Name: Optyczna koherentna tomografia myszy o ultrawysokiej rozdzielczości wspomagająca wstrzyknięcie do gałki ocznej w badaniach nad terapią genową siatkówki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Poznaj metodę wstrzyknięcia podsiatkówkowego wspomaganą optyczną koherentną tomografią wysokiej rozdzielczości u myszy. Technika umożliwia obserwację w czasie rzeczywistym dostarczania wektorów terapii genowej siatkówki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten materiał jest oparty na pracy częściowo wspieranej przez Departament Spraw Weteranów (VA), Administrację Zdrowia Weteranów, Biuro Badań i Rozwoju (Badania i Rozwój Laboratorium Biomedycznego) (VA Merit Grant 1I01BX000669). JMS jest zatrudniony, częściowo, jako lekarz-naukowiec w okulistyce przez VA WNY; MCB jest częściowo zatrudniony przez VA WNY. Badanie zostało przeprowadzone i częściowo wspierane przez Veterans Administration Western New York Healthcare System (Buffalo, NY). Treści nie reprezentują poglądów Departamentu ds. Weteranów ani rządu Stanów Zjednoczonych. Wspierany również w dużej części przez grant NIH/NEI R01 EY013433 (PI: JMS), GRANT NIH/NEI R24 EY016662 (UB Vision Infrastructure Center, kierownik projektu: M Slaughter, dyrektor modułu biofotoniki: JMS), nieograniczony grant dla Wydziału Okulistyki/Uniwersytetu w Buffalo z Research to Prevent Blindness (Nowy Jork, NY) oraz grant z Fundacji Oishei (Buffalo, Nowy Jork). Przyjmujemy dar transgenicznej linii RHOP347S hC1 i nokaut RHO myszy eksonu 1 od dr Janis Lem (Tufts New England Medical Center, Boston, MA) oraz dar modelu transgenu NHR-E w stanie heterozygotycznym na tle nokautu RHO eksonu myszy 2 od dr G. Jane Farrar i Petera Humphriesa (Trinity College, Dublin, IRE).

