Name: Poczwórne barwienie immunologiczne opuszki węchowej w celu wizualizacji węchowych kodów tożsamości molekularnej aksonu czuciowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Poznaj metodę immunohistochemiczną barwienia węchowych neuronów czuciowych w myszy, aby wizualizować ekspresję molekuł sortujących aksony. Technika ta umożliwia analizę wzorców ekspresji w opuszce węchowej bez wariacji między przekrojami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Mitsubishi Foundation, Takeda Science Foundation, JST PRESTO i JSPS KAKENHI Grant Number 16H06144.

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone za zgodą komisji etyki eksperymentów na zwierzętach na Uniwersytecie Tokijskim i zgodnie z wytycznymi Uniwersytetu Tokijskiego dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.
1. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Przygotować 0,01 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS): dodać tabletkę PBS (0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,010 M PO43-, pH 7,4) do 1 l wody destylowanej i mieszać w temperaturze pokojowej aż do całkowitego rozpuszczenia.</li>
	<li>Przygotuj 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS: dodaj 4 g PFA do 100 ml PBS. Mieszać roztwór w temperaturze 60 °C aż do całkowitego rozpuszczenia.
	<ol>
		<li>Po rozpuszczeniu PFA w PBS dostosować pH roztworu do 7,4 za pomocą 1 N wodorotlenku sodu (NaOH). Następnie ostudzić na lodzie i przefiltrować roztwór przez bibułę filtracyjną, aby usunąć wszelkie cząstki stałe. Przechowywać w temperaturze 4 °C. 
		Uwaga: Zachowaj odpowiednią ostrożność podczas korzystania z tych odczynników. Z okularami ochronnymi należy obchodzić się ostrożnie i używać rękawic, okularów ochronnych i fartucha laboratoryjnego pod kapturem chemicznym. 
		UWAGA: Użyj świeżego 4% roztworu PFA przygotowanego w ciągu 2 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 0,01 M PBS uzupełnionego 0,3% Triton X-100 (PBST): dodać 3 ml Triton X-100 do 997 ml PBS. Mieszać roztwór w temperaturze pokojowej aż do całkowitego rozpuszczenia.</li>
	<li>Przygotować 1% i 5% roztwór blokujący: dodać 10 g odtłuszczonego mleka do 200 ml PBST, aby przygotować 5% roztwór blokujący. Mieszać w temperaturze pokojowej, aż do całkowitego rozpuszczenia. Rozcieńczyć 5% roztwór blokujący pięciokrotnie PBST, aby przygotować 1% roztwór blokujący.</li>
</ol>
2. Przygotowanie parastrzałkowych sekcji położniczych
<ol>
	<li>Używaj zwierząt w wieku od 1 do 2 tygodni. Te grupy wiekowe są odpowiednie do następujących eksperymentów, ponieważ kłębuszki nerkowe są wyraźnie widoczne, a mózg można przeciąć czaszką.</li>
	<li>Znieczulić zwierzę wstrzyknięciem dootrzewnowym pentobarbitalu (50 mg/kg masy ciała). Perfuzję zwierzęcia przezsercowo z lodowatym 4% PFA w PBS. Z okularami należy obchodzić się ostrożnie i używać rękawic, okularów ochronnych i fartucha laboratoryjnego pod kapturem chemicznym.</li>
	<li>Po perfuzji odetnij głowę nożyczkami i ostrożnie usuń skórę. Następnie włóż ostrze nożyczek w przestrzeń między górnymi i dolnymi zębami i tnij poziomo, aby usunąć dolną kość szczęki. Odetnij nadmiar tkanki za pomocą kleszczy i nożyczek, aby pozostawić tkankę węchową, w tym OB i OE. 
	UWAGA: Nie usuwaj czaszki otaczającej OB, ponieważ dzięki temu kłębuszki przyśrodkowe są ustawione pionowo prosto.</li>
	<li>Zanurz tkankę węchową w PBS, aby usunąć powietrze z jamy nosowej. Odetnij tylną część mózgu pionowo i umieść tkankę węchową na dnie formy osadzającej nacięciem skierowaną w dół. Napełnij formę związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (O.C.T.), a następnie zanurz formę w ciekłym azocie.
	<ol>
