Połączenie podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ z immunoznakowaniem w celu wykrycia ekspresji trzech genów w wycinkach mózgu myszy
26 marca 2016
Lokalizacja ekspresji genów w określonych typach komórek może być trudna ze względu na brak specyficznych przeciwciał. W tym miejscu opisujemy protokół jednoczesnego potrójnego wykrywania ekspresji genów poprzez połączenie hybrydyzacji in situ RNA z podwójną fluorescencją z barwieniem immunologicznym.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest jednoczesne wykrycie ekspresji trzech różnych genów w sekcjach mózgu, przy użyciu podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ, a następnie barwienia immunologicznego. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii, takie jak to, który typ komórki wyraża mój gen, który mnie interesuje? Główną zaletą tej techniki jest to, że nie potrzebujesz dobrego przeciwciała, aby interesujący Cię gen był w stanie zlokalizować jego ekspresję w określonym typie komórki.
Podsumowując tę procedurę, pierwszego dnia utrwalone skrawki tkanek są cięte i hybrydyzowane z dwiema różnie znakowanymi sondami RNA w nocy. Drugiego dnia skrawki są inkubowane przez noc z przeciwciałem skierowanym do sondy znakowanej FITC. Przeciwciało to jest sprzężone z peroksydazą chrzanową, która katalizuje dodanie fluorescencyjnego tyramidu trzeciego dnia.
Następnie stosuje się przeciwciało sprzężone z fosfatazą alkaliczną, aby celować w sondę znakowaną DIG. Czwartego dnia enzym ten katalizuje tworzenie się osadu fluorescencyjnego podczas inkubacji z roztworem Fast Red. Następnie skrawki są inkubowane przez noc z pierwszorzędowym przeciwciałem skierowanym przeciwko białemu będącemu przedmiotem zainteresowania.
Wreszcie, w piątym dniu, białko to jest wizualizowane za pomocą przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z fluoroforem. Aby rozpocząć tę procedurę, wybierz klon DNA, który zawiera sekwencję cDNA interesującego genu w plazmidzie z promotorami polimerazy RNA. Następnie wyhoduj klon DNA, wyekstrahuj plazmid za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu na małą skalę i zsekwencjonuj go za pomocą uniwersalnych starterów T7 i SP6.
Trawić od 10 do 20 mikrogramów plazmidowego DNA za pomocą enzymu restrykcyjnego, który przecina pięć głównych końców nici zmysłowej cDNA. Inkubuj przez 1,5 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie uruchom małą porcję na żelu agarozowym, aby sprawdzić, czy plazmid jest w pełni zlinearyzowany.
Aby oczyścić zlinearyzowany plazmid, dodaj 1/10 objętości trzech molowych octanu sodu, jedną objętość 10-milimolowego fenolu o równowadze Tris-HCl i jedną objętość chloroformowego alkoholu izoamylowego. Wirować w temperaturze 16 000 g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej i ekstrahować górną fazę wodną. Następnie dodać jedną objętość chloroformu IAA.
Odwirować go w temperaturze 16 000 g przez jedną minutę i wyekstrahować górną fazę wodną. Powtórz ten krok jeszcze raz. Następnie dodaj dwie objętości etanolu i utrzymuj go w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez godzinę lub przez noc.
Następnie odwirować w temperaturze 16 000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Wyrzuć supernatant i umyj osad 70% zimnym etanolem. Następnie ponownie zawiesić go w TE przy stężeniu jednego mikrograma cDNA na 2,5 mikrolitra.
Aby zsyntetyzować dwie sondy, najpierw wybierz odpowiednią polimerazę RNA. Następnie przygotuj reakcję transkrypcji in vitro i zwiększ końcową objętość do 20 mikrolitrów wodą uzdatnioną DEPC. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 1,5 godziny.
Następnie uruchom jeden mikrolitr reakcji transkrypcji na 1% żelu agarozowym, aby sprawdzić, czy reakcja zadziałała. Żel powinien pokazywać szablon liniowy i jasny pasek sondy. W tej procedurze należy wyciąć w kriostacie odcinki zamrożonej tkanki o grubości 15 mikrometrów.