<ol><li>Regus-Leidig, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+knockdown+of+Piccolino+disrupts+presynaptic+ribbon+morphology+in+mouse+photoreceptor+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In-vivo knockdown of Piccolino disrupts presynaptic ribbon morphology in mouse photoreceptor synapses.</a> Front Cell Neurosci. 8 (259), 1-13 (2014).</li>
<li>Jiang, L., Frederick, J. M., Baehr, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+gene+therapy+in+dominant+retinitis+pigmentosa+and+cone-rod+dystrophy+mouse+models+caused+by+GCAP1+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">RNA interference gene therapy in dominant retinitis pigmentosa and cone-rod dystrophy mouse models caused by GCAP1 mutations.</a> Front Mol Neurosci. 7 (25), 1-8 (2014).</li>
<li>Seo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+gene+therapy+of+mice+with+Bardet-Beidl+Syndrome+Type-1%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Subretinal gene therapy of mice with Bardet-Beidl Syndrome Type-1.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6118-6132 (2013).</li>
<li>Molday, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RD3+gene+delivery+restores+guanylate+cyclase+localization+and+rescues+photoreceptors+in+the+RD3+mouse+model+of+Leber+congenital+amaurosis+12%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">RD3 gene delivery restores guanylate cyclase localization and rescues photoreceptors in the RD3 mouse model of Leber congenital amaurosis 12.</a> Hum. Mol. Genet. 22 (19), 3894-3905 (2014).</li>
<li>Pang, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-mediated+gene+therapy+in+mouse+models+of+recessive+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">AAV-mediated gene therapy in mouse models of recessive retinal degeneration.</a> Curr. Mol. Med. (3), 316-330 (2012).</li>
<li>Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21993172">Novel adeno-associated viral vectors for retinal gene therapies.</a> Gene Ther. 19 (2), 162-168 (2012).</li>
<li>Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+risks+related+to+the+use+of+adeno-associated+virus-based+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors.</a> Curr. Gene Ther. 3 (6), 545-565 (2003).</li>
<li>Parikh, S., Le, A., Davenport, J., Gorin, M. B., Nusinowitz, S., Matynia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+and+validated+injection+method+for+accessing+the+subretinal+space+via+a+transcleral+posterior+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An alternative and validated injection method for accessing the subretinal space via a transcleral posterior approach.</a> J. Vis. Exp. (118), e54808(2016).</li>
<li>Bainbridge, J. W. B., Mistry, A. R., Thrasher, A. J., Ali, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+ocular+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Science%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for ocular angiogenesis.</a> Clinical Science. 104, 561-575 (2003).</li>
<li>Igarashi, T., Miyake, K., Asakawa, N., Miyake, N., Shimada, T., Takahashi, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23489150">Direct comparison of administration routes for AAV-8 mediated ocular gene therapy.</a> Curr. Eye Res. 38 (5), 569-577 (2013).</li>
<li>Bennett, J., Duan, D., Engelhardt, J. F., Maguire, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+noninvasive+in+vivo.assessment+of+adeno-associated+virus-mediated+retinal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Real-time noninvasive in vivo.assessment of adeno-associated virus-mediated retinal transduction.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 38, 2857-2863 (1997).</li>
<li>Ruggeri, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17389515">In vivo three-dimensional high-resolution imaging of the rodent retinal with spectral-domain optical coherence tomography.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (4), 1808-1814 (2007).</li>
<li>Berger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+domain+optical+coherence+tomography+of+the+rodent+eye%3A+highlighting+layers+of+the+outer+retina+using+signal+averaging+and+comparison+with+histology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Spectral domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology.</a> PLoS One. 9 (5), 96494(2014).</li>
<li>Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+mouse+retinal+layers+using+automated+segmentation+of+spectral+domain+optical+coherence+tomography+images%5BTitle%5D)+AND+%22TVST%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of mouse retinal layers using automated segmentation of spectral domain optical coherence tomography images.</a> TVST. 4 (4), 9(2015).</li>
<li>Bhootada, Y., Choudhury, S., Gully, C., Gorbatyuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+caspase-12+to+preserve+vision+in+mice+with+inherited+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Targeting caspase-12 to preserve vision in mice with inherited retinal degeneration.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56, 4725-4733 (2015).</li>
<li>Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+injection+of+gene+therapy+vectors+and+stem+cells+in+the+perinatal+mouse+eye%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye.</a> J. Vis. Exp. (69), e4286(2012).</li>
<li>Berger, A., al,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral-domain+optical+coherence+tomography+of+the+rodent+eye%3A+highlighting+layers+of+the+outer+retina+using+signal+averaging+and+comparison+with+histology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoSOne%22%5BJournal%5D)">Spectral-domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology.</a> PLoSOne. 9 (5), 96494(2014).</li>
<li>Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+technique+for+subretinal+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Optimized technique for subretinal injections in mice.</a> Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. (2013).</li>
<li>Sarra, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0042698901002309">Kinetics of transgene expression in mouse retina following subretinal injection of recombinant adeno-associated virus.</a> Vision Res. 42, 541-549 (2002).</li>
<li>Yan, Q. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-corneal+subretinal+injection+in+mice+and+its+effect+on+the+function+and+morphology+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina.</a> PLoS One. 10 (8), 0136523(2015).</li>
<li>Park, S. W., Kim, J. H., Park, W. J., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+approach-subretinal+injection+of+viral+vectors+for+gene+therapy+in+mice+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Limbal approach-subretinal injection of viral vectors for gene therapy in mice retinal pigment epithelium.</a> J. Vis. Exp. (102), e53030(2015).</li>
<li>Westenskow, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performing+subretinal+injections+in+rodents+to+deliver+retinal+pigment+epithelium+cells+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Performing subretinal injections in rodents to deliver retinal pigment epithelium cells in suspension.</a> J. Vis. Exp. (95), e52247(2015).</li>
<li>Butler, M. C., Sullivan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+real-time%2C+in+vivo+mouse+retinal+imaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">A novel, real-time, in vivo mouse retinal imaging system.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (12), 7159-7168 (2015).</li>
<li>Rolling, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+adeno-associated+virus-mediated+gene+transfer+into+the+rat+retina+by+clinical+fluorescence+photography%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Evaluation of adeno-associated virus-mediated gene transfer into the rat retina by clinical fluorescence photography.</a> Hum. Gene Ther. 10, 641-648 (1999).</li>
<li>Ferguson, L. R., Grover, S., Dominguez, J. M., Balaiya, S., Chalam, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+thickness+measurement+obtained+with+spectral+domain+optical+coherence+tomography+assisted+optical+biopsy+accurately+correlates+with+ex+vivo+histology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Retinal thickness measurement obtained with spectral domain optical coherence tomography assisted optical biopsy accurately correlates with ex vivo histology.</a> PLoS One. 9 (10), 111203(2014).</li>
<li>Li, T., Snyder, W. K., Olsson, J. E., Dryja, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+carrying+the+dominant+rhodopsin+mutation+P347S%3A+evidence+for+defective+vectorial+transport+of+rhodopsin+to+the+outer+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice carrying the dominant rhodopsin mutation P347S: evidence for defective vectorial transport of rhodopsin to the outer segments.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 14176-14181 (1996).</li>
<li>Brill, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2248236/">A novel form of transducin-dependent retinal degeneration: accelerated retinal degeneration in the absence of rod transducing.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 5445-5453 (2007).</li>
<li>Olsson, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+with+a+rhodopsin+mutation+%28Pro23His%29%3A+a+mouse+model+of+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice with a rhodopsin mutation (Pro23His): a mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> Neuron. 9, 815-830 (1992).</li>
<li>Humphries, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinopathy+induced+in+mice+by+targeted+disruption+of+the+rhodopsin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Retinopathy induced in mice by targeted disruption of the rhodopsin gene.</a> Nat. Genet. 15, 216-219 (1997).</li>
<li>Hruby, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13155497">Clinical examination of the vitreous body.</a> Proc. Roy. Soc. Med. 47, 163-170 (1953).</li>
<li>Kolniak, T. A., Sullivan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cell-based+toxicity+screen+of+potentially+therapeutic+post-transcriptional+gene+silencing+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">cell-based toxicity screen of potentially therapeutic post-transcriptional gene silencing agents.</a> Experimental Eye Research. 92, 328-337 (2011).</li>
<li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-corneal+subretinal+injection+in+mice+and+its+effect+on+the+function+and+morphology+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina.</a> PLoS One. 10 (8), 0136523(2015).</li>
<li>Timmers, A. M., Zhang, H., Squitieri, A., Gonzalez-Pola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+injections+in+rodent+eyes%3A+effects+on+electrophysiology+and+histology+of+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Subretinal injections in rodent eyes: effects on electrophysiology and histology of rat retina.</a> Mol. Vis. 7, 131-137 (2000).</li>
<li>Johnson, C. J., Berglin, L., Chrenek, M. A., Redmond, T. M., Boatright, J. H., Nickerson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+brief%3A+subretinal+injection+and+electroporation+into+adult+mouse+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Technical brief: subretinal injection and electroporation into adult mouse eyes.</a> Mol. Vis. 14, 2211-2226 (2008).</li>
<li>Sullivan, J. M., Yau, E. H., Taggart, R. T., Butler, M. C., Kolniak, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bottlenecks+in+development+of+therapeutic+post-transcriptional+gene+silencing+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Bottlenecks in development of therapeutic post-transcriptional gene silencing agents.</a> Vision Res. 48, 453-469 (2008).</li>
</ol>