		<li>Po całkowitym zamrożeniu tkanki w związku inkubować ją w kriostacie w temperaturze -20 °C przez 1 godzinę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonać szeregowe przekroje przystrzałkowe (10 μm) OB za pomocą kriostatu i zebrać je, przyklejając do szkiełek pokrytych MAS. Po przyklejeniu należy natychmiast wysuszyć szkiełka suszarką.</li>
</ol>
3. Dzień 1: Poczwórne barwienie immunologiczne plastrów OB 
<ol>
	<li>Myj szkiełka przez 5 minut za pomocą PBS w temperaturze RT. Powtórz 3 razy.</li>
	<li>Zablokować niespecyficzne miejsca wiązania, inkubując szkiełka przez 1 godzinę z 5% roztworem blokującym w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować szkiełka O/N z koktajlem pierwszorzędowych przeciwciał (400 μl każda szkiełka) w 1% roztworze blokującym w temperaturze pokojowej. Należy użyć następujących przeciwciał pierwszorzędowych: przeciwciało anty-Kirrel2 świnki morskiej (1:1000), przeciwciało anty-Semaforyna-7A (Sema7A) (1:500), szczurze przeciwciało anty-OL-protokadheryny (OLPC) (1:500) i mysie przeciwciało przeciwpęcherzykowe transporter glutaminianu2 (VGLUT2) (1:500).</li>
</ol>
4. Dzień 2: Poczwórne barwienie immunologiczne plastrów OB 
<ol>
	<li>Odrzucić roztwór przeciwciała pierwotnego i myć szkiełka przez 5 minut PBST w temperaturze RT. Powtórzyć 3 razy.</li>
	<li>Inkubować szkiełka przez 1 godzinę z koktajlem przeciwciał drugorzędowych (400 μl każda szkiełko) w PBS w temperaturze pokojowej. Użyj następujących przeciwciał drugorzędowych: przeciwko osłemu Alexa Fluor 405 (1:400), anty-kozie osła Alexa Fluor 488 (1:400), anty-śwince morskiej osła Alexa Fluor 555 (1:400) i anty-szczurowi osła Alexa Fluor 647 (1:400). 
	UWAGA: Wszystkie przeciwciała drugorzędowe powinny pochodzić od tego samego gatunku gospodarza. Wybierz inną długość fali fluorescencji przeciwciał drugorzędowych dla każdego przeciwciała pierwszorzędowego, aby zapewnić brak nakładania się długości fal</li>.
	<li>Wyrzuć roztwór i myj szkiełka przez 5 minut PBS w temperaturze RT. Powtórz 3 razy.</li>
	<li>Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach za pomocą medium montażowego. W tym celu nałóż 2 krople podłoża montażowego na każde szkiełko, a następnie nałóż szkiełko nakrywkowe, usuwając pęcherzyki powietrza.</li>
</ol>
5. Pomiary intensywności
<ol>
	<li>Uzyskaj obrazy fluorescencyjne za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Użyj następujących kostek filtrujących: kostka filtra DAPI (wzbudzenie 360/40 nm, emisja 460/50 nm i lustro dichroiczne 400 nm) dla sygnałów Alexa Fluor 405, kostka filtra GFP (wzbudzenie 470/40 nm, emisja 525/50 nm i lustro dichroiczne 495 nm) dla Alexa Fluor 488, kostka filtra TRITC (wzbudzenie 545/25 nm, emisja 605/70 nm i lustro dichroiczne 565 nm) dla Alexa Fluor 555, oraz kostka filtra Cy5 (wzbudzenie 620/60 nm, emisja 700/75 nm i lustro dichroiczne 600 nm) dla Alexa Fluor 647. 
	Uwaga: Dostosuj czas ekspozycji, aby uzyskać sygnały fluorescencyjne obrazu bez nasycenia.</li>
	<li>Zdefiniuj strukturę kłębuszkową za pomocą sygnałów immunofluorescencyjnych VGLUT2. Zmierz intensywność barwienia cząsteczek sortujących aksony w kłębuszkach nerkowych za pomocą ImageJ.</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Odejmij sygnały tła od intensywności barwienia cząsteczek sortujących aksony.</li>
	<li>Przygotuj macierz danych wyrażeń, która zawiera kolumny złożone z cząsteczek sortujących aksony i rzędy złożone z kłębuszków nerkowych.</li>
	<li>Wykonaj analizę składowych głównych (PCA) przy użyciu przygotowanego zestawu danych wyrażeń. Następnie uzyskaj wyniki PCA, współczynniki udziału i ładunki czynników każdego głównego składnika.</li>
</ol>

