Name: Technika Slice Patch Clamp do analizy plastyczności wywołanej uczeniem się (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Poznaj technikę slice patch clamp do analizy plastyczności synaptycznej wywołanej uczeniem się u szczurów. Metoda ta pozwala badać zmiany w aktywności neuronów kory ruchowej po treningu motorycznym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Dr. Paw-Min-Thein-Oo, Dr. Han-Thiri-Zin i Pani H. Tsurutani za ich pomoc techniczną. Projekt ten był wspierany przez Grants-in-Aid for Young Scientists (H.K. i Y.S.), Scientific Research B (D.M.), Scientific Research C (D.M.) oraz Scientific Research in Innovative Areas (D.M.) z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii Japonii.

Wszystkie procedury chirurgiczne związane z utrzymaniem zwierząt były zgodne z Wytycznymi do eksperymentów na zwierzętach Szkoły Medycznej Uniwersytetu Yamaguchi i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Yamaguchi.
1. Zwierzęta
<ol>
	<li>Stosować 4- do 5-tygodniowych samców szczurów Sprague-Dawley (w wieku pourodzeniowym od 28 do 31 dni).</li>
	<li>Zwierzęta są trzymane w oddzielnych klatkach z tworzywa sztucznego (40 cm × 25 cm × 25 cm) utrzymywanych w stałej temperaturze (23 °C ± 1 °C) w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność. Daj szczurom ad libitum dostęp do wody i pożywienia.</li>
</ol>
2. Test pręta wirnika
<ol>
	<li>Aby zbadać uczenie się umiejętności motorycznych, poddaj każdego szczura testowi pręta wirnika (średnica pręta 7 cm; szerokość toru 8,9 cm; wysokość upadku 26,7 cm) przez 1 lub 2 kolejne dni (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A w Kida et al., 20167). Zadanie należy wykonać w cichym pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze (23 ± 1 °C). Nie przeszkadzaj szczurom ani nie dotykaj ich przed badaniem.</li>
	<li>Ustaw pręt wirnika w tryb przyspieszenia, który zwiększa się liniowo od 4 obrotów/min do 40 obrotów/min (8 π/min do 80 π/min) w ciągu 5 minut.</li>
	<li>Połóż szczura na spoczywającym obrotowym pręcie. Upewnij się, że wszystkie kończyny znajdują się na pręcie.</li>
	<li>Zmierz opóźnienie, które ma spaść z obracającego się pręta, aby ocenić wydajność silnika.</li>
	<li>Pozwól każdemu szczurowi na 10 prób (prób) w odstępach 30-sekundowych.</li>
	<li>Jeśli szczur spadnie z obracającego się pręta, połóż go ponownie na pręcie po upływie 10-20 sekund.</li>
	<li>Ofiarować szczura z przedawkowaniem pentobarbitalu (400 mg / kg) 30 minut po ostatniej próbie. Wstrzyknij niewyszkolonym szczurom kontrolnym taką samą dawkę znieczulenia w ich klatkach domowych.</li>
</ol>
3. Test unikania hamowania
<ol>
	<li>Aby zbadać uczenie się kontekstowe, poddaj szczury testowi unikania hamowania (IA) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D w Mitsushima et al., 2011, 201310,11) Unikaj wszelkich epizodycznych doświadczeń w dniu eksperymentu, takich jak kontakt z innymi, zmiana klatki lub sprzątanie. Zadanie należy wykonywać w cichym pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze (23 ± 1 °C). 
	UWAGA: Aparat treningowy IA to dwukomorowe pudełko akrylowe (długość 33 cm; szerokość 58 cm; wysokość 33 cm). Ma podświetlaną bezpieczną stronę i ciemną stronę przeciwwstrząsową, które są oddzielone klapą (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D).</li>
	<li>Umieść szczura po bezpiecznej (oświetlonej) stronie podświetlanego pudełka. Obchodzić się ze szczurem delikatnie, bez stresu.</li>
	<li>Odczekaj krótki czas (10 do 20 s), aby zaaklimatyzować się szczura w środowisku.</li>
	<li>Otwórz przesuwane drzwi, aby szczur mógł dowolnie wejść do ciemnego pudełka.</li>
	<li>Zmierz opóźnienie (s), zanim szczur wejdzie w nową ciemną stronę pudełka. Opóźnienie pierwszej próby reprezentuje wydajność szczura przed treningiem.</li>
	<li>Po wejściu na ciemną stronę zamknij drzwi i zastosuj wstrząs elektryczny (2 s, 1,6 mA) za pomocą stalowych prętów elektrycznych wbitych w podłogę skrzynki. Pozwól szczurom spacerowym eksplorować aparaturę treningową przez 1 minutę bez szoku. Trzymaj niesparowane szczury w oświetlonej klatce szokowej przez kilka dni i nagle poddaj szok bez epizodycznych doświadczeń. Obchodź się delikatnie, bez stresu w żadnych grupach.</li>
	<li>Trzymaj każdego szczura w ciemnym pudełku przez 10 sekund przed powrotem do klatki domowej.</li>
	<li>Po 30 minutach od wstrząsu stopy ponownie umieść szczura po oświetlonej stronie pudełka. Zmierz opóźnienie, aby przejść na ciemną stronę.</li>
	<li>Wróć szczura do klatki domowej.</li>
	<li>Po 60 minutach od wstrząsu należy złożyć ofiarę szczura z przedawkowaniem pentobarbitalu (400 mg/kg). Ze szczurem należy obchodzić się delikatnie i wstrzykiwać znieczulenie dootrzewnowo. U nieprzeszkolonych szczurów kontrolnych wstrzyknąć znieczulenie w ich domowych klatkach bez doświadczenia opisanego powyżej.</li>
</ol>
4. Bufor preparacyjny
<ol>
	<li>Rozpuść kryształy 0,195 g NaH2PO 4-2H 2O, 0,188 g KCl, 0,074 g CaCl2, 1,423 g MgCl2-6H 2O i 12,579 g chlorku choliny w ultraczystej wodzie (900 ml do 950 ml). Patrz tabela 1.</li>
	<li>Rozpuść kryształy 2.340 g kwasu askorbinowego, 0.342 g soli sodowej kwasu pirogronowego, 2.100 gNaHCO3 i 4.500 g glukozy.</li>
	<li>Dodaj wodę do 1000 ml. Zakres osmolalności będzie wynosił od 290 mOsm/L do 300 mOsm/L. Dostosuj osmolalność, dodając ultraczystą wodę, jeśli jest poza zakresem.</li>
	<li>Roztwór należy rozpylać z mieszaniną 5% CO2 / 95% O2 w lodowatych temperaturach przez 5 minut przed użyciem.</li>
</ol>
5. Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF)
<ol>
	<li>Rozpuść kryształy 0,186 g KCl, 6,700 g NaCl i 0,156 g NaH2PO 4-2H2O w ultraczystej wodzie (900 ml do 950 ml). Patrz tabela 2.</li>
	<li>Bąbelkować mieszaniną gazów przez 5 minut.</li>
	<li>Rozpuścić kryształy 1.800 g glukozy i 2.184 gNaHCO3, a następnie dodać 4 ml MgCl2 i 4 ml CaCl2 z 1 M roztworów podstawowych.</li>
	<li>Dodaj wodę do 1000 ml. Zakres osmolalności będzie wynosił od 290 mOsm/L do 295 mOsm/L. Dostosuj osmolalność, dodając ultraczystą wodę, jeśli przekracza zakres.</li>
	<li>Przed użyciem przemyć bąbelki z mieszaniną gazów.</li>
</ol>
6. Roztwory wewnątrzkomórkowe
<ol>
	<li>W przypadku zapisów cęgowych prądowych (Tabela 3) rozpuść 0,0746 g KCl, 6,089 g K-glukonianu, 0,476 g HEPES, 0,0456 g EGTA i 500 μl MgCl2 z 1 M roztworu podstawowego w 180 ml ultraczystej wody (dostosuj pH do 7,2 za pomocą KOH).
	<ol>
		<li>Dodać 0,4408 g Na2-ATP, 0,0418 g Na3-GTP i 0,510 g Na-fosfokreatyny. Dodaj wodę do 200 ml i dostosuj pH do 7,35 za pomocą KOH.</li>
		<li>Dostosuj osmolalność do około 290 mOsm/L, dodając ultraczystą wodę.</li>
		<li>Przechowywać w postaci 1 ml porcji w zamrażarce (-30 °C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku zapisów cęgowych (Tabela 4) rozpuść 5,244 g CsMeSO3, 0,672 g CsCl, 0,476 g HEPES, 0,0456 g EGTA i 500 μl MgCl2 z 1 M roztworów podstawowych w 180 ml ultraczystej wody. Dostosuj pH do 7,2 za pomocą CsOH. W przypadku zapisów mEPSP i mIPSP należy użyć zmodyfikowanego stężenia 5,814 g CsMeSO3 i 0,252 g CsCl, aby dostosować potencjał odwrócenia odpowiedzi receptora GABAA11.
	<ol>
		<li>Dodać 0,4408 g Na2-ATP, 0,0418 g Na3-GTP i 0,510 g Na-fosfokreatyny. Dodaj wodę do 200 ml i dostosuj pH do 7,35 za pomocą CsOH.</li>
		<li>Dostosuj osmolalność do około 290 mOsm/L, dodając ultraczystą wodę.</li>
		<li>Przechowywać w postaci 1 ml porcji w zamrażarce (-30 °C).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Przygotowanie plastra
<ol>
	<li>Przed złożeniem w ofierze schłodź wszystkie narzędzia do preparowania kruszonym lodem (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). Dodaj około 500 ml zimnej wody do pojemnika z kruszonym lodem, aby zwiększyć powierzchnię kontaktu. Ta procedura została opisana wcześniej10,11,12. 
	UWAGA: Narzędzia tutaj to: duże nożyczki, nożyczki do tęczówki, szpatułka, mikroszpatułka, kleszcze, pęseta, zlewka ze stali nierdzewnej o pojemności 200 ml, ostrze do przycinania mózgu, strzykawka do perfuzji serca o pojemności 120 ml wypełniona buforem preparacyjnym potraktowanym mieszaniną gazów, silikonowa rurka (20 cm) połączona ze spłaszczoną igłą o rozmiarze 18, nierdzewny etap preparacji mózgu (grubość = 3 mm, φ = 12 cm) oraz stolik montażowy dla wibratomu (φ = 5 cm).</li>
	<li>Poświęć szczura 30 minut po zakończeniu paradygmatu behawioralnego, znieczulając go przedawkowaniem pentobarbitalu (400 mg / kg masy ciała). Szybko przygotuj plasterki, aby upewnić się, że są one tak zdrowe, jak to tylko możliwe10,11,12. Protokół ekstrakcji mózgu spełnia wszystkie normy weterynaryjne obowiązujące na naszej uczelni.</li>
	<li>Napełnij strzykawkę o pojemności 120 ml lodowatym buforem do rozwarstwiania (Tabela 1) z bąbelkami 5% mieszaniny gazów CO2 / 95% O2 . Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza przed perfuzją.</li>
	<li>Po odsłonięciu serca wbij igłę w tylną część lewej komory.</li>
	<li>Wykonaj perfuzję przezsercową mózgu ręcznie za pomocą strzykawki. Większe szczury wymagają większego buforu preparacyjnego do perfuzji. Zanurz mózg w lodowatym buforze preparacyjnym na 5 minut. Podczas zanurzania należy w sposób ciągły bąbelkować bufor</li>.
	<li>Przytnij tylną stronę mózgu pod kątem równoległym do dendrytycznej orientacji docelowego obszaru korowego za pomocą ostrza. Ponieważ mózg stoi na etapie sekcji z odciętym końcem na dole, kąt początkowy określa kąt wszystkich kolejnych wycinków mózgu. Ten krok jest niezwykle ważny (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). Nieprawidłowy kąt może przeciąć docelowe neurony piramidowe. 
	UWAGA: Narzędzia tutaj to: ostrze do przycinania mózgu, bibuła filtracyjna (φ = 10 cm), nierdzewny etap preparacji mózgu (grubość = 3 mm, φ = 12 cm), szpatułka, superglue, zakraplacz i stolik montażowy do wibratomu (φ = 5 cm).</li>
	<li>Wytnij wycinki mózgu koronalnego o grubości 350 μm za pomocą wibratomu. Napełnij komorę rozwarstwiania lodowatym buforem z bąbelkami mieszaniny gazów 5% CO2 / 95% O2 (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2C). Bąbelkuj bufor w sposób ciągły podczas wycinka mózgu.</li>
