Name: Protokół skanowania zegara do analizy obrazu: wtyczki ImageJ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Poznaj analizę obrazu metodą Clock Scan za pomocą wtyczek ImageJ do badania intensywności pikseli w regionach zainteresowania. Narzędzia te ułatwiają szybką charakterystykę danych w neurobiologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Tanji Maritzen i dr Fabianowi Feutlinske (Instytut Farmakologii Molekularnej im. Leibniza, Berlin, Niemcy) za podzielenie się z nami swoją wersją wtyczki Fuji ImageJ Clock Scan i zainspirowanie nas do opracowania tej wersji programu. Jesteśmy również wdzięczni dr Fritzowi Melchersowi (Zakład Rozwoju Limfocytów, Instytut Biologii Zakażeń im. Maxa Plancka) za jego uprzejmą zgodę na wykorzystanie obrazów z bazy danych jego wydziału w celu testowania i ulepszania wtyczki. Wsparcie: Centrum Neuronauk Translacyjnych; Grant NIH: P30-GM110702-03.

1. Instalacja oprogramowania
<ol>
	<li>Zainstaluj najnowsze wersje dołączonej Javy i ImageJ lub Fiji ImageJ zgodnie z zaleceniami na odpowiednich stronach internetowych (linki do odpowiednich stron internetowych znajdują się w tabeli materiałów). W poniższym tekście oba programy są określane jako "ImageJ".</li>
	<li>Skopiuj pliki wtyczek "Clock_Scan-1.0.1. jar" i "Multi_Clock_Scan-1.0.1.jar" za pomocą linku podanego w tabeli materiałów i wklej je do katalogu wtyczek ImageJ. Alternatywnie użyj "Wtyczki | Zainstaluj wtyczkę", aby zainstalować te pliki po ich zapisaniu na dysku twardym komputera.</li>
</ol>
2. Analiza skanowania zegara
<ol>
	<li>Wtyczka Standard Clock Scan (<silna klasa="xfig">Rysunek 1):
	<ol>
		<li>Użyj ImageJ "Plik | Otwórz" polecenie menu, aby otworzyć interesujący Cię obraz.</li>
		<li>Kliknij narzędzie "wielokąt" lub narzędzie "wybór linii segmentowej", a następnie narysuj obraz, aby obrysować cały obszar zwrotu lub segment tego regionu. Zobacz Rysunek 1A dla przykładu wyboru wielokąta (wewnętrzny przerywany kontur). 
		UWAGA: Można również użyć innych narzędzi do zaznaczania, dostępnych w oprogramowaniu (zaznaczanie linii prostokątnych, owalnych i odręcznych).</li>
		<li>Wybierz "Wtyczki | Skanowanie zegara" z menu, aby otworzyć wyskakujące okno opcji standardowego protokołu skanowania zegara. Zauważ, że to polecenie otworzy również okno Menedżera ROI z automatycznie dodanym do niego konspektem.</li>
		<li>Użyj okna opcji wtyczki, aby wykonać następujące czynności.
		<ol>
			<li>Przejrzyj i zmień współrzędne X i Y środka ROI (automatycznie obliczane jako współrzędne środka masy fizycznej) za pomocą pasków przewijania lub zmieniając wartości w odpowiednich polach wejściowych. Zobacz Rysunek 1B.</li>
			<li>W zależności od tego, jaka część obszaru tła poza obiektem powinna zostać pokryta skanowaniem, dostosuj limity skanowania za pomocą paska przewijania "Limit skanowania". Zobacz Rysunek 1A. 
			UWAGA: Limit skanowania to liczba ułamkowa określająca, jak daleko skanowanie powinno przebiegać poza granicę obiektów w dowolnym kierunku; Wartość domyślna to 1,20, co oznacza, że długość skanowania będzie o 20% dłuższa niż promień obiektu w kierunku skanowania; patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1A, zewnętrzna przerywana linia).</li>
			<li>Zmodyfikuj dane wyjściowe wtyczki za pomocą pól wyboru "promień rzeczywisty", "odejmij tło", "transformacja biegunowa" i/lub "wykres z odchyleniem standardowym".</li>
			<li>Kliknij "OK", aby uruchomić wtyczkę. Zobacz Rysunek 1C-H. 
