Poczwórne barwienie immunologiczne opuszki węchowej w celu wizualizacji węchowych kodów tożsamości molekularnej aksonu czuciowego
5 czerwca 2017
Węchowe neurony czuciowe wyrażają szeroką gamę cząsteczek sortujących aksony, aby ustanowić prawidłowe obwody neuronowe. Protokół ten opisuje metodę barwienia immunohistochemicznego w celu wizualizacji kombinatorycznych ekspresji cząsteczek sortujących aksony na końcach aksonów węchowych neuronów czuciowych.
Ogólnym celem tej metody barwienia immunohistochemicznego jest wizualizacja połączonej ekspresji cząsteczek sortujących aksony na końcach aksonów węchowych neuronów czuciowych. Metoda ta może pomóc w scharakteryzowaniu kluczowych procesów w dziedzinie rozwoju węchu, takich jak przewodnictwo aksonów, tworzenie synaps i regeneracja węchowych neuronów czuciowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala naukowcom porównywać i analizować wzorce ekspresji cząsteczek sortujących aksony w opuszce węchowej bez utrzymywania zmienności między sekcjami.
Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etap osadzania jest trudny do nauczenia, ponieważ położenie i kąt próbki tkanek węchowych w formie są trudne do opisania słowami. Zacznij od głów myszy w wieku od jednego do dwóch tygodni, które zostały utrwalone przez wewnątrzsercową perfuzję 4% paraformaldehydu. Włóż ostrze nożyczek w przestrzeń między górnymi i dolnymi zębami i tnij poziomo, aby usunąć dolną szczękę.
Następnie odetnij nadmiar tkanki za pomocą kleszczy i nożyczek, aby pozostawić tkankę węchową, w tym opuszkę węchową i nabłonek węchowy. Zanurz tkankę węchową w PBS, aby usunąć powietrze z jamy nosowej, a następnie wykonaj pionowe cięcie, aby usunąć tylną część mózgu i umieść tkankę węchową na dnie formy do osadzania z odciętym końcem skierowanym w dół. Napełnij formę związkiem o optymalnej temperaturze cięcia, a następnie zanurz w ciekłym azocie.
Po całkowitym zamrożeniu tkanki i OCT należy zrównoważyć tkankę w kriostacie w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez godzinę. Teraz wykonaj seryjne sekcje parasagitalne opuszki węchowej za pomocą kriostatu i zbierz je, przyklejając do szkiełek pokrytych MAS. Po przyklejeniu należy natychmiast wysuszyć szkiełka suszarką.
Barwienie immunologiczne należy rozpocząć od przemywania wysuszonych szkiełek PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Zablokuj niespecyficzne miejsca wiązania, inkubując szkiełka przez godzinę z 5% roztworem blokującym w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 400 mikrolitrów koktajlu przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych w 1% roztworze blokującym do każdego szkiełka.
Inkubować szkiełka przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego dnia należy wyrzucić roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przemyć szkiełka PBST trzy razy przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 400 mikrolitrów koktajlu przeciwciał drugorzędowych i PBS do każdego szkiełka.
Chronić przed światłem i inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji wyrzucić roztwór i ponownie umyć szkiełka trzy razy przez pięć minut, każde PBS w temperaturze pokojowej. Na koniec zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach, nakładając dwie krople medium montażowego na każdy szkiełko, umieszczając szkiełko nakrywkowe i usuwając pęcherzyki powietrza.
Uzyskaj obrazy fluorescencyjne za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy użyciu odpowiedniego filtra dla każdego fluoroforu. Dostosuj czas ekspozycji, aby uzyskać sygnały fluorescencyjne obrazu bez nasycenia. Zdefiniuj strukturę kłębuszkową za pomocą sygnałów immunofluorescencyjnych GLUT2.
Użyj obrazu J, aby zmierzyć intensywność barwienia cząsteczek sortujących aksony w kłębuszkach nerkowych. To zdjęcie przedstawia przekrój opuszki węchowej przysagowej dwutygodniowej myszy wybarwionej immunologicznie przeciwciałami przeciwko VGLUT2, Kirrel2 pokazanemu na czerwono, semaforynie 7A pokazanej na zielono i OLPC na niebiesko. Połączony obraz pokazuje, że cząsteczki sortujące aksony biorące udział w segregacji kłębuszków nerkowych są wyrażone w niezależnym od pozycji wzorze mozaiki
.Każdy kłębuszek nerkowy jest definiowany przez sygnały fluorescencyjne markera presynaptycznego VGLUT2. Struktury kłębuszkowe otoczone są liniami przerywanymi. Intensywność sygnałów cząsteczek sortujących aksony mierzono w każdym kłębuszku nerkowym.
Jak widać tutaj, cząsteczki sortujące aksony są różnie wyrażane w każdym kłębuszku nerkowym. Na przykład kłębuszek nerkowy 3 ma wysoki poziom OLPC, pośredni poziom semaforyny 7A i niższy poziom Kirrelu2, a różnicę tę można określić ilościowo, mierząc intensywność barwienia. Natomiast kłębuszek nerkowy 4 ma wysoki poziom OLPC i niższy poziom Kirrelu2 i semaforyny 7A.
