Name: Zautomatyzowana kwantyfikacja i analiza procedur zliczania komórek za pomocą wtyczek ImageJ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną kwantyfikację komórek za pomocą wtyczek ImageJ do analizy hemocytometru oraz testów migracji i inwazji. Ta metoda zapewnia szybkie i precyzyjne zliczanie z wieloma narzędziami analizy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Kanadyjski Instytut Badań nad Zdrowiem do CP (OR 142730 i OR 89931). Chcielibyśmy podziękować Jelenie Brkic za jej początkowy pomysł na analizę cząstek binarnych w ImageJ.

<ol><li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+and+Determining+the+Viability+of+Cultured+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Counting and Determining the Viability of Cultured Cells.</a> J. Vis. Exp. (16), e752(2008).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells</a> (2016).</li>
<li>Graham, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coulter+principle%3A+foundation+of+an+industry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Autom%22%5BJournal%5D)">The coulter principle: foundation of an industry.</a> J. Lab. Autom. 8 (6), 72-81 (2003).</li>
<li>Ormerod, M. G., Imrie, P. R. Flow cytometry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOrmerod%2C+MG+%22Animal+Cell+Culture%22">Animal Cell Culture</a>. Walker, J. M., Pollard, J. W. , Humana Press. 543-558 (1990).</li>
<li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Imaging+Software+Tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Biological Imaging Software Tools.</a> Nat. Methods. 9 (7), 697-710 (2013).</li>
<li>Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using Trypan blue: manual and automated methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLouis%2C+KS+%22Mammalian+Cell+Viability%3A+Methods+and+Protocols%22">Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols</a>. Stoddart, J. M. , Humana Press. 7-12 (2011).</li>
<li>Scott, W. N. Invasion and motility assays. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aScott%2C+WN+%22Cancer+Cell+Culture%3A+Methods+and+Protocols%22">Cancer Cell Culture: Methods and Protocols</a>. Langdon, S. P. , Humana Press. 225-229 (2004).</li>
<li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Cell+Migration+and+Invasion+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro Cell Migration and Invasion Assays.</a> J. Vis. Exp. (88), e51046(2014).</li>
<li>Luo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-378a-5p+promotes+trophoblast+cell+survival%2C+migration+and+invasion+by+targeting+Nodal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-378a-5p promotes trophoblast cell survival, migration and invasion by targeting Nodal.</a> J. Cell Sci. 125, 3124-3132 (2012).</li>
<li>Adorno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mutant-p53%2FSmad+Complex+Opposes+p63+to+Empower+TGFbeta-Induced+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Mutant-p53/Smad Complex Opposes p63 to Empower TGFbeta-Induced Metastasis.</a> Cell. 137, 87-98 (2009).</li>
<li>Chung, T. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+microRNA-204+mediates+migration+and+invasion+of+endometrial+cancer+by+regulating+FOXC1%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of microRNA-204 mediates migration and invasion of endometrial cancer by regulating FOXC1.</a> Int. J. Cancer. 130, 1036-1045 (2012).</li>
<li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.%2FRev.+Mutat%22%5BJournal%5D)">et al. In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutat. Res./Rev. Mutat. 752, 10-24 (2013).</li>
<li>Al-Khazraji, B. K., Medeiros, P. J., Novielli, N. M., Jackson, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+cell-counting+algorithm+for+fluorescently-stained+cells+in+migration+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Proced.+Online%22%5BJournal%5D)">An automated cell-counting algorithm for fluorescently-stained cells in migration assays.</a> Biol. Proced. Online. 13, 1-6 (2011).</li>
<li>Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> (2007).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+Intern%22%5BJournal%5D)">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics Intern. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Grishagin, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+cell+counting+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Automatic cell counting with ImageJ.</a> Anal. Biochem. 473, 63-65 (2015).</li>
<li>Thomas, C. R., Paul, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+image+analysis+in+cell+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Applications of image analysis in cell technology.</a> Curr. Opin. Biotech. 7 (1), 35-45 (1996).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appreciating+data%3A+warts%2C+wrinkles+and+all%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Appreciating data: warts, wrinkles and all.</a> Nat. Cell Biol. 8, 203(2006).</li>
<li>Rossner, M., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What%27s+in+a+picture%3F+The+temptation+of+image+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">What's in a picture? The temptation of image manipulation.</a> J. Cell Biol. 166, 11-15 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Count+objects+in+an+image+in+Adobe+Photoshop%5BTitle%5D)+AND+%22Helpx.adobe.com%22%5BJournal%5D)">Count objects in an image in Adobe Photoshop.</a> Helpx.adobe.com. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://helpx.adobe.com/photoshop/using/counting-objects-image.html">https://helpx.adobe.com/photoshop/using/counting-objects-image.html</a> (2016).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Kroki krytyczne, rozwiązywanie problemów i ograniczenia
Sama natura zautomatyzowanych metod obliczeniowych, w szczególności tych związanych z analizą cząstek, wymaga matematycznej zdolności do definiowania tych cząstek. W związku z tym dokładność zarówno kalkulatora stężenia komórek, jak i licznika testu migracji zależy w dużej mierze od wierności obrazu, to znaczy od tego, jak bardzo przechwycony obraz przypomina próbkę komórki lub błonę testu migracji. Dlatego niezwykle ważne jest, aby jak najl...

