Połączenie podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ z immunoznakowaniem w celu wykrycia ekspresji trzech genów w wycinkach mózgu myszy

Ogólnym celem tego eksperymentu jest jednoczesne wykrycie ekspresji trzech różnych genów w sekcjach mózgu, przy użyciu podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ, a następnie barwienia immunologicznego. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii, takie jak to, który typ komórki wyraża mój gen, który mnie interesuje? Główną zaletą tej techniki jest to, że nie potrzebujesz dobrego przeciwciała, aby interesujący Cię gen był w stanie zlokalizować jego ekspresję w określonym typie komórki.

Podsumowując tę procedurę, pierwszego dnia utrwalone skrawki tkanek są cięte i hybrydyzowane z dwiema różnie znakowanymi sondami RNA w nocy. Drugiego dnia skrawki są inkubowane przez noc z przeciwciałem skierowanym do sondy znakowanej FITC. Przeciwciało to jest sprzężone z peroksydazą chrzanową, która katalizuje dodanie fluorescencyjnego tyramidu trzeciego dnia.

Następnie stosuje się przeciwciało sprzężone z fosfatazą alkaliczną, aby celować w sondę znakowaną DIG. Czwartego dnia enzym ten katalizuje tworzenie się osadu fluorescencyjnego podczas inkubacji z roztworem Fast Red. Następnie skrawki są inkubowane przez noc z pierwszorzędowym przeciwciałem skierowanym przeciwko białemu będącemu przedmiotem zainteresowania.

Wreszcie, w piątym dniu, białko to jest wizualizowane za pomocą przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z fluoroforem. Aby rozpocząć tę procedurę, wybierz klon DNA, który zawiera sekwencję cDNA interesującego genu w plazmidzie z promotorami polimerazy RNA. Następnie wyhoduj klon DNA, wyekstrahuj plazmid za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu na małą skalę i zsekwencjonuj go za pomocą uniwersalnych starterów T7 i SP6.

Trawić od 10 do 20 mikrogramów plazmidowego DNA za pomocą enzymu restrykcyjnego, który przecina pięć głównych końców nici zmysłowej cDNA. Inkubuj przez 1,5 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie uruchom małą porcję na żelu agarozowym, aby sprawdzić, czy plazmid jest w pełni zlinearyzowany.

Aby oczyścić zlinearyzowany plazmid, dodaj 1/10 objętości trzech molowych octanu sodu, jedną objętość 10-milimolowego fenolu o równowadze Tris-HCl i jedną objętość chloroformowego alkoholu izoamylowego. Wirować w temperaturze 16 000 g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej i ekstrahować górną fazę wodną. Następnie dodać jedną objętość chloroformu IAA.

Odwirować go w temperaturze 16 000 g przez jedną minutę i wyekstrahować górną fazę wodną. Powtórz ten krok jeszcze raz. Następnie dodaj dwie objętości etanolu i utrzymuj go w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez godzinę lub przez noc.

Następnie odwirować w temperaturze 16 000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Wyrzuć supernatant i umyj osad 70% zimnym etanolem. Następnie ponownie zawiesić go w TE przy stężeniu jednego mikrograma cDNA na 2,5 mikrolitra.

Aby zsyntetyzować dwie sondy, najpierw wybierz odpowiednią polimerazę RNA. Następnie przygotuj reakcję transkrypcji in vitro i zwiększ końcową objętość do 20 mikrolitrów wodą uzdatnioną DEPC. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 1,5 godziny.

Następnie uruchom jeden mikrolitr reakcji transkrypcji na 1% żelu agarozowym, aby sprawdzić, czy reakcja zadziałała. Żel powinien pokazywać szablon liniowy i jasny pasek sondy. W tej procedurze należy wyciąć w kriostacie odcinki zamrożonej tkanki o grubości 15 mikrometrów.