			UWAGA: Przykłady danych wyjściowych protokołu z wybranymi opcjami "wykres z odchyleniem standardowym" i "transformacja biegunowa" lub "promień rzeczywisty" i "transformacja biegunowa" są pokazane w Rysunek 1C i 1D oraz Rysunek 1E i 1Fodpowiednio. Należy pamiętać, że obliczone wartości odchylenia standardowego (SD) reprezentują różnice między poszczególnymi skanami intensywności pikseli radialnych obiektu. Zwróć również uwagę na wiersz "Długość wyboru ROI" w oknie wtyczki, który wyświetla informacje o długości konturu ROI mierzonej w pikselach.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W wygenerowanym "Wykresie profilu skanowania zegara" użyj polecenia "Lista", aby wykreślić wartości wyświetlane w dwóch kolumnach X i Y danych dla obrazów w skali szarości oraz w X i czterech kolumnach Y danych dla obrazów RGB, z których kolumny Y0, Y1, Y2 i Y3 zostaną wypełnione całkami i indywidualnymi (czerwony, zielony i niebieski) wartości intensywności pikseli kanału koloru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wtyczka Multiple ROI Clock Scan - działająca z wieloma ROI (<silna klasa="xfig">Rysunek 2):
	<ol>
		<li>Otwórz obraz zawierający wielokrotny zwrot z inwestycji.</li>
		<li>Otwórz Menedżera zwrotu z inwestycji, klikając "Analizuj | Narzędzia | Menedżer zwrotu z inwestycji".</li>
		<li>Sekwencyjnie obrysuj (patrz krok 2.1.2) i dodaj każdy ROI do Menedżera ROI, klikając "Dodaj" w oknie Menedżera ROI; zrób to dla wszystkich ROI na obrazie. Za pomocą przycisku "Analizuj| Zmierz", jeśli interesujące są wskaźniki ROI.
		<ol>
			<li>Zobacz Rysunek 2A dla przykładu wielu wyborów linii segmentowych i Rysunek 2E dla przykładu wyboru wielu wielokątów.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wybierz "Multi Clock Scan" w menu "Wtyczki", aby otworzyć wyskakujące okno opcji protokołu.</li>
		<li>Użyj okna opcji protokołu, aby wykonać następujące czynności.
		<ol>
			<li>W razie potrzeby zresetuj limit skanowania zgodnie z krokiem 2.1.4.2; wartość domyślna to 1.20.</li>
			<li>W razie potrzeby wybierz opcję wykreślenia profilu skanowania średniego zegara ze słupkami SD, zaznaczając pole "Drukuj z odchyleniem standardowym". Zobacz Rysunek 2C i D. 
			UWAGA: Obliczone wartości SD będą reprezentować różnice między integralnymi profilami skanowania zegara różnych obiektów. Zwróć też uwagę na linię w oknie wtyczki wyświetlającą informacje o "liczbie wybranych ROI".</li>
			<li>Kliknij "OK", aby uruchomić protokół.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W wygenerowanym "Wykresie profilu skanowania zegara" użyj polecenia "Lista", aby wykreślić wartości wyświetlane w oknie "Wartości wykresu". Zobacz legendę okna "Multi Clock Scan Profile Plot" w celu oznaczenia kolumn za pomocą kanału koloru.</li>
		<li>Zwróć uwagę, że ROI są ponumerowane, a ich profile skanowania zegara dla dowolnego kanału koloru są wykreślane w tej samej kolejności, w jakiej ROI zostały nakreślone i dodane do "Menedżera ROI".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wtyczka Multiple ROI Clock Scan - praca ze stosem obrazów (Rysunek 3):
	<ol>
		<li>Otwórz interesujący Cię stos obrazów.</li>
		<li>Otwórz Menedżera zwrotu z inwestycji, klikając "Analizuj | Narzędzia | Menedżer zwrotu z inwestycji".</li>
		<li>Nakreśl ROI obrazów w stosie i dodaj go do menedżera ROI zgodnie z opisem w krokach 2.1.2 i 2.2.3. Za pomocą punktu menu "Analizuj | Zmierz", jeśli interesujące są metryki ROI.</li>
		<li>Wybierz "Multi Clock Scan" w menu "Wtyczki", aby otworzyć wyskakujące okno opcji protokołu.</li>
		<li>Użyj okna opcji protokołu, aby wykonać następujące czynności.
		<ol>
			<li>Zresetuj limit skanowania zgodnie z opisem w kroku 2.1.4.2; wartość domyślna to 1,20.</li>
			<li>Wybierz opcję, aby wykreślić profil skanowania średniego zegara z paskami SD, zaznaczając pole "Drukuj z odchyleniem standardowym". 
			UWAGA: Obliczone wartości SD będą reprezentować różnice między różnymi instancjami obiektu wybranego w stosie obrazów. Zwróć również uwagę na linię w oknie wtyczki wyświetlającą informacje o "liczbie obrazów w stosie".</li>
			<li>Kliknij "OK", aby uruchomić protokół.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W oknie "Wykres profilu skanowania zegara" kliknij "Lista", aby wykreślić wartości wyświetlane w oknie "Wartości wykresu", gdzie numer kolumny Y reprezentuje pozycję obrazu w stosie - 1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Dobretsov, M., Romanovsky, D. "Clock-scan" protocol for image analysis. Am J Physiol Cell Physiol. 291, 869-879 (2006).</li>
<li>Feutlinske, F., Browarski, M., Ku, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stonin1+mediates+endocytosis+of+the+proteoglycan+NG2+and+regulates+focal+adhesion+dynamics+and+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Stonin1 mediates endocytosis of the proteoglycan NG2 and regulates focal adhesion dynamics and cell motility.</a> Nat Commun. 6, 8535(2015).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Dobretsov, M., Hastings, S. L., Stimers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-uniform+expression+of+alpha+subunit+isoforms+of+the+Na%2B%2FK%2B+pump+in+rat+dorsal+root+ganglia+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Non-uniform expression of alpha subunit isoforms of the Na+/K+ pump in rat dorsal root ganglia neurons.</a> Brain Res. 821, 212-217 (1999).</li>
<li>Hayar, A., Gu, C., Al-Chaer, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+patch+clamp+recording+and+calcium+imaging+of+neurons+in+the+intact+dorsal+root+ganglion+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved method for patch clamp recording and calcium imaging of neurons in the intact dorsal root ganglion in rats.</a> J Neurosci Methods. 173, 74-82 (2008).</li>
<li>Dobretsov, M., Pierce, D., Light, K. E., Kockara, N. T., Kozhemyakin, M., Wight, P. A. Transgenic mouse model to selectively identify alpha3 Na,K-ATPase expressing cells in the nervous system. Society for Neuroscience. , Online Program No. 123.01/B54 1(2015).</li>
<li>Lein, E. S., Hawrylycz, M. J., Ao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445, 168-176 (2007).</li>
<li>Romanovsky, D., Mrak, R. E., Dobretsov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+decline+in+density+of+human+nerve+and+spinal+ganglia+neurons+expressing+the+alpha3+isoform+of+Na%2FK-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Age-dependent decline in density of human nerve and spinal ganglia neurons expressing the alpha3 isoform of Na/K-ATPase.</a> Neuroscience. 310, 342-353 (2015).</li>
<li>Campbell, J., Singh, D., Hollett, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+selective+photoconductive+stimulation+of+live+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spatially selective photoconductive stimulation of live neurons.</a> Front Cell Neurosci. 8, 142(2014).</li>
<li>Yuryev, M., Pellegrino, C., Jokinen, V., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4701926/">In vivo Calcium Imaging of Evoked Calcium Waves in the Embryonic Cortex.</a> Front Cell Neurosci. 9, 500(2015).</li>
<li>Qiao, M., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Method+for+Labeling+Electrically+Coupled+Cells%3A+Application+to+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic Method for Labeling Electrically Coupled Cells: Application to Retina.</a> Front Mol Neurosci. 8, 81(2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Protokół skanowania zegara: Protokół Clock Scan to szybkie i proste narzędzie do analizy obrazu. Zalety tego protokołu, w porównaniu z istniejącymi powszechnymi podejściami do analizy obrazu (takimi jak liniowe skanowanie intensywności pikseli lub obliczanie średniej intensywności pikseli w ROI), zostały szczegółowo opisane we wcześniejszych publikacjach 1,9. Krótko mówiąc, protokół ten umożliwia generowanie integralnych promieniowych profili int...