Zbierz skrawki na szkiełka mikroskopowe i pozostaw szkiełka do wyschnięcia na godzinę, aby upewnić się, że tkanki przylegają do szkiełek. Najważniejszym czynnikiem, aby ta procedura działała dobrze, jest jakość sekcji. Zależy to częściowo od dobrze ukrwionej i utrwalonej tkanki, a częściowo od techniki cięcia w celu uzyskania płaskich odcinków, które są wolne od zanieczyszczenia RNazą.
Następnie rozcieńczyć dwie sondy w buforze hybrydyzacyjnym podgrzanym do 65 stopni Celsjusza i dobrze wymieszać. Nałóż 300 mikrolitrów mieszanki hybrydyzacyjnej na każde szkiełko i przykryj przykrywką wypaloną w piekarniku. Następnie inkubuj szkiełka przez noc w temperaturze 65 stopni Celsjusza w wilgotnej komorze.
Następnego dnia przenieś szkiełka do słoika Coplin zawierającego wstępnie podgrzany bufor do mycia i myj szkiełka przez 30 minut, dwukrotnie, w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Następnie myj szkiełka przez 10 minut trzykrotnie roztworem myjącym MABT w temperaturze pokojowej. Na tym etapie użyj hydrofobowego pisaka, aby narysować kółka wokół odcinków tkanki.
Następnie inkubować szkiełka przez godzinę w temperaturze pokojowej z buforem blokującym ISH w wilgotnej komorze. Następnie inkubuj szkiełka przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza z chrzanowym, peroksydowanym, sprzężonym przeciwciałem anty-fitc. Następnie umieść szkiełka w słoiku z kopinem zawierającym PBST.
Umyj je w PBST trzy razy przez 10 minut za każdym razem i za każdym razem zastąp świeżym PBST. Następnie dodaj fluorescencyjny tyromid do szkiełek i pozostaw je na 10 minut w temperaturze pokojowej. Umieść szkiełka w słoiku z kopeliną i myj w PBST przez 10 minut trzy razy.
Następnie inkubować szkiełka z buforem blokującym ISH przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie inkubuj szkiełka przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza z przeciwciałem anty-dig sprzężonym z fosfatazą alkaliczną. Następnie umyj je MABT trzy razy przez 10 minut za każdym razem.
Następnie umyj szkiełka dwukrotnie 0,1 molowym tris HCL o pH 8,2 przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Przefiltruj szybki czerwony roztwór i inkubuj szkiełka w temperaturze 37 stopni Celsjusza z szybkim czerwonym roztworem w wilgotnej komorze. Ponieważ czas optymalnego rozwoju jest różny, należy regularnie sprawdzać szkiełka za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, aby monitorować tworzenie się osadu.
Następnie umyj je trzy razy PBST przez 10 minut za każdym razem. Aby przeprowadzić immunohistochemię, należy inkubować szkiełka z buforem blokującym IHC przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze. Następnie inkubuj szkiełka w roztworze przeciwciała pierwotnego w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.
Następnego dnia umyj szkiełka PBST przez 10 minut trzy razy. Inkubować je w roztworze przeciwciał drugorzędowych w temperaturze pokojowej przez godzinę. Następnie umyj je PBST trzy razy przez 10 minut za każdym razem.
Następnie częściowo wysuszyć szkiełka w temperaturze pokojowej i zamontować za pomocą fluorescencyjnego medium montażowego. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia przed obrazowaniem ich w mikroskopie konfokalnym. Pokazano tutaj reprezentatywne obrazy z ISH dla Aspa i Mbp, a następnie barwienie immunologiczne dla OLIG2 połączone z barwieniem haczykowym.