Liczenie komórek in vitro jest ważną podstawową techniką w szerokim zakresie eksperymentów z hodowlami tkankowymi. Dokładne określenie liczby komórek w hodowli ma zasadnicze znaczenie dla odtwarzalności doświadczalnej i standaryzacji1,2. Liczenie komórek można przeprowadzić ręcznie za pomocą hemocytometru, a także przy użyciu różnych metod automatycznych, z których każda ma swoje zalety i wady3,4,5. Większość zautomatyzowanych metod liczenia komórek należy do jednej z dwóch klas, tych, które wykorzystują zasadę Coultera lub cytometrię przepływową. Liczniki redlic wykorzystują opór elektryczny komórek do określania liczby i wielkości komórek. Są szybkie, dokładne i tańsze niż cytometry przepływowe. Jednak są one rzadko używane tylko do zliczania komórek ze względu na ich znaczny koszt w porównaniu z liczeniem ręcznym3. Z drugiej strony cytometry przepływowe są drogie, ale mają wiele zastosowań, takich jak zliczanie komórek, analiza kształtu, struktury komórek i pomiar wewnętrznych markerów komórkowych4,5. Maszyny, które wykorzystują jedną z tych dwóch zasad, są dostępne u wielu producentów. Liczenie ręczne jest niedrogie, ale czasochłonne i podatne na błędy, podczas gdy metody automatyczne zajmują ułamek czasu potrzebnego na liczenie ręczne, ale przy użyciu drogich maszyn6.
Inne popularne procedury hodowli komórek to testy ruchliwości komórek in vitro, a mianowicie migracja komórek i inwazja7. Testy migracji i inwazji są powszechnie stosowane do badania ruchliwości i inwazyjności komórek w odpowiedzi na odpowiedź chemotaktyczną. Ponadto są szeroko stosowane do badania rozwoju embrionalnego, różnicowania, odpowiedzi zapalnej i przerzutów wielu typów komórek7-11. Komórki, które migrowały lub zostały zaatakowane przez porowatą błonę testu migracji, można określić ilościowo na dwa różne sposoby. Po pierwsze, poprzez barwienie komórek barwnikiem fluorescencyjnym, dysocjację od błony i kwantyfikację za pomocą czytnika fluorescencyjnego12. Ograniczeniem tej metody oznaczania ilościowego jest to, że nie można zachować żadnych zapisów dotyczących błon i nie ma możliwości dalszej analizy13. Druga metoda oznaczania ilościowego polega na utrwaleniu migrowanych/zaatakowanych komórek i wybarwieniu ich barwnikiem fluorescencyjnym lub, częściej, barwnikami cytologicznymi, takimi jak fiolet krystaliczny, barwnik błękitu toluidynowego lub hematoksylina; Następnie komórki są oznaczane ilościowo ręcznie za pomocą odwróconych obrazów mikroskopowych tych błon, co jest bardzo czasochłonnym zadaniem12,13.
Aby przezwyciężyć wady ręcznego liczenia komórek, opracowano dwa niezawodne i dokładne automatyczne liczniki komórek do koncentracji komórek i do testu migracji. Te zautomatyzowane algorytmy licznika komórek zostały opracowane dla ImageJ jako wtyczka wykorzystująca język komputerowy Java firmy Oracle. ImageJ jest publicznym i szeroko stosowanym narzędziem do przetwarzania obrazów opracowanym przez National Institute of Health (NIH)14,15; w ten sposób napisanie tych wtyczek dla ImageJ ułatwia łatwą integrację ze społecznością biologiczną.
Automatyzacja liczenia komórek zapewnia wysoką przepustowość i powtarzalność w porównaniu do liczenia ręcznego. Chociaż inne dostępne programy i wtyczki mogą być używane do obliczania stężenia komórek poprzez analizę obrazu5,16,17, wtyczka Kalkulator stężenia komórek jest szybka i może również obsługiwać rozcieńczenia komórek i zabiegi. Co więcej, wszystkie wyniki i obliczenia z tych dwóch liczników można zapisać i wyeksportować. Dwie wtyczki opisane w tym artykule są zoptymalizowane pod kątem użycia mikroskopu z kontrastem fazowym do obrazowania żywych komórek i obrazowania o dużym polu widzenia (przechwytywanie całej błony) do oznaczania migracji membran za pomocą lunety preparacyjnej. Wtyczki są dostępne do pobrania bezpłatnie z instrukcją instalacji pod adresem: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

