Protokół skanowania zegara do analizy obrazu: wtyczki ImageJ
19 czerwca 2017
Ten artykuł opisuje dwie nowatorskie wtyczki ImageJ do analizy obrazów 'Clock Scan'. Wtyczki te rozszerzają funkcjonalność oryginalnego programu Visual Basic 6 i, co najważniejsze, udostępniają program dużej społeczności badawczej, łącząc go z bezpłatnym pakietem oprogramowania do analizy obrazu ImageJ.
Ogólnym celem protokołów skanowania zegarowego jest umożliwienie szybkiej charakterystyki średniej intensywności pikseli wewnątrz, wzdłuż krawędzi i/lub na zewnątrz wybranych obszarów zainteresowania. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania oraz w przeszkoleniu analityków obrazu w zakresie średniej intensywności pikseli w konkretnych obszarach zainteresowania. Główną zaletą zastosowanej tutaj techniki skanowania zegarowego jest możliwość szybkiej charakterystyki średniej intensywności pikseli z orbity w jednym lub wielu obszarach zainteresowania.
Aby przeprowadzić standardową analizę skanowania zegarowego, w menu Plik w odpowiednim programie ImageJ wybierz Otwórz, aby otworzyć interesujący plik obrazu. Na przykład w tym przypadku analizowany będzie przekrój tkanki z neuronami znakowanymi pod kątem białka będącego przedmiotem zainteresowania. Wybierz odpowiednie narzędzie do rysowania i obrysuj obszar zainteresowania.
Z menu Plik wybierz Plugins, a następnie Clock Scan, aby otworzyć standardowy protokół skanowania zegara (okno opcji wyskakujących). Otworzy się również okno menedżera obszarów zainteresowania (ROI) z automatycznie dodanym obrysem. W oknie opcji wtyczki użyj pasków przewijania, aby w razie potrzeby zmienić współrzędne x i y w centrum obszaru zainteresowania.
W zależności od tego, jak duży obszar tła poza obiektem ma zostać objęty skanowaniem, należy użyć paska przewijania limitów skanowania (scan limit), aby dostosować zakresy skanowania. Zaznaczyć pola wyboru real radius, subtract background, polar transform i/lub plot with standard deviation, zależnie od wymagań eksperymentalnych. Następnie kliknąć OK, aby uruchomić wtyczkę.
Po zakończeniu analizy należy użyć polecenia list, aby uzyskać dostęp do danych liczbowych w celu ich dalszej analizy. W przypadku analizy skanowania zegara dla wielu obszarów, należy otworzyć plik obrazu zawierający wiele obszarów zainteresowania. Przykładowo, w tym przypadku analizowany będzie panel klatek zarejestrowanych w obrębie tego samego przekroju tkanki, zgodnie z wcześniejszą demonstracją.
Kliknij Analyze, następnie Tools, a potem Region of Interest Manager i użyj odpowiedniego narzędzia do rysowania, aby obrysować każdy obszar zainteresowania. Narzędzie linii segmentowej jest przydatne do wyboru asymetrycznych obszarów zainteresowania oraz do wykluczenia sygnału tła. Kliknij Add w oknie Region of Interest Manager, aby dodać każdy wybrany obszar zainteresowania do menedżera.
w menu Wtyczki (Plugins) wybierz Multi Clock Scan, aby otworzyć okno pop-up z opcjami protokołu, a następnie w razie potrzeby zresetuj limit skanowania. Zaznacz pola wykresem z odchyleniem standardowym i/lub odejmowaniem tła, zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi. Następnie kliknij OK, aby uruchomić protokół, co spowoduje wygenerowanie dwóch okien z wynikowymi wykresami.
Aby przeprowadzić analizę skanowania zegarowego (clock scan) stosu obrazów, otwórz interesujący Cię stos obrazów. W tym przypadku analizowany będzie stos obrazów odizolowanego zwoju korzeniowego tylnego, znakowanego fluorescencyjnym wskaźnikiem wrażliwym na wapń, obrazowanego przed i po stymulacji elektrodą wewnątrzkomórkową. Obrysuj obszar zainteresowania (ROI) w obrębie stosu obrazów.
