Technika Slice Patch Clamp do analizy plastyczności wywołanej uczeniem się

Cześć, nazywam się Dai Mitsushima. Tutaj pokażemy Ci, jak zrobić plasterki mózgu u wyszkolonych zwierząt, porównując dane z zacisków łatek u niewyszkolonych zwierząt. Możemy analizować plastyczność synaptyczną wywołaną uczeniem się.

Cześć, nazywam się Hiroyuki Kida. W tym eksperymencie zbadaliśmy neuromechanizm biegania motorycznego za pomocą testu pręta wirnika. Test pręta wirnika jest szeroko stosowany do oceny funkcji poznawczych motorycznych gryzoni.

Zaletą tej metody jest to, że możemy zmienić poziom odkrycia podczas testu, zwiększając prędkość rotatora. Test pręta wirnika. Przed przystąpieniem do zadania silnika aparat pręta wirnika powinien być ustawiony w tryb przyspieszania od 4 do 40 obr./min w ciągu 300 sekund.

Szczury zostały zmuszone do wykonania dziesięciu prób dla każdego testu. W odstępie czasowym między próbami wynosił 30 sekund. Podczas pierwszej sesji treningowej szczury zwykle spadają z pręta, nawet przy niskich prędkościach, a czasem idą w złym kierunku.

Jednak po powtórzeniu treningu szczur może chodzić z większą prędkością. Mierząc opóźnienie pręta, możemy oszacować wydajność uczenia się umiejętności przez szczura. Tutaj możemy zobaczyć wyniki testu pręta wirnika.

Jak pokazano na tym rysunku, dwa dni treningu wystarczą, aby nabyć umiejętności motoryczne. W porównaniu z opóźnieniem w pierwszym badaniu, analiza post hoc wykazała znaczną poprawę w porównaniu z ostatnim badaniem dni treningowych. Mierząc opóźnienie pręta, możemy oszacować wydajność uczenia się umiejętności przez szczura.

Następnie pokażemy Ci test unikania hamowania. Ten test jest przydatny do analizowania wyników uczenia się kontekstowego. Aparat unikania hamowania składa się z jasnych i ciemnych stron oddzielonych klapą.

Podczas sesji treningowej szczury są umieszczane w oświetlonym miejscu i daje im krótki czas na zaaklimatyzowanie się w środowisku. Po otwarciu drzwi szczury mogą swobodnie wchodzić do zaciemnionego obszaru, kiedy tylko zechcą. Po wejściu do zaciemnionego obszaru drzwi są zamykane, a szczury są poddawane łagodnemu porażeniu prądem przez dwie sekundy.

Po powrocie do klatek na 30 minut po zakończeniu próby, szczury są ponownie umieszczane w oświetlonym obszarze aparatury. Trzydzieści minut po wstrząsie wytrenowane szczury konsekwentnie wykazywały dłuższe opóźnienie przed wejściem w ciemny obszar. Tutaj możemy zobaczyć wyniki testu unikania hamowania.

Po porażeniu prądem szczury nauczyły się unikać zaciemnionego obszaru i pozostawać po oświetlonej stronie, czego normalnie by nie preferowały. Ta tendencja do unikania ciemnej strony wskazuje na nabywanie wspomnień kontekstowych. Wycinki mózgu po treningu.

Przed nacięciem schładzamy wszystkie nożyczki, hemostaty i zlewki kruszonym lodem. Tutaj możesz zobaczyć nasze przygotowanie do sekcji. Sekcja mózgu powinna być wykonana tak szybko, jak to możliwe.

Po tym głęboko znieczulonym szczura umieszcza się na płytkiej tacy z pokruszonym lodem i wykonuje się nacięcie w celu otwarcia jamy brzusznej. Po nacięciu przepony wykonuje się kolejne nacięcie boczne. Aby otworzyć jamę piersiową, chrząstka żebrowa powinna zostać zbita za pomocą hemostatu.

Po odsłonięciu serca w tylną część lewej komory wprowadza się igłę ze stali nierdzewnej o rozmiarze 18. Końcówka igły powinna być widoczna przez ścianę aorty. Po przecięciu prawej małżowiny usznej rozpoczyna się perfuzja.