<ol><li>Mori, K., Sakano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+is+the+olfactory+map+formed+and+interpreted+in+the+mammalian+brain%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">How is the olfactory map formed and interpreted in the mammalian brain?</a> Annu Rev Neurosci. 34, 467-499 (2011).</li>
<li>Takeuchi, H., Sakano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+map+formation+in+the+mouse+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Neural map formation in the mouse olfactory system.</a> Cell Mol Life Sci. 71, 3049-3057 (2014).</li>
<li>Mombaerts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+an+olfactory+sensory+map%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing an olfactory sensory map.</a> Cell. 87, 675-686 (1996).</li>
<li>Feinstein, P., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+contextual+model+for+axonal+sorting+into+glomeruli+in+the+mouse+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A contextual model for axonal sorting into glomeruli in the mouse olfactory system.</a> Cell. 117, 817-831 (2004).</li>
<li>Ishii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoallelic+expression+of+the+odourant+receptor+gene+and+axonal+projection+of+olfactory+sensory+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cell%22%5BJournal%5D)">Monoallelic expression of the odourant receptor gene and axonal projection of olfactory sensory neurones.</a> Genes Cell. 6, 71-78 (2001).</li>
<li>Nakashima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agonist-independent+GPCR+activity+regulates+anterior-posterior+targeting+of+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Agonist-independent GPCR activity regulates anterior-posterior targeting of olfactory sensory neurons.</a> Cell. 154, 1314-1325 (2013).</li>
<li>Serizawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neuronal+identity+code+for+the+odorant+receptor-specific+and+activity-dependent+axon+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting.</a> Cell. 127, 1057-1069 (2006).</li>
<li>Kaneko-Goto, T., Yoshihara, S., Miyazaki, H., Yoshihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BIG-2+mediates+olfactory+axon+convergence+to+target+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">BIG-2 mediates olfactory axon convergence to target glomeruli.</a> Neuron. 57, 834-846 (2008).</li>
<li>Ihara, N., Nakashima, A., Hoshina, N., Ikegaya, Y., Takeuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+axon-sorting+molecules+in+mouse+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neuro%22%5BJournal%5D)">Differential expression of axon-sorting molecules in mouse olfactory sensory neurons.</a> Eur J Neuro. 44, 1998-2003 (2016).</li>
<li>Williams, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delta+Protocadherin+10+is+Regulated+by+Activity+in+the+Mouse+Main+Olfactory+System%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Delta Protocadherin 10 is Regulated by Activity in the Mouse Main Olfactory System.</a> Front Neural Circuits. 5, 9(2011).</li>
<li>Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+anosmia+caused+by+a+targeted+disruption+of+the+mouse+olfactory+cyclic+nucleotide-gated+cation+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel.</a> Neuron. 17, 681-693 (1996).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Poczwórne barwienie immunologiczne przystrzałkowych odcinków OB umożliwiło wizualizację i kwantyfikację poziomów ekspresji aż czterech cząsteczek sortujących aksony jednocześnie w większej liczbie kłębuszków nerkowych. Analizując te dane wielowymiarowe za pomocą PCA, można spekulować na temat charakterystyki ekspresji tych cząsteczek.
Dla skutecznego barwienia niezwykle ważne jest przygotowanie próbki tkanki. Niektóre protokoły sugerują, że tkanki powinny być utrwalone 4% PFA i potraktowane 30...

