Poczwórne barwienie immunologiczne opuszki węchowej w celu wizualizacji węchowych kodów tożsamości molekularnej aksonu czuciowego

Ogólnym celem tej metody barwienia immunohistochemicznego jest wizualizacja połączonej ekspresji cząsteczek sortujących aksony na końcach aksonów węchowych neuronów czuciowych. Metoda ta może pomóc w scharakteryzowaniu kluczowych procesów w dziedzinie rozwoju węchu, takich jak przewodnictwo aksonów, tworzenie synaps i regeneracja węchowych neuronów czuciowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala naukowcom porównywać i analizować wzorce ekspresji cząsteczek sortujących aksony w opuszce węchowej bez utrzymywania zmienności między sekcjami.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etap osadzania jest trudny do nauczenia, ponieważ położenie i kąt próbki tkanek węchowych w formie są trudne do opisania słowami. Zacznij od głów myszy w wieku od jednego do dwóch tygodni, które zostały utrwalone przez wewnątrzsercową perfuzję 4% paraformaldehydu. Włóż ostrze nożyczek w przestrzeń między górnymi i dolnymi zębami i tnij poziomo, aby usunąć dolną szczękę.

Następnie odetnij nadmiar tkanki za pomocą kleszczy i nożyczek, aby pozostawić tkankę węchową, w tym opuszkę węchową i nabłonek węchowy. Zanurz tkankę węchową w PBS, aby usunąć powietrze z jamy nosowej, a następnie wykonaj pionowe cięcie, aby usunąć tylną część mózgu i umieść tkankę węchową na dnie formy do osadzania z odciętym końcem skierowanym w dół. Napełnij formę związkiem o optymalnej temperaturze cięcia, a następnie zanurz w ciekłym azocie.

Po całkowitym zamrożeniu tkanki i OCT należy zrównoważyć tkankę w kriostacie w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez godzinę. Teraz wykonaj seryjne sekcje parasagitalne opuszki węchowej za pomocą kriostatu i zbierz je, przyklejając do szkiełek pokrytych MAS. Po przyklejeniu należy natychmiast wysuszyć szkiełka suszarką.

Barwienie immunologiczne należy rozpocząć od przemywania wysuszonych szkiełek PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Zablokuj niespecyficzne miejsca wiązania, inkubując szkiełka przez godzinę z 5% roztworem blokującym w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 400 mikrolitrów koktajlu przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych w 1% roztworze blokującym do każdego szkiełka.

Inkubować szkiełka przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego dnia należy wyrzucić roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przemyć szkiełka PBST trzy razy przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 400 mikrolitrów koktajlu przeciwciał drugorzędowych i PBS do każdego szkiełka.

Chronić przed światłem i inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji wyrzucić roztwór i ponownie umyć szkiełka trzy razy przez pięć minut, każde PBS w temperaturze pokojowej. Na koniec zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach, nakładając dwie krople medium montażowego na każdy szkiełko, umieszczając szkiełko nakrywkowe i usuwając pęcherzyki powietrza.

Uzyskaj obrazy fluorescencyjne za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy użyciu odpowiedniego filtra dla każdego fluoroforu. Dostosuj czas ekspozycji, aby uzyskać sygnały fluorescencyjne obrazu bez nasycenia. Zdefiniuj strukturę kłębuszkową za pomocą sygnałów immunofluorescencyjnych GLUT2.

Użyj obrazu J, aby zmierzyć intensywność barwienia cząsteczek sortujących aksony w kłębuszkach nerkowych. To zdjęcie przedstawia przekrój opuszki węchowej przysagowej dwutygodniowej myszy wybarwionej immunologicznie przeciwciałami przeciwko VGLUT2, Kirrel2 pokazanemu na czerwono, semaforynie 7A pokazanej na zielono i OLPC na niebiesko. Połączony obraz pokazuje, że cząsteczki sortujące aksony biorące udział w segregacji kłębuszków nerkowych są wyrażone w niezależnym od pozycji wzorze mozaiki

Każdy kłębuszek nerkowy jest definiowany przez sygnały fluorescencyjne markera presynaptycznego VGLUT2. Struktury kłębuszkowe otoczone są liniami przerywanymi. Intensywność sygnałów cząsteczek sortujących aksony mierzono w każdym kłębuszku nerkowym.

Jak widać tutaj, cząsteczki sortujące aksony są różnie wyrażane w każdym kłębuszku nerkowym. Na przykład kłębuszek nerkowy 3 ma wysoki poziom OLPC, pośredni poziom semaforyny 7A i niższy poziom Kirrelu2, a różnicę tę można określić ilościowo, mierząc intensywność barwienia. Natomiast kłębuszek nerkowy 4 ma wysoki poziom OLPC i niższy poziom Kirrelu2 i semaforyny 7A.

Ponownie, różnicę tę można określić ilościowo, mierząc intensywność barwienia. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, aby pominąć post-utrwalenie PFA i leczenie roztworem sacharozy, które są zwykle zalecane. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak umieścić więcej kłębuszków nerkowych na pojedynczym odcinku opuszki węchowej i jak przeprowadzić wysokiej jakości barwienie immunologiczne za pomocą wielu przeciwciał, które można zastosować do innych obszarów mózgu.

Nie zapomnij mieć nadziei, że ta metoda pomoże Ci odnieść sukces w przyszłych eksperymentach.