Zastosowania technik mapowania czasoprzestrzennego i analizy cząstek do ilościowego określania wewnątrzkomórkowej sygnalizacji Ca2+ in situ
7 stycznia 2019
Genetycznie kodowane wskaźniki Ca2+ (GECI) radykalnie zmieniły sposób wykonywania obrazowania in situ Ca2+. Aby zmaksymalizować odzysk danych z takich nagrań, wymagana jest odpowiednia analiza sygnałów Ca2+. Protokoły przedstawione w tym artykule ułatwiają kwantyfikację sygnałów Ca2+ zarejestrowanych in situ przy użyciu mapowania czasoprzestrzennego i analizy opartej na cząstkach.
Zdolność do pozyskiwania dużych ilości danych z eksperymentów obrazowania wapnia znacznie się poprawiła, zwłaszcza w przypadku eksperymentów z obrazowaniem tkanek. Nasze protokoły opisują odpowiednie techniki analizy w celu ilościowego określenia i opisania tych zestawów danych. Nasze protokoły generują szereg wartości przestrzennych, czasowych i intensywności, które są nieodłącznie związane z sygnalizacją wapniową w całych tkankach, co może zostać utracone w bardziej podstawowej analizie.
Na godzinę przed obrazowaniem przenieść jelito cienkie pobrane od myszy z komórkami śródmiąższowymi Cajala lub ICC, które specyficznie wyrażają genetycznie kodowany wskaźnik wapnia, do etapu mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem. I w sposób ciągły perfundować tkankę roztworem wodorowęglanu Krebsa-Ringera lub KRB o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Korzystając z powiększenia od 60 do 100 razy, zlokalizuj gwiaździsty splot mięśniowo-jelitowy ICC lub ICC-MY między okrężnymi i podłużnymi warstwami mięśni gładkich jelita cienkiego.
Następnie zlokalizuj wrzecionowaty splot mięśniowy głęboki ICC lub ICC-DMP w jednej płaszczyźnie między okrężną warstwą mięśni gładkich a splotem podśluzówkowym i zapisz filmy jako stos obrazów TIFF. Aby utworzyć mapy czasoprzestrzenne lub STM aktywności wapnia ICC-DMP, otwórz stos obrazów w ImageJ i kliknij opcję Obraz, Typ i 32-bitowy, aby zmodyfikować jakość obrazu. Aby utworzyć skanowanie linii, kliknij prawym przyciskiem myszy narzędzie wyboru linii i wybierz linię podzieloną na segmenty.
Używając pojedynczych lewych przycisków myszy, narysuj linię wzdłuż środkowego dostępu pojedynczego ICC-DMP, klikając dwukrotnie, gdy cała komórka zostanie obrysowana. Wybierz Obraz, Stosy i Ponowne pokrój. Pojawi się wyskakujące okienko.
Wybierz opcję Obróć o 90 stopni, aby zorientować skan linii od lewej do prawej, tak aby można go było skalibrować i odczytać w funkcji czasu na osi x ze spacją na osi y, a następnie kliknij przycisk OK. Pojawi się mapa czasoprzestrzenna. Aby dokładnie zmierzyć amplitudę sygnałów wapniowych z mapy, wybierz zaznaczenie prostokątne i narysuj obszar zainteresowania wokół obszaru w STM, który wyświetla najbardziej jednorodny i najmniej intensywny obszar fluorescencji. Kliknij przycisk Analizuj i histogram, aby uzyskać średnią wartość intensywności w wybranym obszarze zainteresowania, a następnie kliknij przycisk Edycja, Zaznaczenie, Zaznacz wszystko, aby zaznaczyć cały STM.
Następnie kliknij Proces, Matematyka i Dziel i wprowadź średnią wartość intensywności z wybranym regionem STM w wyskakującym okienku. STM zmieni kolor na. Popraw to, klikając Obraz, Dopasuj, Jasność/Kontrast i Auto w wyskakującym okienku.
Skan liniowy zostanie teraz skalibrowany dla amplitudy z intensywnością fluorescencji wyrażoną jako fluorescencja podzielona przez fluorescencję zerową. STM wyświetli liczbę klatek w stosie TIFF na osi x oraz liczbę pikseli reprezentujących długość komórki na osi y. Aby określić ilościowo dane czasowe i przestrzenne z sygnałów wapniowych, kliknij Obraz i właściwości i wprowadź odpowiednie wartości, aby w pełni skalibrować STM dla przestrzeni i czasu w wyskakującym okienku.