Dodaj wybrany stos obrazów do menedżera obszarów zainteresowania (region of interest manager), zgodnie z wcześniejszą demonstracją, a następnie wybierz opcję Multi Clock Scan, aby otworzyć okno pop-up z opcjami protokołu. Zresetuj limit skanowania w razie potrzeby i zaznacz pola wykreśl wykres z odchyleniem standardowym oraz/lub odejmij tło, zgodnie z wymogami eksperymentu. Następnie kliknij OK, aby uruchomić protokół, co wygeneruje dwa okna z wynikowymi wykresami.
W tej reprezentatywnej analizie przekroju tkanki z neuronami znakowanymi fluorescencyjnie, wyznaczono obszar zainteresowania (ROI) obejmujący silny sygnał badanego białka, a następnie przeprowadzono standardową analizę skanowania zegarowego w celu zebrania radialnych skanów intensywności pikseli od centrum obszaru zainteresowania do wyznaczonej granicy skanowania. Skan radialny znormalizowano do promienia obszaru zainteresowania w kierunku skanowania. Wyciągnięto średnią, aby uzyskać zintegrowany radialny profil intensywności pikseli, co wykazało, że większość badanego białka znajdowała się w błonie plazmatycznej komórki.
Ponieważ do niniejszej analizy wybrano wykres z odchyleniem standardowym, pionowe linie odchylenia standardowego wskazały różnice w intensywności pikseli pomiędzy poszczególnymi profilami skanowania radialnego w danej odległości od punktu początkowego skanowania. W analizie tej przeskanowano wiele obszarów zainteresowania w próbce tkanki neuronów, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, co pozwoliło na wygenerowanie całkowitego profilu intensywności pikseli dla każdego przeskanowanego obiektu w kolejności, w jakiej były one dodawane do menedżera obszarów zainteresowania, a także średniego profilu intensywności pikseli dla każdego wybranego obszaru zainteresowania.
Słupki odchylenia standardowego reprezentują zatem zmienność między skanami całkowymi poszczególnych obiektów, a nie między pojedynczymi skanami radialnymi. W tym przypadku przeprowadzono analizę stosu obrazów odizolowanego neuronu z zwoju korzeniowego tylnego, zarejestrowanego w różnych odstępach czasu, przed i po stymulacji za pomocą elektrody wewnątrzkomórkowej. Na koniec analizy wyświetlono całkowity profil intensywności pikseli dla poszczególnych wystąpień badanego obiektu na różnych obrazach w stosie oraz średni profil intensywności pikseli dla wszystkich wystąpień tego obiektu.
Ponadto analiza odchylenia standardowego stosu obrazów z przeskanowania zegarowego wykazuje zmienność danych pomiędzy skanami całkowkami w całym stosie obrazów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat pomiaru intensywności pikseli przy użyciu wtyczek do skanowania zegarowego. Naszym celem podczas opracowywania tych wtyczek było udostępnienie tego rodzaju analizy obrazu każdemu badaczowi.
Wierzymy, że protokół skanowania zegarowego znajdzie zastosowanie w wielu obszarach badawczych, w tym, między innymi, w aplikacjach obrazowania biologicznego, chemicznego i fizycznego. W miarę dalszego rozwoju i wdrażania tych wtyczek do skanowania zegarowego, będziemy wdzięczni za wszelkie uwagi i sugestie od zainteresowanych stron dotyczące ulepszenia tych narzędzi.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje dwie nowe wtyczki do programu ImageJ przeznaczone do analizy obrazów metodą „Clock Scan”, które stanowią udoskonalenie oryginalnego programu napisanego w języku Visual Basic 6. Wtyczki te czynią program dostępnym dla szerszego grona badaczy poprzez jego integrację z pakietem oprogramowania ImageJ.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Analiza obrazu
- Neuronauka
- Tworzenie oprogramowania
Wstęp
- Protokoły skanowania zegarowego ułatwiają szybką charakterystykę intensywności pikseli.
- Pomagają analitykom obrazu określić średnią intensywność pikseli w obszarach zainteresowania.
- Technika ta pozwala na szybką analizę pojedynczych lub wielu obszarów.
- ImageJ to powszechnie stosowane, bezpłatne oprogramowanie do analizy obrazu.
Cel badania
- Wprowadzenie nowych wtyczek w celu usprawnienia analizy obrazu.
- Zapewnienie badaczom narzędzi do efektywnej analizy intensywności pikseli.
- Rozszerzenie dostępu do metodologii skanowania zegarowego (clock scan).
Zastosowane metody
- Wykorzystanie oprogramowania ImageJ do analizy obrazów.
