Optyczna koherentna tomografia myszy o ultrawysokiej rozdzielczości wspomagająca wstrzyknięcie do gałki ocznej w badaniach nad terapią genową siatkówki

Ogólnym celem tej procedury iniekcji podsiatkówkowej jest dostarczenie wektora do siatkówki w minimalnie inwazyjny i powtarzalny sposób, który można obserwować w czasie rzeczywistym. Witam, ta metoda może być wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad terapią genową dotyczące skuteczności dostarczania wektorów i toksyczności środków terapeutycznych. Niektóre zalety tej techniki obejmują minimalne uszkodzenia siatkówki i innych struktur oka, precyzyjne mapowanie miejsca wstrzyknięcia oraz rygorystyczne ilościowe pomiary in vivo, które pozwalają na solidne wnioskowanie statystyczne.

W przypadku wewnątrzgałkowego wstrzyknięcia transgenu najpierw umieść znieczuloną mysz na stoliku obserwacyjnym mikroskopu systemu obrazowania siatkówki i umieść końcówki sterylnych kleszczyków tęczówki w pozycjach godziny siódmej i 10 powieki, jednocześnie popychając kleszcze do przodu i do dołu, aby delikatnie wywołać wytrzeszcz. Użyj kleszczy, aby nakłonić powieki pod gałką oka i skieruj końcówkę igły na około jeden do 1,5 milimetra poniżej krawędzi rąbka rogówki. Następnie nanieść kroplę sterylnego roztworu PBS na oko i przykryć oko sterylnym szkiełkiem nakrywkowym.

Ostrożnie wbij igłę w oko przez spojówkę, aż powstanie zagłębienie twardówkowe. Użyj mikromanipulatora, aby obrócić oko w górę, aż zagłębienie twardówki będzie ostre, a następnie wbij igłę do przodu, aby końcem igły utworzyć ostry szczyt w siatkówce. Za pomocą uchwytu igły obracać igłę tylko do momentu, gdy końcówka igły przebije się przez twardówkę i RPE, dzięki czemu flouresceina w końcówce igły będzie widoczna pod tkanką siatkówki w bezpośrednim sąsiedztwie przestrzeni podsiatkówkowej i monowarstwy komórek nabłonka barwnikowego siatkówki.

Wbić końcówkę igły w dół, tak aby była styczna do kuli ziemskiej, a następnie uruchomić pompę wtryskową za pomocą przełącznika nożnego. Po dostarczeniu 0,5 do jednego mikrolitra roztworu transgenu do przestrzeni podsiatkówkowej należy wyjąć igłę i upewnić się, że krew jest stabilna i że płyn nie wycieka z miejsca wstrzyknięcia. Aby potwierdzić powodzenie wstrzyknięcia, należy zarejestrować prostokątną objętość OCT i porównać obrazy z obrazami różnych rodzajów potencjalnych wyników wstrzyknięcia.

Po potwierdzeniu prawidłowego umieszczenia wstrzyknięcia, użyj tego prostokątnego obrazu OCT, aby odwzorować zasięg pęcherzyka na obrazie dna oka. Aby zmapować zasięg pęcherzyka podsiatkówkowego, otwórz prostokątny obraz OCT o objętości pęcherzyka, tak aby na obrazie znalazł się rozpoznawalny punkt orientacyjny w oku. Dodaj tyle suwmiarek, ile jest konieczne, aby zidentyfikować położenie lewej i prawej krawędzi skanu B, a także głowy nerwu wzrokowego, ONH, jeśli jest obecny, oraz punktu przegięcia, w którym siatkówka odłącza się od RPE i naczyniówki, a następnie zapisz dane.

Następnie skompiluj zapisane pliki i wykreśl dane, skutecznie tworząc mapę pęcherzyka iniekcyjnego na obrazie OCT en face. Nałóż wykreślone dane na obraz dna oka zawierający miejsce wstrzyknięcia i zapisz scalony obraz. Użyj tego obrazu, aby zlokalizować obszary zainteresowania podczas kontrolnego obrazowania OCT.

Aby ocenić zwyrodnienie siatkówki po wstrzyknięciu, najpierw otwórz zarejestrowany obraz prostokątnej objętości OCT lub HRSD OCT w domenie widmowej o wysokiej rozdzielczości i wybierz skan B, który ma zostać zmierzony. Powiększ wybrany obraz, aż wypełni ekran i kliknij go prawym przyciskiem myszy. Kliknij suwmiarki, aby wybrać odpowiednią liczbę suwmiarki, a następnie użyj funkcji konfiguracji suwmiarki, aby przypisać suwmiarki jako pionowe w kolumnie bloku kąta i włącz lokalizację suwmiarki na wyświetlaczu, aby ułatwić równomierne umieszczenie suwmiarki w siatkówce.