Relacje handlowe: MCB: brak; JMS: Żadnych. System obrazowania siatkówki (RIS)23 zastosowany w tym badaniu jest nowatorskim urządzeniem o istotnym zastosowaniu dla każdej grupy dążącej do przeprowadzenia badań nad dostarczaniem terapii genowej u myszy, gryzoni lub małych zwierząt. Chociaż autorzy nie mają obecnie żadnych konfliktów do zadeklarowania w odniesieniu do tego urządzenia, Uniwersytet w Buffalo-SUNY i Administracja Weteranów mają prawa do własności intelektualnej i mogą dążyć do komercjalizacji tego instrumentu w przyszłości.

HR-SD-OCT zapewnia prostą metodę charakterystyki potencjalnych zwierzęcych modeli chorób u ludzi w celu określenia ich przydatności w testowaniu potencjalnych środków terapeutycznych. Zdolność do szybkiego i wiarygodnego scharakteryzowania potencjalnego zwierzęcego modelu choroby człowieka ma kluczowe znaczenie dla procesu odkrywania leków terapeutycznych (np. zastępcza terapia genowa, terapia genowa knockdown rybozymu lub shRNA, skojarzona terapia genowa). HR-SD-OCT zapewnia prostą, szybką i nieinwazyjną metodę...

