Name: Zastosowania technik mapowania czasoprzestrzennego i analizy cząstek do ilościowego określania wewnątrzkomórkowej sygnalizacji Ca2+ in situ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Poznaj techniki mapowania czasoprzestrzennego i analizy cząstek do ilościowego określania sygnalizacji Ca²⁺ in situ w tkankach. Metoda umożliwia precyzyjne badanie sygnałów wapniowych w komórkach Cajala jelita cienkiego myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie zostało zapewnione przez NIDDK, za pośrednictwem P01 DK41315.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obrazowanie Ca2 + określonych typów komórek w nienaruszonych tkankach lub w sieciach komórek często ujawnia złożone wzorce stanów przejściowych Ca2 + . Działanie to wymaga starannych i dogłębnych analiz i kwantyfikacji, aby uchwycić jak najwięcej informacji na temat zdarzeń leżących u podstaw tych zdarzeń i kinetyki. Analiza STM i PTCL daje możliwość maksymalizacji ilości danych ilościowych uzyskanych z nagrań tego typu.
Wąska, wrzecionowata morfologia ICC-DMP sprawia, że...

Ca2+ to wszechobecny posłaniec wewnątrzkomórkowy, który kontroluje szeroki zakres procesów komórkowych, takich jak skurcze mięśni1,2, metabolism3, proliferacja komórek3,4,5, stymulacja uwalniania neuroprzekaźników na zakończeniach nerwowych6,7, oraz aktywacja czynników transkrypcyjnych w jądrze. 7 Wewnątrzkomórkowe sygnały Ca2+ często przyjmują formę przejściowych wzrostów cytozolowego Ca2+, które mogą być spontaniczne lub wynikać ze stymulacji agonistycznej, w zależności od typu komórki8. Parametry przestrzenne, czasowe i intensywności nieodłącznie związane z sygnałami Ca2+, takie jak częstotliwość, czas trwania, propagacja, prędkość i amplituda, mogą dostarczyć informacji biologicznej wymaganej do sygnalizacji wewnątrzkomórkowej5,7,9. Cytoplazmatyczne sygnały Ca2 + mogą wynikać z napływu Ca2 + z przestrzeni zewnątrzkomórkowej lub poprzez uwalnianie Ca2 + z retikulum endoplazmatycznego (ER) przez kanały uwalniania Ca2 +, takie jak receptory ryanodyny (RyRs) i receptory trifosforanu inozytolu (IP3Rs) <klasa sup = "xref">10. RyRs i IP3R mogą przyczyniać się do generowania sygnałów Ca2 + i skoordynowanego otwierania tych kanałów, co w połączeniu z różnymi mechanizmami napływu Ca2 + może skutkować niezliczonymi wzorcami sygnalizacji Ca2 +, które są kształtowane przez liczby i prawdopodobieństwo otwarcia kanałów napływu Ca2 +, profil ekspresji kanałów uwalniania Ca2 +, bliskość między kanałami napływu i uwalniania Ca2 + oraz ekspresja i dystrybucja białek wychwytu zwrotnego i ekstruzji Ca2 +. Sygnały Ca2+ mogą przybierać postać jednolitych, długotrwałych globalnych oscylacji o wysokiej intensywności, które mogą trwać kilka sekund lub nawet minut, propagując wewnątrzkomórkowe i międzykomórkowe fale Ca2+, które mogą przekraczać odległości wewnątrzkomórkowe ponad 100 μm10,11,12,13,14,15,16, lub bardziej krótko, przestrzennie zlokalizowane zdarzenia, takie jak iskry Ca2+ i zaciągnięcia Ca2+, które występują w skali czasowej dziesiątek milisekund i rozprzestrzeniają się na mniej niż 5 μm17,18,19,20.
Mikroskopia fluorescencyjna jest szeroko stosowana do monitorowania sygnalizacji Ca2+ w izolowanych i hodowanych komórkach oraz w nienaruszonych tkankach. Tradycyjnie, eksperymenty te obejmowały użycie fluorescencyjnych wskaźników Ca2+, barwników ratiometrycznych i nieratiometrycznych, takich jak Fura2, Fluo3/4 czy Rhod2, między innymi 21,22,23. Wskaźniki te zostały zaprojektowane tak, aby były przepuszczalne dla błon komórkowych, a następnie były uwięzione w komórkach przez rozszczepienie grupy estrowej za pośrednictwem endogennych esterazy. Wiązanie Ca2+ ze wskaźnikami wysokiego powinowactwa powodowało zmiany we fluorescencji, gdy komórki i tkanki były oświetlane odpowiednimi długościami fal świetlnych. Zastosowanie przepuszczalnych dla komórek wskaźników Ca2 + znacznie poszerzyło naszą wiedzę na temat sygnalizacji Ca2 + w żywych komórkach i umożliwiło rozdzielczość przestrzenną i kwantyfikację tych sygnałów, co nie było możliwe przy oznaczaniu sygnałów Ca2 + za pomocą innych środków, takich jak elektrofizjologia. Jednak tradycyjne wskaźniki Ca2+ mają kilka ograniczeń, takich jak fotowybielanie, które występuje przez dłuższe okresy nagrywania24. Podczas gdy nowsze barwniki wskaźnikowe Ca2+, takie jak Cal520/590, znacznie poprawiły stosunek sygnału do szumu i zdolność do wykrywania lokalnych sygnałów Ca2+25, problemy z fotowybielaniem mogą nadal stanowić problem dla niektórych badaczy26,27,28. Fotowybielanie przepaściowe ogranicza również powiększenie, szybkość akwizycji obrazu i rozdzielczość, które można wykorzystać do nagrań, ponieważ zwiększona moc obiektywu i wyższe szybkości akwizycji obrazu wymagają zwiększonej intensywności światła wzbudzającego, które zwiększa fotowybielanie.
Te ograniczenia tradycyjnych barwników wskaźnikowych Ca2+ są zaostrzone podczas rejestrowania sygnałów Ca2+ in situ, na przykład podczas rejestrowania wewnątrzkomórkowych sygnałów Ca2+ z nienaruszonych tkanek. Ze względu na powyższe problemy, wizualizacja sygnałów Ca2 + in situ przy użyciu przepuszczalnych dla komórek wskaźników Ca2 + została ograniczona do powiększenia o niskiej mocy i zmniejszonej szybkości przechwytywania obrazu, ograniczając zdolność badaczy do rejestrowania i ilościowego określania ograniczonych czasowo lub przestrzennie subkomórkowych sygnałów Ca2 +. W związku z tym trudno było uchwycić, przeanalizować i docenić przestrzenną i czasową złożoność sygnałów Ca2 +, które mogą być ważne w generowaniu pożądanych odpowiedzi biologicznych, jak opisano powyżej. Analiza sygnałów Ca2+ z komórek in situ zazwyczaj opiera się na prostych pomiarach intensywności z wybranych obszarów zainteresowania (ROI) w polu widzenia (FOV). Arbitralny wybór liczby, wielkości i położenia ROI, zależny od kaprysu badacza, może poważnie zniekształcić uzyskane wyniki. Oprócz nieodłącznej stronniczości w analizie ROI, podejście to ignoruje wiele ważnych informacji sygnalizacyjnych zawartych w FOV, ponieważ do analizy wybierane są dynamiczne zdarzenia Ca2+ w ramach arbitralnie wybranego ROI. Co więcej, analiza ROI nie dostarcza informacji na temat charakterystyki przestrzennej obserwowanych sygnałów Ca2+. Na przykład może nie być możliwe odróżnienie wzrostu Ca2 + wynikającego z rozchodzącej się fali Ca2 + od wysoce zlokalizowanego zdarzenia uwolnienia Ca2 + na podstawie tabel sygnałów Ca2 + w ramach ROI.
Pojawienie się genetycznie kodowanych wskaźników Ca2+ (GECI) radykalnie zmieniło sposób, w jaki obrazowanie Ca2+ może być wykonywane in situ29,30,31,32,33. Stosowanie GECI ma kilka zalet w porównaniu z barwnikami. Być może najważniejsze jest to, że ekspresja GECI może być przeprowadzana w sposób specyficzny dla komórki, co zmniejsza niepożądane zanieczyszczenie tła z komórek, które nie są przedmiotem zainteresowania. Kolejną zaletą GECI w porównaniu z tradycyjnymi wskaźnikami Ca2+ jest to, że fotowybielanie jest zmniejszone (ponieważ fluorescencja, a co za tym idzie fotowybielanie występuje tylko wtedy, gdy komórki są aktywne) w porównaniu z próbkami obciążonymi barwnikiem, szczególnie przy dużym powiększeniu i wysokich wskaźnikach przechwytywania obrazu34. W związku z tym obrazowanie za pomocą GECI, takich jak seria czujników optogenetycznych GCaMP, daje badaczom możliwość rejestrowania krótkich, zlokalizowanych subkomórkowych sygnałów Ca2 + in situ i badania sygnalizacji Ca2 + w komórkach w ich natywnym środowisku, co wcześniej nie było możliwe. Aby zmaksymalizować odzyskiwanie informacji z takich nagrań o wysokiej rozdzielczości, wymagana jest odpowiednia analiza przestrzenna i czasowa sygnałów Ca2+. Należy zauważyć, że chociaż GECI mogą oferować pewne wyraźne korzyści, ostatnie badania wykazały, że obrazowanie Ca2 + można z powodzeniem przeprowadzić na dużych populacjach różnych klas neurochemicznych neuronów jednocześnie przy użyciu konwencjonalnych wskaźników Ca2 +, które nie są genetycznie zakodowane w zwierzęciu35. W tym podejściu wykorzystano immunohistochemię post hoc, aby ujawnić wiele różnych klas neuronów strzelających z wysoką częstotliwością w zsynchronizowanych zrywach i uniknięto potencjalnego potencjału, że modyfikacje genetyczne zwierzęcia mogły zakłócać fizjologiczne zachowanie, które badacz stara się zrozumieć35,36.