<table><tbody><tr><td>HyClone Klasyczne płynne podłoże: RPMI 1640 - z L-glutaminą</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002702</td><td>Pożywki do hodowli komórkowych&nbsp;</td></tr><tr><td>Surowica płodowa (FBS)</td><td>GIBCO BRL</td><td>P00015</td><td>Dostawa pożywki</td></tr><tr><td>Linia komórkowa trofoblastów HTR8 / SVneo</td><td>Komórki uzyskano od dr Charlesa Grahama (Królowa' s University, Kingston, Kanada)</td><td></td><td>Oprogramowanie jest przeznaczone do pracy z dowolną linią komórkową.</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>GIBCO BRL</td><td>27250-018</td><td>Przygotowany jako 0,20% (w/v) w 10 &mikro; M EDTA 1x PBS</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>10 cm płytki do hodowli komórkowych</td><td>SARSTEDT</td><td>833902</td><td>Odpowiednie będą wszelkie płytki poddane działaniu kultur tkankowych</td></tr><tr><td>Wkładki z membrany poliestrowej Transwell - 8.0&nbsp; &mikro; m Wielkość porów</td><td>Costar 3422 zamówiona w Fisher Scientific 7200150</td><td></td><td>Do płytek 24-dołkowych; Wielkość porów: 8,0 i mikro; m; średnica 6,5 mm; 0,33 cm2 obszar wzrostu</td></tr><tr><td>HARLECO Hematologia Barwniki i odczynniki, EMD Millipore - Roztwory 1, 2 i 3</td><td>EMD Millipore i zamówione w VWR</td><td>65044A, B i C</td><td>Zestaw barwników Hemacolor składa się z trzech butelek foliowych o pojemności 500 ml (16,9 uncji) i zawiera utrwalacz metanolu (roztwór 1), barwnik eozynowy lub kwasowy (roztwór 2) oraz błękit metylenowy lub barwnik zasadowy (roztwór 3)</td></tr><tr><td>Aplikator z bawełnianą końcówką</td><td>Puritan Medical</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Przemysłowe żyletki jednokrawędziowe</td><td>VWR</td><td>55411 - 055</td><td>Grubość: 0,30 mm (0,012")</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe - wstępnie oczyszczone/gładkie</td><td>Fisher Scientific</td><td>12550A3</td><td>Wymiary: 25 mm x 75 mm x 1,0 mm</td></tr><tr><td>Okulary przeciwsłoneczne Fisherbrand - prostokąty nr 1</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545E</td><td>Grubość: 0,13 do 0,17 mm; Rozmiar: 50 mm x 22 mm</td></tr><tr><td>Fisher Chemical Permount Mounting Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Leica Stereo mikroskop preparacyjny</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Mikroskop jest wyposażony w kamerę mikroskopową Leica Model MC170 HD, a oprogramowanie kamery to Leica App. Suite (LAS E2) wersja 3.1.1 [Build: 490]. Części mikroskopu:&nbsp; LED3000 Oświetlenie punktowe Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Obiektyw achromatyczny 1.0X, WD=90&nbsp; mm Model: MOB306 & Obiektyw achromatyczny 0,32X, WD=303&nbsp; mm Model: MOB315, Obiektyw wideo 0,5X Model: MTU-293</td></tr><tr>Asystent<td>hemacytometru</td><td>Niemcy&nbsp;</td><td></td><td>Głębokość 0,100 mm - 0,0025 mm2</td></tr><tr><td>Mikroskop światła odwróconego</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX41SF</td><td>Mikroskop jest wyposażony w kolorową kamerę Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapiksel CMOS i oprogramowanie kamery to analiza Infinity Wersja 6.5.2</td></tr><tr><td>Komora laminarna Seria 1300 A2</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>Model: 1375</td><td>Każda komora z przepływem laminarnym do prac związanych z hodowlą komórkową będzie odpowiednia&nbsp;</td></tr><tr><td>Inkubator do hodowli komórkowych</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>Model: 370</td><td>Każdy inkubator do hodowli komórkowych będzie odpowiedni - Komórki hodowano w wilgotnym środowisku, 5% CO2, 37 & C&nbsp;</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td>NIH Wersja 1.50e</td><td>Wymagana minimalna wersja</td></tr><tr><td>Java Runtime Environment</td><td>Oracle</td><td>Version 1.8.0_66</td><td>Wymagana minimalna wersja</td></tr></tbody></table>

