Tandemowe oczyszczanie kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych

Ogólnym celem tej metody oczyszczania powinowactwa tandemowego jest wyizolowanie kompleksów białkowych ulegających ekspresji z komórek eukariotycznych w celu charakterystyki biochemicznej i zespołów molekularnych oraz identyfikacji nowych interaktorów i modyfikacji potranslacyjnych, które regulują ich funkcję. Metoda ta umożliwia oczyszczanie nienaruszonych kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych w celu identyfikacji nowych interaktorów i regulacyjnych modyfikacji potranslacyjnych, które dostrajają ich funkcję. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na uzyskanie wysokiej czystości i wydajności kompleksów białkowych do dalszych zastosowań in vitro w celu zbadania ich funkcji i aktywności.

Komórki pobiera się z oczyszczania powinowactwa do STREP 48 godzin po transfekcji. Usuń pożywkę i dodaj osiem mililitrów zimnego PBS. Pipetować w górę i w dół, aby odłączyć komórki od płytki.

Zbierz i przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki i wiruj komórki z prędkością 800 razy g przez cztery minuty w czterech stopniach Celsjusza. Usunąć supernatant PBS. Wiruj w dół z prędkością 800 razy g przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby wyeliminować wszelkie pozostałości PBS.

Aby rozpocząć tę procedurę, ponownie zawieś każdą osadkę komórkową w pięciokrotności objętości osadu komórkowego pasywnego bufora do lizy lub PLB. Przenieś zawiesinę komórek do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Krótko zmieszać zawiesinę i nutować przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Odwiruj zawiesinę komórkową z prędkością 10 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś rozpuszczalny lizat do nowej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki i wyrzuć osad komórkowy. Zaoszczędź 10% końcowej objętości rozpuszczalnego lizatu jako wsad STREP-AP i przechowuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Ważne jest, aby użyć kulek STREP do pierwszego etapu oczyszczania powinowactwa, ponieważ kompleksy ściągnięte za pomocą kulek STREP odzyskują znacznie więcej białka niż te ściągnięte za pomocą kulek FLAG. Za pomocą końcówki pipety z szerokim otworem usuń odpowiednią ilość 50% zawiesiny kulek STREP w celu oczyszczenia powinowactwa. Wiruj z prędkością 1 500 razy g przez dwie minuty w czterech stopniach Celsjusza.

Usuń supernatant i dodaj 500 mikrolitrów PLB do kulek. Nutuj mieszaninę kulek przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ponownie obróć w dół.

Po trzecim przemyciu usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulki w PLB do końcowej objętości n razy 40 mikrolitrów, gdzie n jest liczbą próbek. Dodaj 40 mikrolitrów 50% zawiesiny kulek STREP do każdej próbki lizatu komórkowego i nutuj przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Podczas tej produkcji i odzyskiwania białka można użyć wielu płytek komórkowych, a te same próbki białka zlizowane z różnych płytek można połączyć z jedną porcją kulek podczas oczyszczania powinowactwa do STREP.

Po inkubacji lizatu komórkowego i zawiesiny kulek STREP przez dwie godziny, wirować je w temperaturze 1 500 g przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zachowaj supernatant podczas przepływu AP przez STREP i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dodaj 500 mikrolitrów buforu płuczącego STREP AP do kulek.

Nutować kulki w mieszaninie buforowej przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wirować w temperaturze 1 500 razy g przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wyrzucić supernatant i ponownie przemyć 500 mikrolitrami pierwszego buforu płuczącego STREP AP. Po trzecim myciu przenieś roztwór kulek do nowej 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej, aby zredukować tło białkowe.

Przemyć po raz czwarty za pomocą pierwszego buforu płuczącego STREP AP. Po odwirowaniu usuń supernatant i dodaj 500 mikrolitrów mytego masła dwa. Zrównoważ koraliki, odwracając rurki, a następnie wiruj w dół z prędkością 1 500 razy g przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Odrzucić supernatant. Eluować interesujące białko za pomocą 50 mikrolitrów buforu elucyjnego STREP. Wiruj z prędkością 800 obr./min przez 15 minut w czterech stopniach Celsjusza.

Obracaj koraliki w tempie 1 500 g przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zebrać supernatant. Frakcja ta odpowiada próbce elucyjnej STREP AP.

Zachowaj frakcję kulek w temperaturze czterech stopni Celsjusza do drugiej elucji. Podwielokrotność 10% elucji STREP AP do barwienia srebrem i/lub Western blot. Aby zwiększyć ilość materiału wyjściowego do późniejszej immunoprecypitacji LGR, pierwsza i druga elucja STREP mogą być połączone w celu bardziej efektywnego odzyskania elucji LGR.