Protokoły opisane w tym artykule ułatwiają bardziej kompletną analizę i kwantyfikację sygnałów Ca2+ zarejestrowanych z komórek in situ przy użyciu kombinacji analizy opartej na mapie czasoprzestrzennej (STM) i analizy opartej na cząstkach. Protokoły opisują również, w jaki sposób można odpowiednio przeanalizować różne wzorce sygnalizacji Ca2 + obserwowane w różnych populacjach komórek in situ. Dla ilustracji, metoda zbada sygnalizację Ca2 + w wyspecjalizowanej populacji komórek w jelicie cienkim, komórkach śródmiąższowych Cajala (ICC). ICC to wyspecjalizowane komórki w przewodzie pokarmowym (GI), które wykazują dynamiczną wewnątrzkomórkową sygnalizację Ca2 +, jak pokazano przy użyciu myszy wyrażających GCaMPs37,38,39,40,41,42. Stan przejściowy Ca2+ w ICC jest związany z aktywacją kanałów Cl- aktywowanych przez Ca2+ (kodowanych przez Ano1), które są ważne w regulacji pobudliwości komórek mięśni gładkich jelit (SMC)43,44,45. Tak więc badanie sygnalizacji Ca2 + w ICC ma fundamentalne znaczenie dla zrozumienia motoryki jelit. Mysie jelito cienkie stanowi doskonały przykład dla tej demonstracji, ponieważ istnieją dwie klasy ICC, które są anatomicznie oddzielone i mogą być wizualizowane niezależnie: i) ICC znajdują się w obszarze między okrężnymi i podłużnymi warstwami mięśni gładkich, otaczającymi splot mięśniowo-jelitowy (ICC-MY). Komórki te służą jako komórki rozrusznika serca i generują aktywność elektryczną znaną jako fale wolne46,47,48,49; ii) ICC znajdują się również wśród splotu bogatego w zakończenia neuronów ruchowych (głęboki splot mięśniowy, a więc ICC-DMP). Komórki te służą jako mediatory odpowiedzi na neuroprzekaźnictwo ruchowe jelitowe37,39,40,50. ICC-MY i ICC-DMP są morfologicznie różne, a ich zachowania sygnalizacyjne Ca2 + różnią się radykalnie, aby spełnić swoje określone zadania. ICC-MY mają kształt gwiaździsty i tworzą sieć połączonych ze sobą komórek za pomocą połączeń szczelinowych51,52. Sygnały Ca2+ w ICC-MY manifestują się jako krótkie i przestrzennie zlokalizowane zdarzenia uwalniania Ca2+ występujące w wielu miejscach asynchronicznie przez sieć ICC-MY, jak wizualizowane w FOV (obrazowane obiektywem 60X)38. Te asynchroniczne sygnały są zorganizowane czasowo w 1-sekundowe klastry, które po zestawieniu razem dają wzrost komórkowy netto 1 s w Ca2+. Sygnały te rozchodzą się z komórki na komórkę w sieci ICC, a zatem organizują sygnalizację Ca2 +, generowaną z miejsc subkomórkowych, w falę Ca2 + o szerokości tkanki. Grupowanie czasowe i sumowanie sygnałów Ca2+ w ICC-MY zostało nazwane klastrami przejściowymi Ca2+ (CTCs)38. CTC występują rytmicznie (np. dość podobny czas trwania i podobne okresy między CTC) 30 razy na minutę u myszy. I odwrotnie, ICC-DMP to komórki w kształcie wrzeciona, niektóre z procesami wtórnymi, które rozprowadzają się między SMC a żylakami nerwowymi i nie tworzą niezależnie sieci51,52. ICC-DMP tworzy jednak połączenia szczelinowe z SMC i funkcjonuje w obrębie tego większego syncytium, znanego jako SIP syncytium53. Sygnały Ca2+ występują w wielu miejscach na całej długości komórek, ale te stany nieustalone nie są porwane ani czasowo zgrupowane, jak zaobserwowano w ICC-MY37. Sygnały Ca2+ w ICC-DMP występują w sposób stochastyczny, o zmiennym natężeniu, czasie trwania i charakterystyce przestrzennej. Poniższe protokoły, na przykładzie sygnalizacji Ca2 + w ICC-MY i ICC-DMP, opisują techniki analizy złożonej sygnalizacji w określonych typach komórek in situ. Wykorzystaliśmy indukowalny system Cre-Lox p do ekspresji GCaMP6f wyłącznie w ICC, po indukcji aktywacji Cre-Rekombinazy (Cre) sterowanej przez promotor specyficzny dla ICC (Kit).

