Technika Slice Patch Clamp do analizy plastyczności wywołanej uczeniem się

Witam, nazywam się Dai Mitsushima. W niniejszym materiale pokażemy, jak przygotować skrawki mózgu zwierząt wytrenowanych, porównując dane z techniki patch clamp otrzymane od zwierząt niewytrenowanych. Dzięki temu możemy analizować plastyczność synaptyczną indukowaną uczeniem się.

Cześć, nazywam się Hiroyuki Kida. W tym doświadczeniu zbadaliśmy neuromechanizm biegania motorycznego, wykorzystując test rotarod. Test rotarod jest powszechnie stosowany do oceny funkcji motorycznych gryzoni.

Zaletą tej metody jest możliwość zmiany poziomu trudności podczas badania poprzez zwiększenie prędkości obrotowej rotora. Test na rotor-rodzie. Przed rozpoczęciem zadania motorycznego aparat rotor-rod należy ustawić w trybie przyspieszania od 4 do 40 rpm w ciągu 300 sekund.

Szczury wykonywały po dziesięć prób w każdym teście. Odstęp czasowy między próbami wynosił 30 sekund. Podczas pierwszej sesji treningowej szczury zazwyczaj spadają z pręta, nawet przy niskich prędkościach, a niekiedy idą w przeciwnym kierunku.

Jednak po powtórzeniu treningu szczur jest w stanie chodzić z większą prędkością. Poprzez pomiar czasu opóźnienia na pręcie możemy oszacować stopień nabycia tej umiejętności przez szczura. Tutaj możemy zobaczyć wyniki testu na rotarodzie.

Jak pokazano na tej rycinie, dwa dni treningu są wystarczające do opanowania umiejętności motorycznej. W porównaniu z latencją podczas pierwszej próby, analiza post hoc wykazała istotną poprawę w ostatniej próbie w dniach treningowych. Pomiar latencji na pręcie pozwala oszacować efektywność uczenia się tej umiejętności przez szczura.

W następnej części przedstawimy test unikania hamującego. Test ten jest przydatny w analizie efektywności uczenia się kontekstowego. Aparatura do testu unikania hamującego składa się z jasnej i ciemnej strony, rozdzielonych zapadką.

Podczas sesji treningowej szczury są umieszczane w oświetlonym obszarze i mają krótki czas na aklimatyzację do środowiska. Po otwarciu drzwi szczury mogą swobodnie wejść do zaciemnionego obszaru. Po wejściu do strefy zaciemnionej drzwi zostają zamknięte, a szczury otrzymują lekki wstrząs elektryczny przez dwie sekundy.

Po powrocie do klatek na 30 minut po zakończeniu próby, szczury zostają ponownie umieszczone w oświetlonym obszarze aparatury. Trzydzieści minut po wstrząsie, przeszkolone szczury konsekwentnie wykazywały dłuższą latencję przed wejściem do ciemnego obszaru. Tutaj możemy zobaczyć wyniki testu unikania hamującego.

Po wstrząsie elektrycznym szczury nauczyły się unikać zaciemnionego obszaru i pozostawać po oświetlonej stronie, której normalnie by nie preferowały. Ta tendencja do unikania zaciemnionej strony wskazuje na nabycie pamięci kontekstowej. Przekroje mózgu po treningu.

Przed wykonaniem nacięcia schładzamy wszystkie nożyczki, kleszczyki hemostatyczne i zlewki za pomocą kruszonego lodu. Tutaj widoczne jest nasze przygotowanie do sekcji. Sekcja mózgu powinna zostać przeprowadzona tak szybko, jak to możliwe.

Po głębokim znieczuleniu szczura umieszcza się w płytkiej kuwecie z kruszonym lodem i wykonuje nacięcie w celu otwarcia jamy brzusznej. Po nacięciu przepony wykonuje się kolejne nacięcie boczne. Aby otworzyć jamę klatki piersiowej, chrząstki żeber należy zacisnąć za pomocą kleszczyków hemostatycznych.

Po odsłonięciu serca, w tylnej części lewej komory wprowadza się igłę ze stali nierdzewnej o rozmiarze 18G. Końcówka igły powinna być widoczna przez ścianę aorty. Po przecięciu prawego przedsionka rozpoczyna się perfuzję.

Należy upewnić się, że zarówno igła, jak i strzykawka są uprzednio wypełnione napowietrzonym, lodowatym buforem do sekcji. Przed rozpoczęciem perfuzji należy również usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. W pierwszej kolejności należy wykonać cięcie w tylnej części czaszki.