Zbierz skrawki na szkiełka mikroskopowe i pozostaw szkiełka do wyschnięcia na godzinę, aby upewnić się, że tkanki przylegają do szkiełek. Najważniejszym czynnikiem, aby ta procedura działała dobrze, jest jakość sekcji. Zależy to częściowo od dobrze ukrwionej i utrwalonej tkanki, a częściowo od techniki cięcia w celu uzyskania płaskich odcinków, które są wolne od zanieczyszczenia RNazą.

Następnie rozcieńczyć dwie sondy w buforze hybrydyzacyjnym podgrzanym do 65 stopni Celsjusza i dobrze wymieszać. Nałóż 300 mikrolitrów mieszanki hybrydyzacyjnej na każde szkiełko i przykryj przykrywką wypaloną w piekarniku. Następnie inkubuj szkiełka przez noc w temperaturze 65 stopni Celsjusza w wilgotnej komorze.

Następnego dnia przenieś szkiełka do słoika Coplin zawierającego wstępnie podgrzany bufor do mycia i myj szkiełka przez 30 minut, dwukrotnie, w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Następnie myj szkiełka przez 10 minut trzykrotnie roztworem myjącym MABT w temperaturze pokojowej. Na tym etapie użyj hydrofobowego pisaka, aby narysować kółka wokół odcinków tkanki.

Następnie inkubować szkiełka przez godzinę w temperaturze pokojowej z buforem blokującym ISH w wilgotnej komorze. Następnie inkubuj szkiełka przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza z chrzanowym, peroksydowanym, sprzężonym przeciwciałem anty-fitc. Następnie umieść szkiełka w słoiku z kopinem zawierającym PBST.

Umyj je w PBST trzy razy przez 10 minut za każdym razem i za każdym razem zastąp świeżym PBST. Następnie dodaj fluorescencyjny tyromid do szkiełek i pozostaw je na 10 minut w temperaturze pokojowej. Umieść szkiełka w słoiku z kopeliną i myj w PBST przez 10 minut trzy razy.

Następnie inkubować szkiełka z buforem blokującym ISH przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie inkubuj szkiełka przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza z przeciwciałem anty-dig sprzężonym z fosfatazą alkaliczną. Następnie umyj je MABT trzy razy przez 10 minut za każdym razem.

Następnie umyj szkiełka dwukrotnie 0,1 molowym tris HCL o pH 8,2 przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Przefiltruj szybki czerwony roztwór i inkubuj szkiełka w temperaturze 37 stopni Celsjusza z szybkim czerwonym roztworem w wilgotnej komorze. Ponieważ czas optymalnego rozwoju jest różny, należy regularnie sprawdzać szkiełka za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, aby monitorować tworzenie się osadu.

Następnie umyj je trzy razy PBST przez 10 minut za każdym razem. Aby przeprowadzić immunohistochemię, należy inkubować szkiełka z buforem blokującym IHC przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze. Następnie inkubuj szkiełka w roztworze przeciwciała pierwotnego w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia umyj szkiełka PBST przez 10 minut trzy razy. Inkubować je w roztworze przeciwciał drugorzędowych w temperaturze pokojowej przez godzinę. Następnie umyj je PBST trzy razy przez 10 minut za każdym razem.

Następnie częściowo wysuszyć szkiełka w temperaturze pokojowej i zamontować za pomocą fluorescencyjnego medium montażowego. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia przed obrazowaniem ich w mikroskopie konfokalnym. Pokazano tutaj reprezentatywne obrazy z ISH dla Aspa i Mbp, a następnie barwienie immunologiczne dla OLIG2 połączone z barwieniem haczykowym.

Aspa ulegała ekspresji w niektórych MBP-dodatnich komórkach OLIG2-dodatnich w korze i ciele modzelowatym. Niektóre komórki Mbp-dodatnie OLIG2-dodatnie nie wykazują ekspresji Aspa. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby plastry i wszystkie roztwory były wolne od zanieczyszczenia RNazą.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak badać wzorce ekspresji genów poprzez hamowanie N-cytrynu i immunohistochemię. Technikę tę można dostosować do różnych tkanek o różnym pochodzeniu i etapach rozwoju.