Poczwórne barwienie immunologiczne opuszki węchowej w celu wizualizacji węchowych kodów tożsamości molekularnej aksonu czuciowego

Ogólnym celem tej metody barwienia immunohistochemicznego jest wizualizacja połączonej ekspresji cząsteczek sortujących aksony w zakończeniach aksonów neuronów sensorycznych węchu. Metoda ta może pomóc w charakterystyce kluczowych procesów w dziedzinie rozwoju węchu, takich jak prowadzenie aksonów, tworzenie synaps oraz regeneracja neuronów sensorycznych węchu. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona naukowcom na porównanie i analizę wzorców ekspresji cząsteczek sortujących aksony w opłocie węchowym bez wprowadzania różnic między poszczególnymi przekrojami.

Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etap zatapiania jest trudny do opanowania, a opisanie słownie położenia i kąta nachylenia próbki tkanek węchowych w formie jest skomplikowane. Należy rozpocząć od głów myszy w wieku od jednego do dwóch tygodni, utrwalonych poprzez perfuzję wewnątrzsercową 4% paraformaldehydem. Wprowadź ostrze nożyczek w przestrzeń między górnymi a dolnymi zębami i przetnij poziomo, aby usunąć kość żuchwy.

Następnie za pomocą pęsety i nożyczek odetnij nadmiar tkanki, pozostawiając tkankę węchową, w tym cebulkę węchową oraz nabłonek węchowy. Zanurz tkankę węchową w PBS, aby usunąć powietrze z jamy nosowej, a następnie wykonaj cięcie pionowe w celu usunięcia tylnej części mózgu i umieść tkankę węchową na dnie formy do zatapiania, stroną cięcia skierowaną w dół. Wypełnij formę preparatem OCT (optimal cutting temperature compound), a następnie zanurz ją w ciekłym azocie.

Po całkowitym zamrożeniu tkanki i OCT, poddaj tkankę równoważeniu w kriostacie w temperaturze 20 °C przez jedną godzinę. Następnie wykonaj w kriostacie seryjne przekroje parasagitalne opolupia, a następnie zbierz je, przyklejając do szkiełek przedmiotu pokrytych MAS. Po przyklejeniu niezwłocznie wysusz szkiełka za pomocą suszarki.

Immunobarwienie należy rozpocząć od przemycia wysuszonych preparatów w PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Miejsca niespecyficznego wiązania należy zablokować, inkubując preparaty przez jedną godzinę w 5% roztworze blokującym w temperaturze pokojowej. Następnie na każdy preparat należy nanieść 400 µL koktajlu przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych w 1% roztworze blokującym.

Inkubować preparaty przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego dnia usunąć roztwór przeciwciał pierwszorzędowych i trzykrotnie przemyć preparaty buforem PBST przez pięć minut każdy w temperaturze pokojowej. Następnie do każdego preparatu dodać 400 µL koktajlu przeciwciał drugorzędowych i PBS.

Chronić przed światłem i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji wylać roztwór i ponownie przemyć preparaty trzy razy przez pięć minut każdy, używając PBS w temperaturze pokojowej. Na koniec zamontować szkiełka nakrywki na preparatach, nakładając dwie krople medium montażowego na każde szkiełko, kładąc szkiełko nakrywkowe i usuwając pęcherzyki powietrza.

Wykonać obrazy fluorescencyjne za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, używając odpowiedniego filtra dla każdego fluoroforu. Dostosować czas ekspozycji tak, aby uzyskać sygnały fluorescencyjne na obrazie bez efektu nasycenia. Wyznaczyć strukturę kłębuszków na podstawie sygnałów immunofluorescencyjnych GLUT2.

Użyj programu Image J do pomiaru intensywności barwienia cząsteczek sortujących aksony w obrębie kłębków. Na tym obrazie przedstawiono przekrój parasagitalny opuszki węchowej dwutygodniowej myszy, poddany immunostynowaniu przeciwciałami przeciwko VGLUT2, Kirrel2 (kolor czerwony), Semaphorin 7A (kolor zielony) oraz OLPC (kolor niebieski). Nałożone obrazy wykazują, że cząsteczki sortujące aksony, biorące udział w segregacji kłębkowej, są wyrażane w mozaikowym wzorcu niezależnym od położenia.

Każdy kłębek jest zdefiniowany przez sygnały fluorescencyjne markera presynaptycznego VGLUT2. Struktury kłębków zostały obwiedzione liniami przerywanymi. Intensywność sygnałów cząsteczek sortujących aksony była mierzona w każdym kłębku.

Jak widać tutaj, cząsteczki sortujące aksony są różnicowo wyrażane w każdym kłębku. Na przykład, kłębek 3 charakteryzuje się wysokim poziomem OLPC, średnim poziomem Semaforyny 7A i niższym poziomem Kirrel2, a różnicę tę można określić ilościowo poprzez pomiar intensywności barwienia. Natomiast kłębek 4 wykazuje wysoki poziom OLPC oraz niższe poziomy Kirrel2 i Semaforyny 7A.

Ponownie, różnicę tę można określić ilościowo poprzez pomiar intensywności barwienia. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o pominięciu post-fiksacji PFA oraz traktowania roztworem sacharozy, które są zazwyczaj zalecane. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak umieścić więcej kłębków na pojedynczym przekroju opolpacha oraz jak przeprowadzić wysokiej jakości immunobarwienie z użyciem wielu przeciwciał, co można zastosować również do innych obszarów mózgu.

Mamy nadzieję, że ta metoda pomoże Państwu osiągnąć sukces w przyszłych eksperymentach.