Aby przeanalizować poszczególne zdarzenia wapnia, kliknij Linia prosta, a następnie kliknij i przeciągnij STM, aby narysować prostą linię poziomą przechodzącą przez środek zdarzenia wapniowego równolegle do osi x. Następnie kliknij przycisk Analizuj i kreśl profil. Pojawi się ramka przedstawiająca profil wykresu zdarzenia wapniowego.
Aby przeprowadzić analizę danych sygnalizacji wapniowej ICC-MY na podstawie cząstek, otwórz plik filmowy w Volumetry i kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać STK Filter, Differentiate. Kliknij ponownie prawym przyciskiem myszy, aby wprowadzić wartość do rozróżnienia. Naciśnij Enter i kliknij lewym przyciskiem myszy, aby zainicjować różnicowanie.
Aby utworzyć cząstki, użyj środkowego przycisku myszy, aby przewinąć film i wybrać sekcję od 20 do 40 klatek, która obejmuje okres spoczynku, a następnie wystąpienie przejściowego klastra wapnia i od 20 do 40 klatek, które następują bezpośrednio po klastrze. Po zaznaczeniu wszystkich klatek kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie filmu, aby uzyskać dostęp do informacji o cząstkach STK OPS Ramp DS, a następnie kliknij, aby uruchomić procedurę analizy cząstek, która stopniowo zwiększa próg od maksymalnej do minimalnej intensywności. Aby zapewnić pomyślną analizę cząstek, upewnij się, że uwzględniłeś jak najwięcej nieaktywności przejściowej grupy wapniowej i jak najwięcej nieaktywności przejściowej grupy wapniowej po jej
zakończeniu.Pomoże to zwiększyć stosunek sygnału do szumu. Analiza zostanie przedstawiona graficznie w oknie wykresu jako wykres szumu, a w oknie śladów jako trzy kolorowe ślady, przy czym zielony ślad reprezentuje liczbę cząstek, czerwony ślad reprezentuje średnią wielkość cząstek, a niebieski ślad reprezentuje bezwzględny próg intensywności. Aby zrównoważyć histogram wykresu szumu cząstek, naciśnij H na klawiaturze.
Następnie naciśnij prawy nawiasu, aby przełączać się między schematami kolorów, aż tło stanie się białe z kolorowymi śladami na górze. Naciśnij raz F na klawiaturze, aby wyświetlić narzędzie pomiarowe. Następnie naciśnij F po raz drugi, aby zaznaczyć pojedynczą pionową linię na pasku przewijania okna śladów na wykresie na skrzyżowaniu, na którym kolorowe wykresy zaczynają przesuwać się w prawą stronę.
W oknie śladów użyj środkowego przycisku myszy, aby przewinąć od punktu przegięcia czerwonego śladu do zaznaczonej białej pionowej linii. Po zanotowaniu wyświetlanej średniej Y kliknij ponownie środkowym przyciskiem myszy w oknie śladów, aby usunąć zaznaczenie niebieskiego śladu. W oknie filmu kliknij C, aby wyświetlić koło kolorów, lub D, aby dostosować próg.
Prawidłowe cząstki będą teraz wyświetlane na czerwono, a te, które się nasycają, będą białe. Użyj lewego przycisku myszy, aby przewinąć, aż białe obszary zostaną usunięte, i użyj środkowego przycisku myszy, aby dostosować żółtą wartość liczbową w kole kolorów do średniej wartości Y, aby przypisać wszystko na czerwono jako aktywną cząstkę przejściową wapnia w określonym punkcie progowym. Aby zapisać dane jako plik cząstek opartych na współrzędnych, kliknij prawym przyciskiem myszy, aby uzyskać dostęp do STK 3D, zapisz cząstkę zerową i kliknij lewym przyciskiem myszy, aby zapisać plik.
Aby utworzyć mapy cieplne aktywności cząstek, otwórz zapisany plik cząstek i kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie filmu, aby uzyskać dostęp do cząstek STKops, flagi StatMap i wprowadzić przypisania flag do analizy. Kliknij, aby zastosować analizę i mapę cieplną przedstawiającą łączną liczbę cząstek na całej długości nagrania, przy czym różne kolory reprezentują procentowe występowanie w całym nagraniu. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zapisać mapę skupień jako plik TIFF.
Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie filmu, aby uzyskać dostęp do pomiaru cząstek, statystyk cząstek STK równych i wprowadź przypisanie flagi do analizy. W oknie śledzenia zostanie wygenerowana seria śladów. Analiza STM zapewnia możliwość monitorowania i rejestrowania charakterystyk przestrzennych sygnalizacji wapniowej, takich jak rozprzestrzenianie się przestrzenne i prędkość propagacji.
