Ocena internalizacji docelowych białek powierzchniowych za pomocą pochodnej biotyny

Traktuj astrocyty korowe myszy rozszczepialną pochodną biotyny.

Inkubuj w niskiej temperaturze, aby zapobiec internalizacji białka i ułatwić przyłączanie biotyny do docelowych białek powierzchniowych.

Umyj i dodaj ciepłe podłoże, a następnie inkubuj, aby wywołać internalizację biotynylowanych białek.

Umyj i potraktuj nieprzepuszczalnym dla błony środkiem redukującym, aby rozszczepić niezinternalizowaną biotynę.

Dodaj odczynnik hartowniczy, aby zatrzymać reakcję i umyć.

Zbierz komórki i odwiruj. Usunąć supernatant.

Dodaj bufor do lizy komórek, uwalniając niebiotynylowane i zinternalizowane biotynylowane białka.

Wirówka do granulowania resztek komórek.

Zebrać supernatant zawierający białka, dodać kulki streptawidyny-agarozy i wymieszać, aby wychwycić biotynylowane białka.

Odwirować w celu osadzenia kulek i odrzucenia supernatantu.

Dodaj bufor ładujący i podgrzej, aby denaturować i uwolnić białka z kulek.

Umieść białko na żelu i przenieś je na błonę bibułkową.

Wykrywanie za pomocą przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych w celu wizualizacji odrębnego pasma białkowego, potwierdzającego udaną internalizację białka.

Najpierw wyjmij kultury astrocytów z inkubatora i odessaj pożywkę. Następnie umyj komórki trzykrotnie 4 mililitrami schłodzonego CM-PBS i umieść naczynia na kruszonym lodzie. Odessać CM-PBS, a następnie odpipetować 3 mililitry buforu biotyny do każdej naczynia. Przechyl naczynia kilka razy w przód i w tył, aby upewnić się, że bufor jest dobrze rozprowadzony, i pozostaw je na lodzie na 30 minut.

Następnie odessać bufor biotyny i zastąpić go 5 mililitrami ciepłej pożywki. Inkubuj jedną szalkę hodowlaną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, a drugą naczynie w tej samej temperaturze przez 30 minut. Pozostaw inne naczynie w temperaturze 4 stopni Celsjusza jako próbkę zero-minutową.

Pod koniec okresu inkubacji wyrzucić pożywkę i trzykrotnie przemyć komórki 4 mililitrami schłodzonego CM-PBS. Następnie odessać CM-PBS, a następnie odpipetować 6 mililitrów buforu redukującego na komórki i pozostawić próbkę na lodzie na 15 minut.

Następnie zastąp pożywkę 6 mililitrami świeżego buforu redukującego i umieść próbkę na lodzie na dodatkowe 15 minut.

Ten etap ma kluczowe znaczenie, ponieważ glutation zawarty w buforze redukującym rozszczepi cząstki biotyny pozostające na powierzchni komórki. Gwarantuje to, że tylko zinternalizowane białka będą stronnicze i znakowane.

Następnie usuń roztwór redukujący i zastąp go 6 mililitrami buforu hartującego. Pozostawić próbkę na lodzie na kolejne 15 minut i powtórzyć etap hartowania jeszcze raz. Następnie wyrzuć bufor hartowniczy i umyj komórki trzykrotnie 4 mililitrami schłodzonego PBS.

Zassać CM-PBS, a następnie zeskrobać komórki do 1 mililitra schłodzonego PBS za pomocą podnośnika do komórek i przenieść zawiesinę do probówki mikrowirówkowej. Granulować komórki przez odwirowanie w stężeniu 100 g przez trzy minuty. Po trzech minutach wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach buforu do lizy.

Pozostawić próbkę na lodzie na 30 minut i wirować co pięć minut. Odwirować lizat o sile 14 000 g przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby rozpylić detergent i materiały rozpuszczalne. Następnie przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki.

Za pomocą przeciętej końcówki pipety dodaj 150 mikrolitrów zawiesiny agarozowej streptawidyny do lizatu i inkubuj ją w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez trzy godziny na shakerze. Po trzech godzinach granulki agarozy streptawidyny osadzać przez odwirowanie w temperaturze 1500 g przez 30 sekund w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Ponownie zawieś kulki w 1 mililitrze bufora do mycia i kołysz je przez trzy minuty w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Granulki obrabiać i wyrzucić supernatant.

Powtórz ten proces jeszcze cztery razy, aby zminimalizować niespecyficzne wiązanie niebiotynylowanych białek cytozolowych. Następnie granuluj kulki przez odwirowanie z prędkością 1 500 g przez 30 sekund w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Wyrzuć leżący nad nim bufor płuczący i dodaj 50 mikrolitrów 1x bufora ładującego.

Uwolnij biotynę i streptawidynę z kulek poprzez denaturację w temperaturze 95 stopni Celsjusza. Ta frakcja powinna zawierać tylko zinternalizowane białka powierzchniowe komórki. Następnie oddziel dane wejściowe, powierzchnię komórki i frakcje niezwiązane za pomocą SDS-PAGE i przeanalizuj za pomocą Western blot.