	<li>Przytnij obrzeża obszaru docelowego za pomocą nożyczek do przysłony.</li>
	<li>Delikatnie umyj przycięte plastry w temperaturze pokojowej aCSF z bąbelkami 5% CO2 / 95% O2 (tabela 2).</li>
	<li>Trzymaj przycięte plasterki w komorze interfejsu, aż do momentu wykonania nagrania (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D i E). Inkubacja przez 1 godzinę w komorze poprawia stan komórek, ale fenotypy zmieniają się, jeśli plastry są inkubowane dłużej niż 10 godzin. Zamknij pokrywę komory, aby zamknąć gazy i małe krople cieczy aCSF.</li>
</ol>
8. Zacisk krosowy na całe ogniwo
UWAGA: Nagrania całych komórek wymagają wzmacniacza i filtra dolnoprzepustowego, który jest ustawiony na częstotliwość graniczną 5 kHz. Sygnały są digitalizowane i przechowywane w komputerze PC. Przechowywane dane są analizowane w trybie offline (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A).
<ol>
	<li>Utwórz szklane elektrody za pomocą poziomego ściągacza. Napełnij elektrody odpowiednim roztworem (tabele 3 i 4) za pomocą zwykłej strzykawki z polietylenu o pojemności 1 ml przymocowanej do drobnej szklanej rurki i filtra 0,22 μm.</li>
	<li>Przed kontaktem z kuwetą należy utrzymać nadciśnienie i wyregulować prąd pipety do zera.</li>
	<li>Po utworzeniu uszczelki gigaomowej zastosuj podciśnienie, aby rozerwać błonę komórkową (konfiguracja całej komórki w <silna klasa = "xfig" >Rysunek 3F).</li>
</ol>
9. Analiza cęgów prądowych
<ol>
	<li>Właściwości błony komórkowej
	<ol>
		<li>Napełnij pipety rejestrujące plastry roztworem wewnątrzkomórkowym do zapisów cęgowych prądu (Tabela 3). Rezystancja pipety wynosi od 4 MΩ do 7 MΩ w aCSF.</li>
		<li>Po pęknięciu membrany należy utrzymać napięcie membrany na poziomie -60 mV w trybie V-CLAMP. Następnie przełącz się z trybu "kąpieli" na tryb "komórki" w teście membranowym za pomocą oprogramowania do pomiaru wewnętrznych właściwości komórki, takich jak pojemność błony, rezystancja i stała czasowa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aktualne badanie dotyczące iniekcji
	<ol>
		<li>Po zarejestrowaniu wewnętrznych właściwości ogniwa należy przełączyć tryb z V-CLAMP na TRACK (I = 0) / I-CLAMP NORMAL dla wtrysku prądu. Należy pamiętać, że potencjał złącza cieczowego nie powinien być korygowany10.</li>
		<li>Wstrzyknij prąd do ogniwa na 300 ms. Zmieniaj natężenie prądu krok po kroku od -100 pA do +550 pA ze wzrostem o 50 pA. Policz liczbę skoków (potencjałów czynnościowych) wywołanych przez obecne wstrzyknięcia.</li>
		<li>Zmierzyć minimalne napięcie potrzebne do wywołania potencjału czynnościowego (jest to napięcie progowe).</li>
		<li>Oblicz amplitudę po hiperpolaryzacji jako różnicę między napięciem w momencie inicjacji skoku a najniższym napięciem osiągniętym podczas hiperpolaryzacji7.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. Analiza cęgów napięciowych
<ol>
	<li>Stosunek AMPA/NMDA 
	UWAGA: Stosunek AMPA/NMDA jest konwencjonalnym sposobem oceny plastyczności postsynaptycznej w glutaminergicznym synapsie pobudzającym7,8,9,10,11. Należy jednak pamiętać, że równoczesny wzrost obu składników może nie zmienić ratio13.
	<ol>
		<li>Przeprowadzić fuzję komory rejestracyjnej roztworem fizjologicznym bąbelkowym mieszaniną gazów i utrzymać temperaturę na poziomie od 22 °C do 25 °C. Dodać 0,1 mM pikrotoksyny do roztworu, aby zablokować odpowiedź GABAA, w której pośredniczy i dodać 4 μM 2-chloroadenozyny, aby ustabilizować wywołaną odpowiedź neuronalną14.</li>
		<li>Napełnij pipety do zapisu plastrów roztworem wewnątrzkomórkowym do zapisów cęgowych (Tabela 4). Sprawdź rezystancję pipety rejestrującej w aCSF. Rezystancja wynosi od 4 MΩ do 7 MΩ.</li>
		<li>W celu nagrania w warstwie II/III neuronów piramidowych w M1, należy umieścić bipolarną elektrodę stymulującą wolfram 200 μm do 300 μm bocznie od komórek, które mają być rejestrowane, poniżej powierzchni pial w obszarze reprezentacji kończyny przedniej (2 mm bocznie do linii środkowej)15,16,17.</li>
		<li>W celu nagrania w neuronie piramidowym CA1 należy umieścić elektrodę stymulującą od 200 μm do 300 μm boczną (włókno poboczne Schaffera) lub przyśrodkową (ścieżka skroniowo-amonowa) do komórek, które zostaną zarejestrowane (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3B).</li>
		<li>Zwiększ intensywność bodźca aż do odpowiedzi synaptycznej > 10 pA.</li>
		<li>Oblicz stosunek AMPA/NMDA jako stosunek prądu szczytowego mierzonego przy -60 mV do prądu mierzonego przy +40 mV po 150 ms po wystąpieniu bodźca. Należy pamiętać, że w celu obliczenia stosunku należy uśrednić od 50 do 100 śladów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Miniaturowe nagrania prądów postsynaptycznych 
	Uwaga: Uważa się, że miniaturowe pobudzające prądy postsynaptyczne (mEPSC) odpowiadają reakcjom wywołanym przez presynaptyczne uwolnienie pojedynczego pęcherzyka glutaminianu18. W przeciwieństwie do tego, uważa się, że miniaturowe hamujące prądy postsynaptyczne (mIPSC) odpowiadają reakcjom wywołanym przez presynaptyczne uwolnienie pojedynczego pęcherzyka GABA18. Wzrost amplitudy mEPSC i mIPSC odzwierciedla wzmocnienie transmisji postsynaptycznej, podczas gdy wzrost częstości zdarzeń odzwierciedla wzrost liczby funkcjonalnych synaps lub prawdopodobieństwo uwolnienia presynaptycznego11.
	<ol>
		<li>Napełnij pipetę rejestrującą plaster zmodyfikowanym roztworem wewnątrzkomórkowym (Tabela 4), aby dostosować potencjał odwrócenia prądu, w którym pośredniczy receptor GABAA, do -60 mV.</li>
		<li>Dodać 0,5 μM tetrodotoksyny do kąpieli, aby zablokować spontaniczne potencjały czynnościowe.</li>
		<li>Utrzymaj napięcie na poziomie -60 mV, aby rejestrować zdarzenia mEPSC przez 5 minut.</li>
		<li>Zmień potencjał podtrzymania na 0 mV, aby rejestrować zdarzenia mIPSC przez 5 minut. Ponieważ neurony M1 wykazują nieco wyższy potencjał odwrócenia dla prądów za pośrednictwem receptora AMPA, mIPSC neuronów M1 są rejestrowane przy +15 mV z 0,1 mM APV.</li>
		<li>Poczekaj kilka minut, aż prąd się ustabilizuje.</li>
		<li>Nagrywaj zdarzenia mIPSC przez 5 minut.</li>
		<li>Wykrywaj miniaturowe zdarzenia za pomocą oprogramowania i używaj zdarzeń powyżej 10 pA do analizy. Policz liczbę zdarzeń mEPSC lub mIPSC przez 5 minut, aby określić częstotliwość. Uśrednij amplitudy zdarzeń, aby uzyskać średnią amplitudę.</li>
		<li>Sprawdzić, czy kąpiel w kąpieli z użyciem 10 μM CNQX czy 10 μM metiodku bicukuliny blokuje odpowiednio zdarzenia mEPSC i mIPSCs.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza impulsów sparowanych 
	UWAGA: Plastyczność presynaptyczną można analizować za pomocą analizy impulsów sparowanych. Wzrost częstości parowanych impulsów sugeruje spadek prawdopodobieństwa uwalniania presynaptycznego glutaminianu lub GABA7,10,11.
	<ol>
		<li>Aby przeanalizować synapsy pobudzające, dodaj 0,1 mM pikrotoksyny i zarejestruj odpowiedź przy -60 mV. Chociaż do kąpieli dodaliśmy 4 μM 2-chloroadenozynę, musimy pamiętać, że lek wpływa na prawdopodobieństwo uwolnienia presynaptycznego14 .</li>
		<li>Aby przeanalizować synapsy hamujące, dodaj 0,1 mM APV i 4 μM 2-chloroadenozynę do kąpieli i zarejestruj odpowiedź przy 0 mV. W neuronach M1 zarejestruj odpowiedź przy +15 mV.</li>
		<li>Zastosuj sparowane impulsy z interwałem między bodźcami wynoszącym 100 ms lub 200 ms.</li>
		<li>Zapisać 50-100 sekwencyjnych śladów przy każdym potencjale utrzymywania i uśrednić wartości.</li>
		<li>Oblicz sparowany stosunek impulsów jako stosunek drugiego piku do pierwszego piku prądu postsynaptycznego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).</li>
<li>Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thin+slice+preparation+for+patch+clamp+recordings+from+neurones+of+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system.</a> Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).</li>
<li>Rioult-Pedotti, M. S., Friedman, D., Donoghue, J. P. Learning-induced LTP in neocortex. Science. 290 (5491), 533-536 (2000).</li>
<li>Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stably+maintained+dendritic+spines+are+associated+with+lifelong+memories%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories.</a> Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).</li>
<li>Xu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+formation+and+selective+stabilization+of+synapses+for+enduring+motor+memories%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories.</a> Nature. 462 (7275), 915-919 (2009).</li>
<li>Kida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+Training+Promotes+Both+Synaptic+and+Intrinsic+Plasticity+of+Layer+II%2FIII%5BTitle%5D)+AND+%22Pyramidal+Neurons+in+the+Primary+Motor+Cortex.+Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Motor Training Promotes Both Synaptic and Intrinsic Plasticity of Layer II/III.</a> Pyramidal Neurons in the Primary Motor Cortex. Cereb Cortex. 26 (8), 3494-3507 (2016).</li>
<li>Takahashi, T., Svoboda, K., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience+strengthening+transmission+by+driving+AMPA+receptors+into+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Experience strengthening transmission by driving AMPA receptors into synapses.</a> Science. 299 (5612), 1585-1588 (2003).</li>
<li>Rumpel, S., LeDoux, J., Zador, A., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+receptor+trafficking+underlying+a+form+of+associative+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic receptor trafficking underlying a form of associative learning.</a> Science. 308 (5718), 83-88 (2005).</li>
<li>Mitsushima, D., Ishihara, K., Sano, A., Kessels, H. W., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contextual+learning+requires+synaptic+AMPA+receptor+delivery+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Contextual learning requires synaptic AMPA receptor delivery in the hippocampus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12503-12508 (2011).</li>
<li>Mitsushima, D., Sano, A., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cholinergic+trigger+drives+learning-induced+plasticity+at+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A cholinergic trigger drives learning-induced plasticity at hippocampal synapses.</a> Nat Commun. 4, 2760(2013).</li>