<table><tbody><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td><td>Oprogramowanie NIH</td><td>1.5a</td><td>ImageJ</td></tr><tr><td>Wolumetria</td><td>GWH</td><td>Wolumetria 8Gd</td><td>Oprogramowanie analityczne na zamówienie</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter, Deerfield, IL, USA</td><td>NDC 10019-360-60</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>GCaMP6F myszy</td><td>Jackson</td><td>Laboratory Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D</td><td></td></tr><tr><td>Myszy Kit-Cre</td><td>podarowane przez dr Dietera Saura</td><td>C-Kit+/Cre-ERT2</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>SDA 2B-6</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowania technik mapowania czasoprzestrzennego i analizy cząstek do ilościowego określania wewnątrzkomórkowej sygnalizacji ca2+ in situ

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Ca2+ obrazowanie izolowanych komórek lub określonych typów komórek w nienaruszonych tkankach często ujawnia skomplikowane wzorce sygnalizacji Ca2+. Działanie to wymaga starannych i dogłębnych analiz oraz kwantyfikacji, aby uchwycić jak najwięcej informacji o zdarzeniach leżących u podstaw wydarzeń. Parametry przestrzenne, czasowe i intensywności nieodłącznie związane z sygnałami Ca2 +, takie jak częstotliwość, czas trwania, propagacja, prędkość i amplituda, mogą dostarczać pewnych informacji biologicznych wymaganych do sygnalizacji wewnątrzkomórkowej. Obrazowanie Ca2+ w wysokiej rozdzielczości zazwyczaj powoduje pozyskiwanie dużych plików danych, których przetwarzanie jest czasochłonne pod względem przekształcania informacji obrazowych na dane wymierne, a proces ten może być podatny na błędy ludzkie i stronniczość. Analiza sygnałów Ca2+ z komórek in situ zazwyczaj opiera się na prostych pomiarach intensywności z dowolnie wybranych obszarów zainteresowania (ROI) w polu widzenia (FOV). Takie podejście ignoruje wiele ważnych informacji sygnalizacyjnych zawartych w FOV. W związku z tym, aby maksymalnie odzyskać informacje z tak wysokorozdzielczych nagrań uzyskanych za pomocą barwnikówCa2+ lub optogenetycznego obrazowaniaCa2+, wymagana jest odpowiednia analiza przestrzenna i czasowa sygnałówCa2+. Protokoły przedstawione w tym artykule opiszą, w jaki sposób można uzyskać dużą ilość danych z zapisów obrazowania Ca2+, aby ułatwić pełniejszą analizę i kwantyfikację sygnałów Ca2+ zarejestrowanych z komórek przy użyciu kombinacji analizy opartej na mapie czasoprzestrzennej (STM) i analizy opartej na cząstkach. Protokoły opisują również, w jaki sposób można odpowiednio przeanalizować różne wzorce sygnalizacji Ca2 + obserwowane w różnych populacjach komórek in situ. Dla ilustracji, metoda zbada sygnalizację Ca2 + w wyspecjalizowanej populacji komórek w jelicie cienkim, komórkach śródmiąższowych Cajal (ICC), przy użyciu GECI.