zautomatyzowana kwantyfikacja i analiza procedur zliczania komórek za pomocą wtyczek imagej

Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

ImageJ Narodowego Instytutu Zdrowia to potężny, swobodnie dostępny pakiet oprogramowania do przetwarzania obrazów. ImageJ posiada kompleksowe algorytmy analizy cząstek, które mogą być skutecznie wykorzystywane do liczenia różnych cząstek biologicznych. Podczas liczenia dużej liczby próbek komórek hemocytometr stanowi wąskie gardło w odniesieniu do czasu. Podobnie, liczenie błon z testów migracji/inwazji za pomocą wtyczki ImageJ Cell Counter, choć dokładne, jest wyjątkowo pracochłonne, subiektywne i niesławne z powodu powodowania bólu nadgarstka. Aby zaspokoić tę potrzebę, opracowaliśmy dwie wtyczki w ramach ImageJ do wyłącznego zadania automatycznego hemocytometru (lub znanej objętości) i zliczania komórek migracji/inwazji. Obie wtyczki opierają się na możliwości pozyskiwania wysokiej jakości mikrofotografii przy minimalnym tle. Są łatwe w użyciu i zoptymalizowane pod kątem szybkiego liczenia i analizy dużych rozmiarów próbek z wbudowanymi narzędziami analitycznymi, które pomagają w kalibracji zliczeń. Łącząc podstawowe zasady licznika komórek z automatycznym algorytmem zliczania i analizą po zliczeniu, znacznie zwiększa to łatwość, z jaką można przetwarzać testy migracji bez utraty dokładności.

Kalkulator stężenia komórek
Rysunek 1 przedstawia ogólny proces kalibracji CCC oraz obrazowania w celu zliczenia komórek. Rysunek 1A i 1B przedstawiają obraz kalibracyjny kwadratu P oraz obliczanie długości kwadratu P w pikselach. CCC określa stężenie komórek w danej objętości korzystając ze wzoru:
<img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/54719/54719...

Ten artykuł opisuje kwantyfikację hemocytometru i mikrofotografii migracji/inwazji za pomocą dwóch nowych wtyczek ImageJ o otwartym kodzie źródłowym: Kalkulatora Stężenia Komórek i Licznika Testu Migracji. Ponadto opisano w nim protokoły akwizycji i kalibracji obrazu, a także szczegółowo omówiono wymagania wejściowe wtyczek.