Naukowcy opracowują terapie genowe dla różnych chorób zwyrodnieniowych siatkówki i siatkówki z nadzieją na przełożenie nowych metod leczenia chorób u ludzi1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Optyczna koherentna tomografia koherentna w dziedzinie czasu lub w domenie spektralnej (SD-OCT) została wykorzystana do zbadania aspektów zwyrodnienia zewnętrznej siatkówki w określonych mysich modelach choroby12,13,14. HR-SD-OCT nie był jednak szeroko stosowany w kontekście optymalizacji oceny modeli mysich w celu określenia szybkości i jednorodności przestrzennej zwyrodnienia siatkówki, ani w kontekście przedklinicznej oceny terapii opartej na genach, na przykład do oceny ratunku, toksyczności lub przestrzennego zasięgu dostarczania wektorów8,15,16. Gdy model mysi zostanie w pełni scharakteryzowany, dane HR-SD-OCT mogą służyć jako informacyjne i wiarygodne źródło do pomiaru wpływu środków terapeutycznych w celu wywarcia ratunku lub toksyczności w mysich modelach zwyrodnienia siatkówki17. Wiele grup stosuje iniekcję podsiatkówkową jako metodę dostarczania wektora ze względu na jej skuteczność w transdukcji fotoreceptorów i komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Jednak pozostaje to trudną do opanowania metodą, biorąc pod uwagę, że zwykle wykonuje się ją za pomocą operacji z wolnej ręki z powierzchni rogówki i często jest obarczona zaćmą, krwawieniem i niezamierzonymi odwarstwieniami siatkówki występującymi po prostu w wyniku manipulacji tylnego ciała szklistego. Wiele grup nadal próbuje wstrzykiwać podsiatkówkowo na ślepo i dostarcza wirusa za pomocą ręcznych zastrzyków za pomocą igieł ze stali nierdzewnej o stosunkowo dużej średnicy (34G)8,17,18,19,20,21,22, a kilka z nich wykorzystuje obrazowanie optycznej tomografii koherentnej (OCT) w celu potwierdzenia prawidłowego dostarczenia wektora do siatkówki8,17,20,22. Pewne ulepszenia w metodzie zostały ostatnio opisane przy użyciu igieł w mikroskali napędzanych przez mikromanipulator22.
Prezentujemy zintegrowane podejście, które pomaga w pozycjonowaniu igły, a zastrzyki są ułatwione przez specjalnie ukierunkowany stereoskopowy oftalmoskop zaprojektowany w laboratorium specjalnie do wizualizacji wnętrza małego oka myszy17,23. Użycie mikroigieł z wyciąganego szkła w połączeniu z mikromanipulatorem stereotaktycznym zapewnia lepszą kontrolę umieszczania igły bez konieczności chirurgicznego cięcia (tj. przez spojówki i tkankę łączną) przed wstrzyknięciem. Zastosowanie mikroiniektora o regulowanym ciśnieniu pomaga zapewnić stałą objętość wstrzyknięcia, a wstrzyknięcie może być wykonane ze znacznie większą stabilnością, precyzją i znacznie wolniej niż wstrzyknięcia ręczne wykonywane za pomocą ręcznej strzykawki, zmniejszając w ten sposób występowanie wstrzykiwania pęcherzyków do oka. Mniejsza igła pomaga zapobiegać wyciekom po wyjęciu igły, ponieważ ścieżka jest samouszczelniająca. Aby ocenić zakres wstrzyknięcia/dostarczenia, wiele grup badawczych polega na znalezieniu i ocenie powierzchniowego zakresu zwiększonej ekspresji białka zielonej fluorescencji (EGFP) w siatkówce (konstrukt ekspresji dostarczony przez wektor) w eksperymentalnym punkcie końcowym (eutanazja), aby potwierdzić udane wstrzyknięcia11,19,20,24. Takie podejście (bez wykorzystania OCT) do weryfikacji sukcesu chirurgicznego marnuje ogromną ilość zasobów w czasie zabiegów chirurgicznych i zwierzętach, ponieważ wszystkie zwierzęta z (nieznanymi) niepowodzeniami chirurgicznymi muszą być utrzymywane, a następnie poddawane powtarzalnym środkom aż do eutanazji i pobrania oczu (kiedy mierzy się EGFP). Potwierdzenie lokalizacji wstrzyknięcia w siatkówce można poprawić za pomocą HR-SD-OCT, aby wykazać, że wstrzyknięcie znajduje się między właściwymi warstwami siatkówki (tj. przestrzenią podsiatkówkową). HR-SD-OCT może być również używany do natychmiastowego określania nieudanych prób (niepowodzeń chirurgicznych) w celu zidentyfikowania odpowiednich zmiennych w rzeczywistym czasie chirurgicznym w celu ulepszenia podejścia. Stwierdziliśmy, że HR-SD-OCT zapewnia liczne korzyści w przedklinicznych badaniach terapii genowej, umożliwiając szybką ilościową ocenę zewnętrznego zwyrodnienia siatkówki, umożliwiając identyfikację/ubój badanych zwierząt, które nie spełniają kryteriów eksperymentalnych (np. nieprawidłowe wstrzyknięcie podsiatkówkowe) oraz kierując obrazowanie kontrolne do obszaru oka, w którym dostarczono wektor (gdzie efekt przedkliniczny jest najbardziej prawdopodobny), a także regionów kontrolnych, w których wektor nie został dostarczony. Od czasu jego opracowania, stosowanie SD-OCT jest nadal akceptowane i stosowane przez badaczy okulistyki i jest obecnie uważane za standard obrazowania siatkówki w badaniach naukowych siatkówki na modelach myszy lub gryzoni13,25. HR-SD-OCT i jego możliwości oprogramowania zostały wykorzystane w unikalny, zintegrowany sposób, aby osiągnąć cel, jakim jest skuteczna ilościowa terapia genowa w modelach mysich na każdym etapie procesu, w tym selekcji modelu zwierzęcego, charakterystyki zwyrodnienia w wybranych modelach choroby, dostarczania terapeutycznego, mapowania dostarczania wektorów oraz oceny toksyczności/skuteczności. Zastosowanie HR-SD-OCT pozwala na skuteczniejsze odkrywanie leków na każdym poziomie procesu. Tutaj opisujemy te podejścia, które są stosowane w naszym programie odkrywania leków RNA.

<table><tbody><tr><td>C57BL6 (J)</td> <td>Jackson Laboratories</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>N129R-N</td><td>/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>2HRho 1T/1T</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Envisu R-2200 Przyrząd do koherentnej koherentnej koherentności oka (OCT)</td><td>Bioptigen</td><td>90-R2200-U1-120.&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania siatkówki (RIS)</td><td>Własny</td> mikroskop <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000C</td><td>Zeiss</td><td>000000-1106-133</td><td></td></tr><tr><td>P-97 Ściągacz do mikropipet Flaming/Brown</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>p-97</td><td></td></tr><tr><td>MMN-33 mikromanipulator&nbsp;</td><td>Narishige USA</td><td>MMN-33</td><td></td></tr><tr><td>PLI-100&nbsp; mikrowtryskiwacz</td><td>Aparat Harvard</td><td>64-1736</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na mikropipety (obrotowy)</td><td>Wewnętrzny</td> pojemnik do przechowywania <td>mikropipet Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td></td><td>World Precision Instruments Inc.</td><td>E210</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Rurki kapilarne ze szkła borokrzemianowego 1,5-1,8 X 100mm,&nbsp;</td><td>Aparat Harvarda</td><td>30-0053</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-tribromoetanol</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>T48402-25G</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol tert-amylowy</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>240486-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan atropiny Roztwór okulistyczny, USP 1%</td><td>Akorn Inc.</td><td>NDC 17478-215-05</td><td></td></tr><tr><td>Goniovisc</td><td>BioVision Limited</td><td>NDC 17238-610-15</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór okulistyczny chlorowodorku cyklopentolanu, USP&nbsp; 2%</td><td>Akorn Inc.</td><td>NDC 17478-097-10</td><td></td></tr><tr><td>Maść siarczanowa gentamycyny USP, 0,1%</td><td>Perigo</td><td>NDC 45802-046-35</td><td></td></tr><tr><td>Systane Ultra</td><td>Alcon Laboratories, Inc.</td><td>9006619-1013</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek tetrakainy</td><td>Bausch i Lomb</td><td>NDC 24208-920-64</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór okulistyczny, USP 0,5%</td> <td>Bausch i Lomb</td><td>NDC 24208-920-64</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Preparaty wirusowe</td><td>ViGene /UNC</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Złote nanopręty</td><td>NANOPARTz</td><td>D12M-850-1.75</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan fluoresceiny AK-FLUOR 25%</td><td>Akorn Inc.</td><td>NDC 17478-250-20</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-A</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Milton</td><td>18-825</td><td></td></tr><tr><td>Igły 30 grubości</td><td>Beckton Dickenson&nbsp; &nbsp;</td><td>W11604</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki</td><td>Beckton Dickenson&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td>309659</tr><tr><td>Pakiet oprogramowania Bioptigen</td><td>Bioptigen</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek proparakainy Roztwór okulistyczny, USP 0.5%</td><td>Akorn Inc.</td><td>NDC 17478-263-12</td><td></td></tr><tr><td>Windows Excel</td><td>Microsoft</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skala</td><td>Mettler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Świat Instrumenty</td><td></td><td></td>Precyzyjne</tr><tr><td>Dziurkacz do uszu</td><td>Nat' l opaska</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CL 100 Źródło światła</td><td>Welch Allyn</td><td>CL100</td><td></td></tr><tr><td>Gaz</td> azotowy <td>Jackson Zasilanie spawalnicze</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewana kąpiel wodna</td><td>Neslab</td><td>RTE-140</td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzewcza</td><td>w domu</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Mata grzewcza</td><td>Cincinnatti Sub Zero</td><td>273</td><td></td></tr><tr><td>Gliniany uchwyt na mysz</td><td>Plast.i.clay Amerykańska sztuka gliniana Co.</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>MedLine&nbsp;</td><td>NDC53329-938-06</td><td></td></tr><tr><td>Aplikatory z bawełnianą końcówką</td><td>Amerykańska służba zdrowia</td><td>Ctag</td><td></td></tr><tr><td>EtOH 70%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-100</td><td></td></tr><tr><td>Rękawice Nitryl</td><td>VWR</td><td>89038-272</td><td></td></tr><tr><td>Diagnosys ERG Color Dome instrument</td><td>Diagnosys Inc.</td><td>D125</td><td></td></tr><tr><td>Soczewki kontaktowe</td><td>Własne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie Diagnosys Diagnosys</td><td>Inc.</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>oprogramowania Origin 6.1</td><td>OriginLab Corp.</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Elektrody referencyjne</td><td>Ocuscience</td><td>Elektroda z gwintem F (DTL) 24"</td><td></td></tr></tbody></table>