Podczas rozwoju, neurony są precyzyjnie połączone ze sobą, tworząc prawidłowe obwody neuronowe, co jest kluczowe dla prawidłowego funkcjonowania mózgu. Ponieważ uważa się, że nieprawidłowe obwody neuronalne w mózgu są przyczyną zaburzeń psychicznych, takich jak autyzm i schizofrenia, zrozumienie mechanizmów powstawania obwodów nerwowych jest jednym z głównych wyzwań w dziedzinie neuronauki.
W układzie węchowym myszy, każdy węchowy neuron czuciowy (OSN) w nabłonku węchowym (OE) wyraża tylko jeden funkcjonalny gen receptora węchowego (OR), a OSN wyrażające ten sam OR zbiegają swoje aksony do określonej pary kłębuszków w stereotypowych miejscach w opuszce węchowej (OB)1,2. Układ węchowy myszy jest doskonałym systemem modelowym do badania molekularnych mechanizmów tworzenia obwodów nerwowych, ponieważ naukowcy mogą wykorzystać wyrażenie OR do identyfikacji określonego podtypu OSN i wizualizacji miejsc projekcji aksonów OSN jako przezroczystych struktur kłębuszkowych. Niezwykłą cechą projekcji OSN jest to, że OR odgrywają pouczającą rolę w rzutowaniu aksonów OSN na OB3,4,5,6. Mówiąc dokładniej, po tym, jak aksony OSN są kierowane w celu przybliżenia regionów docelowych, są one segregowane w celu utworzenia kłębuszków nerkowych w sposób zależny od OR. Wcześniejsze badania wykazały, że cząsteczki OR kontrolują ekspresję cząsteczek sortujących aksony, które regulują segregację kłębuszków nerkowych7,8. Co więcej, coraz więcej dowodów sugeruje, że cząsteczki OR generują neuronalny kod tożsamości poprzez unikalną kombinację cząsteczek sortujących aksony9. Dlatego, aby zrozumieć mechanizm zależnej od OR segregacji kłębuszków nerkowych, konieczne jest scharakteryzowanie profili ekspresji cząsteczek sortujących aksony w OSN.
Barwienie immunologiczne metodą fluorescencyjną jest powszechną metodą wizualizacji ekspresji określonych genów. Ponieważ białka cząsteczek sortujących aksony są głównie zlokalizowane w aksonach OSN, naukowcy muszą użyć sekcji OB, aby scharakteryzować ich wzorce ekspresji w OSN. Przekrój koronalny OB jest rutynowo stosowany do barwienia immunologicznego. Jednak ten preparat traci informacje topograficzne wzdłuż osi przednio-tylnej w tym samym przekroju OB. W związku z tym opracowaliśmy preparat przystrzałkowy przyśrodkowej strony OB, który może zamontować jak najwięcej otaczających kłębuszków nerkowych na tym samym odcinku OB. W połączeniu z barwieniem immunologicznym przy użyciu wielu przeciwciał, preparat ten umożliwia porównanie i analizę wzorców ekspresji cząsteczek sortujących aksony bez różnic barwiących między sekcjami OB.
Ponadto, przedstawiono metodę barwienia immunohistochemicznego bez utrwalenia za pomocą PFA i sacharozy. Metoda ta pozwala naukowcom uzyskać wystarczającą ilość wysokiej jakości danych barwiących do analizy danych wielowymiarowych. Przedstawione tutaj protokoły dostarczą szczegółowych informacji na temat skutecznych metod dla badaczy, którzy badają powstawanie węchowych obwodów nerwowych.