Zautomatyzowana kwantyfikacja i analiza procedur zliczania komórek za pomocą wtyczek ImageJ

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest wykorzystanie narzędzi analizy cyfrowej do szybkiego i dokładnego zliczania komórek w zawiesinie lub podczas migracji na membranie w teście inwazji. Protokół ten może pomóc badaczom w określeniu liczby komórek wymaganej do powszechnych technik oraz w testach motyliczności komórek in vitro. Główną zaletą tej metody jest zapewnienie szybkiego i dokładnego zliczania komórek przy jednoczesnym zastosowaniu wielu filtrów i narzędzi analitycznych.Na początek ustaw oświetlenie mikroskopu na maksimum. Przełącz obiektyw na 4x i upewnij się, że filtry kontrastu fazowego są włączone. Następnie w oprogramowaniu mikroskopu ustaw domyślne parametry przechwytywania obrazu.Teraz umieść standardny komorę Bürkera na stoliku mikroskopu i wykonaj zdjęcie do etapu kalibracji objętości obrazu. Dostosuj czas ekspozycji w razie potrzeby. W programie ImageJ, w kalkulatorze stężenia komórek, otwórz obraz i kliknij przycisk Get Image Dimension.Ta czynność wypełnia pola tekstowe szerokości i wysokości obrazu rozdzielczością obrazu w pikselach. Następnie wybierz narzędzie linii prostej i narysuj linię prostą wzdłuż całej długości głównego kwadratu p komory licznikowej, klikając i przeciągając kursor. Następnie naciśnij klawisz M, aby wyświetlić okno wyników.Następnie wpisz wartość z kolumny długości do pola tekstowego p-square length w kalkulatorze stężenia komórek. Po tym kliknij przycisk Calculate Image Volume, aby wyświetlić objętość obrazu w polu tekstowym image volume. Na koniec kliknij przycisk Save, aby zakończyć kalibrację wtyczki.W celu analizy próbek należy nanieść 10 µL zawiesiny komórek do obu komór szkiełka hemocytometru i dostosować ostrość tak, aby wnętrze komórek było ciemniejsze niż ich membrana, co zapewni ogniskowanie w centralnym przekroju komórki, a nie na jej biegunach. Następnie należy dodatkowo skorygować ekspozycję, aby komórki nie były prześwietlone. Słabo widoczne linie hemocytometru są dopuszczalne.Następnie wykonaj od pięciu do dziesięciu obrazów niepokrywających się obszarów centralnej części komory hematometrycznej. Rozdzielczość i powiększenie każdego obrazu muszą być takie same, jak w przypadku obrazu kalibracji objętości. Następnie w kalkulatorze stężenia komórek kliknij przycisk Count Cells i w wyświetlonym oknie wybierz folder do przeliczenia.Następnie w polu wprowadzania liczby próbek wpisz liczbę obrazów wykonanych dla każdej komory i kliknij OK. Wtyczka rozpocznie teraz gromadzenie danych. Więcej szczegółów znajduje się w tekście. Na początek, w oprogramowaniu mikroskopu, ustaw domyślne parametry akwizycji obrazu.W przypadku stolika stereomikroskopu należy zastosować jednolite białe tło oraz źródło światła nad stolikiem, najlepiej dwa elastyczne oświetlenia LED. Następnie należy umieścić na stoliku gotowy preparat z membraną po teście migracji. Obserwując obraz w czasie rzeczywistym wyświetlany przez oprogramowanie, należy ręcznie ustawić powiększenie tak, aby krawędzie pojedynczej membrany znajdowały się tuż w obrębie pola widzenia kamery.Następnie należy dostosować położenie źródeł światła oraz czasy ekspozycji, aby w maksymalnym stopniu odwzorować obraz idealny, charakteryzujący się minimalnym kolorem tła i równomiernie oświetloną membraną. Dokładność liczenia komórek zależy od wysokiej jakości akwizycji obrazu.W związku z tym, aby zapewnić najefektywniejsze wykorzystanie wtyczek, ważne jest zarejestrowanie obrazu o najwyższej możliwej jakości, jaką pozwala uzyskać kamera użytkownika. Następnie należy wyjąć preparat i przeprowadzić balans bieli obrazu w oprogramowaniu mikroskopu, aby zakończyć kalibrację. Bezpośrednio przed obrazowaniem należy spłaszczyć każdą membranę, wywierając nacisk na szkiełko nakrywkowe, aby usunąć jak największą liczbę uwięzionych pęcherzyków powietrza.Następnie, w oprogramowaniu, ustaw lokalizację folderu zapisu. Następnie wykonaj jedno zdjęcie dla każdej membrany, zapisując pliki obrazów w formacie TIF, stosując konwencję nazewnictwa sample 001 z sekwencyjnym zwiększaniem numeru dla każdego kolejnego obrazu. Ta konwencja nazewnictwa jest niezbędna, aby wtyczka mogła odnaleźć pliki.Jeśli pożądana jest korekcja pola płaskiego (flat-field), należy dla każdego preparatu znaleźć pusty obszar i wykonać zdjęcie tła. Plik