Celem tej pracy jest przedstawienie protokołu skanowania zegara, który jest niezależny od platformy i dostępny dla każdego badacza zainteresowanego tego typu analizą obrazu. Protokół Clock Scan został pierwotnie opracowany w 2006 roku1, w celu ulepszenia istniejących metod kwantyfikacji intensywności pikseli w wypukłych obszarach zainteresowania (ROI), metody, która ma lepszą zdolność integracji i lepszą rozdzielczość przestrzenną. Podczas akwizycji protokół sekwencyjnie zbiera wiele promieniowych profili intensywności pikseli, skanowanych od centrum ROI do jego granicy lub do z góry określonej odległości poza ROI w celu zmierzenia intensywności pikseli "tła". Protokół skaluje te profile zgodnie z promieniem komórki, mierzonym w kierunku skanowania. W związku z tym odległość od środka do granicy ROI każdego pojedynczego skanu promieniowego wynosi zawsze 100% skali X. Na koniec program uśrednia te poszczególne profile w jeden integralny profil intensywności pikseli promieniowych. Ze względu na skalowanie, średni profil intensywności pikseli, generowany przez protokół "Clock Scan", nie zależy ani od wielkości ROI, ani też, w rozsądnych granicach, od kształtu ROI. Ta metoda umożliwia bezpośrednie porównanie lub, w razie potrzeby, uśrednienie lub odjęcie profili o różnych ROI. Protokół umożliwia również korekcję integralnych profili intensywności pikseli dowolnego obiektu pod kątem szumu tła poprzez proste odjęcie średniej intensywności pikseli znajdujących się na zewnątrz obiektu. Chociaż został przetestowany tylko na próbkach biologicznych, nasz protokół stanowi cenne uzupełnienie innych istniejących narzędzi do analizy obrazu używanych w badaniach obrazów procesów fizycznych lub chemicznych, które są rozmieszczone wokół punktu początkowego (takich jak dyfuzja substancji ze źródła punktowego)1.
Jednak głównym ograniczeniem oryginalnej metody analizy obrazu było to, że protokół został opracowany jako Visual Basic 6 (VB6) (kod), a zatem był zależny od platformy i trudny do dystrybucji (wymagał VB6). Aby rozwiązać ten problem i dołączyć do podobnych niedawnych wysiłków innych badaczy2, przekształciliśmy kod programu VB6 Clock Scan na dwie wtyczki oparte na Javie, kompatybilne ze sponsorowanymi przez NIH i swobodnie dostępnymi programami do analizy obrazów o otwartym kodzie źródłowym i niezależnymi od platformy, ImageJ3 i Fiji ImageJ4. Co więcej, wtyczki te mają teraz kilka nowych funkcji, które rozszerzają możliwości oryginalnego protokołu do przetwarzania wielu zwrotów z inwestycji i stosów obrazów. Wiele aplikacji do analizy obrazu nie jest przyjaznych dla użytkownika, jeśli chodzi o przeprowadzanie analizy statystycznej wielu obiektów, a co za tym idzie, często wyświetlane są tylko reprezentatywne dane. Dzięki wtyczce Multi Clock Scan ImageJ możliwe jest ułatwienie analizy wielu obiektów jednocześnie. Dzięki temu rozszerzeniu wtyczki możliwa jest teraz solidna ocena statystyczna danych mikroskopowych w odniesieniu do rozkładu intensywności sygnału w pojedynczych komórkach/obiektach. W tym miejscu opisujemy wtyczki Clock Scan i pokazujemy przykłady ich zastosowań w analizie obrazu.