Aspa ulegała ekspresji w niektórych MBP-dodatnich komórkach OLIG2-dodatnich w korze i ciele modzelowatym. Niektóre komórki Mbp-dodatnie OLIG2-dodatnie nie wykazują ekspresji Aspa. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby plastry i wszystkie roztwory były wolne od zanieczyszczenia RNazą.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak badać wzorce ekspresji genów poprzez hamowanie N-cytrynu i immunohistochemię. Technikę tę można dostosować do różnych tkanek o różnym pochodzeniu i etapach rozwoju.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół jednoczesnej detekcji ekspresji trzech różnych genów w przekrojach tkanki mózgowej. Metoda ta łączy podwójną fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH) z immunobarwieniem, co pozwala badaczom lokalizować ekspresję genów w konkretnych typach komórek mózgowych, nawet gdy dla wszystkich celów niedostępne są odpowiednie przeciwciała. Protokół został zilustrowany na przykładzie badania ekspresji genu aspartoacylazy (ASPA) w oligodendrocytach i innych komórkach mózgu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia molekularna
- Histologia
Wstęp
- Analiza ekspresji genów w tkance mózgowej jest często ograniczona dostępnością specyficznych przeciwciał do immunobarwienia.
- Hybrydyzacja in situ umożliwia detekcję transkryptów mRNA, stanowiąc alternatywę dla metod opartych na przeciwciałach.
- Połączenie techniki FISH z immunobarwieniem pozwala na jednoczesną wizualizację wielu produktów genów w tym samym przekroju tkanki.
- Gen ASPA jest powiązany z chorobą Canavana i uważa się, że wykazuje ekspresję w oligodendrocytach i mikrogleju, jednak dokładny wzorzec jego ekspresji w mózgu nie był wcześniej jasno określony.
Cel badania
- Opracowanie i zaprezentowanie protokołu wykrywania ekspresji trzech różnych genów w tym samym przekroju mózgu.
- Określenie wzorca ekspresji genu ASPA specyficznego dla danych typów komórek w mózgu.
- Zapewnienie szeroko stosowalnej metody badań ekspresji genów w różnych tkankach i na różnych etapach rozwoju.
Zastosowane metody
- Przygotowanie utrwalonych przekrojów tkanki mózgowej i sekcjonowanie w kriostacie.
- Synteza dwóch genospecyficznych sond RNA znakowanych różnymi tagami (FITC i DIG) poprzez transkrypcję in vitro.
- Podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ z wykorzystaniem dwóch sond, z których każda była wykrywana za pomocą przeciwciał sprzężonych z enzymem i substratów fluorescencyjnych (tyramid i Fast Red).
- Następne barwienie immunocytochemiczne z użyciem wysoce specyficznego przeciwciała przeciwko trzeciemu białku, wizualizowane za pomocą wtórnego przeciwciała sprzężonego z fluorochromem.
- Mikroskopia konfokalna w celu obrazowania i analizy wzorców ekspresji genów.
Główne wyniki
- Protokół ten umożliwił pomyślną jednoczesną detekcję trzech produktów genów w tym samym przekroju mózgu.
- Ekspresja ASPA była zlokalizowana w podgrupie dojrzałych oligodendrocytów, co wykazano poprzez współoznakowanie markerami MBP i OLIG2.
- Niektóre komórki MBP-dodatnie i OLIG2-dodatnie nie wykazywały ekspresji ASPA, co wskazuje na heterogenność wśród oligodendrocytów.
- Metoda okazała się dostosowalna do różnych typów tkanek i etapów rozwoju.
Wnioski
- Niniejszy protokół umożliwia precyzyjne mapowanie ekspresji genów w konkretnych typach komórek mózgu bez konieczności stosowania przeciwciał dla wszystkich celów.
- Dostarcza on nowej wiedzy na temat specyficznej dla typu komórek ekspresji ASPA w mózgu.
- Technika ta ma szerokie zastosowanie w badaniu wzorców ekspresji genów w różnorodnych kontekstach biologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
W procesie odkrywania leków w neuronauce precyzyjne określenie ekspresji genów w konkretnych typach komórek mózgowych ma kluczowe znaczenie dla walidacji celu oraz minimalizacji ryzyka mechanistycznego. Niniejsza metoda umożliwia jednoczesną detekcję trzech genów bez konieczności polegania na wysokiej jakości przeciwciałach, rozwiązując tym samym główny problem w procesie potwierdzania celu. Dzięki dostarczaniu przestrzennie rozdzielonych, multipleksowych danych o ekspresji genów, metoda ta wspiera wczesne testowanie hipotez oraz ustalanie priorytetów w portfelu projektów rozwoju terapii CNS.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez mapowanie ekspresji genów w oligodendrocytach, mikrogleju, astrocytach lub neuronach.