- Wybór obszarów zainteresowania (ROI) przy użyciu narzędzi do rysowania.
- Określenie średniej intensywności pikseli w wybranych obszarach.
- Analiza przekrojów tkankowych znakowanych pod kątem specyficznych białek.
Główne wyniki
- Przedstawienie dwóch wtyczek do programu ImageJ służących do analizy skanów zegarowych.
- Rozszerzona funkcjonalność w porównaniu z oryginalnym programem.
- Zwiększona dostępność dla badaczy w tej dziedzinie.
- Wykazana skuteczność w analizie intensywności pikseli.
Wnioski
- Nowe wtyczki znacznie poprawiają możliwości analizy obrazu.
- Umożliwiają one szybką charakterystykę intensywności pikseli.
- Narzędzia te są cenne dla badaczy w dziedzinie neuronauki i dyscyplin pokrewnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa analiza obrazu jest kluczowa dla wczesnego odkrywania leków oraz badań translacyjnych, umożliwiając precyzyjny pomiar cech molekularnych lub komórkowych w złożonych próbkach biologicznych. Protokół skanowania zegarowego (clock scan), zaimplementowany jako wtyczki do programu ImageJ, zapewnia zestandaryzowaną i powtarzalną kwantyfikację radialnych profili intensywności pikseli w jednym lub wielu obszarach zainteresowania. Możliwość ta wspiera rzetelne podejmowanie decyzji w oparciu o dane w kluczowych punktach zwrotnych w procesach badawczo-rozwojowych branży biofarmaceutycznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia obiektywną kwantyfikację lokalizacji i rozkładu biomarkerów w określonych przedziałach komórkowych.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez dostarczanie powtarzalnych profili intensywności przestrzennej dla potencjalnych celów.
- Ułatwia analizę porównawczą w różnych warunkach eksperymentalnych w celu oceny wiarygodności celu i jego selekcji.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane testy obrazowe do późniejszych etapów procesów przesiewowych poprzez standaryzację analizy obszarów zainteresowania.
- Dostarcza ilościowe, powtarzalne wyniki odpowiednie do wysokoprzepustowych analiz obrazowych (high-content screening) oraz oceny związków.
- Umożliwia analizę seryjną wielu obszarów lub stosów obrazów, co zapewnia skalowalność i możliwość ponownego wykorzystania platformy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Uzgadnia ilościowe punkty końcowe pochodzące z obrazowania z modelami komórkowymi lub tkankowymi istotnymi dla danej choroby, gdy wspiera to kontekst biologiczny.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania po walidację przedkliniczną, umożliwiając spójny pomiar dynamiki biomarkerów przestrzennych.
- Wspiera decyzje o przejściu do kolejnych etapów badań w oparciu o analizę ryzyka dzięki solidnej ilościowej analityce obrazowej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Protokół skanowania zegarowego integruje się z kontinuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając standaryzowaną, ilościową analizę obrazu na wielu etapach procesu badawczego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez profilowanie intensywności przestrzennej.
- Screening: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych wyników w celu weryfikacji gotowości testu oraz oceny związków.
- Analityka: Zapewnia wyniki statystyczne, w tym profile średniej i odchylenia standardowego, do rygorystycznego porównywania warunków.
- Badania translacyjne: Umożliwia dopasowanie punktów końcowych opartych na obrazowaniu do modeli przedklinicznych, jeśli jest to właściwe.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wielokrotnego użytku funkcjonalność open-source dla zróżnicowanych potrzeb analizy obrazów w zespołach B+R.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach opartych na obrazowaniu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje i skaluje przepływy pracy w analizie obrazów w celu zapewnienia powtarzalności i wydajności.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz alokację kapitału poprzez dostarczenie wiarygodnych danych ilościowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów na etapie odkrywania i badań przedklinicznych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w analizie obrazu oraz znajomości platform ImageJ lub Fiji.
- Wymaga dostępu do odpowiedniej aparatury obrazującej i infrastruktury obliczeniowej.
- Wymaga standaryzacji wyboru obszarów zainteresowania (ROI) oraz parametrów analizy pomiędzy zespołami.
- Umożliwia adaptację do różnych modeli biologicznych i metod obrazowania.
- Ograniczone do obszarów o kształcie wypukłym lub segmentowanych; złożone morfologie mogą wymagać dodatkowej walidacji.