<table><tbody><tr><td>Komputer</td><td>Dowolny</td><td></td><td>kompatybilny z oprogramowaniem wymienionym poniżej</td></tr><tr><td>ImageJ lub Fiji ImageJ</td><td>NIH</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/ lub https://fiji.sc/</td> <td>w pakiecie z Java 1.8 lub nowszym</td></tr><tr><td>Wtyczki do skanowania zegara</td><td>freeware</td><td>https://sourceforge.net/projects/clockscan/</td> <td>Clock_Scan-1.0.1 jar i Multi_Clock_Scan-1.0.1/ jar</td></tr><tr><td>Origin 9.0</td><td>OriginLab</td><td>Northampton, MA, Stany Zjednoczone</td><td>Ten program został użyty do wygenerowania kilku wykresów oryginalnych danych skanowania zegara. Do wykonania tej funkcji można użyć dowolnego innego oprogramowania graficznego</td></tr></tbody></table>

protokół skanowania zegara do analizy obrazu: wtyczki imagej

Clock Scan Protocol for Image Analysis: ImageJ Plugins

Protokół skanowania zegara do analizy obrazu jest skutecznym narzędziem do ilościowego określania średniej intensywności pikseli wewnątrz, na granicy i na zewnątrz (tło) zamkniętego lub segmentowanego obszaru zainteresowania w kształcie wypukłym, co prowadzi do wygenerowania uśrednionego profilu integralnej intensywności piksela radialnego. Protokół ten został pierwotnie opracowany w 2006 roku jako skrypt Visual Basic 6, ale jako taki miał ograniczoną dystrybucję. Aby rozwiązać ten problem i dołączyć do podobnych niedawnych wysiłków innych, przekształciliśmy oryginalny kod protokołu skanowania zegara w dwie wtyczki oparte na Javie, kompatybilne ze sponsorowanymi przez NIH i swobodnie dostępnymi programami do analizy obrazów, takimi jak ImageJ lub Fiji ImageJ. Co więcej, wtyczki te mają kilka nowych funkcji, które jeszcze bardziej rozszerzają zakres możliwości oryginalnego protokołu, takich jak analiza wielu obszarów zainteresowania i stosów obrazów. Ta ostatnia funkcja programu jest szczególnie przydatna w aplikacjach, w których ważne jest określenie zmian związanych z czasem i lokalizacją. W związku z tym analiza skanowania zegara stosów obrazów biologicznych może być potencjalnie zastosowana do rozprzestrzeniania się Na+ lub Ca++ w obrębie pojedynczej komórki, a także do analizy aktywności rozprzestrzeniania się (np. fal Ca++) w populacjach komórek połączonych synaptycznie lub sprzężonych ze złączami szczelinowymi. Tutaj opisujemy te nowe wtyczki do skanowania zegara i pokazujemy kilka przykładów ich zastosowań w analizie obrazu.

Obrazy użyte tutaj w celach ilustracyjnych pochodzą z baz danych stworzonych podczas naszych poprzednich badań biologicznych nad komórkami i tkankami5,6,7 oraz z Allen Mouse Brain Atlas8. Obie wtyczki zostały pomyślnie przetestowane w środowiskach programowych ImageJ 1.50i/Java 1.8.0_77, ImageJ 2.0.0-rc-44/1.50e/ Java 1.8.9_66 oraz Fiji ImageJ 2.0.0-rc54/1.51g/Java 1.8.0_6...

Ten artykuł opisuje dwie nowatorskie wtyczki ImageJ do analizy obrazów 'Clock Scan'. Wtyczki te rozszerzają funkcjonalność oryginalnego programu Visual Basic 6 i, co najważniejsze, udostępniają program dużej społeczności badawczej, łącząc go z bezpłatnym pakietem oprogramowania do analizy obrazu ImageJ.

Protokół skanowania zegara do analizy obrazu: wtyczki ImageJ

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a ...