<li>Kida, H., Mitsushima, D. <a target="_blank" href="https://www.jstage.jst.go.jp/article/ymj/63/3/63_189/_article/-char/ja/">Patch Clamp Technique in Brain Slices: Recording of Neuronal Activity in the Rat Primary Motor Cortex.</a> Yamaguchi Medical Journal. 63, (2014).</li>
<li>Watt, A. J., van Rossum, M. C., MacLeod, K. M., Nelson, S. B., Turrigiano, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+coregulates+quantal+AMPA+and+NMDA+currents+at+neocortical+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity coregulates quantal AMPA and NMDA currents at neocortical synapses.</a> Neuron. 26 (3), 659-670 (2000).</li>
<li>Baidan, L. V., Zholos, A. V., Wood, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+calcium+currents+by+G-proteins+and+adenosine+receptors+in+myenteric+neurones+cultured+from+adult+guinea-pig+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Modulation of calcium currents by G-proteins and adenosine receptors in myenteric neurones cultured from adult guinea-pig small intestine.</a> Br J Pharmacol. 116 (2), 1882-1886 (1995).</li>
<li>Tandon, S., Kambi, N., Jain, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlapping+representations+of+the+neck+and+whiskers+in+the+rat+motor+cortex+revealed+by+mapping+at+different+anaesthetic+depths%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Overlapping representations of the neck and whiskers in the rat motor cortex revealed by mapping at different anaesthetic depths.</a> Eur J Neurosci. 27 (1), 228-237 (2008).</li>
<li>Adachi, K., Murray, G. M., Lee, J. C., Sessle, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noxious+lingual+stimulation+influences+the+excitability+of+the+face+primary+motor+cerebral+cortex+%28face+MI%29+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Noxious lingual stimulation influences the excitability of the face primary motor cerebral cortex (face MI) in the rat.</a> J Neurophysiol. 100 (3), 1234-1244 (2008).</li>
<li>Tennant, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organization+of+the+forelimb+representation+of+the+C57BL%2F6+mouse+motor+cortex+as+defined+by+intracortical+microstimulation+and+cytoarchitecture%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">The organization of the forelimb representation of the C57BL/6 mouse motor cortex as defined by intracortical microstimulation and cytoarchitecture.</a> Cereb Cortex. 21 (4), 865-876 (2011).</li>
<li>Pinheiro, P. S., Mulle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+glutamate+receptors%3A+physiological+functions+and+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Presynaptic glutamate receptors: physiological functions and mechanisms of action.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (6), 423-436 (2008).</li>
<li>Kwon, H. B., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+induces+de+novo+growth+of+functional+spines+in+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex.</a> Nature. 474 (7349), 100-104 (2011).</li>
<li>Hess, G., Donoghue, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+potentiation+of+horizontal+connections+provides+a+mechanism+to+reorganize+cortical+motor+maps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Long-term potentiation of horizontal connections provides a mechanism to reorganize cortical motor maps.</a> J Neurophysiol. 71 (6), 2543-2547 (1994).</li>
<li>Shannon, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mathematical+theory+of+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Bell+Sys+Tech+J%22%5BJournal%5D)">A mathematical theory of communication.</a> Bell Sys Tech J. 27, (1948).</li>
<li>Ono, K. M., D, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+creates+diversity+of+excitatory+and+inhibitory+synapses+in+the+hippocampal+CA1%3A+a+possible+amount+of+information+at+a+single+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Sci%22%5BJournal%5D)">Learning creates diversity of excitatory and inhibitory synapses in the hippocampal CA1: a possible amount of information at a single synapse.</a> J Physiol Sci. 67, (2017).</li>
<li>Wang, L., Conner, J. M., Rickert, J., Tuszynski, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+plasticity+within+highly+specific+neuronal+populations+identifies+a+unique+parcellation+of+motor+learning+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Structural plasticity within highly specific neuronal populations identifies a unique parcellation of motor learning in the adult brain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (6), 2545-2550 (2011).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów. Potwierdzamy, że zapoznaliśmy się ze stanowiskiem czasopisma w kwestiach związanych z etycznym publikowaniem i potwierdzamy, że niniejszy raport jest zgodny z tymi wytycznymi. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu lub analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Głównym ograniczeniem techniki zacisku krosowego jest zapis w przygotowaniu plastrów, który może nie odzwierciedlać tego, co dzieje się in vivo. Chociaż analiza cęgów prądowych in vivo jest bardziej wiarygodna, uzyskanie wystarczających danych od przytomnych zwierząt jest technicznie trudne. Ponieważ każdy neuron piramidowy ma inne właściwości komórkowe, potrzebna jest odpowiednia liczba komórek, aby prawidłowo analizować różnice w neuronach po treningu. Co więcej, analiza napięcia cęgowego wymaga ciągłego leczenia farmakologicznego CNQX, APV lub bicukuliny w celu określenia charakteru odpowiedzi postsynaptycznych. Aby przeanalizować miniaturowe reakcje wywołane przez pojedynczy pęcherzyk glutaminianu lub GABA, konieczne jest ciągłe leczenie tetrodotoksyną w celu zablokowania spontanicznych potencjałów czynnościowych. Chociaż niedawno opracowana technika obrazowania wielofotonowego jest skuteczna w analizie zmian morfologicznych w synapsach pobudzających19, do analizy funkcji synaps in vivo potrzebna jest technika połączonego patch clamp. Obecnie dość trudno jest analizować zmiany morfologiczne w synapsach hamujących, ponieważ większość synaps hamujących nie tworzy kolców. W tej chwili zacisk plasterkowy byłby najbardziej odpowiednią techniką do analizy właściwości komórek lub funkcji synaps pobudzających/hamujących u wyszkolonych zwierząt.
Korzystając z analizy cęgów prądowych (ryc. 4), niedawno opisaliśmy wewnętrzną plastyczność wywołaną uczeniem motorycznym w neuronach warstwy II/III. W szczególności szczury trenowane przez 1 dzień wykazały znaczny spadek spoczynkowego potencjału błonowego i wzrost progu skoku. Szczury trenowane przez 2 dni wykazały znaczny wzrost spoczynkowego potencjału błonowego, co doprowadziło do zwiększonej pobudliwości. Wyniki te sugerowały, że u wyszkolonych szczurów zaszły dynamiczne zmiany w wewnętrznej plastyczności neuronów warstwy II/III M1. Dodatkowa analiza napięcia cęgowego ujawniła wzrost współczynnika sparowanych impulsów u szczurów trenowanych w ciągu 1 dnia, co sugeruje, że nastąpił przejściowy spadek presynaptycznego prawdopodobieństwa uwolnienia GABA7. W związku z tym możliwe jest, że odhamowanie GABA w synapsach warstwy II/III może wywołać wynikającą z tego plastyczność indukowaną uczeniem się w M1. W tym celu przygotowanie M1 w plastrach wymaga kąpieli z blokerem receptora GABAA w celu indukcji LTP20.
Analiza miniaturowych potencjałów postsynaptycznych jest skutecznym sposobem wykrywania plastyczności synaptycznej u zwierząt wyszkolonych w IA. Sekwencyjny zapis mEPSC i mIPSC w pojedynczym neuronie CA1 pozwala na analizę synaptycznej siły pobudzającej/hamującej każdego pojedynczego neuronu. Ponieważ pojedyncza odpowiedź mE(I)PSC jest przypisywana pojedynczemu pęcherzykowi glutaminianu lub GABA, wzrost amplitudy mE(I)PSC sugeruje wzmocnienie postsynaptyczne. Korzystając z analizy mE(I)PSC, znaleźliśmy indywidualne różnice w sile wejścia pobudzającego / hamującego do każdego neuronu CA1 (Figura 5C). Trening IA wyraźnie promował różnorodność w sile synaptycznej, ale nie zaobserwowano tego w innych grupach (Tabela 5).
Różnorodność synaptyczna wywołana uczeniem się może być analizowana matematycznie. Obliczając prawdopodobieństwo pojawienia się każdego punktu, dane z każdego neuronu można przekształcić w samoentropię (bit) przy użyciu teorii informacji Claude'a E. Shannona21. Punkt o wysokim prawdopodobieństwie pojawienia się (wokół średniego poziomu) wskazuje na niską autoentropię, podczas gdy punkt o bardzo rzadkim prawdopodobieństwie (punkt odchylony) wskazuje na wysoką autoentropię. W porównaniu z niewyszkolonymi szczurami, samoentropia na neuron była wyraźnie zwiększona u szczurów wyszkolonych przez IA, ale nie uszczurów niesparowanych lub chodzących przez niego. Analiza ta sugeruje, że po uczeniu kontekstowym nastąpił wzrost ilości informacji wewnątrz CA1.
Technika zaciskania łaty slice może być również stosowana do badań nad warunkowaniem strachu w bocznym ciele migdałowatym9 oraz do badań doświadczeń sensorycznych w korze beczkowej8. Co więcej, technika ta może być stosowana z różnymi innymi technikami do dalszych badań. Na przykład technikę dostarczania genów znakowanych białkiem zielonej fluorescencji (GFP) za pośrednictwem wirusa można połączyć z techniką zacisku plastrowego w celu analizy funkcji określonych cząsteczek. Ponadto ogniskowe mikrowstrzyknięcie znacznika wstecznego może być wykorzystane do wizualizacji określonych neuronów, które rzutują na określony obszar. Następnie, korzystając z techniki cęgów prądowych, można przeanalizować właściwości specyficzne dla komórki w wizualizowanych neuronach23. Co więcej, połączenie dwufotonowej laserowej mikroskopii skaningowej z dwufotonowym laserowym odsadzaniem glutaminianu wykorzystano do wykazania wzrostu specyficznego dla kręgosłupa i odpowiedzi EPSC w neuronach piramidowych warstwy II/III kory mózgowej myszy19. W związku z tym technika zaciskania plastrów plastrów jest ulepszana poprzez łączenie jej z nowymi substancjami chemicznymi, dostarczaniem genów i technikami manipulacji zdjęciami.