<table><tbody><tr><td>Tabletki soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), pH 7,4</td><td>TAKARA BIO</td><td>T9181</td><td></td></tr><tr><td>Mleko odtłuszczone</td><td>Nacalai tesque</td><td>31149-75</td><td></td></tr><tr><td>kozie przeciwciało anty-Sema7A</td><td>R& D Systems</td><td>AF2068</td><td></td></tr><tr><td>szczurze przeciwciało anty-OLPC</td><td>Merck Millipore</td><td>MABT20</td><td></td></tr><tr><td>mysie przeciwciało anty-VGLUT2</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB5504</td><td></td></tr><tr><td>kozie przeciwciało anty-BIG-2</td><td>R& D Systems</td><td>AF2205</td><td></td></tr><tr><td>gunea świnia przeciwciało anty-Kirrel2</td><td>Operon Biotechnologies</td><td></td><td>Przeciwciała anty-Kirrel2 zostały wytworzone przez uodparnienie świnek morskich syntetycznymi peptydami sprzężonymi z KLH (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP</td></tr><tr><td>osioł anty-mysz Alexa Fluor 405</td><td>Abcam</td><td>ab175658</td><td></td></tr><tr><td>osioł anty-koza Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-545-003</td><td></td></tr><tr><td>świnka morska przeciwko osłowi Alexa Fluor 555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21432</td><td></td></tr><tr><td>osł anty-szczur Alexa Fluor 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-605-153</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Wako</td><td>162-16065</td><td></td></tr><tr><td>Okulary ślizgowe powlekane MAS</td><td>Kleszcze MATSUNAMI</td><td>MAS-01</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-27</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr> mikroskop <tr><td>fluorescencyjny</td><td>KEYENCE</td><td>BZ-X700</td><td></td></tr><tr><td>Kostka filtra DAPI</td><td>KEYENCE</td><td>OP-87762</td><td></td></tr><tr><td>Kostka filtra GFP</td><td>KEYENCE</td><td>OP-87763</td><td></td></tr><tr><td>Kostka filtracyjna TRITC</td><td>KEYENCE</td><td>OP-87764</td><td></td></tr><tr><td>Kostka filtracyjna Cy5</td> Bibuła filtracyjna <td>KEYENCE</td><td>OP-87766</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ADVANTEC</td><td>00011185</td><td></td></tr><tr><td>Związek OCT</td><td>Sakura Finetek</td><td>M71484</td><td></td></tr></tbody></table>

poczwórne barwienie immunologiczne opuszki węchowej w celu wizualizacji węchowych kodów tożsamości molekularnej aksonu czuciowego

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

Mysi system węchowy jest często używany do badania mechanizmów tworzenia obwodów nerwowych ze względu na swoją prostą budowę anatomiczną. Węchowy neuron czuciowy (OSN) to dwubiegunowa komórka z pojedynczym dendrytem i pojedynczym nierozgałęzionym aksonem. OSN wyraża tylko jeden gen receptora węchowego (OR), OSN wyrażające dany typ OR zbiegają swoje aksony do kilku zestawów niezmiennych kłębuszków nerkowych w opuszki węchowej (OB). Niezwykłą cechą projekcji OSN jest to, że wyrażone OR odgrywają pouczającą rolę w projekcji aksonalnej. Sale operacyjne regulują ekspresję wielu cząsteczek sortujących aksony i generują kombinatoryczny kod molekularny cząsteczek sortujących aksony na końcach aksonów OSN. Tak więc, aby zrozumieć mechanizmy molekularne specyficznych dla OR mechanizmów kierowania aksonami, konieczne jest scharakteryzowanie ich profili ekspresji na końcach aksonów OSN w obrębie tego samego kłębuszka nerkowego. Celem artykułu było przedstawienie metod pobierania jak największej liczby kłębuszków nerkowych na pojedynczym skrawku OB oraz wykonywania barwienia immunologicznego przy użyciu wielu przeciwciał. Pozwoliłoby to na porównanie i analizę wzorców ekspresji cząsteczek sortujących aksony bez różnic w barwieniu między sekcjami OB.

