pochodnej biotyny
JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 5:16 min. • July 8th, 2025
Traktuj astrocyty korowe myszy rozszczepialną pochodną biotyny.
Inkubuj w niskiej temperaturze, aby zapobiec internalizacji białka i ułatwić przyłączanie biotyny do docelowych białek powierzchniowych.
Umyj i dodaj ciepłe podłoże, a następnie inkubuj, aby wywołać internalizację biotynylowanych białek.
Umyj i potraktuj nieprzepuszczalnym dla błony środkiem redukującym, aby rozszczepić niezinternalizowaną biotynę.
Dodaj odczynnik hartowniczy, aby zatrzymać reakcję i umyć.
Zbierz komórki i odwiruj. Usunąć supernatant.
Dodaj bufor do lizy komórek, uwalniając niebiotynylowane i zinternalizowane biotynylowane białka.
Wirówka do granulowania resztek komórek.
Zebrać supernatant zawierający białka, dodać kulki streptawidyny-agarozy i wymieszać, aby wychwycić biotynylowane białka.
Odwirować w celu osadzenia kulek i odrzucenia supernatantu.
Dodaj bufor ładujący i podgrzej, aby denaturować i uwolnić białka z kulek.
Umieść białko na żelu i przenieś je na błonę bibułkową.
Wykrywanie za pomocą przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych w celu wizualizacji odrębnego pasma białkowego, potwierdzającego udaną internalizację białka.
Najpierw wyjmij kultury astrocytów z inkubatora i odessaj pożywkę.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych