Name: Połączenie podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ z immunoznakowaniem w celu wykrycia ekspresji trzech genów w wycinkach mózgu myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Poznaj metodę podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ z immunoznakowaniem do wykrywania trzech genów w tkance mózgu myszy. Technika umożliwia lokalizację ekspresji genów bez konieczności stosowania przeciwciał.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca w laboratoriach autorów była wspierana przez Brytyjską Radę ds. Badań Biotechnologii i Nauk Biologicznych (BB/J006602/1 i BB/L003236/1), Wellcome Trust (WT100269MA) oraz Europejską Radę ds. Badań Naukowych (ERC, Program "Pomysły" 293544). SJ był wspierany przez długoterminowe stypendium EMBO. Autorzy dziękują Stephenowi Grantowi za jego pomoc techniczną.

Oświadczenie etyczne: 
Hodowla myszy i obchodzenie się z nimi są zgodne z przepisami brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych i wytycznymi komisji etycznej UCL, zgodnie z brytyjską ustawą o zwierzętach (procedury naukowe) z 1986 r. i jej przepisami zmieniającymi z 2012 r.
UWAGA: Wszystkie roztwory powinny być wykonane z wody uzdatnionej pirowęglanem dietylu (DEPC), aby zniszczyć wszelkie pozostałości RNazy. W przypadku obróbki DEPC dodaj DEPC (1 ml na litr), energicznie wstrząsaj, aż wszystkie kuleczki DEPC znikną, a następnie autoklaw w celu degradacji DEPC.
1. Synteza sondy RNA
<ol>
	<li>UWAGA: Podczas obchodzenia się z formamidem należy nosić środki ochrony osobistej (PPE) i używać szafy bezpieczeństwa. Przygotuj bufor hybrydyzacyjny: woda dejonizowana uzdatniona DEPC z 50% (v/v) dejonizowanym formamidem, 200 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM NaH2PO4, 5 mM Na2HPO4, 0,01 mg / ml tRNA drożdży, 1× roztworu Denhardta i 10% w/v siarczanu dekstranu.</li>
	<li>Wybierz klon DNA, który zawiera sekwencję cDNA interesującego genu w plazmidzie z promotorami polimerazy RNA. W tym przykładzie użyj klonu pCMV-SPORT6, IRAVp968C0654D (akces GenbankBC024934), z promotorami polimerazy RNA T7 i Sp6 dla Aspa (rysunek uzupełniający 1).</li>
	<li>Przygotuj zlinearyzowane plazmidowe DNA jako matrycę.
	<ol>
		<li>Wyhoduj klon DNA, wyekstrahuj plazmid za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu na małą skalę zgodnie z protokołem producenta i sekwencjonuj za pomocą uniwersalnych starterów T7 i Sp6.</li>
		<li>Trawić 1,020 μg plazmidowego DNA za pomocą enzymu restrykcyjnego, który przecina koniec 5' nici zmysłowej cDNA. W tym przykładzie użyj 100 jednostek SalI do trawienia plazmidu pCMV-SPORT6-Aspa. Inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze 37 oC.</li>
		<li>Uruchom małą porcję na żelu agarozowym, aby sprawdzić, czy plazmid jest w pełni zlinearyzowany.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyść zlinearyzowany plazmid za pomocą fenol-chloroformu.
	<ol>
		<li>Dodać 1:10 objętości 3 M octanu sodu, jedną objętość 10 mM Tris HCl (pH 8,0) - zrównoważonego fenolu i jedną objętość chloroformu/alkoholu izoamylowego (IAA) (24:1).</li>
		<li>Wirować przy 16 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (20 - 25 °C, RT) i ekstrahować górną fazę wodną.</li>
		<li>Dodać jedną objętość chloroformu/IAA, odwirować przy 16 000 x g przez 1 minutę i ekstrahować górną fazę wodną.</li>
		<li>Powtórz krok 1.4.3.</li>
		<li>Dodać 2 objętości etanolu i pozostawić w temperaturze -20oC na 1 godzinę lub O/N.</li>
		<li>Wirować w temperaturze 16 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Przemyć osad 70% zimnym etanolem i ponownie zawiesić na poziomie około 1 μg cDNA na 2,5 μl w TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,5).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zsyntetyzować dwie sondy, jedną znakowaną digoksygeniną (DIG), a drugą izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC).
	<ol>
		<li>Wybierz odpowiednią polimerazę RNA, aby utworzyć sondę antysensowną (komplementarną do docelowego mRNA). W tym przykładzie użyj polimerazy RNA T7 do wykonania sondy Aspa.</li>
		<li>Przygotować reakcję transkrypcji in vitro: dodać 1 μg zlinearyzowanego DNA, 4,0 μl 5 x bufor transkrypcyjny, 6,0 μl 100 mM DTT, 2,0 μl 10 μl mieszaniny znakowanej DIG lub FITC RNA zawierającej dNTP, 1 μl inhibitora RNazy i 20 - 40 jednostek polimerazy RNA; uzupełnić końcową objętość do 20 μl wodą uzdatnioną DEPC.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 oC przez 1,5 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom 1 μl reakcji transkrypcji na 1,0% żelu agarozowym, aby sprawdzić, czy reakcja zadziałała. Żel powinien pokazywać szablon liniowy i jasny pasek sondy.</li>
	<li>Uzupełnić objętość do 100 μl buforem hybrydyzacyjnym i przechowywać 10 μl podwielokrotności w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. Perfuzja, utrwalenie i pobieranie tkanek
<ol>
	<li>UWAGA: Podczas pracy z paraformaldehydem (PFA), zarówno stałym, jak i wodnym, należy nosić środki ochrony osobistej i używać szafki bezpieczeństwa. Przygotować roztwór formaldehydu, rozpuszczając 4% (m/v) PFA w 1x roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) za pomocą ciepła (55 °C). Przefiltruj roztwór formaldehydu za pomocą bibuły filtracyjnej.</li>
	<li>Przygotować roztwór sacharozy, rozpuszczając 20% (m/v) sacharozę w wodzie destylowanej i dodając 0,1% (v/v) roztwór DEPC. Pozostaw O/N w RT z luźną pokrywką, a następnie autoklaw.</li>
	<li>Znieczulenie końcowe myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitonu (50 mg/kg). Oceń głębokość znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi, a brak odruchu wycofania wskazuje na głębokie znieczulenie.</li>
	<li>Gdy mysz znajdzie się w głębokim znieczuleniu, wykonaj nacięcie pod klatką piersiową i przetnij klatkę piersiową po obu stronach, podnieś ją, aby odsłonić serce.</li>
	<li>Wbić igłę 25 G do lewej komory serca. Wykonaj małe nacięcie w prawym przedsionku serca.</li>
	<li>Przeprowadzić perfuzję zwierzęcia za pomocą 20 ml PBS, a następnie 40 ml roztworu formaldehydu. W przypadku myszy P30 i starszych należy stosować szybkość perfuzji 12 ml / min, ale w przypadku młodszych zwierząt należy stosować niższą szybkość (7 - 10 ml / min).</li>
	<li>Przeanalizuj mózg.
	<ol>
		<li>Odetnij głowę myszy nożyczkami chirurgicznymi, wykonując nacięcie z tyłu od uszu. Wykonaj ogonowe nacięcie linii środkowej w skórze i pracuj rostralnie, aby usunąć skórę z czaszki.</li>
		<li>Zaczynając od części ogonowej, przeciąć górną część czaszki wzdłuż linii środkowej i między oczami nożyczkami do tęczówki. Usuń płytkę kostną ciemieniową i czołową, przechylając za każdym razem jedną stronę płytki kostnej i odłamując ją pęsetą.</li>
		<li>Delikatnie przechyl mózg do góry od przedniej części za pomocą pęsety i przetnij nerwy wzrokowe i inne nerwy czaszkowe. Delikatnie wyjmij mózg z czaszki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść mózg w koronalnej macierzy mózgu myszy. Pokrój mózg na 3 kawałki o średnicy około 4 mm za pomocą żyletki z piór.</li>
	<li>Przenieść plastry do 4% roztworu PFA i inkubować O/N w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść wycinki mózgu do 20% roztworu sacharozy poddanego działaniu DEPC i inkubować O/N w temperaturze 4 °C</li>
	<li>Umieść każdy plasterek mózgu w suchej krioformie, otocz pożywką o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i zamroź na suchym lodzie. Przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Kriosekcja
<ol>
	<li>Wytnij 15 μm skrawki zamrożonej tkanki w kriostacie i zbierz skrawki na szkiełka mikroskopowe. W razie potrzeby zwilż sekcje PBS poddanym działaniu DEPC i spłaszcz je drobnym pędzlem.</li>
	<li>Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na około 1 godzinę, aby upewnić się, że chusteczka przylega do szkiełka.</li>
</ol>
4. Hybrydyzacja
<ol>
	<li>Przygotować bufor do przemywania o temperaturze 65 °C: 150 mM NaCl, 15 mM Na3C3H5O(COO)3 (= 1x solony cytrynian sodu), 50% (v/v) formamid i 0,1% (v/v) Tween-20.</li>
	<li>Przygotować bufor MABT: 100 mM kwas maleinowy, 150 mM NaCl, 0,1% (v/v) Tween-20, pH 7,5.</li>
	<li>Rozcieńczyć dwie sondy (znakowaną DIG i FITC) w stosunku 1:1000 w buforze hybrydyzacyjnym podgrzanym do temperatury 65 °C i dobrze wymieszać.</li>
	<li>Nałożyć około 300 μl mieszaniny hybrydyzacyjnej na każde szkiełko nakrywkowe z szkiełkami nakrywkowymi wypieczonymi w piekarniku (200 oC) i inkubować O/N w temperaturze 65 °C w wilgotnej komorze.</li>
	<li>Przenieś szkiełka do słoika Coplin zawierającego wstępnie podgrzany bufor do mycia. Myć szkiełka przez 30 minut dwa razy w temperaturze 65 °C z buforem do płukania.</li>
	<li>Myć szkiełka przez 10 minut trzykrotnie za pomocą MABT w RT.</li>
</ol>
5. Wizualizacja sondy FITC
<ol>
	<li>Przygotować bufor blokujący ISH: MABT z 2% odczynnikiem blokującym i 10% inaktywowaną termicznie surowicą owczą.</li>
	<li>Opcjonalnie: za pomocą pisaka hydrofobowego narysuj kółka wokół odcinków tkanki na szkiełku, aby zmniejszyć wymaganą objętość roztworów przeciwciał.</li>
	<li>Inkubować szkiełka przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z buforem blokującym ISH w wilgotnej komorze.</li>
	<li>Inkubować szkiełka O/N w temperaturze 4 °C z przeciwciałem anty-FITC sprzężonym z peroksydazą chrzanową (POD) rozcieńczonym w stosunku 1/500 (v/v) w buforze blokującym ISH.</li>
	<li>Umieść szkiełka w słoiku Coplin zawierającym PBS z 0,1% (v/v) Tween-20 (PBST). Umyj 3 razy przez 10 minut w PBST i za każdym razem zastąp świeżym PBST.</li>
	<li>Bezpośrednio przed użyciem należy przygotować tyramid fluorescencyjny, rozcieńczając go 100 razy w rozcieńczalniku Amplifikacja. W tym przykładzie użyj FITC-tyramide.</li>
	<li>Dodaj to do slajdów i pozostaw na 10 minut w RT.</li>
	<li>Umieść szkiełka w słoiku Coplin i umyj 3 razy w PBST przez 10 minut.</li>
</ol>
6. Wizualizacja sondy DIG
<ol>
	<li>Przygotować 0,1 M Tris-HCl pH 8,2.</li>
	<li>Inkubować szkiełka z buforem blokującym ISH przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować szkiełka O/N w temperaturze 4 °C z przeciwciałem anty-DIG sprzężonym z fosfatazą alkaliczną (AP) rozcieńczonym w stosunku 1/1,500 (v/v) w buforze blokującym ISH.</li>
	<li>Myć MABT przez 10 minut trzy razy.</li>
	<li>Umyć dwukrotnie 0,1 M Tris-HCl pH 8,2 przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Bezpośrednio przed użyciem należy przygotować roztwór Fast Red, rozpuszczając tabletki w 0,1 M Tris pH 8,2. Przefiltrować roztwór przez filtr 0,22 μM.</li>
	<li>Inkubować szkiełka w temperaturze 37 °C z roztworem Fast Red w wilgotnej komorze. Ponieważ czas optymalnego rozwoju jest różny, należy regularnie sprawdzać szkiełka za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, aby monitorować tworzenie się osadu. W tym przykładzie przerwij reakcję po 2-3 godzinach.</li>
	<li>Myć PBST przez 10 minut trzy razy.</li>
</ol>
7. Immunohistochemia
<ol>
	<li>Przygotować bufor blokujący IHC: 10% (v/v) surowicy (innego gatunku niż pierwotne przeciwciało gospodarza) w PBST.</li>
	<li>Inkubować szkiełka z buforem blokującym IHC przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze</li>.
	<li>Przygotować przeciwciało pierwszorzędowe: rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w odpowiednim rozcieńczeniu w PBST 5% surowicą (innego gatunku niż przeciwciało pierwszorzędowe gospodarza). W tym przykładzie należy użyć króliczego przeciwciała anty-Olig2 w rozcieńczeniu 1/400 (v/v).</li>
	<li>Inkubować w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego w temperaturze 4 °C O/N.</li>
	<li>Myć PBST przez 10 minut trzy razy.</li>
	<li>Przygotować przeciwciało drugorzędowe: rozcieńczyć sprzężone z fluoroforem przeciwciało drugorzędowe w odpowiednim rozcieńczeniu w PBST 5% (v/v) surowicy (innego gatunku niż pierwszorzędowe przeciwciało gospodarza) i 0,1% (v/v) Hoechst 33258. W tym przykładzie należy użyć przeciwciała drugorzędowego Alexa647 przeciwko królikowi w rozcieńczeniu 1/1,000 (v/v).</li>
	<li>Inkubować w drugorzędowym roztworze przeciwciała w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Myć PBST przez 10 minut trzy razy.</li>
</ol>
8. Montaż
<ol>
	<li>Częściowo wysuszyć szkiełka w temperaturze pokojowej i zamontować za pomocą fluorescencyjnego medium montażowego. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia, a następnie zobrazuj w mikroskopie konfokalnym pod obiektywami 10X, 20X i 63X przy użyciu 4 różnych kanałów o następujących długościach fal wzbudzenia: 570 nm dla Fast Red, 488 nm dla FITC, 647 nm dla immunoznakowania Olig2 i 350 nm dla Hoechst.</li>
</ol>

<ol><li>Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cells+as+intrinsic+components+of+non-cell-autonomous+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease.</a> Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).</li>
<li>Baslow, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acetylaspartate+in+the+vertebrate+brain%3A+metabolism+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function.</a> Neurochem Res. 28 (6), 941-953 (2003).</li>
<li>Hoshino, H., Kubota, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canavan+disease%3A+clinical+features+and+recent+advances+in+research%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Int%22%5BJournal%5D)">Canavan disease: clinical features and recent advances in research.</a> Pediatr Int. 56 (4), 477-483 (2014).</li>
<li>Kaul, R., Gao, G. P., Balamurugan, K., Matalon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+the+human+aspartoacylase+cDNA+and+a+common+missense+mutation+in+Canavan+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Cloning of the human aspartoacylase cDNA and a common missense mutation in Canavan disease.</a> Nat Genet. 5 (2), 118-123 (1993).</li>
<li>Divry, P., Mathieu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspartoacylase+deficiency+and+N-acetylaspartic+aciduria+in+patients+with+Canavan+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Aspartoacylase deficiency and N-acetylaspartic aciduria in patients with Canavan disease.</a> Am J Med Genet. 32 (4), 550-551 (1989).</li>
<li>Bartalini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+diagnosis+of+Canavan+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Childs+Nerv+Syst%22%5BJournal%5D)">Biochemical diagnosis of Canavan disease.</a> Childs Nerv Syst. 8 (8), 468-470 (1992).</li>
<li>Moffett, J. R., Ross, B., Arun, P., Madhavarao, C. N., Namboodiri, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Acetylaspartate+in+the+CNS%3A+from+neurodiagnostics+to+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">N-Acetylaspartate in the CNS: from neurodiagnostics to neurobiology.</a> Prog Neurobiol. 81 (2), 89-131 (2007).</li>
<li>D'Adamo, A. F., Smith, J. C., Woiler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+occurrence+of+N-acetylaspartate+amidohydrolase+%28aminoacylase+II%29+in+the+developing+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The occurrence of N-acetylaspartate amidohydrolase (aminoacylase II) in the developing rat.</a> J Neurochem. 20 (4), 1275-1278 (1973).</li>
<li>Bhakoo, K. K., Craig, T. J., Styles, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+regional+distribution+of+aspartoacylase+in+rat+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Developmental and regional distribution of aspartoacylase in rat brain tissue.</a> J Neurochem. 79 (1), 211-220 (2001).</li>
<li>Sommer, A., Sass, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+aspartoacylase+%28ASPA%29+and+Canavan%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Expression of aspartoacylase (ASPA) and Canavan.</a> Gene. 505 (2), 206-210 (2012).</li>
<li>Klugmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+distribution+of+aspartoacylase+in+the+postnatal+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Identification and distribution of aspartoacylase in the postnatal rat brain.</a> Neuroreport. 14 (14), 1837-1840 (2003).</li>
<li>Madhavarao, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+localization+of+aspartoacylase+in+the+rat+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical localization of aspartoacylase in the rat central nervous system.</a> J Comp Neurol. 472 (3), 318-329 (2004).</li>
<li>Hershfield, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspartoacylase+is+a+regulated+nuclear-cytoplasmic+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Aspartoacylase is a regulated nuclear-cytoplasmic enzyme.</a> Faseb J. 20 (12), 2139-2141 (2006).</li>
<li>Moffett, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+aspartoacylase+expression+in+the+rat+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Extensive aspartoacylase expression in the rat central nervous system.</a> Glia. 59 (10), 1414-1434 (2011).</li>
<li>Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Kallarakal, A. T., Namboodiri, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspartoacylase+is+restricted+primarily+to+myelin+synthesizing+cells+in+the+CNS%3A+therapeutic+implications+for+Canavan+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Mol+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Aspartoacylase is restricted primarily to myelin synthesizing cells in the CNS: therapeutic implications for Canavan disease.</a> Brain Res Mol Brain Res. 107 (2), 176-182 (2002).</li>
<li>Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Namboodiri, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+increase+of+aspartoacylase+in+oligodendrocytes+parallels+CNS+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Dev+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Developmental increase of aspartoacylase in oligodendrocytes parallels CNS myelination.</a> Brain Res Dev Brain Res. 140 (1), 105-115 (2003).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-sequencing+transcriptome+and+splicing+database+of+glia%2C+neurons%2C+and+vascular+cells+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex.</a> J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Protokół ten zapewnia procedurę krok po kroku dla podwójnej hybrydyzacji RNA in situ , a następnie barwienia immunologicznego. Użyliśmy tego protokołu, aby potwierdzić, że Aspa ulega ekspresji w dojrzałych oligodendrocytach w kilku obszarach mózgu.
Ta wieloetapowa procedura ma wiele potencjalnych pułapek, które mogą wpływać na wrażliwość i należy ich unikać. Po pierwsze, wszystkie roztwory i magazynujące dla reakcji transkrypcji muszą być wolne od RNazy. Po drugie, wybór matr...

Komórki glejowe, które są najliczniejszymi komórkami w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), obejmują oligodendrocyty (komórki mielinizujące OUN), prekursory oligodendrocytów (OP, znane również jako "komórki NG2"), astrocyty i mikroglej. Rośnie zainteresowanie funkcjami komórek glejowych i ich potencjalną rolą w chorobach neurologicznych1. Na przykład choroba Canavan (CD) jest dziedziczną chorobą neurodegeneracyjną rozpoczynającą się we wczesnym dzieciństwie z gąbczastą leukodystrofią i postępującą utratą neuronów, prowadzącą do śmierci zwykle przed 10 rokiem życia2,3. Zidentyfikowano mutacje w genie aspartoacyklazy (ASPA), które prowadzą do drastycznego zmniejszenia aktywności ASPA4 w CD. ASPA jest enzymem katalizującym deacetylację N-acetyloasparaginianu (NAA), cząsteczki silnie skoncentrowanej w mózgu, wytwarzającej octan i asparaginian 5-7. Wielu pacjentów z CD wykazuje wyższy poziom NAA z powodu braku aktywności ASPA. Niektóre badania spekulują, że octan pochodzący z NAA może być głównym źródłem kwasów tłuszczowych / lipidów w mózgu podczas rozwoju, a CD może wynikać ze zmniejszonej syntezy mieliny podczas rozwoju spowodowanej niepowodzeniem w rozkładzie NAA3,5,6.
ASPA znajduje się głównie w nerkach, wątrobie i istocie białej mózgu, a biorąc pod uwagę ważną rolę ASPA w CD, ekspresja komórkowa tego enzymu w mózgu została zbadana przez kilka laboratoriów. Przyglądając się aktywności enzymatycznej ASPA w mózgu, wcześniejsze badania wykazały, że wzrost aktywności ASPA podczas rozwoju mózgu przebiega równolegle z przebiegiem czasowym mielinizacji 8-10. Na poziomie komórkowym testy aktywności enzymatycznej, a także analizy hybrydyzacji in situ (ISH) i immunohistochemii (IHC) sugerują, że ASPA ulega ekspresji głównie w oligodendrocytach w mózgu, ale nie w neuronach lub astrocytach11-16. Kilka badań wykazało, że ASPA może być również wyrażana w mikrogleju w OUN12,14. Dotychczasowe dane dotyczące wyrażania ASPA w PO są ograniczone. Zgodnie z niedawnym badaniem, w którym transkryptomy różnych typów komórek w korze mózgowej myszy, w tym neuronów, astrocytów, OP, nowo powstałych oligodendrocytów, oligodendrocytów mielinizujących, mikrogleju, komórek śródbłonka i perycytów analizowano za pomocą sekwencjonowania RNA17, ASPA ulega ekspresji wyłącznie w oligodendrocytach, w szczególności w oligodendrocytach mielinujących (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). Pomimo tych badań nad ASPA wzorca ekspresji w mózgu, pozostaje szereg niewiadomych.
Różne techniki mogą być używane do badania wzorców ekspresji genów. IHC jest powszechnie stosowaną metodą wykrywania funkcjonalnego produktu (tj. białka) ekspresji genu w skrawkach tkanki. Pomimo dużej użyteczności, technika ta ma ograniczenia, ponieważ jej zastosowanie i swoistość zależą od dostępności i swoistości potrzebnego przeciwciała. Dla porównania, ISH ma tę zaletę, że jest w stanie ujawnić ekspresję dowolnego genu na poziomie mRNA. Jednak użycie kilku sond w tym samym czasie w celu zlokalizowania ekspresji genu w określonych typach komórek może być technicznie trudne. W artykule opisano protokół łączący hybrydyzację in situ RNA z podwójną fluorescencją z immunoznakowaniem fluorescencyjnym białka. Użyliśmy tego zestawu technik do zbadania wzorca ekspresji Aspa w mózgu myszy. Metoda ta pozwala na precyzyjne badanie ekspresji genów za pomocą mikroskopii konfokalnej.

<table><tbody><tr><td>QIAprep Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Dejonizowany formamid</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td>do buforu blokującego ISH</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>VWR International</td><td>20252.290</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy bezwodny</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy dwuwodny</td><td>Sigma</td><td>30435</td><td></td></tr><tr><td>Drożdże tRNA</td><td>Roche</td><td>10109495001</td><td></td></tr><tr><td>50x roztwór Denhardta</td><td>Life Technologies</td><td>750018</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan dekstranu</td><td>Sigma</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Aspa klon cDNA</td><td>Źródło: Bioscience</td><td>IRAVp968C0654D</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0138</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony fenol</td><td>Sigma</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izoamylowy</td><td>Aldrich</td><td>496200</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR International</td><td>20821.321</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA polimeraza</td><td>Promega</td><td>P4074</td><td></td></tr><tr><td>Bufor transkrypcyjny</td><td>Promega</td><td>P118B</td><td></td></tr><tr><td>100 mM DTT</td><td>Promega</td><td>P117B</td><td></td></tr><tr><td>UTP-DIG NTP mix</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>Rnasin</td><td>Promega</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>Fisher </td><td>005479470</td><td></td>naukowy</tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>59378</td><td></td></tr><tr><td>pirowęglan dietylu</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbitone</td><td>Animalcare Ltd</td><td>BN43054</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne</td><td>World Precision Instruments</td><td>15922</td><td></td></tr><tr><td>Igła o rozmiarze 25</td><td>Terumo</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Cole-Parmer Instrument Co., Ltd</td><td>WZ-07522-30</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do przysłony</td><td>Weiss</td><td>103227</td><td></td></tr><tr><td>pęseta nr 2</td><td>World Precision Instruments</td><td>500230</td><td></td></tr><tr><td>Coronal Brain Matrix</td><td>World Precision Instruments</td><td>RBMS-200C</td><td></td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>Personna Medical</td><td>PERS60-0138</td><td></td></tr><tr><td>OCT medium</td><td>Tissue tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat/mikrotom</td><td>Bright</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus szkiełka</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>Sigma</td><td>S4641</td><td>do 65 & stopni; C bufor do płukania</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7503</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>VWR International</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>Smith Scientific Ltd</td><td>2959</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie surowica</td><td>owcza Sigma</td><td>S2263</td><td></td></tr><tr><td>Długopis hydrofobowy</td><td>Cosmo Bio</td><td>DAI-PAP-S</td><td>1:500</td></tr><tr><td>&alpha;-FITC POD-przeciwciało sprzężone</td><td>Roche</td><td>11426346910</td><td></td></tr><tr><td>TSA&handel; Plus System fluoresceiny</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL741001KT</td><td>1:1,500</td></tr><tr><td>&alpha;-DIG AP-sprzężone</td><td>z</td> AP Roche <td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Szybkie czerwone tabletki</td><td>Roche</td><td>11496549001.22</td><td></td></tr> <tr><td>&micro; Filtr M</td><td>Millex</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Olig2 Mrówkojad królika</td><td>Millipore</td><td>AB9610</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg; 647-sprzężone &alfa;-królicze przeciwciało</td><td>Technologie życia</td><td>A-31573</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>bisBenzimide H 33258</td><td>sigma</td><td>B2883</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP2 konfokalne mikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