Wykorzystując myszy Kit-Cre-GCaMP6F (Rysunek 1), można obrazować in situ dynamiczne zachowania sygnałów Ca2+ w komórkach ICC przewodu pokarmowego. Dzięki mikroskopii konfokalnej możliwe jest uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości specyficznych populacji ICC bez zanieczyszczenia sygnałami z innych populacji ICC w tej samej tkance, lecz w anatomicznie różnych płaszczyznach ogniskowania (Rysunek 2A)...

Genetycznie kodowane wskaźniki Ca2+ (GECI) radykalnie zmieniły sposób wykonywania obrazowania in situ Ca2+. Aby zmaksymalizować odzysk danych z takich nagrań, wymagana jest odpowiednia analiza sygnałów Ca2+. Protokoły przedstawione w tym artykule ułatwiają kwantyfikację sygnałów Ca2+ zarejestrowanych in situ przy użyciu mapowania czasoprzestrzennego i analizy opartej na cząstkach.

Zastosowania technik mapowania czasoprzestrzennego i analizy cząstek do ilościowego określania wewnątrzkomórkowej sygnalizacji Ca2+ in situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...

Zdolność do pozyskiwania dużych ilości danych z eksperymentów obrazowania wapnia znacznie się poprawiła, zwłaszcza w przypadku eksperymentów z obrazowaniem tkanek. Nasze protokoły opisują odpowiednie techniki analizy w celu ilościowego określenia i opisania tych zestawów danych. Nasze protokoły generują szereg wartości przestrzennych, czasowych i intensywności, które są nieodłącznie związane z sygnalizacją wapniową w całych tkankach, co może zostać utracone w bardziej podstawowej analizie.Na godzinę przed obrazowaniem przenieść jelito cienkie pobrane od myszy z komórkami śródmiąższowymi Cajala lub ICC, które specyficznie wyrażają genetycznie kodowany wskaźnik wapnia, do etapu mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem. I w sposób ciągły perfundować tkankę roztworem wodorowęglanu Krebsa-Ringera lub KRB o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Korzystając z powiększenia od 60 do 100 razy, zlokalizuj gwiaździsty splot mięśniowo-jelitowy ICC lub ICC-MY między okrężnymi i podłużnymi warstwami mięśni gładkich jelita cienkiego.Następnie zlokalizuj wrzecionowaty splot mięśniowy głęboki ICC lub ICC-DMP w jednej płaszczyźnie między okrężną warstwą mięśni gładkich a splotem podśluzówkowym i zapisz filmy jako stos obrazów TIFF. Aby utworzyć mapy czasoprzestrzenne lub STM aktywności wapnia ICC-DMP, otwórz stos obrazów w ImageJ i kliknij opcję Obraz, Typ i 32-bitowy, aby zmodyfikować jakość obrazu. Aby utworzyć skanowanie linii, kliknij prawym przyciskiem myszy narzędzie wyboru linii i wybierz linię podzieloną na segmenty.Używając pojedynczych lewych przycisków myszy, narysuj linię wzdłuż środkowego dostępu pojedynczego ICC-DMP, klikając dwukrotnie, gdy cała komórka zostanie obrysowana. Wybierz Obraz, Stosy i Ponowne pokrój. Pojawi się wyskakujące okienko.Wybierz opcję Obróć o 90 stopni, aby zorientować skan linii od lewej do prawej, tak aby można go było skalibrować i odczytać w funkcji czasu na osi x ze spacją na osi y, a następnie kliknij przycisk OK. Pojawi się mapa czasoprzestrzenna. Aby dokładnie zmierzyć amplitudę sygnałów wapniowych z mapy, wybierz zaznaczenie prostokątne i narysuj obszar zainteresowania wokół obszaru w STM, który wyświetla najbardziej jednorodny i najmniej intensywny obszar fluorescencji. Kliknij przycisk Analizuj i histogram, aby uzyskać średnią wartość intensywności w wybranym