Zastosowania technik mapowania czasoprzestrzennego i analizy cząstek do ilościowego określania wewnątrzkomórkowej sygnalizacji Ca²⁺ in situ

Zdolność do pozyskiwania dużych ilości danych z eksperymentów obrazowania wapnia znacznie się poprawiła, zwłaszcza w przypadku eksperymentów z obrazowaniem tkanek. Nasze protokoły opisują odpowiednie techniki analizy w celu ilościowego określenia i opisania tych zestawów danych. Nasze protokoły generują szereg wartości przestrzennych, czasowych i intensywności, które są nieodłącznie związane z sygnalizacją wapniową w całych tkankach, co może zostać utracone w bardziej podstawowej analizie.

Na godzinę przed obrazowaniem przenieść jelito cienkie pobrane od myszy z komórkami śródmiąższowymi Cajala lub ICC, które specyficznie wyrażają genetycznie kodowany wskaźnik wapnia, do etapu mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem. I w sposób ciągły perfundować tkankę roztworem wodorowęglanu Krebsa-Ringera lub KRB o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Korzystając z powiększenia od 60 do 100 razy, zlokalizuj gwiaździsty splot mięśniowo-jelitowy ICC lub ICC-MY między okrężnymi i podłużnymi warstwami mięśni gładkich jelita cienkiego.

Następnie zlokalizuj wrzecionowaty splot mięśniowy głęboki ICC lub ICC-DMP w jednej płaszczyźnie między okrężną warstwą mięśni gładkich a splotem podśluzówkowym i zapisz filmy jako stos obrazów TIFF. Aby utworzyć mapy czasoprzestrzenne lub STM aktywności wapnia ICC-DMP, otwórz stos obrazów w ImageJ i kliknij opcję Obraz, Typ i 32-bitowy, aby zmodyfikować jakość obrazu. Aby utworzyć skanowanie linii, kliknij prawym przyciskiem myszy narzędzie wyboru linii i wybierz linię podzieloną na segmenty.

Używając pojedynczych lewych przycisków myszy, narysuj linię wzdłuż środkowego dostępu pojedynczego ICC-DMP, klikając dwukrotnie, gdy cała komórka zostanie obrysowana. Wybierz Obraz, Stosy i Ponowne pokrój. Pojawi się wyskakujące okienko.

Wybierz opcję Obróć o 90 stopni, aby zorientować skan linii od lewej do prawej, tak aby można go było skalibrować i odczytać w funkcji czasu na osi x ze spacją na osi y, a następnie kliknij przycisk OK. Pojawi się mapa czasoprzestrzenna. Aby dokładnie zmierzyć amplitudę sygnałów wapniowych z mapy, wybierz zaznaczenie prostokątne i narysuj obszar zainteresowania wokół obszaru w STM, który wyświetla najbardziej jednorodny i najmniej intensywny obszar fluorescencji. Kliknij przycisk Analizuj i histogram, aby uzyskać średnią wartość intensywności w wybranym obszarze zainteresowania, a następnie kliknij przycisk Edycja, Zaznaczenie, Zaznacz wszystko, aby zaznaczyć cały STM.

Następnie kliknij Proces, Matematyka i Dziel i wprowadź średnią wartość intensywności z wybranym regionem STM w wyskakującym okienku. STM zmieni kolor na. Popraw to, klikając Obraz, Dopasuj, Jasność/Kontrast i Auto w wyskakującym okienku.

Skan liniowy zostanie teraz skalibrowany dla amplitudy z intensywnością fluorescencji wyrażoną jako fluorescencja podzielona przez fluorescencję zerową. STM wyświetli liczbę klatek w stosie TIFF na osi x oraz liczbę pikseli reprezentujących długość komórki na osi y. Aby określić ilościowo dane czasowe i przestrzenne z sygnałów wapniowych, kliknij Obraz i właściwości i wprowadź odpowiednie wartości, aby w pełni skalibrować STM dla przestrzeni i czasu w wyskakującym okienku.

Aby przeanalizować poszczególne zdarzenia wapnia, kliknij Linia prosta, a następnie kliknij i przeciągnij STM, aby narysować prostą linię poziomą przechodzącą przez środek zdarzenia wapniowego równolegle do osi x. Następnie kliknij przycisk Analizuj i kreśl profil. Pojawi się ramka przedstawiająca profil wykresu zdarzenia wapniowego.

Aby przeprowadzić analizę danych sygnalizacji wapniowej ICC-MY na podstawie cząstek, otwórz plik filmowy w Volumetry i kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać STK Filter, Differentiate. Kliknij ponownie prawym przyciskiem myszy, aby wprowadzić wartość do rozróżnienia. Naciśnij Enter i kliknij lewym przyciskiem myszy, aby zainicjować różnicowanie.