Następnie należy wykonać cięcie boczne, a potem cięcie środkowe, aby odsłonić mózg. Po wyjęciu mózg należy umieścić w napowietrzonym, lodowatym buforze na pięć minut. Przed przystąpieniem do sekcji papier filtracyjny należy zwilżyć lodowatym buforem.

Następnie mózg umieszcza się na lodowej platformie ze stali nierdzewnej. Kąt ustawienia platformy do cięcia jest kluczowy dla zapewnienia prawidłowego kąta cięcia plastra mózgu. Nieprawidłowy kąt mógłby doprowadzić do przecięcia docelowych neuronów piramidowych.

Po przycięciu na stole vibratone należy nanieść jedną kroplę superkleju. Aby zapewnić mocne przyleganie, nadmiar buforu do sekcji należy usunąć za pomocą kawałka papieru filtracyjnego. Przy użyciu urządzenia vibratone można wykonać cienkie skrawki mózgu, utrzymując je w napowietrzonym, lodowatym buforze.

Naszym obszarem docelowym jest pierwotna kora ruchowa. Docelowy obszar mózgu można wyciąć za pomocą nożyczek irydologicznych. Komorę interfejsu można wykonać, wykorzystując plastikowy pojemnik spożywczy.

Pokrywa komory interfejsowej jest niezbędna do utrzymania gazu. Przekroje obserwuje się przy użyciu mikroskopu IR-DIC. Tutaj widzimy przykład neuronów warstw 2/3 w pierwotnej korze ruchowej.

Pipety do rejestracji typu patch-clamp wypełnia się odpowiednim roztworem wewnątrzkomórkowym. Roztwór stosowany do analizy w trybie clamp prądowy różni się od roztworu używanego do analizy w trybie clamp napięciowy. Reprezentatywne wyniki.

Technika zaciskania prądowego (current clamp) jest przydatna do analizy wewnętrznych właściwości komórkowych. Po treningu na urządzeniu Rotor rod udało nam się uzyskać dane z zaciskania prądowego z neuronów warstwy 2/3 w pierwotnej korze ruchowej. Panel A przedstawia typowe przebiegi wywołane wstrzyknięciem prądu.

Panel B wskazuje na zależność między wstrzykniętym prądem a liczbą potencjałów czynnościowych (spike'ów). Szczury trenowane przez jeden dzień indukowały mniej spike'ów, natomiast szczury trenowane przez dwa dni indukowały ich znacznie więcej niż szczury nietrenowane. Jak widać na dolnych panelach, szczury trenowane przez jeden dzień wykazywały niższy potencjał spoczynkowy, wyższy próg pobudzenia oraz głębszą hiperpolaryzację następczą.

Szczury trenowane przez dwa dni wykazały wyższy potencjał spoczynkowy oraz wyższą rezystancję błony. Technika clampowania napięcia jest użyteczna do analizy synaptycznej plastyczności indukowanej uczeniem się. Poniżej przedstawiono dane z neuronów CA1 po treningu kontekstowym.

Zarejestrowano miniaturowe prądy postsynaptyczne w neuronach CA1, wywołane pojedynczymi pęcherzykami glutaminianu lub GABA. Panele A i B przedstawiają reprezentatywne ślady miniaturowych prądów postsynaptycznych. W obecności tetrodotoksyny mierzono sekwencyjnie w tych samych neuronach miniaturowe EPSC przy −16 mV oraz miniaturowe IPSC przy 0 mV.

Panel C przedstawia wykresy dwuwymiarowe amplitud miniaturowych EPSC i miniaturowych IPSC u szczurów niewytrenowanych, wytrenowanych, niedopasowanych oraz w grupie walk-through. Panel D przedstawia wykresy dla częstotliwości miniaturowych. Jak widać w dolnych panelach, treningi kontekstowe znacząco wzmocniły zarówno synapsy pobudzające, jak i hamujące, co sprzyja różnorodności wejść synaptycznych do neuronów.

Podsumowując, technika clampingu prądowego jest przydatna do analizy zmian właściwości komórek wywołanych uczeniem się. Z kolei technika clampingu napięciowego stanowi potężne narzędzie do analizy plastyczności indukowanej uczeniem się w synapsach pobudzających i hamujących. Szczegółowe wyniki tych analiz można znaleźć w następujących publikacjach.