Należy upewnić się, że zarówno igła, jak i strzykawka są najpierw napełnione zagazowanym, lodowatym buforem do rozwarstwiania. Przed perfuzją należy również usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Najpierw przeciąć tylną część czaszki.

Następnie wykonaj cięcie boczne, a następnie cięcie środkowe, aby odsłonić mózg. Po sekcji mózg należy umieścić w bulgoczącym, lodowatym buforze na pięć minut. Przed przystąpieniem do sekcji bibułę filtracyjną należy zwilżyć za pomocą lodowatego bufora.

Następnie mózg umieszcza się na lodowatej scenie ze stali nierdzewnej. Kąt etapu cięcia ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia prawidłowego kąta cięcia dla wycinka mózgu. Nieprawidłowy kąt może potencjalnie przeciąć docelowe neurony piramidowe.

Po przycięciu jedną kroplę superglue należy umieścić na stoliku wibratonu. Aby zapewnić ścisłą przyczepność, nadmiar bufora preparacyjnego należy usunąć za pomocą kawałka bibuły filtracyjnej. Za pomocą wibratonu można sprawić, że cienkie plasterki mózgu będą utrzymywane w bulgoczącym, lodowatym buforze.

Naszym obszarem docelowym jest pierwotna kora ruchowa. Docelowy obszar mózgu można przyciąć za pomocą nożyczek do tęczówki. Komora interfejsu może być wykonana za pomocą plastikowego pojemnika na żywność.

Pokrywa komory interfejsu jest niezbędna do przechowywania gazu. Plastry obserwuje się za pomocą mikroskopu DIC w podczerwieni. Tutaj możemy zobaczyć przykład neuronów warstwy 2/3 w pierwszorzędowej korze ruchowej.

Pipety rejestrujące wstawki są napełniane odpowiednim roztworem wewnątrzkomórkowym. Rozwiązanie do analizy cęgów prądowych różni się od analizy cęgów napięciowych. Reprezentatywne wyniki.

Obecna technika cęgowania jest przydatna do analizy wewnętrznych właściwości komórek. Po treningu pręta wirnika byliśmy w stanie uzyskać aktualne dane o zaciskach z neuronów warstwy 2/3 w pierwotnej korze ruchowej. Panel A wskazuje typowe ślady indukowane przez zatłaczenia prądu.

Panel B wskazuje zależność między wstrzykiwanym prądem a liczbą skoków. Jednodniowe wytrenowane szczury wywołały mniej skoków, podczas gdy dwudniowe szczury wywołały znacznie więcej kolców niż szczury niewyszkolone. Jak widać w dolnych panelach, jednodniowe szczury trenowane wykazywały niższy potencjał spoczynkowy, wyższy próg kolca i głębszą pohiperpolaryzację.

Szczury trenowane przez dwa dni wykazywały wyższy potencjał spoczynkowy i odporność błony. Technika cęgów napięciowych jest przydatna do analizy plastyczności synaptycznej wywołanej uczeniem się. Tutaj możemy zobaczyć dane z neuronów CA1 po trenowaniu kontekstowym.

Uzyskaliśmy miniaturowe prądy postsynaptyczne z neuronów CA1 indukowane przez pojedyncze pęcherzyki glutaminianu lub GABA. Na panelach A i B widoczne są reprezentatywne ślady miniaturowego prądu postsynaptycznego. W obecności tetrodotoksyny, miniaturowe EPSC przy minus 16 miliwoltach i miniaturowe IPSC przy zerowym miliwoltach mierzono sekwencyjnie w tych samych neuronach.

Panel C przedstawia dwuwymiarowe wykresy miniaturowych amplitud EPSC i miniaturowych IPSC u szczurów niewyszkolonych, wyszkolonych, niesparowanych i chodzących. Panel D przedstawia wykresy dla miniaturowych częstotliwości. Jak można zauważyć w dolnych panelach, treningi kontekstowe znacznie wzmocniły zarówno synapsy pobudzające, jak i hamujące, promując różnorodność sygnałów synaptycznych do neuronów.

Podsumowując, technika cęgów prądowych jest przydatna do analizy zmian właściwości komórek wywołanych uczeniem się. Ponadto technika zacisków napięciowych jest potężnym narzędziem do analizy plastyczności wywołanej uczeniem się w synapsach pobudzających i hamujących. Szczegółowe wyniki tych analiz można znaleźć w poniższych publikacjach.