Aby utworzyć cząstki, użyj środkowego przycisku myszy, aby przewinąć film i wybrać sekcję od 20 do 40 klatek, która obejmuje okres spoczynku, a następnie wystąpienie przejściowego klastra wapnia i od 20 do 40 klatek, które następują bezpośrednio po klastrze. Po zaznaczeniu wszystkich klatek kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie filmu, aby uzyskać dostęp do informacji o cząstkach STK OPS Ramp DS, a następnie kliknij, aby uruchomić procedurę analizy cząstek, która stopniowo zwiększa próg od maksymalnej do minimalnej intensywności. Aby zapewnić pomyślną analizę cząstek, upewnij się, że uwzględniłeś jak najwięcej nieaktywności przejściowej grupy wapniowej i jak najwięcej nieaktywności przejściowej grupy wapniowej po jej

Pomoże to zwiększyć stosunek sygnału do szumu. Analiza zostanie przedstawiona graficznie w oknie wykresu jako wykres szumu, a w oknie śladów jako trzy kolorowe ślady, przy czym zielony ślad reprezentuje liczbę cząstek, czerwony ślad reprezentuje średnią wielkość cząstek, a niebieski ślad reprezentuje bezwzględny próg intensywności. Aby zrównoważyć histogram wykresu szumu cząstek, naciśnij H na klawiaturze.

Następnie naciśnij prawy nawiasu, aby przełączać się między schematami kolorów, aż tło stanie się białe z kolorowymi śladami na górze. Naciśnij raz F na klawiaturze, aby wyświetlić narzędzie pomiarowe. Następnie naciśnij F po raz drugi, aby zaznaczyć pojedynczą pionową linię na pasku przewijania okna śladów na wykresie na skrzyżowaniu, na którym kolorowe wykresy zaczynają przesuwać się w prawą stronę.

W oknie śladów użyj środkowego przycisku myszy, aby przewinąć od punktu przegięcia czerwonego śladu do zaznaczonej białej pionowej linii. Po zanotowaniu wyświetlanej średniej Y kliknij ponownie środkowym przyciskiem myszy w oknie śladów, aby usunąć zaznaczenie niebieskiego śladu. W oknie filmu kliknij C, aby wyświetlić koło kolorów, lub D, aby dostosować próg.

Prawidłowe cząstki będą teraz wyświetlane na czerwono, a te, które się nasycają, będą białe. Użyj lewego przycisku myszy, aby przewinąć, aż białe obszary zostaną usunięte, i użyj środkowego przycisku myszy, aby dostosować żółtą wartość liczbową w kole kolorów do średniej wartości Y, aby przypisać wszystko na czerwono jako aktywną cząstkę przejściową wapnia w określonym punkcie progowym. Aby zapisać dane jako plik cząstek opartych na współrzędnych, kliknij prawym przyciskiem myszy, aby uzyskać dostęp do STK 3D, zapisz cząstkę zerową i kliknij lewym przyciskiem myszy, aby zapisać plik.

Aby utworzyć mapy cieplne aktywności cząstek, otwórz zapisany plik cząstek i kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie filmu, aby uzyskać dostęp do cząstek STKops, flagi StatMap i wprowadzić przypisania flag do analizy. Kliknij, aby zastosować analizę i mapę cieplną przedstawiającą łączną liczbę cząstek na całej długości nagrania, przy czym różne kolory reprezentują procentowe występowanie w całym nagraniu. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zapisać mapę skupień jako plik TIFF.

Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie filmu, aby uzyskać dostęp do pomiaru cząstek, statystyk cząstek STK równych i wprowadź przypisanie flagi do analizy. W oknie śledzenia zostanie wygenerowana seria śladów. Analiza STM zapewnia możliwość monitorowania i rejestrowania charakterystyk przestrzennych sygnalizacji wapniowej, takich jak rozprzestrzenianie się przestrzenne i prędkość propagacji.

Informacje te można zgromadzić, aby zapewnić dość kompletny obraz zachowań sygnalizacyjnych wapnia w komórkach w ich natywnym środowisku. Za pomocą analizy cząstek można obliczyć informacje ilościowe o sygnalizacji wapniowej, mierząc powierzchnię cząstek i liczbę cząstek, które razem można wykorzystać do określenia zakresów przestrzennych aktywacji sygnału wapniowego w określonym polu widzenia. Analiza cząstek pozwala również na dogłębną kwantyfikację subkomórkowej sygnalizacji wapnia poprzez badanie lokalizacji i prawdopodobieństwa wypalania miejsc wypalania wapnia.

Przydzielając cząstki do różnych flag w oparciu o ich charakterystykę czasową, cząstki inicjujące mogą być dokładnie odwzorowane. Można również uzyskać bogactwo twardych danych na temat liczby miejsc inicjacji, rozmiaru miejsca w pikselach i mikrometrach, prawdopodobieństwa, że każde miejsce inicjacji zostanie wystrzelone raz lub wiele razy podczas każdego przejściowego klastra wapnia oraz procentu miejsc wypalania, które są uruchamiane podczas każdego cyklu przejściowego klastra wapnia. Konsekwencja jest kluczem do sukcesu w tym protokole.

Wszystkie zestawy danych i wszystkie filmy muszą być traktowane dokładnie tak samo, aby zapewnić wiarygodne, powtarzalne wyniki. Jest to szczególnie ważne, gdy mamy do czynienia z plikami cząstek. Nasze protokoły pozwalają na głęboką charakterystykę sygnalizacji wapniowej in situ, a szereg metod statystycznych, jeśli są odpowiednio stosowane, może ocenić różnice między szeregiem parametrów przestrzennych i czasowych.

Te techniki analizy w naszym protokole pozwoliły naukowcom zadać i odpowiedzieć na wcześniej nieodpowiadające pytania dotyczące rozrusznika jelit i unerwienia jelit, a także kontroli neuronalnej dolnych dróg moczowych.