obszarze zainteresowania, a następnie kliknij przycisk Edycja, Zaznaczenie, Zaznacz wszystko, aby zaznaczyć cały STM.Następnie kliknij Proces, Matematyka i Dziel i wprowadź średnią wartość intensywności z wybranym regionem STM w wyskakującym okienku. STM zmieni kolor na. Popraw to, klikając Obraz, Dopasuj, Jasność/Kontrast i Auto w wyskakującym okienku.Skan liniowy zostanie teraz skalibrowany dla amplitudy z intensywnością fluorescencji wyrażoną jako fluorescencja podzielona przez fluorescencję zerową. STM wyświetli liczbę klatek w stosie TIFF na osi x oraz liczbę pikseli reprezentujących długość komórki na osi y. Aby określić ilościowo dane czasowe i przestrzenne z sygnałów wapniowych, kliknij Obraz i właściwości i wprowadź odpowiednie wartości, aby w pełni skalibrować STM dla przestrzeni i czasu w wyskakującym okienku.Aby przeanalizować poszczególne zdarzenia wapnia, kliknij Linia prosta, a następnie kliknij i przeciągnij STM, aby narysować prostą linię poziomą przechodzącą przez środek zdarzenia wapniowego równolegle do osi x. Następnie kliknij przycisk Analizuj i kreśl profil. Pojawi się ramka przedstawiająca profil wykresu zdarzenia wapniowego.Aby przeprowadzić analizę danych sygnalizacji wapniowej ICC-MY na podstawie cząstek, otwórz plik filmowy w Volumetry i kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać STK Filter, Differentiate. Kliknij ponownie prawym przyciskiem myszy, aby wprowadzić wartość do rozróżnienia. Naciśnij Enter i kliknij lewym przyciskiem myszy, aby zainicjować różnicowanie.Aby utworzyć cząstki, użyj środkowego przycisku myszy, aby przewinąć film i wybrać sekcję od 20 do 40 klatek, która obejmuje okres spoczynku, a następnie wystąpienie przejściowego klastra wapnia i od 20 do 40 klatek, które następują bezpośrednio po klastrze. Po zaznaczeniu wszystkich klatek kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie filmu, aby uzyskać dostęp do informacji o cząstkach STK OPS Ramp DS, a następnie kliknij, aby uruchomić procedurę analizy cząstek, która stopniowo zwiększa próg od maksymalnej do minimalnej intensywności. Aby zapewnić pomyślną analizę cząstek, upewnij się, że uwzględniłeś jak najwięcej nieaktywności przejściowej grupy wapniowej i jak najwięcej nieaktywności przejściowej grupy wapniowej po jej zakończeniu.Pomoże to zwiększyć stosunek sygnału do szumu. Analiza zostanie przedstawiona graficznie w oknie wykresu jako wykres szumu, a w oknie śladów jako trzy kolorowe ślady, przy czym zielony ślad reprezentuje liczbę cząstek, czerwony ślad reprezentuje średnią wielkość cząstek, a niebieski ślad reprezentuje bezwzględny próg intensywności. Aby zrównoważyć histogram wykresu szumu cząstek, naciśnij H na klawiaturze.Następnie naciśnij prawy nawiasu, aby przełączać się między schematami kolorów, aż tło stanie się białe z kolorowymi śladami na górze. Naciśnij raz F na klawiaturze, aby wyświetlić narzędzie pomiarowe. Następnie naciśnij F po raz drugi, aby zaznaczyć pojedynczą pionową linię na pasku przewijania okna śladów na wykresie na skrzyżowaniu, na którym kolorowe wykresy zaczynają przesuwać się w prawą stronę.W oknie śladów użyj środkowego przycisku myszy, aby przewinąć od punktu przegięcia czerwonego śladu do zaznaczonej białej pionowej linii. Po zanotowaniu wyświetlanej średniej Y kliknij ponownie środkowym przyciskiem myszy w oknie śladów, aby usunąć zaznaczenie niebieskiego śladu. W oknie filmu kliknij C, aby wyświetlić koło kolorów, lub D, aby dostosować próg.Prawidłowe cząstki będą teraz wyświetlane na czerwono, a te, które się nasycają, będą białe. Użyj lewego przycisku myszy, aby przewinąć, aż białe obszary zostaną usunięte, i użyj środkowego przycisku myszy, aby dostosować żółtą wartość liczbową w kole kolorów do średniej wartości Y, aby przypisać wszystko na czerwono jako aktywną cząstkę przejściową wapnia w określonym punkcie progowym. Aby zapisać dane jako plik cząstek opartych na współrzędnych, kliknij prawym przyciskiem myszy, aby uzyskać dostęp do STK 3D, zapisz cząstkę zerową i kliknij lewym przyciskiem myszy, aby zapisać plik.Aby utworzyć mapy cieplne aktywności cząstek, otwórz zapisany plik cząstek i kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie filmu, aby uzyskać dostęp do cząstek STKops, flagi StatMap i wprowadzić przypisania flag do analizy. Kliknij, aby zastosować analizę i mapę cieplną przedstawiającą łączną liczbę cząstek na całej długości nagrania, przy czym różne kolory reprezentują procentowe występowanie w całym nagraniu. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zapisać mapę skupień jako plik TIFF.Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie filmu, aby uzyskać dostęp do pomiaru cząstek, statystyk cząstek STK równych i wprowadź przypisanie flagi do analizy. W oknie śledzenia zostanie wygenerowana seria śladów. Analiza STM zapewnia możliwość monitorowania i rejestrowania charakterystyk przestrzennych sygnalizacji wapniowej, takich jak rozprzestrzenianie się przestrzenne i prędkość propagacji.Informacje te można zgromadzić, aby zapewnić dość kompletny obraz zachowań sygnalizacyjnych wapnia w komórkach w ich natywnym środowisku. Za pomocą analizy cząstek można obliczyć informacje ilościowe o sygnalizacji wapniowej, mierząc powierzchnię cząstek i liczbę cząstek, które razem można wykorzystać do określenia zakresów przestrzennych aktywacji sygnału wapniowego w określonym polu widzenia. Analiza cząstek pozwala również na dogłębną kwantyfikację subkomórkowej sygnalizacji wapnia poprzez badanie lokalizacji i prawdopodobieństwa wypalania miejsc wypalania wapnia.Przydzielając cząstki do różnych flag w oparciu o ich charakterystykę czasową, cząstki inicjujące mogą być dokładnie odwzorowane. Można również uzyskać bogactwo twardych danych na temat liczby miejsc inicjacji, rozmiaru miejsca w pikselach i mikrometrach, prawdopodobieństwa, że każde miejsce inicjacji zostanie wystrzelone raz lub wiele razy podczas każdego przejściowego klastra wapnia oraz procentu miejsc wypalania, które są uruchamiane podczas każdego cyklu przejściowego klastra wapnia. Konsekwencja jest kluczem do sukcesu w tym protokole.Wszystkie zestawy danych i wszystkie filmy muszą być traktowane dokładnie tak samo, aby zapewnić wiarygodne, powtarzalne wyniki. Jest to szczególnie ważne, gdy mamy do czynienia z plikami cząstek. Nasze protokoły pozwalają na głęboką charakterystykę sygnalizacji wapniowej in situ, a szereg metod statystycznych, jeśli są odpowiednio stosowane, może ocenić różnice między szeregiem parametrów przestrzennych i czasowych.Te techniki analizy w naszym protokole pozwoliły naukowcom zadać i odpowiedzieć na wcześniej nieodpowiadające pytania dotyczące rozrusznika jelit i unerwienia jelit, a także kontroli neuronalnej dolnych dróg moczowych.