należy zapisać pod nazwą próbki z dopiskiem „blank”. Następnie w programie ImageJ należy otworzyć wtyczkę TC.W programie TC kliknij przycisk Flatfield, a w oknie dialogowym Choose Directory wybierz folder, w którym zapisano obrazy membran. Następnie otwórz obraz membrany z testu migracji i wybierz Color Threshold. W oknie ustaw metodę na Shanbhag.Ustaw kolor progu na biały. Ustaw przestrzeń kolorów na RGB i odznacz opcję ciemnego tła. Następnie przesuń górne suwaki do zera, a dolne do 255, aby obraz stał się całkowicie biały.Gdy obraz stanie się biały, dostosuj suwaki koloru zielonego i czerwonego, aż widoczne będą tylko jądra komórkowe. W wtyczce TC skopiuj wartości suwaków RGB do odpowiadających im pól tekstowych progów RGB w ustawieniach konfiguracji. Następnie kliknij przycisk Add/Modify i nadpisz konfigurację.W panelu ustawień konfiguracji kliknij Save, aby zapisać ustawienia na dysku twardym. Aby teraz policzyć obrazy za pomocą wtyczki TC, kliknij Count Folder i wybierz folder do przeliczenia. Program przetworzy następnie obrazy i automatycznie doda dane do głównej tabeli.Teraz w głównej tabeli pojawi się znak wyboru w kolumnie Calibrate?, jeśli obraz zostanie oznaczony do kalibracji na podstawie podobieństwa do idealnych parametrów. Wybierz wszystkie próbki oznaczone do kalibracji.Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Recount and Suggested Size. Spowoduje to ponowne przeliczenie obrazów z sugerowaną minimalną powierzchnią cząsteczki. Następnie ponownie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Show Plot.Idealny obraz powinien wykazywać wykres przypominający długi prawostronny rozkład normalny. W razie potrzeby należy dostosować dolny zakres rozmiaru lub ustawienia progu RGB, wybierając próbkę, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając Recount and Manual Settings. Następnie należy wprowadzić żądane ustawienia i kliknąć Count, aby ponownie przeliczyć obraz.Aby ręcznie skorygować liczbę zliczeń, zaznacz próbki, kliknij prawym przyciskiem myszy w tabeli i wybierz Open image with counts. Otworzy się oryginalny obraz z czerwonymi znacznikami reprezentującymi każdą cząstkę zliczoną przez wtyczkę. Dodatkowo można użyć opcji Show counted binary image, aby sprawdzić, jak dobrze poszczególne komórki są rozdzielane przez progowanie kolorystyczne.Aby ręcznie dodać zliczenie, przytrzymaj klawisz Ctrl i kliknij lewym przyciskiem myszy. Spowoduje to umieszczenie znacznika w miejscu kursora, który zostanie dodany do całkowitej liczby zliczeń. Aby ręcznie usunąć znacznik, kliknij prawym przyciskiem myszy na obrazie, a wtyczka usunie znacznik znajdujący się najbliżej kursora.Aby usunąć grupę markerów, należy zaznaczyć obszar zainteresowania i kliknąć go prawym przyciskiem myszy, przytrzymując klawisz Ctrl. Proces działania kalkulatora stężenia komórek opiera się na obrazie kalibracyjnym pola p (p-square) oraz obliczeniu długości pola p i liczby pikseli. Pole p hemocytometru ma objętość 100 nanolitrów i przy przyjęciu tej stałej całkowita objętość obrazu może zostać obliczona po przeliczeniu pikseli na milimetry.Porównanie zliczeń manualnych i automatycznych na 57 obrazach z różnych eksperymentów i typów komórek wykazuje bardzo silną korelację między obiema metodami. Stężenia od pięciu milionów do 2 000 komórek na mililitr były zliczane dokładnie przy użyciu procesu automatycznego. Metryka Q reprezentuje ogólną klarowność obrazów na podstawie rozkładu rozmiarów poszczególnych cząstek.Odpowiednia wartość Q powinna być większa niż 0.5. Po zastosowaniu tych kryteriów do wyboru obrazów o jakości od umiarkowanej do doskonałej pod względem jasności i szumu tła, liczba komórek na obrazach skalibrowanych była znacznie bliższa liczbom uzyskanym z ręcznego liczenia niż w przypadku obrazów nieskalibrowanych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat dokładnego i efektywnego liczenia komórek w zawiesinie oraz w testach motyliczności komórkowej przy użyciu wtyczek CCC i TC do programu ImageJ.Po opanowaniu wtyczki TC, proces akwizycji, kwantyfikacji i korygowania liczby komórek może zostać przeprowadzony w czasie krótszym niż godzina. Obie wtyczki opierają się na funkcji zliczania cząstek z programu ImageJ i mogą być modyfikowane poprzez edycję makr używanych przez ImageJ. Zapewnia to użytkownikowi większą elastyczność w rozszerzaniu zakresu działania wtyczek na inne cząstki.