Technika zaciskania kropek, opracowana przez Nehera i Sakmanna, była szeroko stosowana do eksperymentów elektrofizjologicznych1. Technika zacisku krosowego dla całej komórki2 może być używana do rejestrowania prądu lub napięcia wewnątrzkomórkowego za pomocą gigaomowego uszczelnienia błony komórkowej. Technika cęgów prądowych pozwala nam analizować różnice we właściwościach membrany, takich jak potencjał spoczynkowy, rezystancja i pojemność3. Technika zacisku napięcia pozwala nam analizować plastyczność synaptyczną wywołaną uczeniem się zarówno w synapsach pobudzających, jak i hamujących.
Główna kora ruchowa (M1) to centralny obszar, który jest niezbędny do wykonywania zręcznych ruchów dobrowolnych. Wcześniejsze badania elektrofizjologiczne wykazały rozwój plastyczności podobnej do długotrwałego wzmocnienia (LTP) w synapsach pobudzających warstwy II/III po wykwalifikowanym treningu motorycznym4. Co więcej, badania obrazowe in vivo wykazały ponadto przebudowę kolców dendrytycznych M1 po umiejętnym dochodzeniu do celu5,6. Jednak plastyczność synaptyczna i wewnętrzna wywołana uczeniem się nie została wykazana w neuronach M1.
Niedawno informowaliśmy, że zadanie pręta wirnika promowało dynamiczne zmiany w synapsach glutaminergicznym i GABA-ergicznych oraz zmieniało wewnętrzną plastyczność neuronów warstwy II/III M17. W tym przypadku użyliśmy techniki slice patch clamp do zbadania plastyczności wywołanej uczeniem się. Technika ta może być również wykorzystana do badania innych rodzajów plastyczności zależnej od doświadczenia w innych obszarach mózgu. Na przykład, bodźce sensoryczne do kory beczkowej mogą wzmocnić bodźce pobudzające za pośrednictwem receptora AMPA do neuronów warstwy II/III8, a warunkowanie strachu sygnalizujące wzmacnia bodźce pobudzające do bocznych neuronów ciała migdałowatego, co jest wymagane dla pamięci strachu9. Co więcej, uczenie się kontekstowe tworzy różnorodność pod względem pobudzających i hamujących danych synaptycznych do neuronów CA1 hipokampa10,11.