optyczna koherentna tomografia myszy o ultrawysokiej rozdzielczości wspomagająca wstrzyknięcie do gałki ocznej w badaniach nad terapią genową siatkówki

Ultrahigh Resolution Mouse Optical Coherence Tomography to Aid Intraocular Injection in Retinal Gene Therapy Research

HR-SD-OCT jest używany do monitorowania postępu degeneracji fotoreceptorów w żywych modelach mysich, oceny dostarczania środków terapeutycznych do przestrzeni podsiatkówkowej oraz do oceny toksyczności i skuteczności in vivo. HR-SD-OCT wykorzystuje światło bliskiej podczerwieni (800-880 nm) i ma optykę specjalnie zaprojektowaną dla unikalnej optyki oka myszy o rozdzielczości osiowej poniżej 2 mikronów. Transgeniczne mysie modele zwyrodnienia zewnętrznej siatkówki (fotoreceptorów) i grupy kontrolnej zostały zobrazowane w celu oceny postępu choroby. Wyciągnięte szklane mikroigły użyto do podania podsiatkówkowych iniekcji wirusa związanego z adenowirusem (AAV) lub nanocząstkami (NP) za pomocą podejścia przeztwardówkowego i przeznaczyniówkowego. Ostrożne umieszczenie igły w przestrzeni podsiatkówkowej było wymagane przed skalibrowanym wstrzyknięciem ciśnieniowym, które dostarcza płyn do przestrzeni podsiatkówkowej. Przeprowadzono operację podsiatkówkową w czasie rzeczywistym na naszym systemie obrazowania siatkówki (RIS). HR-SD-OCT wykazał postępujące jednolite zwyrodnienie siatkówki spowodowane ekspresją toksycznego zmutowanego ludzkiego zmutowanego transgenu rodopsyny (P347S) (RHOP347S) u myszy. HR-SD-OCT umożliwia rygorystyczną ocenę ilościową wszystkich warstw siatkówki. Pomiary grubości zewnętrznej warstwy jądrowej (ONL) i długości zewnętrznego segmentu fotoreceptora (OSL) korelują z żywotnością fotoreceptora, degeneracją lub ratunkiem. System dostarczania RIS umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym wstrzyknięć podsiatkówkowych u noworodków (~P10-14) lub dorosłych myszy, a HR-SD-OCT natychmiast określa powodzenie porodu i mapuje zasięg powierzchniowy. HR-SD-OCT to potężne narzędzie, które może ocenić powodzenie operacji podsiatkówkowej u myszy, a także mierzyć żywotność fotoreceptorów in vivo. HR-SD-OCT może być również stosowany do identyfikacji jednolitych kohort zwierząt w celu oceny zakresu zwyrodnienia siatkówki, toksyczności i ratowania terapeutycznego w przedklinicznych badaniach naukowych nad terapią genową.