Koniugacyjna mapa kłaczków węchowych powstaje w wyniku początkowego globalnego celowania, a następnie segregacji kłaczkowej aksonów OSN1,2. Segregacja kłaczkowa jest regulowana przez adhezyjne/repulsywne oddziaływania aksonalne pośredniczone przez cząsteczki sortujące aksony, których poziomy ekspresji są determinowane przez ekspresowane cząsteczki OR7. Cząsteczki sortujące aksony uczestniczące w segregacji ...

Węchowe neurony czuciowe wyrażają szeroką gamę cząsteczek sortujących aksony, aby ustanowić prawidłowe obwody neuronowe. Protokół ten opisuje metodę barwienia immunohistochemicznego w celu wizualizacji kombinatorycznych ekspresji cząsteczek sortujących aksony na końcach aksonów węchowych neuronów czuciowych.

Poczwórne barwienie immunologiczne opuszki węchowej w celu wizualizacji węchowych kodów tożsamości molekularnej aksonu czuciowego

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

Ogólnym celem tej metody barwienia immunohistochemicznego jest wizualizacja połączonej ekspresji cząsteczek sortujących aksony w zakończeniach aksonów neuronów sensorycznych węchu. Metoda ta może pomóc w charakterystyce kluczowych procesów w dziedzinie rozwoju węchu, takich jak prowadzenie aksonów, tworzenie synaps oraz regeneracja neuronów sensorycznych węchu. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona naukowcom na porównanie i analizę wzorców ekspresji cząsteczek sortujących aksony w opłocie węchowym bez wprowadzania różnic między poszczególnymi przekrojami.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etap zatapiania jest trudny do opanowania, a opisanie słownie położenia i kąta nachylenia próbki tkanek węchowych w formie jest skomplikowane. Należy rozpocząć od głów myszy w wieku od jednego do dwóch tygodni, utrwalonych poprzez perfuzję wewnątrzsercową 4% paraformaldehydem. Wprowadź ostrze nożyczek w przestrzeń między górnymi a dolnymi zębami i przetnij poziomo, aby usunąć kość żuchwy.Następnie za pomocą pęsety i nożyczek odetnij nadmiar tkanki, pozostawiając tkankę węchową, w tym cebulkę węchową oraz nabłonek węchowy. Zanurz tkankę węchową w PBS, aby usunąć powietrze z jamy nosowej, a następnie wykonaj cięcie pionowe w celu usunięcia tylnej części mózgu i umieść tkankę węchową na dnie formy do zatapiania, stroną cięcia skierowaną w dół. Wypełnij formę preparatem OCT (optimal cutting temperature compound), a następnie zanurz ją w ciekłym azocie.Po całkowitym zamrożeniu tkanki i OCT, poddaj tkankę równoważeniu w kriostacie w temperaturze 20 °C przez jedną godzinę. Następnie wykonaj w kriostacie seryjne przekroje parasagitalne opolupia, a następnie zbierz je, przyklejając do szkiełek przedmiotu pokrytych MAS. Po przyklejeniu niezwłocznie wysusz szkiełka za pomocą suszarki.Immunobarwienie należy rozpocząć od przemycia wysuszonych preparatów w PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Miejsca niespecyficznego wiązania należy zablokować, inkubując preparaty przez jedną godzinę w 5% roztworze blokującym w temperaturze pokojowej. Następnie na każdy preparat należy nanieść 400 µL koktajlu przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych w 1% roztworze blokującym.Inkubować preparaty przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego dnia usunąć roztwór przeciwciał pierwszorzędowych i trzykrotnie przemyć preparaty buforem PBST przez pięć minut każdy w temperaturze pokojowej. Następnie do