- Wartość operacyjna: Zmniejsza zależność od dostępności przeciwciał, co przyspiesza proces walidacji celów terapeutycznych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez bezpośrednią wizualizację wzorców koekspresji genów w typach komórek istotnych dla danej choroby.
Przesiewy i rozwój testów
- Gotowość do analizy: Generuje standaryzowane, powtarzalne odczyty fluorescencyjne dla trzech celów na przekrój, umożliwiając ilościowe porównanie pomiędzy różnymi warunkami.
- Skalowalność: Kompatybilny z platformami do obrazowania o wysokiej rozdzielczości, co pozwala na skalowalną analizę ekspresji genów w modelach przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Możliwość adaptacji do różnych obszarów mózgu i etapów rozwoju, co ułatwia zachowanie spójności między badaniami podczas profilowania ekspresji celów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy odkrycia dotyczące ekspresji genów na etapie wyszukiwawczym z modelami przedklinicznymi poprzez potwierdzenie specyficznej dla typu komórek ekspresji w mózgu myszy.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Pozwala wyjaśnić, czy dany cel jest eksponowany w zamierzonym kontekście komórkowym, co zmniejsza ryzyko niepowodzeń wynikających z mechanizmu działania.
- Dopasowanie biomarkerów: Wspiera identyfikację sygnałów specyficznych dla typu komórek, które mogą przełożyć się na biomarkery w płynach ustrojowych lub obrazowaniu w późniejszych etapach.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania – od postawienia hipotezy dotyczącej celu po identyfikację związku wiodącego – zapewniając pewność co do mechanizmu działania przed rozpoczęciem przesiewu związków.
- Biologia odkrywcza: Weryfikuje hipotezy dotyczące ekspresji celu poprzez wizualizację ko-lokalizacji RNA i białek w określonych populacjach komórek.
- Przesiewy: Generuje zestandaryzowane, multipleksowe wyniki, które umożliwiają wiarygodne porównanie ekspresji genów w grupach eksperymentalnych.
- Analityka: Dostarcza ilościowe odczyty oparte na fluorescencji i osadach, które wspierają statystyczne porównanie poziomów ekspresji.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki uzyskane in vitro lub in silico z wzorcami ekspresji in vivo w tkance neuronalnej istotnej dla danej choroby.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Tworzy możliwość wielokrotnego wykorzystania metody profilowania multipleksowej ekspresji genów w wielu projektach dotyczących OUN.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie biologii celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w ekspresji genów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje proces pracy dla detekcji multipleksowej, poprawiając powtarzalność wyników między ośrodkami i zespołami.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu projektu (go/no-go) poprzez potwierdzenie ekspresji celu w odpowiednich typach komórek, co redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o zwalidowane profile ekspresji w systemach istotnych dla danej choroby.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu hybrydyzacji in situ RNA, immunohistochemii oraz mikroskopii fluorescencyjnej.
- Metoda jest zależna od środowiska wolnego od RNaz, jakości utrwalenia tkanek oraz precyzji skrawania.
- Wymagany jest dostęp do pieców do hybrydyzacji, mikroskopów fluorescencyjnych oraz odczynników do detekcji Tyramide i Fast Red.
- Należy zoptymalizować stężenie sond oraz miareczkowanie przeciwciał dla każdego celu, aby zminimalizować tło.
- Ograniczeniem jest autofluorescencja tkanek oraz potencjalne nakładanie się sygnałów w kanałach multipleksowych, co wymaga dokładnej separacji spektralnej.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:42
Overview of Double Fluoresence In Situ Hybridization Followed by Immunostaining
1:44
RNA Probe Synthesis
4:12
Cryosectioning and Hybridization
5:33
Visualization of the FITC Probe and the DIG Probe
7:23
Immunohistochemistry and Mounting
8:16
Results: Expression of Aspa in Oligodendrocytes in the Cortex and the Corpus Callosum
8:45
Conclusion