Ponownie, różnicę tę można określić ilościowo, mierząc intensywność barwienia. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, aby pominąć post-utrwalenie PFA i leczenie roztworem sacharozy, które są zwykle zalecane. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak umieścić więcej kłębuszków nerkowych na pojedynczym odcinku opuszki węchowej i jak przeprowadzić wysokiej jakości barwienie immunologiczne za pomocą wielu przeciwciał, które można zastosować do innych obszarów mózgu.
Nie zapomnij mieć nadziei, że ta metoda pomoże Ci odnieść sukces w przyszłych eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę barwienia immunohistochemicznego w celu wizualizowania ekspresji cząsteczek sortujących aksony na zakończeniach aksonów neuronów czuciowych węchowych. Technika ta jest kluczowa dla zrozumienia procesów rozwoju narządu węchu, takich jak przewodzenie aksonów i tworzenie synaps.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Rozwój układu węchowego
- Imunohistochemia
Tło
- Neurony czuciowego układu węchowego odgrywają kluczowa rolę w zmyśle węchu.
- Cząsteczki sortujące aksony są niezbędne do ustanowienia odpowiednich połączeń neuronowych.
- Zrozumienie ich wzorców ekspresji może dostarczyć wglądu w funkcje układu węchowego.
- Wizualizacja tych ekspresji może pomóc w badaniu procesów regeneracji neuronów czuciowych węchowych.
Cel badania
- Wizualizacja połączonej ekspresji cząsteczek sortujących aksony.
- Zcharakteryzowanie kluczowych procesów w rozwoju układu węchowego.
- Ułatwienie porównania wzorców ekspresji w cebulkach węchowych.
Stosowane metody
- Technika barwienia immunohistochemicznego.
- Użycie głów myszy w wieku od jednego do dwóch tygodni.
- Przetoczenie przez serce 4% paraformaldehydu w celu fiksacji.
- Zakańczanie i przecinanie próbek tkanki węchowej.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja ekspresji cząsteczek sortujących aksony.
- Wykazanie możliwości analizy wzorców ekspresji bez różnic między przekrojami.
- Zastosowane klarowne metody zakańczania tkanek węchowych.
- Podkreślenie znaczenia demonstracji wizualnych dla nauki techniki.
Wnioski
- Metoda immunohistochemiczna jest skuteczna w badaniu neuronów czuciowych węchowych.
- Zrozumienie cząsteczek sortujących aksony może zwiększyć wiedzę o rozwoju układu węchowego.
- Ta technika może być cennym narzędziem dla przyszłych badań nad regeneracją węchu.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables precise molecular mapping of axon-sorting molecules in the olfactory bulb, supporting target validation in neurodevelopmental research. By allowing quantitative comparison of protein expression patterns across glomeruli without section-to-section variability, it enhances predictive confidence in mechanistic studies of neural circuit formation. The approach provides a scalable, reproducible platform for de-risking hypotheses related to axon guidance and synaptic specificity in preclinical discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of molecular identity codes at axon termini to clarify target engagement mechanisms in olfactory sensory neuron development.
- Operational Value: Supports functional target validation by correlating axon-sorting molecule expression with glomerular organization patterns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing standardized immunostaining protocols for multiplex protein detection.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through consistent glomerular definition using VGLUT2 as a presynaptic marker.
- Strategic Value: Highlights screening readiness via quantitative intensity measurements that enable reliable comparison of molecular expression across experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by linking axon-sorting molecule codes to neural circuit formation processes applicable to neurodegenerative models.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling longitudinal analysis of axonal regeneration and reinnervation patterns.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification by providing molecular resolution of axon guidance mechanisms critical for neurotherapeutic development.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing of OR-specific axon guidance through combinatorial molecular code visualization at axon termini.
- Screening: Describes assay readiness through standardized section collection and immunostaining that minimizes technical variation across samples.
- Analytics: Highlights quantitative readouts from ImageJ-based intensity measurements that enable statistical comparison of axon-sorting molecule expression across glomeruli.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by enabling analysis of olfactory regeneration processes relevant to injury models.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for multiplex protein profiling in other brain regions beyond the olfactory system.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct visualization of molecular determinants of axonal segregation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability achieved via consistent tissue embedding and sectioning protocols.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in neural pathway models.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through quantitative biomarker-like readouts of axon-sorting molecule co-expression patterns.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in immunohistochemistry, cryosectioning, and fluorescent microscopy.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including cryostat, fluorescence microscope, and image analysis software.
- Cross-team standardization requirements for antibody validation and staining protocol consistency.
- Adaptation considerations across model systems, particularly for tissues with different embedding properties.
- Practical limitations include the technical challenge of tissue orientation in embedding molds, which requires hands-on training to master.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
5:42
Conclusion
4:26
Results: Quantification of Axon-sorting Molecules in the Olfactory Bulb
1:11
Preparation of Parasagittal Olfactory Bulb Sections
2:33
Day 1: Quadruple Immunostaining of Olfactory Bulb Slices
3:07
Day 2: Quadruple Immunostaining of Olfactory Bulb Slices
3:56
The Use of Fluorescence Intensity Measurements