każdego preparatu dodać 400 µL koktajlu przeciwciał drugorzędowych i PBS.Chronić przed światłem i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji wylać roztwór i ponownie przemyć preparaty trzy razy przez pięć minut każdy, używając PBS w temperaturze pokojowej. Na koniec zamontować szkiełka nakrywki na preparatach, nakładając dwie krople medium montażowego na każde szkiełko, kładąc szkiełko nakrywkowe i usuwając pęcherzyki powietrza.Wykonać obrazy fluorescencyjne za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, używając odpowiedniego filtra dla każdego fluoroforu. Dostosować czas ekspozycji tak, aby uzyskać sygnały fluorescencyjne na obrazie bez efektu nasycenia. Wyznaczyć strukturę kłębuszków na podstawie sygnałów immunofluorescencyjnych GLUT2.Użyj programu Image J do pomiaru intensywności barwienia cząsteczek sortujących aksony w obrębie kłębków. Na tym obrazie przedstawiono przekrój parasagitalny opuszki węchowej dwutygodniowej myszy, poddany immunostynowaniu przeciwciałami przeciwko VGLUT2, Kirrel2 (kolor czerwony), Semaphorin 7A (kolor zielony) oraz OLPC (kolor niebieski). Nałożone obrazy wykazują, że cząsteczki sortujące aksony, biorące udział w segregacji kłębkowej, są wyrażane w mozaikowym wzorcu niezależnym od położenia.Każdy kłębek jest zdefiniowany przez sygnały fluorescencyjne markera presynaptycznego VGLUT2. Struktury kłębków zostały obwiedzione liniami przerywanymi. Intensywność sygnałów cząsteczek sortujących aksony była mierzona w każdym kłębku.Jak widać tutaj, cząsteczki sortujące aksony są różnicowo wyrażane w każdym kłębku. Na przykład, kłębek 3 charakteryzuje się wysokim poziomem OLPC, średnim poziomem Semaforyny 7A i niższym poziomem Kirrel2, a różnicę tę można określić ilościowo poprzez pomiar intensywności barwienia. Natomiast kłębek 4 wykazuje wysoki poziom OLPC oraz niższe poziomy Kirrel2 i Semaforyny 7A.Ponownie, różnicę tę można określić ilościowo poprzez pomiar intensywności barwienia. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o pominięciu post-fiksacji PFA oraz traktowania roztworem sacharozy, które są zazwyczaj zalecane. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak umieścić więcej kłębków na pojedynczym przekroju opolpacha oraz jak przeprowadzić wysokiej jakości immunobarwienie z użyciem wielu przeciwciał, co można zastosować również do innych obszarów mózgu.Mamy nadzieję, że ta metoda pomoże Państwu osiągnąć sukces w przyszłych eksperymentach.

quadruple-immunostaining-olfactory-bulb-for-visualization-olfactory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przedstawiamy technikę lentiwirusową służącą do manipulacji genetycznej i wizualizacji pojedynczego aksonu neuronu sensorycznego węchu oraz jego arboryzacji terminalnej in vivo.

Lentiwirusowa manipulacja genetyczna i wizualizacja neuronów sensorycznych węchu in vivo

Niniejszy artykuł przedstawia protokoły obrazowania wrodzonych sygnałów optycznych oraz sygnałów autofluorescencji flawoprotein w celu mapowania aktywności wywołanej zapachami na powierzchni opolpacha u myszy.

Obrazowanie aktywności wywołanej zapachami w opoliach myszy z wykorzystaniem sygnałów odbicia optycznego i autofluorescencji

Tutaj opisujemy proces barwienia immunologicznego czułków Drosophila przez całe mocowanie, co pozwala nam lepiej zrozumieć mechanizmy molekularne związane z dywersyfikacją neuronów receptorów węchowych (ORN).