<table><tbody><tr><td>Bieżnie Rota-Rod</td><td>Med Associates Inc.</td><td>ENV577</td><td></td></tr><tr><td>Pudełko do unikania hamowania</td><td>Shinano Seisakusho</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Kyoritsu Seiyaku</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blade</td><td>Nisshin EM Co., Ltd</td><td>LC05Z</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka perfuzyjna serca</td><td>JMS Co., Ltd</td><td>JS-S00S</td><td></td></tr><tr><td>Wibratome</td><td>&nbsp; Leica Microsystems</td><td>VT-1200</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz poziomy</td><td>Instrument Sutter</td><td>Model P97</td><td></td></tr><tr><td>Microfilm 34 gauge</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>0,22 i mikro; m filtr</td><td>Millipore</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>Axopatch&ndash; Wzmacniacz 1D&nbsp;</td><td>Tablica Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1440 AD</td><td>Oprogramowanie Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 10</td> Mikroskop pionowy <td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kamera CCD Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kontroler kamery Olympus</td><td>U-CMAD3</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu Photonics K.K.</td><td></td><td>C2741</td><td></td></tr><tr><td>Stymulator</td><td>Nihon Kohden</td><td>SEN-3301</td><td></td></tr><tr><td>Izolator</td><td>Nihon Kohden</td><td>SS-104J</td><td></td></tr><tr><td>Manipulator z napędem</td><td>silnikowym Sutter Instrument</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narishige</td><td>NMN-21</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna&nbsp;</td><td>Gilson, Inc</td><td>MINIPULS&reg; 3</td><td></td></tr><tr><td>Szklana kapilarna</td> elektroda <td>Narishige</td><td>GD-1,5</td><td></td></tr><tr><td>Ag/AgCl&nbsp;</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>EP4</td><td></td></tr><tr><td>Slice Anchor</td><td>Warner instruments</td><td>64-0252</td><td></td></tr><tr><td>Elektroda stymulująca</td><td>Unique Medical Co., Ltd</td><td>KU201-025B</td><td></td></tr><tr><td><silny>Materiały</mocny><</td><td>silny>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Bufor separacyjny/ sztuczny CSF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 &bull; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>C1426</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>039-00475</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 &bull; 6H2O</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek choliny&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>C7527</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>190-01255</td><td></td></tr><tr><td>Kwas pirogronowy Na</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>199-03062</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>28-1850-5</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>07-0680-5</td><td></td></tr><tr><td><silny>Materiały</mocny><</td><td>silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</strong</td></tr><tr><td>>Roztwór wewnątrzkomórkowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>K-Gluconate</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>346-01373</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>348-01311</td><td></td></tr><tr><td>Na2 ATP</td><td>Nacalai Tesque</td><td>01072-24</td><td></td></tr><tr><td>Na3 GTP</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>G-8877</td><td></td></tr><tr><td>Na fosfokreatyna</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>P-7936</td><td></td></tr><tr><td>CsMeSO3</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>C1426</td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>033-01953</td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Drugs w aCSF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Chloroadenozyna</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>C5134</td><td></td></tr><tr><td>Pikrotoksyna&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>P-1675</td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotoksyna</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>207-15901</td><td></td></tr><tr><td>CNQX&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>C239</td><td></td></tr><tr><td>APV</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>Ciągnik siodłowy A5282</td><td></td></tr></tbody></table>