applications-spatio-temporal-mapping-particle-analysis-techniques-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Tutaj zademonstrowany jest nowatorski protokół analizy interesujących regionów, oparty na sortowaniu najlepiej dopasowanych elips przypisanych do regionów pozytywnego sygnału w dwuwymiarowych sekwencjach obrazów poklatkowych. Algorytm ten może umożliwić badaczom kompleksową analizę fizjologicznych sygnałów Ca2 + przy minimalnym wkładzie użytkownika i stronniczości.

Automatyczna analiza dynamicznych sygnałów Ca2+ w sekwencjach obrazów

Ca2+ reguluje różnorodne procesy biologiczne w roślinach. W tym miejscu przedstawiamy podejścia do monitorowania przestrzennych i czasowych sygnałów Ca2 + wywołanych stresem abiotycznym w komórkach i tkankach rzodkiewnika przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników Ca2 + Aequorin lub Case12.

Pomiar przestrzennych i czasowych sygnałów Ca2+ u rzodkiewnika

Tutaj prezentujemy techniki obrazowania lokalnych zdarzeń Ca2+ za pośrednictwem IP3 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w nienaruszonych komórkach ssaków załadowanych wskaźnikami Ca2+ wraz z algorytmem, który automatyzuje identyfikację i analizę tych zdarzeń.

Obrazowanie lokalnych sygnałów Ca2+ w hodowanych komórkach ssaków

Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół i sprzęt niezbędny do podwójnego optycznego mapowania potencjału transbłonowego (Vm) i wolnej retikulum wewnątrzsarkoplazmatycznego (SR) Ca2+ w sercu królika z perfundacją Langendorffa. Metoda ta pozwala na bezpośrednią obserwację i kwantyfikację dynamiki Vm i SR Ca2+ w nienaruszonym sercu.

Mapowanie optyczne retikulum wewnątrzsarkoplazmatycznego Ca2+ i potencjału transbłonowego w sercu królika perfundowanym metodą Langendorffa

Tutaj prezentujemy procedurę wykonywania wielkoskalowego obrazowania Ca2+ z rozdzielczością komórkową w wielu warstwach kory mózgowej u swobodnie poruszających się myszy. Setki aktywnych komórek można obserwować jednocześnie za pomocą miniaturowego mikroskopu montowanego na głowie w połączeniu z wszczepioną sondą pryzmatyczną.

Wielowarstwowe obrazowanie kory Ca2+ u swobodnie poruszających się myszy z sondami pryzmatycznymi i zminiaturyzowaną mikroskopią fluorescencyjną

Prezentujemy metodę łączącą zapisy z całokomórkowego patch-clampu i obrazowania dwufotonowego w celu zarejestrowania stanów przejściowych Ca2+ w dendrytach neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu.

Dwufotonowe obrazowanie wapnia w dendrytach neuronalnych w wycinkach mózgu

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania sygnalizacji wapniowej w populacjach poszczególnych typów komórek w mysim złączu nerwowo-mięśniowym.

Ex vivo Obrazowanie specyficznej dla komórki sygnalizacji wapniowej w trójdzielnej synapsie przepony myszy

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania Ca2+ w neuronach i komórkach glejowych, który umożliwia analizę sygnałów Ca2+ w rozdzielczości subkomórkowej. Proces ten ma zastosowanie do wszystkich typów komórek, które umożliwiają ekspresję genetycznie kodowanych wskaźników Ca2 +.

Analiza lokalnych sygnałów Ca2 + w hodowanych komórkach za pomocą ukierunkowanych na błonę wskaźników Ca2 +

Obecne metody opisują nieratiometryczne podejście do wysokorozdzielczego, subkompartmentowego obrazowania wapnia in vivo u Caenorhabditis elegans przy użyciu łatwo dostępnych genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.

Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo

Tutaj udostępniamy kompleksowy protokół do rozwiązywania początkowych lokalnych sygnałów Ca2+, znanych jako mikrodomeny Ca2+, w pierwotnych mysich i ludzkich limfocytach T za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten służy jako cenne źródło informacji dla naukowców badających szlaki sygnałowe Ca2+ w komórkach odpornościowych i do dalszego odkrywania ich funkcji.

Obrazowanie początkowych mikrodomen Ca2+ w pierwotnych limfocytach T

Poznaj techniki mapowania czasoprzestrzennego i analizy cząstek do ilościowego określania sygnalizacji Ca²⁺ in situ w tkankach. Metoda umożliwia precyzyjne badanie sygnałów wapniowych w komórkach Cajala jelita cienkiego myszy.

Zastosowania technik mapowania czasoprzestrzennego i analizy cząstek do ilościowego określania wewnątrzkomórkowej sygnalizacji Ca2+ in situ (Wideo) | JoVE Journal

Zastosowania technik mapowania czasoprzestrzennego i analizy cząstek do ilościowego określania wewnątrzkomórkowej sygnalizacji Ca²⁺ in situ

Przeglądaj więcej filmów