Zautomatyzowana kwantyfikacja i analiza procedur zliczania komórek za pomocą wtyczek ImageJ

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest wykorzystanie narzędzi analizy cyfrowej do szybkiego i dokładnego zliczania komórek w zawiesinie lub podczas migracji na membranie w teście inwazji. Protokół ten może pomóc badaczom w określeniu liczby komórek wymaganej do powszechnych technik oraz w testach motyliczności komórek in vitro. Główną zaletą tej metody jest zapewnienie szybkiego i dokładnego zliczania komórek przy jednoczesnym zastosowaniu wielu filtrów i narzędzi analitycznych.

Na początek ustaw oświetlenie mikroskopu na maksimum. Przełącz obiektyw na 4x i upewnij się, że filtry kontrastu fazowego są włączone. Następnie w oprogramowaniu mikroskopu ustaw domyślne parametry przechwytywania obrazu.

Teraz umieść standardny komorę Bürkera na stoliku mikroskopu i wykonaj zdjęcie do etapu kalibracji objętości obrazu. Dostosuj czas ekspozycji w razie potrzeby. W programie ImageJ, w kalkulatorze stężenia komórek, otwórz obraz i kliknij przycisk Get Image Dimension.

Ta czynność wypełnia pola tekstowe szerokości i wysokości obrazu rozdzielczością obrazu w pikselach. Następnie wybierz narzędzie linii prostej i narysuj linię prostą wzdłuż całej długości głównego kwadratu p komory licznikowej, klikając i przeciągając kursor. Następnie naciśnij klawisz M, aby wyświetlić okno wyników.

Następnie wpisz wartość z kolumny długości do pola tekstowego p-square length w kalkulatorze stężenia komórek. Po tym kliknij przycisk Calculate Image Volume, aby wyświetlić objętość obrazu w polu tekstowym image volume. Na koniec kliknij przycisk Save, aby zakończyć kalibrację wtyczki.

W celu analizy próbek należy nanieść 10 µL zawiesiny komórek do obu komór szkiełka hemocytometru i dostosować ostrość tak, aby wnętrze komórek było ciemniejsze niż ich membrana, co zapewni ogniskowanie w centralnym przekroju komórki, a nie na jej biegunach. Następnie należy dodatkowo skorygować ekspozycję, aby komórki nie były prześwietlone. Słabo widoczne linie hemocytometru są dopuszczalne.

Następnie wykonaj od pięciu do dziesięciu obrazów niepokrywających się obszarów centralnej części komory hematometrycznej. Rozdzielczość i powiększenie każdego obrazu muszą być takie same, jak w przypadku obrazu kalibracji objętości. Następnie w kalkulatorze stężenia komórek kliknij przycisk Count Cells i w wyświetlonym oknie wybierz folder do przeliczenia.

Następnie w polu wprowadzania liczby próbek wpisz liczbę obrazów wykonanych dla każdej komory i kliknij OK. Wtyczka rozpocznie teraz gromadzenie danych. Więcej szczegółów znajduje się w tekście. Na początek, w oprogramowaniu mikroskopu, ustaw domyślne parametry akwizycji obrazu.

W przypadku stolika stereomikroskopu należy zastosować jednolite białe tło oraz źródło światła nad stolikiem, najlepiej dwa elastyczne oświetlenia LED. Następnie należy umieścić na stoliku gotowy preparat z membraną po teście migracji. Obserwując obraz w czasie rzeczywistym wyświetlany przez oprogramowanie, należy ręcznie ustawić powiększenie tak, aby krawędzie pojedynczej membrany znajdowały się tuż w obrębie pola widzenia kamery.

Następnie należy dostosować położenie źródeł światła oraz czasy ekspozycji, aby w maksymalnym stopniu odwzorować obraz idealny, charakteryzujący się minimalnym kolorem tła i równomiernie oświetloną membraną. Dokładność liczenia komórek zależy od wysokiej jakości akwizycji obrazu.

W związku z tym, aby zapewnić najefektywniejsze wykorzystanie wtyczek, ważne jest zarejestrowanie obrazu o najwyższej możliwej jakości, jaką pozwala uzyskać kamera użytkownika. Następnie należy wyjąć preparat i przeprowadzić balans bieli obrazu w oprogramowaniu mikroskopu, aby zakończyć kalibrację. Bezpośrednio przed obrazowaniem należy spłaszczyć każdą membranę, wywierając nacisk na szkiełko nakrywkowe, aby usunąć jak największą liczbę uwięzionych pęcherzyków powietrza.

Następnie, w oprogramowaniu, ustaw lokalizację folderu zapisu. Następnie wykonaj jedno zdjęcie dla każdej membrany, zapisując pliki obrazów w formacie TIF, stosując konwencję nazewnictwa sample 001 z sekwencyjnym zwiększaniem numeru dla każdego kolejnego obrazu. Ta konwencja nazewnictwa jest niezbędna, aby wtyczka mogła odnaleźć pliki.

