Zautomatyzowana kwantyfikacja i analiza procedur zliczania komórek za pomocą wtyczek ImageJ

Ogólnym celem tego protokołu jest wykorzystanie cyfrowych narzędzi analitycznych do szybkiego dokładnego zliczania komórek w zawiesinie lub podczas migracji w błonie do badania inwazji. Protokół ten może pomóc naukowcom w ilościowym określeniu liczby komórek wymaganej w popularnych technikach i testach ruchliwości komórek in vitro. Główną zaletą tej metody jest to, że zapewnia szybkie i dokładne zliczanie komórek, a jednocześnie zawiera wiele filtrów i narzędzi analitycznych.

Aby rozpocząć, ustaw oświetlenie mikroskopu na maksimum. Przełącz się na obiektyw 4x i upewnij się, że filtry kontrastu fazowego są używane. Następnie w oprogramowaniu mikroskopu ustaw ustawienia przechwytywania obrazu na wartości domyślne.

Teraz umieść standardowy hemocytometr na stoliku mikroskopu i uchwyć obraz do etapu kalibracji objętości obrazu. W razie potrzeby dostosuj czas ekspozycji. W ImageJ, pod kalkulatorem stężenia komórek, otwórz obraz i kliknij przycisk Pobierz wymiar obrazu.

Ta akcja powoduje wypełnienie pól tekstowych szerokości i wysokości obrazu rozdzielczością obrazu w pikselach. Następnie wybierz narzędzie linii prostej i narysuj linię prostą na całej długości głównego kwadratu p hemocytometru, klikając i przeciągając kursor. Następnie naciśnij M, aby wyświetlić okno wyników.

Teraz wpisz wartość z kolumny długości w polu tekstowym długości p-kwadrat w kalkulatorze stężenia komórek. Następnie kliknij przycisk Oblicz objętość obrazu, aby wyświetlić wolumin obrazu w polu tekstowym objętości obrazu. Na koniec kliknij przycisk Zapisz, aby zakończyć kalibrację wtyczki.

W celu analizy próbki załaduj 10 mikrolitrów komórek do obu komór szkiełka hemocytometrycznego i dostosuj ognisko tak, aby wnętrze komórek było ciemniejsze niż błona komórkowa, aby zapewnić ognisko w centralnym przekroju komórki, a nie na biegunach. Następnie jeszcze bardziej dostosuj ekspozycję, aby komórki nie były prześwietlone. Dopuszczalne są słabo widoczne linie hemocytometru.

Teraz uchwyć od pięciu do dziesięciu nienakładających się na siebie obrazów centralnego obszaru hemocytometru. Rozdzielczość i powiększenie każdego obrazu muszą być takie same, jak w przypadku obrazu kalibrującego objętość. Następnie w kalkulatorze stężenia komórek kliknij Policz komórki iw wyskakującym okienku wybierz folder do zliczenia.

Następnie w polu wprowadzania numeru próbki wprowadź liczbę zdjęć wykonanych w każdej komorze i kliknij przycisk OK. Wtyczka będzie teraz zbierać dane. Zobacz tekst, aby uzyskać więcej informacji. Aby rozpocząć, w oprogramowaniu mikroskopu ustaw ustawienia przechwytywania obrazu na wartości domyślne.

Na etapie lunety sekcyjnej użyj jednolitego białego tła i użyj źródła światła nad sceną, najlepiej dwóch elastycznych lamp LED. Teraz umieść na stoliku wypełnioną szkiełko membranowe do testu migracji. Patrząc na obraz w czasie rzeczywistym wyświetlany przez oprogramowanie, ręcznie dostosuj powiększenie tak, aby krawędzie pojedynczej membrany znajdowały się dokładnie w polu widzenia kamery.

Następnie dostosuj pozycje źródła światła i czasy naświetlania, aby jak najdokładniej odtworzyć idealny obraz. Który ma minimalny kolor tła i równomiernie oświetloną membranę. Dokładność zliczania komórek zależy od wysokiej jakości akwizycji obrazu.

Dlatego ważne jest, aby uchwycić jak najlepszy obraz osiągalny przez kamerę użytkownika, aby jak najefektywniej korzystać z wtyczek. Teraz usuń szkiełko i zrównoważ biel obrazu w oprogramowaniu mikroskopu, aby zakończyć kalibrację. Bezpośrednio przed obrazowaniem spłaszcz każdą membranę, wywierając nacisk na szkiełko nakrywkowe, aby usunąć jak najwięcej uwięzionych pęcherzyków.

Teraz w oprogramowaniu ustaw lokalizację folderu przechwytywania. Następnie przechwyć jeden obraz na membranę, zapisując pliki obrazów jako TIF-y przy użyciu konwencji nazewnictwa próbki 001 z przyrostowym zwiększaniem liczby dla każdego obrazu. Ta konwencja nazewnictwa jest wymagana, aby wtyczka mogła znaleźć pliki.

Jeśli wymagana jest korekcja płaskiego pola, dla każdego slajdu znajdź pusty obszar i zrób pusty obraz. Zapisz plik jako nazwę próbki pustą. Następnie w ImageJ otwórz wtyczkę TC.

W TC kliknij przycisk Flatfield, a następnie w oknie dialogowym Wybierz katalog wybierz folder, w którym zostały zapisane obrazy membrany. Teraz otwórz obraz membrany testu migracji i wybierz opcję Próg koloru. W oknie ustaw metodę na Shanbhag.

Ustaw kolor progu na biały. Ustaw przestrzeń kolorów na RGB i odznacz opcję ciemnego tła. Następnie ustaw górne suwaki na zero, a dolne suwaki na 255, aby obraz był całkowicie biały.

Gdy będą białe, dostosuj zielone i czerwone suwaki, aż widoczne będą tylko jądra. We wtyczce TC skopiuj wartości suwaków RGB do powiązanych ustawień konfiguracyjnych Pola tekstowe progu RGB. Następnie kliknij przycisk Dodaj/Modyfikuj i nadpisz konfigurację.

W panelu ustawień konfiguracyjnych kliknij przycisk Zapisz, aby zapisać ustawienia na dysku twardym. Teraz, aby policzyć obrazy za pomocą wtyczki TC, kliknij Count Folder i wybierz folder do zliczenia. Następnie program przetworzy obrazy i automatycznie doda dane do tabeli głównej.

Teraz w głównej tabeli pojawi się znacznik wyboru w Kalibruj? Kolumna, jeśli znajduje się na obrazie, jest oznaczona do kalibracji na podstawie jej podobieństwa do idealnych wskaźników. Wybierz wszystkie próbki oznaczone do kalibracji.

Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Przelicz i Sugerowany rozmiar. Spowoduje to przeliczenie obrazów z sugerowaną minimalną powierzchnią cząstek. Następnie ponownie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Pokaż wykres.

Idealny obraz będzie zawierał wykres przypominający długi prawostronny rozkład normalny. W razie potrzeby dostosuj dolny zakres rozmiarów lub ustawienia progu RGB, zaznaczając próbkę, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając opcję Przelicz i ustawienia ręczne. Następnie wprowadź żądane ustawienia i kliknij przycisk Policz, aby ponownie przeliczyć obraz.

Aby ręcznie dostosować zliczenia, zaznacz próbki, kliknij prawym przyciskiem myszy tabelę i wybierz Otwórz obraz z licznikami. Oryginalny obraz otworzy się z czerwonymi znakami, które reprezentują każdą cząstkę zliczoną przez wtyczkę. Dodatkowo opcja Pokaż zliczony obraz binarny może być użyta do sprawdzenia, jak dobrze poszczególne komórki są rozwiązywane przez progi kolorów.

Aby ręcznie dodać liczbę, przytrzymaj Control i kliknij lewym przyciskiem myszy. Spowoduje to dodanie znacznika w miejscu kursora, który zostanie dodany do całkowitej liczby. Aby ręcznie usunąć znacznik, kliknij obraz prawym przyciskiem myszy, a wtyczka usunie znacznik znajdujący się najbliżej kursora.

Aby usunąć grupę znaczników, wybierz obszar zainteresowania i kliknij go prawym przyciskiem myszy, przytrzymując Control. Proces kalkulatora stężenia komórek zależy od obrazu kalibracji p-kwadratu oraz obliczenia długości p-kwadratu i pikseli. P-kwadrat hemocytometru ma objętość 100 nanolitrów, a biorąc pod uwagę tę stałą, całkowitą objętość obrazu można obliczyć po przeliczeniu pikseli na milimetry.

Porównanie ręcznych i automatycznych zliczeń na 57 obrazach z różnych eksperymentów i typów komórek pokazuje, że istnieje bardzo ścisła korelacja między obiema metodami. Stężenia od pięciu milionów do 2 000 komórek na mililitr zostały dokładnie policzone przy użyciu zautomatyzowanego procesu. Wskaźnik Q reprezentuje ogólną klarowność obrazów w oparciu o rozkład różnych rozmiarów cząstek.

Odpowiednie Q jest większe niż 0,5. Stosując te kwalifikatory do wybranych obrazów o niskiej lub doskonałej jasności i szumach tła, skalibrowane liczby obrazów były znacznie bliższe zliczeniom ręcznym niż zliczeniom obrazów nieskalibrowanych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak dokładnie i wydajnie liczyć komórki w zawiesinie oraz na podstawie testów ruchliwości komórek za pomocą wtyczek CCC i TC ImageJ.

Po opanowaniu wtyczki TC, w której akwizycja, kwantyfikacja i regulacja liczby komórek może być wykonana w mniej niż godzinę. Obie wtyczki opierają się na funkcji zliczania cząstek z ImageJ i mogą być modyfikowane poprzez edycję makr używanych przez ImageJ. Daje to użytkownikowi większą elastyczność w rozszerzaniu zakresu wtyczek na inne cząsteczki.