technika slice patch clamp do analizy plastyczności wywołanej uczeniem się

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

Technika zaciskania plastrów jest potężnym narzędziem do badania plastyczności neuronalnej wywołanej uczeniem się w określonych obszarach mózgu. Aby przeanalizować plastyczność wywołaną uczeniem motorycznym, przeszkoliliśmy szczury za pomocą zadania z przyspieszonym prętem wirnika. Szczury wykonywały zadanie 10 razy w odstępach 30-sekundowych przez 1 lub 2 dni. Wydajność uległa znacznej poprawie w dni treningowe w porównaniu z pierwszym badaniem. Następnie przygotowaliśmy ostre wycinki mózgu pierwszorzędowej kory ruchowej (M1) u niewyszkolonych i wyszkolonych szczurów. Analiza cęgów prądowych wykazała dynamiczne zmiany spoczynkowego potencjału błonowego, progu skoku, pohiperpolaryzacji i oporu błony w neuronach piramidowych warstwy II/III. Obecne wstrzyknięcie wywołało znacznie więcej skoków u szczurów trenowanych przez 2 dni niż u niewyszkolonych osób z grupy kontrolnej.
Aby przeanalizować plastyczność wywołaną uczeniem kontekstowym, przeszkoliliśmy szczury za pomocą zadania unikania hamowania (IA). Po doświadczeniu szoku stopy w ciemnej stronie pudełka, szczury nauczyły się go unikać, pozostając po oświetlonej stronie. Przygotowaliśmy ostre plastry hipokampa od szczurów nietrenowanych, trenowanych przez IA, niesparowanych i chodzących. Analizę napięcia cęgowego wykorzystano do sekwencyjnego rejestrowania miniaturowych pobudzających i hamujących prądów postsynaptycznych (mEPSC i mIPSC) z tego samego neuronu CA1. Znaleźliśmy różne średnie amplitudy mEPSC i mIPSC w każdym neuronie CA1, co sugeruje, że każdy neuron miał różne siły postsynaptyczne w synapsach pobudzających i hamujących. Co więcej, w porównaniu z niewyszkolonymi kontrolami, szczury wyszkolone przez IA miały wyższe amplitudy mEPSC i mIPSC, z dużą różnorodnością. Wyniki te sugerują, że uczenie się kontekstowe tworzy postsynaptyczną różnorodność zarówno w synapsach pobudzających, jak i hamujących w każdym neuronie CA1.
receptory AMPA lub GABAA wydawały się pośredniczyć w prądach postsynaptycznych, ponieważ leczenie kąpielą CNQX lub bicukuliną blokowało odpowiednio zdarzenia mEPSC lub mIPSC. Technika ta może być wykorzystana do badania różnych rodzajów uczenia się w innych regionach, takich jak kora czuciowa i ciało migdałowate.