Informacje te można zgromadzić, aby zapewnić dość kompletny obraz zachowań sygnalizacyjnych wapnia w komórkach w ich natywnym środowisku. Za pomocą analizy cząstek można obliczyć informacje ilościowe o sygnalizacji wapniowej, mierząc powierzchnię cząstek i liczbę cząstek, które razem można wykorzystać do określenia zakresów przestrzennych aktywacji sygnału wapniowego w określonym polu widzenia. Analiza cząstek pozwala również na dogłębną kwantyfikację subkomórkowej sygnalizacji wapnia poprzez badanie lokalizacji i prawdopodobieństwa wypalania miejsc wypalania wapnia.
Przydzielając cząstki do różnych flag w oparciu o ich charakterystykę czasową, cząstki inicjujące mogą być dokładnie odwzorowane. Można również uzyskać bogactwo twardych danych na temat liczby miejsc inicjacji, rozmiaru miejsca w pikselach i mikrometrach, prawdopodobieństwa, że każde miejsce inicjacji zostanie wystrzelone raz lub wiele razy podczas każdego przejściowego klastra wapnia oraz procentu miejsc wypalania, które są uruchamiane podczas każdego cyklu przejściowego klastra wapnia. Konsekwencja jest kluczem do sukcesu w tym protokole.
Wszystkie zestawy danych i wszystkie filmy muszą być traktowane dokładnie tak samo, aby zapewnić wiarygodne, powtarzalne wyniki. Jest to szczególnie ważne, gdy mamy do czynienia z plikami cząstek. Nasze protokoły pozwalają na głęboką charakterystykę sygnalizacji wapniowej in situ, a szereg metod statystycznych, jeśli są odpowiednio stosowane, może ocenić różnice między szeregiem parametrów przestrzennych i czasowych.
Te techniki analizy w naszym protokole pozwoliły naukowcom zadać i odpowiedzieć na wcześniej nieodpowiadające pytania dotyczące rozrusznika jelit i unerwienia jelit, a także kontroli neuronalnej dolnych dróg moczowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na usprawnieniu analizy danych obrazowania wapnia w eksperymentach tkankowych, w szczególności przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników Ca2+ (GECIs). Przedstawia ono szczegółowe protokoły ułatwiające kwantyfikację sygnałów wapniowych przy użyciu zaawansowanych technik analitycznych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Obrazowanie wapnia
- Kwantyfikacja sygnału
- Analiza tkanek
Wstęp
- Udoskonalone pozyskiwanie danych z eksperymentów obrazowania wapnia
- Znaczenie precyzyjnych technik analizy w rejestrowaniu sygnałów wapniowych
- Zastosowanie genetycznie kodowanych wskaźników do obrazowania in situ
Zastosowane metody
- Mapowanie czasoprzestrzenne
- Analiza oparta na cząstkach
- Techniki mikroskopowe (mikroskop konfokalny)
Główne wyniki
- Protokoły dostarczają danych przestrzennych, czasowych i intensywności, które są kluczowe dla zrozumienia sygnalizacji wapniowej
- Zwiększona dokładność w pomiarze zdarzeń wapniowych i ich właściwości
- Ustanowiono ramy analizy klastrów przejściowych stężeń wapnia w próbkach tkanek
Wnioski
- Badanie prezentuje zaawansowane metody ilościowego pomiaru sygnałów wapniowych w tkankach
- Podkreśla znaczenie udoskonalonych podejść analitycznych dla lepszego zrozumienia biologicznych mechanizmów sygnalizacji wapniowej
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Dokładne ilościowe określenie sygnałów wewnątrzkomórkowych Ca2+ w natywnych środowiskach tkankowych ma kluczowe znaczenie dla minimalizacji ryzyka podczas walidacji celów w procesie odkrywania leków na schorzenia przewodu pokarmowego i układu nerwowo-mięśniowego. Mapowanie przestrzennie-czasowe oraz analiza oparta na cząstkach umożliwiają wyodrębnienie parametrów przestrzennych, czasowych i intensywności z obrazowania Ca2+ o wysokiej rozdzielczości, co zmniejsza zależność od uproszczonych pomiarów ROI, które pomijają złożoność sygnalizacji. Podejście to wspiera zrozumienie mechanizmów aktywności rozrusznika oraz szlaków kontroli neuronalnej, co zwiększa pewność predykcyjną we wczesnych etapach odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez kwantyfikację wzorców sygnałowych Ca2+, takich jak częstotliwość, czas trwania, prędkość propagacji i amplituda w nienaruszonych tkankach.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez szczegółową charakterystykę aktywności komórek Cajala (ICC), które są kluczowymi regulatorami motoryki przewodu pokarmowego.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję projektów w portfolio poprzez powiązanie dynamiki sygnałowania Ca2+ z rozrusznikowością jelit oraz neuronalną kontrolą dolnego odcinka dróg moczowych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów analizy poprzez generowanie ilościowych wyników z klastrów przejściowych Ca2+ in situ.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność testów dzięki skalibrowanym mapom czasoprzestrzennym (STMs) oraz analizie opartej na cząstkach z określonymi protokołami progowania i przypisywania flag.