Rozpocznij tę procedurę od użycia końcówki pipety z szerokim otworem, aby przenieść odpowiednią ilość roztworu kulek FLAG do probówki mikrowirówkowej. Wiruj z prędkością 1 500 razy g przez dwie minuty w czterech stopniach Celsjusza. Usuń supernatant i dodaj 500 mikrolitrów buforu do płukania FLAG do kulek.

Wiruj z prędkością 1 500 razy g przez dwie minuty w czterech stopniach Celsjusza. Odrzucić supernatant i ponownie przemyć buforem płuczącym FLAG. Po trzecim przemyciu usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulki w buforze do płukania FLAG do końcowej objętości n razy 16 mikrolitrów, gdzie n jest liczbą próbek.

Dodać 16 mikrolitrów zawiesiny kulek FLAG do pozostałej elucji STREP AP i nutować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po całonocnej inkubacji gnojowicy perełkowej FLAG i elucji STREP AP należy przystąpić do immunoprecypitacji FLAG. Obracaj zawiesinę koralików FLAG pod ciśnieniem 1 500 razy g przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Zachowaj supernatant podczas przepływu IP flagi i przechowuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dodaj 500 mikrolitrów buforu do płukania FLAG do kulek. Nutować przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza i odwirowywać w temperaturze 1 500 razy g przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Wyrzucić supernatant i ponownie przemyć 500 mikrolitrami buforu do płukania FLAG. Po trzecim płukaniu przenieś roztwór kulek białkowych do nowej 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej, aby zredukować tło. Przemyć po raz czwarty buforem do płukania FLAG.

Usunąć supernatant z ostatniego wirowania i dodać do kulek 30 mikrolitrów buforu do płukania FLAG zawierającego 200 nanogramów na mikrolitr peptydu FLAG. Wiruj z prędkością 800 obr./min przez dwie godziny w czterech stopniach Celsjusza. Po dwóch godzinach odkręć zawieszenie z prędkością 1 500 g przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Zebrać supernatant i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza jako elucję FLAG IP. W tym filmie oczyszczanie powinowactwa w tandemie lub metoda TAP została zastosowana do kompleksu Cyclin-T1 CDK9. Cyklina-T1 znakowana STREP i CKD9 znakowana FLAG ulegały nadekspresji w limfocytach T HEK293.

Przeprowadzono również eksperyment odwrotny z STREP oznaczonym CDK9 i FLAG oznaczonym Cyclin-T1. Analiza Western blot pokazuje, że CKD9 znakowany FLAG koeluował STREP oznaczony Cyclin-T1 z kulek STREP, ale nie w kontroli negatywnej, AP bez STREP oznaczonego Cyclin-T1. Oba białka wykryto w elucji FLAG, co dodatkowo potwierdziło tworzenie się kompleksu.

Wzajemne wyniki TAP pokazują, że znakowana FLAG Cyclin-T1 koeluowała się z CDK9 znakowanym STREP, co dodatkowo potwierdza, że oddziaływanie Cyclin-T1 CDK9 jest niezależne od użytych epitopów. Wyniki TAP i odwrotnego TAP analizowano również za pomocą barwienia srebrem. Gwiazdki oznaczają zanieczyszczenia spruwane.

FLAG oznaczone CKD9 spruuowane STREP oznaczone Cyclin-T1 z koralików STREP, ale nie z kontroli AP.In późniejszej elucji FLAG, STREP oznaczone Cyclin-T1 spruowane z FLAG oznaczone CDK9 z koralików FLAG. Podobnie, FLAG oznaczona Cykliną-T1 spruuowaną z STREP oznaczoną CDK9 z kulek STREP, ale nie z kontrolnego AP. Kompleks białko-białko został skutecznie odzyskany po drugim etapie projektu FLAG IP. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch dni, rozpoczynając, gdy komórki są gotowe do pobrania, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o odpowiednim zwiększeniu liczby płytek komórkowych w eksperymencie, aby zapewnić odzyskanie i wykrycie wystarczającej ilości białka. Na przykład identyfikacja nowych podjednostek regulatorowych i/lub badanie modyfikacji potranslacyjnych podjednostek złożonych. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom badającym interakcje białko-białko w celu zbadania nowych interakcji i modyfikacji potranslacyjnych w komórkach eukariotycznych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować i charakteryzować białka za pomocą znaczników STREP i FLAG.