Technika zaciskania plastrów jest skuteczną metodą analizy wywołanych uczeniem się zmian wewnętrznych właściwości i plastyczności synaps pobudzających lub hamujących.

Technika Slice Patch Clamp do analizy plastyczności wywołanej uczeniem się

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Witam, nazywam się Dai Mitsushima. W niniejszym materiale pokażemy, jak przygotować skrawki mózgu zwierząt wytrenowanych, porównując dane z techniki patch clamp otrzymane od zwierząt niewytrenowanych. Dzięki temu możemy analizować plastyczność synaptyczną indukowaną uczeniem się.Cześć, nazywam się Hiroyuki Kida. W tym doświadczeniu zbadaliśmy neuromechanizm biegania motorycznego, wykorzystując test rotarod. Test rotarod jest powszechnie stosowany do oceny funkcji motorycznych gryzoni.Zaletą tej metody jest możliwość zmiany poziomu trudności podczas badania poprzez zwiększenie prędkości obrotowej rotora. Test na rotor-rodzie. Przed rozpoczęciem zadania motorycznego aparat rotor-rod należy ustawić w trybie przyspieszania od 4 do 40 rpm w ciągu 300 sekund.Szczury wykonywały po dziesięć prób w każdym teście. Odstęp czasowy między próbami wynosił 30 sekund. Podczas pierwszej sesji treningowej szczury zazwyczaj spadają z pręta, nawet przy niskich prędkościach, a niekiedy idą w przeciwnym kierunku.Jednak po powtórzeniu treningu szczur jest w stanie chodzić z większą prędkością. Poprzez pomiar czasu opóźnienia na pręcie możemy oszacować stopień nabycia tej umiejętności przez szczura. Tutaj możemy zobaczyć wyniki testu na rotarodzie.Jak pokazano na tej rycinie, dwa dni treningu są wystarczające do opanowania umiejętności motorycznej. W porównaniu z latencją podczas pierwszej próby, analiza post hoc wykazała istotną poprawę w ostatniej próbie w dniach treningowych. Pomiar latencji na pręcie pozwala oszacować efektywność uczenia się tej umiejętności przez szczura.W następnej części przedstawimy test unikania hamującego. Test ten jest przydatny w analizie efektywności uczenia się kontekstowego. Aparatura do testu unikania hamującego składa się z jasnej i ciemnej strony, rozdzielonych zapadką.Podczas sesji treningowej szczury są umieszczane w oświetlonym obszarze i mają krótki czas na aklimatyzację do środowiska. Po otwarciu drzwi szczury mogą swobodnie wejść do zaciemnionego obszaru. Po wejściu do strefy zaciemnionej drzwi zostają zamknięte, a szczury otrzymują lekki wstrząs elektryczny przez dwie sekundy.Po powrocie do klatek na 30 minut po zakończeniu próby, szczury zostają ponownie umieszczone w oświetlonym obszarze aparatury. Trzydzieści minut po wstrząsie, przeszkolone szczury konsekwentnie wykazywały dłuższą latencję przed wejściem do ciemnego obszaru. Tutaj możemy zobaczyć wyniki testu unikania hamującego.Po wstrząsie elektrycznym szczury nauczyły się unikać zaciemnionego obszaru i pozostawać po oświetlonej stronie, której normalnie by nie preferowały. Ta tendencja do unikania zaciemnionej strony wskazuje na nabycie pamięci kontekstowej. Przekroje mózgu po treningu.Przed wykonaniem nacięcia schładzamy wszystkie nożyczki, kleszczyki hemostatyczne i zlewki za pomocą kruszonego lodu. Tutaj widoczne jest nasze przygotowanie do sekcji. Sekcja mózgu powinna zostać przeprowadzona tak szybko, jak to możliwe.Po głębokim znieczuleniu szczura umieszcza się w płytkiej kuwecie z kruszonym lodem i wykonuje nacięcie w celu otwarcia jamy brzusznej. Po nacięciu przepony wykonuje się kolejne nacięcie boczne. Aby otworzyć jamę klatki piersiowej, chrząstki żeber należy zacisnąć za pomocą kleszczyków hemostatycznych.Po odsłonięciu serca, w tylnej części lewej komory wprowadza się igłę ze stali nierdzewnej o rozmiarze 18G. Końcówka igły powinna być widoczna przez ścianę aorty. Po przecięciu prawego przedsionka rozpoczyna się perfuzję.Należy upewnić się, że zarówno igła, jak i strzykawka są uprzednio wypełnione napowietrzonym, lodowatym buforem do sekcji. Przed rozpoczęciem perfuzji należy również usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. W pierwszej kolejności należy wykonać cięcie w tylnej części czaszki.Następnie należy wykonać cięcie boczne, a potem cięcie środkowe, aby odsłonić mózg. Po wyjęciu mózg należy umieścić w napowietrzonym, lodowatym buforze na pięć minut. Przed przystąpieniem do sekcji papier filtracyjny należy zwilżyć lodowatym buforem.Następnie mózg umieszcza się na lodowej platformie ze stali nierdzewnej. Kąt ustawienia platformy do cięcia jest kluczowy dla zapewnienia prawidłowego kąta cięcia plastra mózgu. Nieprawidłowy kąt mógłby doprowadzić do przecięcia docelowych neuronów piramidowych.Po przycięciu na stole vibratone należy nanieść jedną kroplę superkleju. Aby zapewnić mocne przyleganie, nadmiar buforu do sekcji należy usunąć za pomocą kawałka papieru filtracyjnego. Przy użyciu urządzenia vibratone można wykonać cienkie skrawki mózgu, utrzymując je w napowietrzonym, lodowatym buforze.Naszym obszarem docelowym jest pierwotna kora ruchowa. Docelowy obszar mózgu można wyciąć za pomocą nożyczek irydologicznych. Komorę interfejsu można wykonać, wykorzystując plastikowy pojemnik spożywczy.Pokrywa komory interfejsowej jest niezbędna do utrzymania gazu. Przekroje obserwuje się przy użyciu mikroskopu IR-DIC. Tutaj widzimy przykład neuronów warstw 2/3 w pierwotnej korze ruchowej.Pipety do rejestracji typu patch-clamp wypełnia się odpowiednim roztworem wewnątrzkomórkowym. Roztwór stosowany do analizy w trybie clamp prądowy różni się od roztworu używanego do analizy w trybie clamp napięciowy. Reprezentatywne wyniki.Technika zaciskania prądowego (current clamp) jest przydatna do analizy wewnętrznych właściwości komórkowych. Po treningu na urządzeniu Rotor rod udało nam się uzyskać dane z zaciskania prądowego z neuronów warstwy 2/3 w pierwotnej korze ruchowej. Panel A przedstawia typowe przebiegi wywołane wstrzyknięciem prądu.Panel B wskazuje na zależność między wstrzykniętym prądem a liczbą potencjałów czynnościowych (spike'ów). Szczury trenowane przez jeden dzień indukowały mniej spike'ów, natomiast szczury trenowane przez dwa dni indukowały ich znacznie więcej niż szczury nietrenowane. Jak widać na dolnych panelach, szczury trenowane przez jeden dzień wykazywały niższy potencjał spoczynkowy, wyższy próg pobudzenia oraz głębszą hiperpolaryzację następczą.Szczury trenowane przez dwa dni wykazały wyższy potencjał spoczynkowy oraz wyższą rezystancję błony. Technika clampowania napięcia jest użyteczna do analizy synaptycznej plastyczności indukowanej uczeniem się. Poniżej przedstawiono dane z neuronów CA1 po treningu kontekstowym.Zarejestrowano miniaturowe prądy postsynaptyczne w neuronach CA1, wywołane pojedynczymi pęcherzykami glutaminianu lub GABA. Panele A i B przedstawiają reprezentatywne ślady miniaturowych prądów postsynaptycznych. W obecności tetrodotoksyny mierzono sekwencyjnie w tych samych neuronach miniaturowe EPSC przy −16 mV oraz miniaturowe IPSC przy 0 mV.Panel C przedstawia wykresy dwuwymiarowe amplitud miniaturowych EPSC i miniaturowych IPSC u szczurów niewytrenowanych, wytrenowanych, niedopasowanych oraz w grupie walk-through. Panel D przedstawia wykresy dla częstotliwości miniaturowych. Jak widać w dolnych panelach, treningi kontekstowe znacząco wzmocniły zarówno synapsy pobudzające, jak i hamujące, co sprzyja różnorodności wejść synaptycznych do neuronów.Podsumowując, technika clampingu prądowego jest przydatna do analizy zmian właściwości komórek wywołanych uczeniem się. Z kolei technika clampingu napięciowego stanowi potężne narzędzie do analizy plastyczności indukowanej uczeniem się w synapsach pobudzających i hamujących. Szczegółowe wyniki tych analiz można znaleźć w następujących publikacjach.