- Skalowalność: Umożliwia przygotowanie do screeningu za pomocą plików cząsteczek opartych na współrzędnych oraz map ciepła, co pozwala na przetwarzanie dużych wolumenów danych i porównywanie wyników między różnymi eksperymentami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy analizę sygnalizacji Ca2+ w jelitowych ICC na etapie odkrywczym z przedkliniczną walidacją zaburzeń motoryki i dysfunkcji dróg moczowych.
- Mechanistyczna redukcja ryzyka: Umożliwia szczegółową kwantyfikację podkomórkowej sygnalizacji Ca2+ poprzez badanie lokalizacji miejsc inicjacji, prawdopodobieństwa wyładowań oraz dynamiki klastrów.
- Postęp skorygowany o ryzyko: Wspiera decyzje typu go/no-go, dostarczając twardych danych na temat liczby miejsc inicjacji, wielkości miejsc w pikselach/mikrometrach oraz procenta aktywnych miejsc wyładowań w cyklu jednego klastra przejściowego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z procesem badawczym, od wczesnego etapu odkrywania (Early Discovery), przez identyfikację wiodącego związku (Lead Identification), aż po badania przedkliniczne, dostarczając ilościowych danych o sygnalizacji Ca2+, które pomagają w walidacji celu terapeutycznego i przygotowaniu testów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez rejestrację rozprzestrzeniania przestrzennego i prędkości propagacji sygnałów Ca2+ za pomocą analizy STM.
- Screening: Zapewnia gotowość do analizy dzięki powtarzalnej kwantyfikacji powierzchni i liczby cząstek, co umożliwia określenie zakresu przestrzennego aktywacji sygnału Ca2+ w zdefiniowanym polu widzenia.
- Analityka: Generuje wyniki statystyczne dotyczące charakterystyki czasowej cząstek, co pozwala na ich przypisanie do znaczników w celu mapowania cząstek inicjujących i oceny prawdopodobieństwa wyładowań.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością przedkliniczną, umożliwiając analizę wzorców sygnalizacji Ca2+ związanych z rozrusznikami jelitowymi i szlakami kontroli neuronalnej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość ponownego wykorzystania w analizie sygnalizacji Ca2+ w różnych systemach modelowych poprzez standaryzowane protokoły kalibracji STM, analizy cząstek i generowania map ciepła.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększenie pewności prognostycznej w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w dynamice sygnalizacji Ca2+.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność osiągnięte dzięki skalibrowanym STM, analizie opartej na cząstkach z regulacją progu oraz wyjściowi danych opartemu na współrzędnych.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa i zmniejszone ryzyko biologiczne na późniejszych etapach dzięki umożliwieniu wczesnego wykrywania niespójnych lub niepowtarzalnych wzorców sygnalizacji.
- Wpływ na portfolio: Decyzje o priorytetyzacji i dalszym rozwoju skorygowane o ryzyko, wsparte ilościowymi danymi dotyczącymi gęstości miejsc inicjacji, ich rozmiaru oraz niezawodności wyładowań.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana wiedza specjalistyczna z zakresu mikroskopii konfokalnej, obsługi programu ImageJ oraz wolumetrii w celu generowania STM i analizy cząstek.
- Wymagane instrumentarium i infrastruktura analityczna obejmują konfokalny mikroskop z dyskiem obrotowym, obsługę stosów obrazów TIFF oraz oprogramowanie do przerywania skanów liniowych (reslice), balansowania histogramów i regulacji progu.
- Wymagania dotyczące standaryzacji międzyzespołowej obejmują spójne traktowanie wszystkich zestawów danych i filmów w celu zapewnienia wiarygodnych i powtarzalnych wyników, szczególnie w odniesieniu do generowania plików cząstek i analizy opartej na flagach.
- Rozważania dotyczące adaptacji w różnych systemach modelowych obejmują dostosowanie orientacji skanu liniowego, wybór klatek dla okresów spoczynku i aktywności oraz kalibrację progu na podstawie profili intensywności fluorescencji.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność starannego wyboru sekcji 20–40 klatek obejmujących okresy spoczynku, klastry przejściowe Ca2+ oraz aktywność po klastrach, aby zapewnić poprawną analizę cząstek i optymalny stosunek sygnału do szumu.