automated-quantification-analysis-cell-counting-procedures-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Adhezyjne mikrowzory normalizujące architekturę komórkową mogą być wykorzystane do zwiększenia czułości w wykrywaniu efektów działania leków, poprawy powtarzalności oraz uproszczenia zautomatyzowanego pozyskiwania i analizy obrazów. Taka technologia przyniesie korzyści w testach przesiewowych leków/siRNA, które są przeprowadzane na konwencjonalnych podłożach do hodowli komórkowej i w konsekwencji obarczone są nadmierną zmiennością międzykomórkową.

Udoskonalona wizualizacja i analiza ilościowa efektów działania leków z wykorzystaniem komórek rozmieszczonych w mikrowzorach

Opisujemy prototypową metodę przygotowania szkiełek podstawowych pokrytych fluorescencyjną żelatyną w celu wizualizacji degradacji macierzy pośrednio przez invadopodia. Przedstawiono techniki obliczeniowe z wykorzystaniem dostępnego oprogramowania do kwantyfikacji poziomu proteolizy macierzy przez pojedyncze komórki w obrębie mieszanej populacji oraz przez grupy wielokomórkowe obejmujące całe pola widzenia mikroskopu.

Ilościowy pomiar proteolizy macierzy zewnątrzkomórkowej zależnej od invadopodiów w kontekście jednokomórkowym i wielokomórkowym

Źródło: Dodge, R., et al. Szybkie liczenie jednostek tworzących kolonie w formacie 96-dołkowej płytki zastosowanej do mikrobiomu Drosophila . J. Vis. Exp. (2023)Ten film pokazuje ilościowe oznaczanie jednostek tworzących kolonie (CFU) bakterii związanych z jelitami u much Drosophila przy użyciu podejścia opartego na seryjnym rozcieńczaniu i posiewaniu. Homogenizowane próbki much zawierające bakterie jelitowe są seryjnie rozcieńczane, posiewane na agarze i inkubowane, aby umożliwić wzrost...

