Protokół skanowania zegara do analizy obrazu: wtyczki ImageJ

Ogólnym celem tych protokołów skanowania zegara jest umożliwienie szybkiej charakterystyki średniej intensywności pikseli wewnątrz, wzdłuż granicy i/lub na zewnątrz wybranych obszarów zainteresowania. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania i nauczyć analityków obrazu na temat średniej intensywności pikseli w określonych obszarach zainteresowania. Głównymi zaletami techniki skanowania zegara jest to, że można ją wykorzystać do szybkiego scharakteryzowania średniej intensywności pikseli z orbity w jednym lub wielu obszarach zainteresowania.

W przypadku standardowej analizy skanowania zegara, w menu Plik, w odpowiednim programie ImageJ wybierz opcję Otwórz, aby otworzyć plik obrazu, który Cię interesuje. Na przykład w tym przypadku analizowany będzie wycinek tkanki z neuronami oznaczonymi dla interesującego nas białka. Wybierz odpowiednie narzędzie do rysowania i nakreśl obszar zainteresowania.

Wybierz Wtyczki i skanowanie zegara z menu Plik, aby otworzyć standardowy protokół skanowania zegara, wyskakujące okno opcji. Otworzy się również okno menedżera obszaru zainteresowań z automatycznie dodanym konspektem. W oknie opcji Wtyczka użyj pasków przewijania, aby odpowiednio zmienić współrzędne x i y w środku obszaru zainteresowania.

W zależności od tego, jaka część obszaru tła poza obiektem powinna być objęta skanowaniem, użyj paska przewijania limitu skanowania, aby dostosować limity skanowania. Zaznacz pola wyboru promień rzeczywisty, odejmij tło, transformację biegunową i/lub wykreśl z odchyleniem standardowym, zgodnie z potrzebami doświadczalnymi. Następnie kliknij OK, aby uruchomić wtyczkę.

Po zakończeniu analizy użyj polecenia list, aby uzyskać dostęp do danych numerycznych w celu dalszej analizy. Aby przeanalizować skanowanie zegara wielu regionów, otwórz plik obrazu zawierający wiele obszarów zainteresowania. Na przykład w tym przypadku analizowany będzie panel klatek przechwyconych w tym samym przekroju tkanki, jak właśnie pokazano.

Kliknij Analizuj, następnie Narzędzia, a następnie Menedżer obszaru zainteresowań i użyj odpowiedniego narzędzia do rysowania, aby obrysować każdy obszar zainteresowania. Narzędzie do segmentowania linii jest przydatne do zaznaczania asymetrycznych obszarów zainteresowania i wykluczania etykiet tła. Kliknij przycisk Dodaj w oknie Menedżer obszaru zainteresowania, aby dodać każdy region zainteresowania do wybranego menedżera.

w menu Wtyczki wybierz Skanowanie wielu zegarów, aby otworzyć wyskakujące okno opcji protokołu i w razie potrzeby zresetować limit skanowania. Sprawdź wykres z odchyleniem standardowym i/lub odejmij pola tła, zgodnie z eksperymentalnym wnioskiem. Następnie kliknij przycisk OK, aby uruchomić protokół, który wygeneruje dwa okna wykresu wyjściowego.

Aby przeprowadzić analizę skanowania zegara stosu obrazów, otwórz interesujący go stos obrazów. W tym przypadku przeanalizowany zostanie stos obrazów izolowanego zwoju korzenia grzbietowego, oznaczonego światłoczułym fluorescencyjnym wapniem, który został zobrazowany przed i po wewnątrzkomórkowej stymulacji elektrod. Nakreśl obszar zainteresowania w stosie obrazów.

Dodaj wybrany stos obrazów do menedżera obszaru zainteresowania, jak pokazano powyżej, i wybierz opcję Skanowanie wielu zegarów, aby otworzyć wyskakujące okno opcji protokołu. W razie potrzeby zresetuj limit skanowania i sprawdź wykres z odchyleniem standardowym i/lub odejmij pola tła, zgodnie z potrzebami eksperymentalnymi. Następnie kliknij przycisk OK, aby uruchomić protokół, generując dwa okna wykresu wyjściowego.

W tej reprezentatywnej analizie wycinka tkanki znakowanych fluorescencyjnie neuronów, obszar zainteresowania został narysowany przez jasny sygnał dla białka będącego przedmiotem zainteresowania, a następnie przeprowadzono standardową analizę skanowania zegara w celu zebrania skanów intensywności pikseli radialnych od środka obszaru zainteresowania do zarysowanego limitu skanowania. Skany promieniowe zostały znormalizowane do obszaru zainteresowania o promieniu w kierunku skanowania. Uśrednionie, aby uzyskać integralny profil intensywności pikseli radiowych, ujawniając, że większość białka będącego przedmiotem zainteresowania została zmierzona na błonie plazmatycznej komórki.

Ponieważ do tej analizy wybrano wykres z odchyleniem standardowym, pionowe linie odchylenia standardowego wskazywały intensywność między pikselami poszczególnych profili skanowania radialnego w danej odległości od początku skanowania. W tej analizie skanowano wiele obszarów zainteresowania w próbce tkanki neuronalnej, jak właśnie pokazano, generując integralny profil intensywności pikseli dla każdego skanowanego obiektu w sekwencji, w której zostały dodane do menedżera obszaru zainteresowania. Oraz średni profil intensywności pikseli dla każdego wybranego obszaru zainteresowania.

Te słupki odchylenia standardowego reprezentują zatem zmienność między całkowymi skanami poszczególnych obiektów, a nie pojedynczymi skanami promieniowymi. W tym przypadku przeprowadzono analizę stosu obrazów izolowanego neuronu zwoju korzenia grzbietowego uchwyconego w różnym czasie, przed i po stymulacji, za pomocą elektrody wewnątrzkomórkowej. Na końcu analizy wyświetlono integralny profil intensywności pikseli poszczególnych instancji obiektu zainteresowania na różnych obrazach w stosie oraz średni profil intensywności pikseli dla wszystkich instancji obiektu.

Co więcej, analiza odchylenia standardowego stosu obrazów zeskanowanych przez zegar pokazuje zmienność danych między całkowymi skanami w całym stosie obrazów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć intensywność pikseli za pomocą wtyczek do skanowania zegara. Naszym celem przy tworzeniu tych wtyczek było udostępnienie tego typu analiz obrazów za darmo każdemu badaczowi.

Wierzymy, że protokół skanowania zegara będzie wykorzystywany w wielu obszarach badań, w tym między innymi w zastosowaniach obrazowania biologicznego, chemicznego i fizycznego. Ponieważ nadal rozwijamy i obsługujemy te wtyczki do skanowania zegara, będziemy wdzięczni za wszelkie opinie i sugestie zainteresowanych stron dotyczące ulepszenia tych narzędzi.