Ocena obecności, tempa i jednolitości modelu zwyrodnienia zewnętrznej siatkówki 
Pomiar warstwy nabłonka zwojowego (ONL) przeprowadzono od OPL do ELM, wyznaczając granice ONL za pomocą narzędzia suwmiarki dostępnego w oprogramowaniu urządzenia. Celem było zobrazowanie postępu zwyrodnienia zewnętrznej siatkówki w częściowo humanizowanym modelu mysim adRP. Porównywalne obrazy z myszy kontrolnej C57BL/6(J) oraz modelu mysiego hC1/hC1//mWT/mWT, ekspresyjnego dwóch kopii lu...

Tutaj demonstrujemy nowatorskie podejście do wykorzystania wysokiej rozdzielczości optycznej koherentnej tomografii spektralnej (HR-SD-OCT) do wspomagania dostarczania środków terapii genowej do przestrzeni podsiatkówkowej, oceny jej zasięgu powierzchniowego i charakteryzowania żywotności fotoreceptorów.

Optyczna koherentna tomografia myszy o ultrawysokiej rozdzielczości wspomagająca wstrzyknięcie do gałki ocznej w badaniach nad terapią genową siatkówki

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the ...

Ogólnym celem tej procedury iniekcji podsiatkówkowej jest dostarczenie wektora do siatkówki w sposób małoinwazyjny i powtarzalny, z możliwością obserwacji w czasie rzeczywistym. Metoda ta może być wykorzystana do odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad terapią genową dotyczące skuteczności dostarczania wektorów oraz toksyczności czynników terapeutycznych. Do zalet tej techniki należą minimalne uszkodzenia siatkówki i innych struktur oka, precyzyjne mapowanie miejsca iniekcji oraz rygorystyczne ilościowe pomiary in vivo, które umożliwiają rzetelną analizę statystyczną.W celu dokonania dokanałowej iniekcji transgenu, najpierw umieść znieczuczoną mysz na stole obserwacyjnym mikroskopu systemu obrazowania siatkówki, a następnie przyłóż końcówki sterylnej tępej pęsety irydowej w pozycjach godziny siódmej i dziesiątej powieki, rozwierając i dociskając pęsetę w dół, aby delikatnie wywołać proptozę. Użyj pęsety, aby przesunąć powieki pod gałkę oczną i skieruj końcówkę igły na odległość około 1 do 1,5 mm poniżej krawędzi limbusa rogówki. Następnie nanieś kroplę sterylnego roztworu PBS do oka i przykryj oko sterylnym szkiełkiem podstawowym.Ostrożnie wprowadź igłę do oka przez spojówkę

ultrahigh-resolution-mouse-optical-coherence-tomography-to-aid

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film demonstruje technikę obrazowania in vivo do wykrywania i ilościowego określania stanu zapalnego oka w mysim modelu poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka. Technika ta, znana jako optyczna tomografia koherentna (OCT), generuje obrazy przekroju poprzecznego oka o wysokiej rozdzielczości w celu oceny postępu choroby.

Obrazowanie optycznej koherentnej tomografii do oceny zapalenia błony naczyniowej oka w modelu mysim

Source: Jagodzińska, J., et. al., optyczna tomografia koherentna: obrazowanie komórek zwojowych siatkówki myszy . J. Vis. Exp. (2017)  W tym filmie pokazujemy zastosowanie optycznej koherentnej tomografii w domenie spektralnej (SD-OCT) do obrazowania warstw siatkówki i oceny zmian strukturalnych w genetycznie zmodyfikowanym modelu myszy z neuropatią nerwu wzrokowego.