Ogólnym celem protokołów skanowania zegarowego jest umożliwienie szybkiej charakterystyki średniej intensywności pikseli wewnątrz, wzdłuż krawędzi i/lub na zewnątrz wybranych obszarów zainteresowania. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania oraz w przeszkoleniu analityków obrazu w zakresie średniej intensywności pikseli w konkretnych obszarach zainteresowania. Główną zaletą zastosowanej tutaj techniki skanowania zegarowego jest możliwość szybkiej charakterystyki średniej intensywności pikseli z orbity w jednym lub wielu obszarach zainteresowania.Aby przeprowadzić standardową analizę skanowania zegarowego, w menu Plik w odpowiednim programie ImageJ wybierz Otwórz, aby otworzyć interesujący plik obrazu. Na przykład w tym przypadku analizowany będzie przekrój tkanki z neuronami znakowanymi pod kątem białka będącego przedmiotem zainteresowania. Wybierz odpowiednie narzędzie do rysowania i obrysuj obszar zainteresowania.Z menu Plik wybierz Plugins, a następnie Clock Scan, aby otworzyć standardowy protokół skanowania zegara (okno opcji wyskakujących). Otworzy się również okno menedżera obszarów zainteresowania (ROI) z automatycznie dodanym obrysem. W oknie opcji wtyczki użyj pasków przewijania, aby w razie potrzeby zmienić współrzędne x i y w centrum obszaru zainteresowania.W zależności od tego, jak duży obszar tła poza obiektem ma zostać objęty skanowaniem, należy użyć paska przewijania limitów skanowania (scan limit), aby dostosować zakresy skanowania. Zaznaczyć pola wyboru real radius, subtract background, polar transform i/lub plot with standard deviation, zależnie od wymagań eksperymentalnych. Następnie kliknąć OK, aby uruchomić wtyczkę.Po zakończeniu analizy należy użyć polecenia list, aby uzyskać dostęp do danych liczbowych w celu ich dalszej analizy. W przypadku analizy skanowania zegara dla wielu obszarów, należy otworzyć plik obrazu zawierający wiele obszarów zainteresowania. Przykładowo, w tym przypadku analizowany będzie panel klatek zarejestrowanych w obrębie tego samego przekroju tkanki, zgodnie z wcześniejszą demonstracją.Kliknij Analyze, następnie Tools, a potem Region of Interest Manager i użyj odpowiedniego narzędzia do rysowania, aby obrysować każdy obszar zainteresowania. Narzędzie linii segmentowej jest przydatne do wyboru asymetrycznych obszarów zainteresowania oraz do wykluczenia sygnału tła. Kliknij Add w oknie Region of Interest Manager, aby dodać każdy wybrany obszar zainteresowania do menedżera.w menu Wtyczki (Plugins) wybierz Multi Clock Scan, aby otworzyć okno pop-up z opcjami protokołu, a następnie w razie potrzeby zresetuj limit skanowania. Zaznacz pola wykresem z odchyleniem standardowym i/lub odejmowaniem tła, zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi. Następnie kliknij OK, aby uruchomić protokół, co spowoduje wygenerowanie dwóch okien z wynikowymi wykresami.Aby przeprowadzić analizę skanowania zegarowego (clock scan) stosu obrazów, otwórz interesujący Cię stos obrazów. W tym przypadku analizowany będzie stos obrazów odizolowanego zwoju korzeniowego tylnego, znakowanego fluorescencyjnym wskaźnikiem wrażliwym na wapń, obrazowanego przed i po stymulacji elektrodą wewnątrzkomórkową. Obrysuj obszar zainteresowania (ROI) w obrębie stosu obrazów.Dodaj wybrany stos obrazów do menedżera obszarów zainteresowania (region of interest manager), zgodnie z wcześniejszą demonstracją, a następnie wybierz opcję Multi Clock Scan, aby otworzyć okno pop-up z opcjami protokołu. Zresetuj limit skanowania w razie potrzeby i zaznacz pola wykreśl wykres z odchyleniem standardowym oraz/lub odejmij tło, zgodnie z wymogami eksperymentu. Następnie kliknij OK, aby uruchomić protokół, co wygeneruje dwa okna z wynikowymi wykresami.W tej reprezentatywnej analizie przekroju tkanki z neuronami znakowanymi fluorescencyjnie, wyznaczono obszar zainteresowania (ROI) obejmujący silny sygnał badanego białka, a następnie przeprowadzono standardową analizę skanowania zegarowego w celu zebrania radialnych skanów intensywności pikseli od centrum obszaru zainteresowania do wyznaczonej granicy skanowania. Skan radialny znormalizowano do promienia obszaru zainteresowania w kierunku skanowania. Wyciągnięto średnią, aby uzyskać zintegrowany radialny profil intensywności pikseli, co wykazało, że większość badanego białka znajdowała się w błonie plazmatycznej komórki.Ponieważ do niniejszej analizy wybrano wykres z odchyleniem standardowym, pionowe linie odchylenia standardowego wskazały różnice w intensywności pikseli pomiędzy poszczególnymi profilami skanowania radialnego w danej odległości od punktu początkowego skanowania. W analizie tej przeskanowano wiele obszarów zainteresowania w próbce tkanki neuronów, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, co pozwoliło na wygenerowanie całkowitego profilu intensywności pikseli dla każdego przeskanowanego obiektu w kolejności, w jakiej były one dodawane do menedżera obszarów zainteresowania, a także średniego profilu intensywności pikseli dla każdego wybranego obszaru zainteresowania.Słupki odchylenia standardowego reprezentują zatem zmienność między skanami całkowymi poszczególnych obiektów, a nie między pojedynczymi skanami radialnymi. W tym przypadku przeprowadzono analizę stosu obrazów odizolowanego neuronu z zwoju korzeniowego tylnego, zarejestrowanego w różnych odstępach czasu, przed i po stymulacji za pomocą elektrody wewnątrzkomórkowej. Na koniec analizy wyświetlono całkowity profil intensywności pikseli dla poszczególnych wystąpień badanego obiektu na różnych obrazach w stosie oraz średni profil intensywności pikseli dla wszystkich wystąpień tego obiektu.Ponadto analiza odchylenia standardowego stosu obrazów z przeskanowania zegarowego wykazuje zmienność danych pomiędzy skanami całkowkami w całym stosie obrazów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat pomiaru intensywności pikseli przy użyciu wtyczek do skanowania zegarowego. Naszym celem podczas opracowywania tych wtyczek było udostępnienie tego rodzaju analizy obrazu każdemu badaczowi.Wierzymy, że protokół skanowania zegarowego znajdzie zastosowanie w wielu obszarach badawczych, w tym, między innymi, w aplikacjach obrazowania biologicznego, chemicznego i fizycznego. W miarę dalszego rozwoju i wdrażania tych wtyczek do skanowania zegarowego, będziemy wdzięczni za wszelkie uwagi i sugestie od zainteresowanych stron dotyczące ulepszenia tych narzędzi.