slice-patch-clamp-technique-for-analyzing-learning-induced-plasticity

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje procedurę mapowania połączeń synaptycznych poprzez zabezpieczenie wycinka mózgu, ustawienie pipet w celu uzyskania konfiguracji całych komórek i stymulowanie neuronów presynaptycznych do rejestrowania odpowiedzi postsynaptycznych, wyjaśniając w ten sposób łączność neuronalną.

Zapis sparowanych połączeń neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu

Wieloelektrodowe nagrania patch-clamp stanowią skomplikowane zadanie. Pokazujemy tutaj, w jaki sposób, poprzez automatyzację wielu etapów eksperymentu, można przyspieszyć proces prowadzący do jakościowej poprawy wydajności i liczby nagrań.

Wspomagany komputerowo wieloelektrodowy system krosówek

Tutaj opisano procedurę uzyskiwania długich odcinków zapisu prądu z jednego kanału jonowego za pomocą techniki patch-clamp dołączonej do komórki. Metoda ta pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym wzorca konformacji kanałów otwórz-zamknij, które leżą u podstaw sygnału biologicznego. Dane te informują o właściwościach kanałów w niezakłóconych błonach biologicznych.

Jednokanałowe nagrywanie z zaciskiem krosowym dołączonym do komórki

Zapisy patch-clamp i jednoczesne wewnątrzkomórkowe wypełnianie biocytyną synaptycznie sprzężonych neuronów w ostrych wycinkach mózgu pozwalają na skorelowaną analizę ich strukturalnych i funkcjonalnych właściwości. Celem niniejszego protokołu jest opisanie podstawowych etapów technicznych zapisu elektrofizjologicznego z mikroukładów neuronalnych i ich późniejszej analizy morfologicznej.

Elektrofizjologiczna i morfologiczna charakterystyka mikroobwodów neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu przy użyciu sparowanych nagrań patch-clamp

Ten artykuł wideo opisuje eksperymentalne procedury badania długoterminowej plastyczności i jej procesów asocjacyjnych, takich jak znakowanie synaptyczne, przechwytywanie i krzyżowanie w neuronach piramidowych CA1 przy użyciu ostrych wycinków hipokampa od gryzoni.

Badanie znakowania/przechwytywania synaptycznego i przechwytywania krzyżowego przy użyciu ostrych plastrów hipokampa od gryzoni

Ten protokół opisuje podstawowe kroki proceduralne do wykonywania nagrań z użyciem krosówek dla całej komórki. Technika ta pozwala na badanie zachowania elektrycznego neuronów, a gdy jest wykonywana w wycinkach mózgu, pozwala na ocenę różnych funkcji neuronalnych z neuronów, które są nadal zintegrowane w stosunkowo dobrze zachowanych obwodach mózgowych.

Nagrania z użyciem zacisku krosowego całych komórek w wycinkach mózgu

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzać automatyczne eksperymenty z zaciskami krosowymi sterowanymi obrazem przy użyciu niedawno opracowanego systemu dla standardowego sprzętu do elektrofizjologii in vitro.

Zastosowanie zautomatyzowanego zacisku krosowego sterowanego obrazem do badania neuronów w wycinkach mózgu

Tutaj pokazano, jak model urazu głowy w stanie czuwania może być wykorzystany do zbadania wpływu powtarzających się łagodnych urazów mózgu (r-mTBI) na plastyczność synaptyczną w hipokampie. Model replikuje ważne cechy r-mTBI u pacjentów i jest stosowany w połączeniu z elektrofizjologią in vitro.

Ocena zmian plastyczności synaptycznej przy użyciu modelu łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu w stanie czuwania

Dynamiczna elektrofizjologia zaciskowa może ustalić związki przyczynowe między deficytami wyładowania neuronów a dysfunkcją kanału jonowego. Opisujemy metody i protokoły dynamicznego zaciskania w myszowych neuronach Purkinjego w móźku, zwracając uwagę na przydatne zasoby i kwestie techniczne. W badaniu reprezentatywnym dodaliśmy modelowaną przewodność sodu do neuronów Tsc1-/- Purkinje, aby zapobiec powtarzalnemu wyładowaniu.

Metody dynamicznego zacisku do badania upośledzonej pobudliwości neuronów związanych z autyzmem

W niniejszej pracy opisujemy procedurę przygotowywania adaptowanych do ciemności skrawków siatkówki mysiej do pomiarów elektrofizjologicznych.

Rejestracja metodą patch-clamp z neuronów siatkówki myszy w preparacie skrawka adaptowanego do ciemności

Poznaj technikę slice patch clamp do analizy plastyczności synaptycznej wywołanej uczeniem się u szczurów. Metoda ta pozwala badać zmiany w aktywności neuronów kory ruchowej po treningu motorycznym.

Technika Slice Patch Clamp do analizy plastyczności wywołanej uczeniem się

Przeglądaj więcej filmów