połączenie podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ z immunoznakowaniem w celu wykrycia ekspresji trzech genów w wycinkach mózgu myszy

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Wykrywanie ekspresji genów w różnych typach komórek mózgu, np. neuronach, astrocytach, oligodendrocytach, prekursorach oligodendrocytów i mikrogleju, może być utrudnione przez brak specyficznych pierwszorzędowych lub drugorzędowych przeciwciał do barwienia immunologicznego. Tutaj opisujemy protokół wykrywania ekspresji trzech różnych genów w tej samej sekcji mózgu za pomocą podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ z dwiema sondami specyficznymi dla genu, a następnie barwienia immunologicznego przeciwciałem o wysokiej specyficzności skierowanym przeciwko białku kodowanemu przez trzeci gen. Uważa się, że gen aspartoacyklazy (ASPA), którego mutacje mogą prowadzić do rzadkiej choroby istoty białej u ludzi - choroby Canavan - ulega ekspresji w oligodendrocytach i mikrogleju, ale nie w astrocytach i neuronach. Jednak dokładny wzorzec ekspresji ASPA w mózgu nie został jeszcze ustalony. Protokół ten pozwolił nam ustalić, że ASPA ulega ekspresji w podzbiorze dojrzałych oligodendrocytów i może być ogólnie stosowany w szerokim zakresie badań wzorców ekspresji genów.

Niniejszy artykuł opisuje metodę podwójnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (ISH) z następującym po niej immunoznakowaniem w przekrojach mózgu myszy. Krótki opis tego protokołu przedstawiono w Rysunek 1. Pierwszym krokiem była synteza sond specyficznych dla Aspa i Mbp (podstawowe białko mieliny)). Aby sprawdzić, czy sondy zostały zsyntetyzowane, niewielką alikwot każdej reakcji naniesiono na żel agarozy. Widoczne są słabo wyraźna liniowa matryca ora...

Lokalizacja ekspresji genów w określonych typach komórek może być trudna ze względu na brak specyficznych przeciwciał. W tym miejscu opisujemy protokół jednoczesnego potrójnego wykrywania ekspresji genów poprzez połączenie hybrydyzacji in situ RNA z podwójną fluorescencją z barwieniem immunologicznym.

Połączenie podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ z immunoznakowaniem w celu wykrycia ekspresji trzech genów w wycinkach mózgu myszy

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest jednoczesne wykrycie ekspresji trzech różnych genów w przekrojach mózgu, przy użyciu podwójnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ, a następnie immunobarwienia. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neuronauki, takie jak: który typ komórki wykazuje ekspresję badanego genu? Główną zaletą tej techniki jest fakt, że aby zlokalizować ekspresję badanego genu w konkretnym typie komórek, nie jest wymagane posiadanie wysokiej jakości przeciwciała przeciwko temu genowi.Podsumowując tę procedurę: pierwszego dnia wycina się utrwalone przekroje tkanek i poddaje je hybrydyzacji z dwiema różnie znakowanymi sondami RNA przez noc. Drugiego dnia przekroje inkubuje się przez noc z przeciwciałem skierowanym przeciwko sondzie znakowanej FITC. Przeciwciało to jest sprzężone z peroksydazą chrzanową, która trzeciego dnia katalizuje przyłączanie fluorescencyjnej tyramidy.Następnie stosuje się przeciwciało sprzężone z fosfatazą alkaliczną, aby skierować je przeciwko sondzie znakowanej DIG. Czwartego dnia enzym ten katalizuje tworzenie fluorescencyjnego osadu podczas inkubacji z roztworem Fast Red. Następnie przekroje inkubuje się przez noc z

combining-double-fluorescence-situ-hybridization-with-immunolabelling

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół opisuje niepromienną procedurę hybrydyzacji in-situ, która umożliwia jednoczesną identyfikację dwóch gatunków transkryptów z rozdzielczością pojedynczych komórek w cienkich przekrojach mózgu kręgowców.

Podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w świeżych przekrojach mózgu

Przedstawiono kombinację różnych technik w celu maksymalizacji zakresu gromadzonych danych z tkanki mysiej.

Łączenie barwnika lipofilowego, hybrydyzacji in situ, immunohistochemii i histologii

Źródło: Jolly, S., et.al. Połączenie podwójnej fluorescencji  hybrydyzacji in situ z immunoznakowaniem w celu wykrycia ekspresji trzech genów w sekcjach mózgu myszy. J. Vis. Exp. (2016). Ten film demonstruje zastosowanie hybrydyzacji in situ z podwójną fluorescencją do wizualizacji ekspresji dwóch celów RNA w sekcjach mózgu myszy. Protokół obejmuje sekwencyjne wykrywanie RNA za pomocą sond znakowanych izotiocyjanianem fluoresceiny i digoksygeniną, a następnie enzymatyczne wzmacnianie sygnału w...

 Wykonywanie podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ w celu wykrycia ekspresji genów w skrawkach mózgu myszy

Źródło: Baleriola, J.,  et. al., Wykrywanie aksonalnie zlokalizowanych mRNA w sekcjach mózgu przy użyciu hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości.  J. Vis. Exp. (2015)Ten film demonstruje wykrywanie mRNA w aksonach cholinergicznych w utrwalonych mysich wycinkach hipokampa przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i barwienia przeciwciałami. Mikroskopia fluorescencyjna ujawnia przestrzenną lokalizację znakowanych sondą mRNA i acetylotransferazy choliny w neuronach cholinergicznych.

Barwienie immunologiczne neuronów w wycinkach mózgu myszy po fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

Ten protokół wprowadzający opisuje odczynniki, sprzęt i techniki wymagane do przeprowadzenia immunohistochemicznego barwienia mózgów gryzoni, używając jako przykładu markerów dla mikrogleju i elementów neuronalnych.

Podstawa immunohistochemii na kriowyciętej tkance mózgowej szczura: przykładowe barwienie mikrogleju i neuronów

Ten artykuł wideo ilustruje kompleksowy protokół do wykrywania i ilościowego określania wszystkich etapów neurogenezy dorosłego hipokampa w obrębie tego samego odcinka tkanki. Opracowaliśmy metodę przezwyciężania ograniczeń pośredniej immunofluorescencji mnogiej, które powstają, gdy odpowiednie przeciwciała od różnych gatunków gospodarzy są niedostępne.

Immunohistochemia i wielokrotne znakowanie przeciwciałami od tego samego gatunku gospodarza w celu zbadania neurogenezy hipokampa u dorosłych

Opisujemy wielozadaniową procedurę chromogenicznej hybrydyzacji in situ (MC-WISH) w nienaruszonych zarodkach Drosophila, pozwalającą na jednoczesne i specyficzne wykrywanie trzech różnych wzorców dystrybucji mRNA poprzez kontrastujące kolorowe osady.

Wielozadaniowa chromogenna hybrydyzacja in situ w całości do porównania domen ekspresji genów w zarodkach Drosophila

Ten protokół opisuje metodę łączenia fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) i immunohistochemii fluorescencji (IHC) zarówno w świeżo mrożonych, jak i stałych sekcjach mózgu myszy, w celu uzyskania wieloznakowego sygnału FISH i fluorescencji IHC. IHC celował w białka cytoplazmatyczne i przyłączone do błony.

Połączenie hybrydyzacji fluorescencji in situ multipleksowej z immunohistochemią fluorescencyjną na świeżo zamrożonych lub utrwalonych wycinkach mózgu myszy

Możliwość trwałego oznaczania komórek macierzystych i ich potomstwa za pomocą fluoroforu za pomocą indukowalnej linii myszy śledzącej transgeniczną linię genealogiczną pozwala na przestrzenną i czasową analizę aktywacji, proliferacji, migracji i/lub różnicowania in vivo. Śledzenie linii może ujawnić nowe informacje na temat zaangażowania w linię, odpowiedzi na interwencję (interwencje) i multipotencji.

Śledzenie linii indukowalnych fluorescencyjnie znakowanych komórek macierzystych w mózgu dorosłej myszy

Iteracyjna hybrydyzacja in situ wspomagana ekspansją (EASI-FISH) to solidna technika, która łączy mikroskopię ekspansywną z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu wykrycia ekspresji wielu genów w grubej tkance. Protokół ten przedstawia ostatnie postępy w metodzie i jej adaptacji do znakowania nienaruszonego ośrodkowego układu nerwowego Drosophila.

Multipleksowe wykrywanie ekspresji genów w nienaruszonym mózgu Drosophila przy użyciu iteracyjnej fluorescencji in situ wspomaganej ekspansją

Poznaj metodę podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ z immunoznakowaniem do wykrywania trzech genów w tkance mózgu myszy. Technika umożliwia lokalizację ekspresji genów bez konieczności stosowania przeciwciał.

Połączenie podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ z immunoznakowaniem w celu wykrycia ekspresji trzech genów w wycinkach mózgu myszy (Wideo) | JoVE Journal

Połączenie podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ z immunoznakowaniem w celu wykrycia ekspresji trzech genów w wycinkach mózgu myszy

Przeglądaj więcej filmów