Jeśli pożądana jest korekcja pola płaskiego (flat-field), należy dla każdego preparatu znaleźć pusty obszar i wykonać zdjęcie tła. Plik należy zapisać pod nazwą próbki z dopiskiem „blank”. Następnie w programie ImageJ należy otworzyć wtyczkę TC.

W programie TC kliknij przycisk Flatfield, a w oknie dialogowym Choose Directory wybierz folder, w którym zapisano obrazy membran. Następnie otwórz obraz membrany z testu migracji i wybierz Color Threshold. W oknie ustaw metodę na Shanbhag.

Ustaw kolor progu na biały. Ustaw przestrzeń kolorów na RGB i odznacz opcję ciemnego tła. Następnie przesuń górne suwaki do zera, a dolne do 255, aby obraz stał się całkowicie biały.

Gdy obraz stanie się biały, dostosuj suwaki koloru zielonego i czerwonego, aż widoczne będą tylko jądra komórkowe. W wtyczce TC skopiuj wartości suwaków RGB do odpowiadających im pól tekstowych progów RGB w ustawieniach konfiguracji. Następnie kliknij przycisk Add/Modify i nadpisz konfigurację.

W panelu ustawień konfiguracji kliknij Save, aby zapisać ustawienia na dysku twardym. Aby teraz policzyć obrazy za pomocą wtyczki TC, kliknij Count Folder i wybierz folder do przeliczenia. Program przetworzy następnie obrazy i automatycznie doda dane do głównej tabeli.

Teraz w głównej tabeli pojawi się znak wyboru w kolumnie Calibrate?, jeśli obraz zostanie oznaczony do kalibracji na podstawie podobieństwa do idealnych parametrów. Wybierz wszystkie próbki oznaczone do kalibracji.

Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Recount and Suggested Size. Spowoduje to ponowne przeliczenie obrazów z sugerowaną minimalną powierzchnią cząsteczki. Następnie ponownie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Show Plot.

Idealny obraz powinien wykazywać wykres przypominający długi prawostronny rozkład normalny. W razie potrzeby należy dostosować dolny zakres rozmiaru lub ustawienia progu RGB, wybierając próbkę, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając Recount and Manual Settings. Następnie należy wprowadzić żądane ustawienia i kliknąć Count, aby ponownie przeliczyć obraz.

Aby ręcznie skorygować liczbę zliczeń, zaznacz próbki, kliknij prawym przyciskiem myszy w tabeli i wybierz Open image with counts. Otworzy się oryginalny obraz z czerwonymi znacznikami reprezentującymi każdą cząstkę zliczoną przez wtyczkę. Dodatkowo można użyć opcji Show counted binary image, aby sprawdzić, jak dobrze poszczególne komórki są rozdzielane przez progowanie kolorystyczne.

Aby ręcznie dodać zliczenie, przytrzymaj klawisz Ctrl i kliknij lewym przyciskiem myszy. Spowoduje to umieszczenie znacznika w miejscu kursora, który zostanie dodany do całkowitej liczby zliczeń. Aby ręcznie usunąć znacznik, kliknij prawym przyciskiem myszy na obrazie, a wtyczka usunie znacznik znajdujący się najbliżej kursora.

Aby usunąć grupę markerów, należy zaznaczyć obszar zainteresowania i kliknąć go prawym przyciskiem myszy, przytrzymując klawisz Ctrl. Proces działania kalkulatora stężenia komórek opiera się na obrazie kalibracyjnym pola p (p-square) oraz obliczeniu długości pola p i liczby pikseli. Pole p hemocytometru ma objętość 100 nanolitrów i przy przyjęciu tej stałej całkowita objętość obrazu może zostać obliczona po przeliczeniu pikseli na milimetry.

Porównanie zliczeń manualnych i automatycznych na 57 obrazach z różnych eksperymentów i typów komórek wykazuje bardzo silną korelację między obiema metodami. Stężenia od pięciu milionów do 2 000 komórek na mililitr były zliczane dokładnie przy użyciu procesu automatycznego. Metryka Q reprezentuje ogólną klarowność obrazów na podstawie rozkładu rozmiarów poszczególnych cząstek.

Odpowiednia wartość Q powinna być większa niż 0.5. Po zastosowaniu tych kryteriów do wyboru obrazów o jakości od umiarkowanej do doskonałej pod względem jasności i szumu tła, liczba komórek na obrazach skalibrowanych była znacznie bliższa liczbom uzyskanym z ręcznego liczenia niż w przypadku obrazów nieskalibrowanych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat dokładnego i efektywnego liczenia komórek w zawiesinie oraz w testach motyliczności komórkowej przy użyciu wtyczek CCC i TC do programu ImageJ.

Po opanowaniu wtyczki TC, proces akwizycji, kwantyfikacji i korygowania liczby komórek może zostać przeprowadzony w czasie krótszym niż godzina. Obie wtyczki opierają się na funkcji zliczania cząstek z programu ImageJ i mogą być modyfikowane poprzez edycję makr używanych przez ImageJ. Zapewnia to użytkownikowi większą elastyczność w rozszerzaniu zakresu działania wtyczek na inne cząstki.