clock-scan-protocol-for-image-analysis-imagej-plugins

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Szczegółowe metody obrazowania Ca2+ o wysokiej rozdzielczości w mięśniach gładkich w obrębie izolowanych organów, obejmujące: przygotowanie tkanki, akwizycję obrazu oraz analizę danych.

Wykrywanie ogniskowych przejściowych zmian stężenia Ca2+ w mięśniach gładkich

Źródło: Mukherjee, K., et. al. Analiza mitochondriów mózgu za pomocą seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej. J. Vis. exp. (2016)Ten film pokazuje przygotowanie,  obrazowanie i analiza tkanki mózgowej myszy przy użyciu seryjnego skaningowego mikroskopu elektronowego z blokową powierzchnią czołową (SBFSEM) w celu wizualizacji ultrastruktury mitochondriów, umożliwiając precyzyjne mapowanie ich morfologii i rozmieszczenia przestrzennego w aksonalnych i dendrytycznych przedziałach...

 Obrazowanie mitochondriów neuronalnych za pomocą seryjnego skaningowego mikroskopu elektronowego typu block-face

Ten artykuł opisuje kwantyfikację hemocytometru i mikrofotografii migracji/inwazji za pomocą dwóch nowych wtyczek ImageJ o otwartym kodzie źródłowym: Kalkulatora Stężenia Komórek i Licznika Testu Migracji.  Ponadto opisano w nim protokoły akwizycji i kalibracji obrazu, a także szczegółowo omówiono wymagania wejściowe wtyczek.

Zautomatyzowana kwantyfikacja i analiza procedur zliczania komórek za pomocą wtyczek ImageJ

Prezentujemy proces tworzenia segmentacji i kwantyfikacji kości beleczkowych dla obrazów 2D i 3D na podstawie zewnętrznej granicy kości za pomocą wtyczki ImageJ. Podejście to jest bardziej wydajne i dokładne niż obecne podejście do ręcznego ręcznego konturowania i zapewnia kwantyfikację warstwa po warstwie, która nie jest dostępna w obecnym oprogramowaniu komercyjnym.