Kwantyfikacja jednostek tworzących kolonie bakterii związanych z jelitami u much Drosophila

Ten protokół opisuje konfigurowalną funkcjonalizację powierzchni systemu destiobiotyny, streptawidyny i APTES w celu wyizolowania określonych typów komórek. Ponadto w niniejszym manuskrypcie omówiono zastosowania, optymalizację i weryfikację tego procesu.

Metoda celowanej izolacji komórek poprzez funkcjonalizację powierzchni szkła

Społeczny ameba Dictyostelium discoideum został niedawno założony jako system do badania nieprawidłowego fałdowania białek i proteostazy. W tym miejscu opisujemy nową metodologię opartą na obrazowaniu do badania agregacji białek wywołanej temperaturą i odpowiedzi na stres komórkowy u D. discoideum.

Badanie systemu kontroli jakości białek D. discoideum przy użyciu obrazowania żywych komórek w kontrolowanej temperaturze

Ten manuskrypt opisuje metodę wizualizacji i ilościowego określania zlokalizowanych zdarzeń translacji w subkomórkowych przedziałach. Podejście zaproponowane w tym manuskrypcie wymaga podstawowego systemu obrazowania konfokalnego i odczynników oraz jest szybkie i opłacalne.

Immunofluorescencja ilościowa do pomiaru globalnej translacji zlokalizowanej

Artykuł opisuje ilościowe określenie 1) wielkości i liczby zrostów ogniskowych oraz 2) wskaźnika kształtu komórki i jego rozkładu na podstawie obrazów konfokalnych zlewających się monowarstw komórek MCF7.

Kwantyfikacja obszaru adhezji komórka-substrat i rozkładu kształtu komórki w monowarstwach komórek MCF7

Prezentujemy metodę, która wykorzystuje uogólnioną analizę obrazu opartą na obszarze do identyfikacji liczby komórek. Analiza różnych populacji komórek pozwoliła na wykorzystanie znacznych różnic w wysokości i strukturze komórek między różnymi typami komórek w ramach algorytmu adaptacyjnego.

Algorytm analizy obrazu oparty na obszarze do ilościowego oznaczania kokultur makrofagów i fibroblastów

Tutaj prezentowana jest metoda analizy kinetyki agregacji białek u nicieni Caenorhabditis elegans. Zwierzęta z populacji zsynchronizowanej pod względem wieku są obrazowane w różnych punktach czasowych, a następnie następuje półautomatyczne zliczanie inkluzji w CellProfiler i dopasowywanie do modelu matematycznego w AmyloFit.

Monitorowanie kinetyki agregacji białek in vivo przy użyciu automatycznego zliczania inkluzji u Caenorhabditis elegans

Ta metoda określa ilościowo obfitość mikroorganizmów za pomocą formatu 96-dołkowej płytki do płytek tworzących kolonie (CFU) i jest stosowana do mikrobiomu Drosophila w próbkach homogenatu całych much. Jednostki CFU są zliczane za pomocą oprogramowania do automatycznej analizy obrazu, które jest dostępne tutaj.

Szybkie zliczanie jednostek tworzących kolonie w formacie 96-dołkowej płytki zastosowane do mikrobiomu Drosophila

Ten artykuł opisuje krok po kroku metody automatyzacji kwantyfikacji jąder na podstawie obrazów za pomocą programu wykonywalnego o otwartym kodzie źródłowym, sprawdzanego w różnych gęstościach komórek. Ten program stanowi alternatywę, która usuwa bariery związane z kosztami, dostępnością dla użytkowników o ograniczonych umiejętnościach technologicznych oraz walidacją specyficzną dla aplikacji, która może ograniczać użyteczność istniejących technologii.

Wykorzystanie bibliotek przetwarzania obrazów w celu usprawnienia kwantyfikacji jąder

Poznaj zautomatyzowaną kwantyfikację komórek za pomocą wtyczek ImageJ do analizy hemocytometru oraz testów migracji i inwazji. Ta metoda zapewnia szybkie i precyzyjne zliczanie z wieloma narzędziami analizy.

Zautomatyzowana kwantyfikacja i analiza procedur zliczania komórek za pomocą wtyczek ImageJ

Przeglądaj więcej filmów