Znakowanie immunologiczne całej góry neuronów receptora węchowego w antenie Drosophila

Opisujemy protokół znakowania in vivo węchowych neuronów czuciowych za pomocą elektroporacji, a następnie konfokalnego skanowania laserowego lub mikroskopii wielofotonowej w celu wizualizacji morfologii neuronów i ich rozwoju w czasie.

Układ węchowy jako model do badania wzorców wzrostu i morfologii aksonów in vivo

Rzęski węchowych neuronów czuciowych zawierają białka kaskady transdukcji sygnału, ale szczegółowa analiza przestrzenna ich rozmieszczenia jest trudna w kriosekcjach. Opisujemy tutaj zoptymalizowane podejście do znakowania całego mocowania i wizualizacji en face białek rzęskowych.

Znakowanie całego mocowania rzęsek w głównym układzie węchowym myszy

Lokalizacja ekspresji genów w określonych typach komórek może być trudna ze względu na brak specyficznych przeciwciał. W tym miejscu opisujemy protokół jednoczesnego potrójnego wykrywania ekspresji genów poprzez połączenie hybrydyzacji in situ RNA z podwójną fluorescencją z barwieniem immunologicznym.

Połączenie podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ z immunoznakowaniem w celu wykrycia ekspresji trzech genów w wycinkach mózgu myszy

Tutaj opisujemy protokół pomiaru i analizy reakcji na temperaturę w opuszce węchowej Xenopus laevis. Neurony receptorów węchowych i komórki mitralne są barwione różnicowo, po czym rejestrowane są zmiany wapnia, odzwierciedlające wrażliwość niektórych sieci neuronowych w bańce na spadki temperatury wywołane w nosie.

Rejestrowanie aktywności neuronalnej wywołanej temperaturą poprzez monitorowanie zmian wapnia w opuszce węchowej Xenopus laevis

Kijanki Xenopus oferują unikalną platformę do badania funkcji układu nerwowego in vivo. Opisano metodologie oceny przetwarzania informacji węchowych u żywych larw Xenopus w normalnych warunkach chowu lub po urazie.

Ocena funkcjonalna szlaków węchowych u żyjących kijanek ksenopusa

Multipleksowa hybrydyzacja in situ (ISH) została wykorzystana do jednoczesnej wizualizacji transkryptów dla dwóch receptorów sprzężonych z białkiem G i jednego czynnika transkrypcyjnego w całym kompleksie zwoju błędnego dorosłej myszy. Protokół ten może być wykorzystany do generowania dokładnych map profili transkrypcyjnych neuronów doprowadzających nerwy błędnego.

Wykrywanie ekspresji receptora sprzężonego z białkiem G w mysich neuronach doprowadzających nerwu błędnego za pomocą hybrydyzacji Multiplex In Situ

Ten protokół opisuje procedurę preparacji, warunki hodowli i obrazowanie na żywo systemu eksplantacji czułków-mózgu do badania zespołu obwodów węchowych.

System eksplantatów do badań obrazowania poklatkowego zespołu obwodów węchowych u Drosophila

Poznaj metodę immunohistochemiczną barwienia węchowych neuronów czuciowych w myszy, aby wizualizować ekspresję molekuł sortujących aksony. Technika ta umożliwia analizę wzorców ekspresji w opuszce węchowej bez wariacji między przekrojami.

Poczwórne barwienie immunologiczne opuszki węchowej w celu wizualizacji węchowych kodów tożsamości molekularnej aksonu czuciowego (Wideo) | JoVE Journal

Poczwórne barwienie immunologiczne opuszki węchowej w celu wizualizacji węchowych kodów tożsamości molekularnej aksonu czuciowego

Przeglądaj więcej filmów