Segmentacja i kwantyfikacja kości beleczkowych wspomagana granicami zewnętrznymi za pomocą wtyczki Imagej

Mikroglej to komórki odpornościowe mózgu, które badają i reagują na zmienione fizjologie mózgu poprzez zmiany morfologiczne, które mogą być oceniane ilościowo. Protokół ten przedstawia protokół analizy oparty na ImageJ, aby przedstawić morfologię mikrogleju jako ciągłe dane zgodnie z takimi wskaźnikami, jak rozgałęzienie komórki, złożoność i kształt.

Kwantyfikacja morfologii mikrogleju na podstawie mikrofotografii immunohistochemicznej tkanki przygotowanej za pomocą ImageJ

Tutaj prezentujemy uproszczone metody wytwarzania przezroczystych fantomów nerwowo-naczyniowych i charakteryzowania przepływu w nich. Zwracamy uwagę na kilka ważnych parametrów i pokazujemy ich związek z dokładnością pola.

Badania szybkościomierzy obrazu cząstek w mezoskali, przepływów nerwowo-naczyniowych in vitro

Genetycznie kodowane wskaźniki Ca2+ (GECI) radykalnie zmieniły sposób wykonywania obrazowania in situ Ca2+. Aby zmaksymalizować odzysk danych z takich nagrań, wymagana jest odpowiednia analiza sygnałów Ca2+. Protokoły przedstawione w tym artykule ułatwiają kwantyfikację sygnałów Ca2+ zarejestrowanych in situ przy użyciu mapowania czasoprzestrzennego i analizy opartej na cząstkach.

Zastosowania technik mapowania czasoprzestrzennego i analizy cząstek do ilościowego określania wewnątrzkomórkowej sygnalizacji Ca2+ in situ

Przedstawiona tutaj metoda wykorzystuje mikrowzorce wraz z obrazowaniem ilościowym, aby ujawnić organizację przestrzenną w kulturach ssaków. Technika ta jest łatwa do wdrożenia w standardowym laboratorium biologii komórki i oferuje elastyczny system do badania wzorców in vitro.

Mapowanie wyłaniającej się organizacji przestrzennej komórek ssaków za pomocą mikrowzorców i obrazowania ilościowego

Szczegółowo opisujemy prostą metodę tworzenia filmów poklatkowych o wysokiej rozdzielczości rojów Pseudomonas aeruginosa, które reagują na bakteriofagi (fagi) i stres antybiotykowy za pomocą płaskiego skanera dokumentów. Procedura ta jest szybką i prostą metodą monitorowania dynamiki roju i może być dostosowana do badania ruchliwości i wzrostu innych gatunków bakterii.

Obrazowanie poklatkowe rojów bakterii i zbiorowej reakcji na stres

Ten protokół przedstawia zbiór sarkomerów, wapnia i makroskopowych danych geometrycznych z aktywnie kurczącego się trabecula serca ex vivo. Te równoczesne pomiary są możliwe dzięki integracji trzech modalności obrazowania.

Jednoczesne obrazowanie w jasnym polu, fluorescencji i optycznej koherentnej tomografii kurczących się beleczków serca ex vivo

Ta metoda określa ilościowo obfitość mikroorganizmów za pomocą formatu 96-dołkowej płytki do płytek tworzących kolonie (CFU) i jest stosowana do mikrobiomu Drosophila w próbkach homogenatu całych much. Jednostki CFU są zliczane za pomocą oprogramowania do automatycznej analizy obrazu, które jest dostępne tutaj.

Szybkie zliczanie jednostek tworzących kolonie w formacie 96-dołkowej płytki zastosowane do mikrobiomu Drosophila

Poznaj analizę obrazu metodą Clock Scan za pomocą wtyczek ImageJ do badania intensywności pikseli w regionach zainteresowania. Narzędzia te ułatwiają szybką charakterystykę danych w neurobiologii.

Protokół skanowania zegara do analizy obrazu: wtyczki ImageJ

Przeglądaj więcej filmów