Obrazowanie in vivo siatkówki myszy za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Wstrzyknięcie podsiatkówkowe to technika chirurgiczna służąca skutecznemu dostarczaniu genów do nabłonka barwnikowego siatkówki w oku myszy.  Tutaj opisujemy łatwą i powtarzalną metodę subretinalnego wstrzykiwania wektorów wirusowych do nabłonka barwnikowego siatkówki u myszy eksperymentalnych.

Podejście rąbkowe - podsiatkówkowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych do terapii genowej u myszy Nabłonek barwnikowy siatkówki

Ten manuskrypt opisuje protokół obrazowania in vivo siatkówki myszy za pomocą optycznej koherentnej tomografii spektralnej o wysokiej rozdzielczości (SD-OCT). Koncentruje się na komórkach zwojowych siatkówki (RGC) w okolicy okołobrodawkowatej, z opisanymi kilkoma podejściami do skanowania i kwantyfikacji.

Optyczna tomografia koherentna: obrazowanie komórek zwojowych siatkówki myszy in vivo

Ten protokół opisuje, jak techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości, takie jak optyczna koherentna tomografia w domenie spektralnej i skaningowa oftalmoskopia laserowa, mogą być wykorzystane u małych gryzoni, przy użyciu systemu platformy obrazowania okulistycznego, aby uzyskać informacje odpowiednio o grubości siatkówki i rozmieszczeniu komórek mikrogleju.

In vivo (in vivo) Obrazowanie myszy reporterowych Cx3cr1gfp/gfp z optyczną koherentną tomografią w domenie spektralnej i skaningową oftalmoskopią laserową

Przedstawiono szczegółowy protokół oceny odczytów strukturalnych i wizualnych u gryzoni za pomocą optycznej koherentnej tomografii i odpowiedzi optokinetycznej. Wyniki dostarczają cennych informacji dla badań okulistycznych i neurologicznych.

Wykorzystanie optycznej tomografii koherentnej i odpowiedzi optokinetycznej jako strukturalnych i funkcjonalnych odczytów układu wzrokowego u myszy i szczurów

Tutaj opisujemy użycie optycznej koherentnej tomografii spektralnej (SD-OCT) do wizualizacji struktur siatkówki i oka in vivo w modelach zwyrodnienia siatkówki, jaskry, retinopatii cukrzycowej i krótkowzroczności.

Strukturalne oceny in vivo chorób oczu w modelach gryzoni przy użyciu optycznej koherentnej tomografii

Tutaj opisujemy technikę obrazowania in vivo wykorzystującą optyczną koherentną tomografię ułatwiającą diagnozę i ilościowy pomiar retinopatii u myszy.

Zastosowanie optycznej koherentnej tomografii do mysiego modelu retinopatii

Obecny protokół przedstawia kroki do wyrównania in vivo obrazów światłowodowej optycznej koherentnej tomografii koherentnej (vis-OCTF) in vivo z obrazami konfokalnymi ex vivo tej samej siatkówki myszy w celu weryfikacji obserwowanej morfologii pęczka aksonów komórek zwojowych siatkówki na obrazach in vivo.

Wyrównanie światłowodów światłowodowej koherentnej tomografii koherentnej w świetle widzialnym z obrazami konfokalnymi tej samej siatkówki myszy

Iniekcje podsiatkówkowe są nieodzowną techniką w przedklinicznym rozwoju terapii chorób fotoreceptorowych i RPE. Opisujemy zoptymalizowaną technikę przeztwardówkowego wstrzykiwania podsiatkówkowego u myszy, która poprawia wskaźniki powodzenia śródoperacyjnego i minimalizuje uszkodzenie siatkówki.

Zoptymalizowana minimalnie inwazyjna technika przeztwardówkowego wstrzykiwania podsiatkówkowego u myszy

Poznaj metodę wstrzyknięcia podsiatkówkowego wspomaganą optyczną koherentną tomografią wysokiej rozdzielczości u myszy. Technika umożliwia obserwację w czasie rzeczywistym dostarczania wektorów terapii genowej siatkówki.

Optyczna koherentna tomografia myszy o ultrawysokiej rozdzielczości wspomagająca wstrzyknięcie do gałki ocznej w badaniach nad terapią genową siatkówki (Wideo) | JoVE Journal

Optyczna koherentna tomografia myszy o ultrawysokiej rozdzielczości wspomagająca wstrzyknięcie do gałki ocznej w badaniach nad terapią genową siatkówki

Przeglądaj więcej filmów