Kliknij Zastosuj i przesuń każdą suwmiarkę w odpowiednie miejsce w odległości od 0,1 do 0,2 milimetra od siebie w poprzek skanu B, uważając, aby w razie potrzeby umieścić jedną suwmiarkę na środku głowy nerwu wzrokowego. Po umieszczeniu wszystkich suwmiarki kliknij i przeciągnij każdą suwmiarkę do zakresu długości obszaru zainteresowania, arbitralnie ustawiając suwmiarki, które nie nakładają się na mierzalne obszary skanu B, na maksymalną długość. Aby zmierzyć grubość zewnętrznej warstwy jądrowej, umieść górną część każdej suwmiarki na zewnętrznej membranie ograniczającej, a spód każdej suwmiarki na dole zewnętrznej warstwy splotowatej w odstępach od 0,1 do 0,2 milimetra w poprzek siatkówki.

Po umieszczeniu wszystkich suwmiarki i dopasowaniu ich do rozmiaru, kliknij prawym przyciskiem myszy obraz i kliknij Zapisz dane suwmiarki"następnie powtórz pomiary, jak właśnie pokazano dla co dziesiątego skanu B, trzymając suwmiarki otwarte i w tym samym miejscu na osi x i dostosuj długości suwmiarki w razie potrzeby, bez przesuwania ich w kierunku x. Po zmierzeniu wszystkich skanów otwórz zapisane pliki danych i kliknij datę modyfikacji"aby ułożyć pliki według zaoszczędzonego czasu. Otwórz wszystkie pliki dla każdego zmierzonego skanu B i skompiluj nieprzetworzone dane z każdego skanu B w jeden plik od najniższego do najwyższego numeru klatki i wybierz kolumny danych, w tym nazwę suwmiarki, długość i środkowe kolumny X.

Upewnij się, że środek X jest taki sam dla wszystkich skanów B zmierzonych dla każdego przetworzonego obrazu OCT o prostokątnej objętości i usuń wszelkie dane z suwmiarki, które nie były używane do rejestrowania pomiarów. Ustaw suwmiarkę znajdującą się w środku głowy nerwu wzrokowego na zero i wykreśl dane dla X w porównaniu z wieloma zestawami danych Y, aby uzyskać funkcję wykresu 3D dla grubości zewnętrznej warstwy jądrowej lub dowolnej innej zmierzonej warstwy siatkówki. Następnie porównaj pomiary zewnętrznej warstwy jądrowej między zwierzętami kontrolnymi i doświadczalnymi w odpowiednim wieku, aby określić tempo i jednorodność potencjalnego zwyrodnienia siatkówki.

Aby uzyskać mapowanie 3D pomiarów siatkówki, przejrzyj obrazy OCT po wstrzyknięciu i zanotuj wszelkie możliwe do zidentyfikowania punkty orientacyjne, a następnie ustaw zwierzę tak, aby uzyskać uzupełniający obraz CT SDO z tego samego regionu, zwracając uwagę, aby uwzględnić te same możliwe do zidentyfikowania punkty orientacyjne, i przetwarzaj zarejestrowane obrazy, jak właśnie pokazano. Bardzo ważne jest uzyskanie wysokiej jakości obrazów OCT, które zawierają możliwe do zidentyfikowania punkty orientacyjne, aby ułatwić ponowne zobrazowanie wcześniej wstrzykniętych obszarów siatkówki. W celu zmierzenia zmian długości OS, suwmiarki umieszczono od zewnętrznej membrany ograniczającej do membrany Brooks, co pozwoliło na wiarygodne pomiary, ponieważ warstwy te można łatwo zidentyfikować na obrazach OCT.

Różnice w pomiarach między tymi warstwami z różnych linii myszy przypisano krótszym długościom segmentów zewnętrznych. Jeśli wstrzyknięcie podsiatkówkowe zostanie wykonane pomyślnie, otwarcie przestrzeni podsiatkówkowej indukuje wytwarzanie pęcherzyka, który można wyraźnie zwizualizować zarówno w widoku en face imagera HRSD OCT, jak i na obrazach skanowania B. Nałożenie mapy granicznej miejsca wstrzyknięcia umożliwia segmentację pomiarów tkanki siatkówki i zestawów danych dotyczących położenia suwmiarki, aby umożliwić późniejsze badania statystyczne wpływu określonych środków terapeutycznych na zwyrodnienie siatkówki.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dziesięciu minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o utrzymaniu środowiska chirurgicznego w czystości i sterylności. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się terapią genową do monitorowania całego procesu chirurgicznego wstrzykiwania podsiatkówkowego w czasie rzeczywistym i stworzyła sposób na natychmiastowe określenie sukcesu chirurgicznego in vivo.

Po tej procedurze wstrzyknięcia, OCT i inne metody, takie jak elektroretinografia, mogą być wykonane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące funkcjonalnego ratowania i/lub toksyczności transgenu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś wiedzieć, jak wykonywać iniekcje podskórne przeztwardówkowe i przeznaczyniówkowe, jak odwzorować zakres wstrzyknięcia na OCT na podstawie tego obrazu i uzyskać rygorystyczne pomiary zewnętrznych warstw siatkówki. Nie zapominaj, że praca z wektorami terapii genowej może być niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej.