Zoptymalizowana minimalnie inwazyjna technika przeztwardówkowego wstrzykiwania podsiatkówkowego u myszy

Iniekcje podsiatkówkowe są ważnym narzędziem w badaniach przedklinicznych terapii dziedzicznych chorób siatkówki. W tym filmie przedstawiamy zoptymalizowaną, minimalnie inwazyjną technikę iniekcji podsiatkówkowej u myszy. Iniekcje przeztwardówkowe podsiatkówkowe są doskonałym sposobem na dostarczenie materiału do fotoreceptorów i RPE.

Technika ta jest jednak technicznie trudna i wymaga opracowania zoptymalizowanego protokołu w celu zwiększenia jego powtarzalności i dostępności. Nasze ulepszenia obejmują opracowanie wziernika powieki myszy, przedoperacyjne podawanie atropiny, stworzenie punktowej sklerotomii za pomocą noża diamentowego oraz optymalizację rozmiaru igły i podejścia do iniekcji. Mamy nadzieję, że spójność, powtarzalność, doskonałe pokrycie transdukcji i minimalne uszkodzenia chirurgiczne naszej metody poprawią dostępność iniekcji podsiatkówkowych dla społeczności naukowej.

Nasze optymalizacje ułatwiają i przyspieszają wykonywanie iniekcji podsiatkówkowych u myszy, zmniejszają zmienność eksperymentalną i poprawiają wskaźniki powodzenia wstrzyknięć. Technika ta ułatwi przyszłe przedkliniczne badania translacyjne siatkówki. Na początek podaj jeden miligram na kilogram atropiny dootrzewnowej w całkowitej objętości 50 mikrolitrów 30 minut przed wykonaniem wstrzyknięcia podsiatkówkowego.

Załadować szklaną mikroigłę żądaną objętością roztworu do wstrzykiwań. Przymocuj igłę do mikroiniektora i ustaw ciśnienie kompensacyjne na pięć hektopaskalów, aby przeciwdziałać działaniu kapilarnemu. Umieść znieczuloną mysz pod mikroskopem stereoskopowym do preparacji.

Nałóż kroplę 0,5% proparakainy na oko, aby uzyskać znieczulenie miejscowe. Nanieść kroplę mieszaniny zawierającej 0,2% cyklopentolanu i 1% fenylefryny na oko, aby rozszerzyć źrenicę w celu pooperacyjnego obrazowania pęcherzyka podsiatkówkowego i zmniejszenia krwawienia śródoperacyjnego. Używając niestandardowego miniaturowego wziernika drucianego, odsłoń górny otwór i unieruchom, aby umożliwić cofnięcie górnej powieki bez użycia rąk.

Używając kątowych nożyczek Vannas, wykonaj nacięcie rąbkowe około jednego milimetra za rąbkiem w górnej spojówce i torebce Tenona, aby odsłonić górną twardówkę. Ostrożnie usunąć wszelkie pozostałości kapsułki Tenona z miejsca wstrzyknięcia. Teraz chwyć przednią krawędź peritomii spojówki i tenotomii za pomocą kleszczy zębatych blokujących.

Następnie delikatnie zmniejsz kulę ziemską, aby odsłonić twardówkę górną. Natychmiast nałóż kroplę zbalansowanej buforowanej soli fizjologicznej na oko, aby utrzymać nawilżenie twardówki i uzyskać większe powiększenie optyczne. Za pomocą noża diamentowego wykonaj punktową sklerotomię około godziny 12 i w odległości od jednego do dwóch milimetrów od rąbka.

Ustawienie ostrza stycznie do twardówki, aby upewnić się, że sklerotomia jest mała i płytka. Użyj gąbki chirurgicznej, aby delikatnie usunąć całą zrównoważoną buforowaną sól fizjologiczną z powierzchni oka. Przytrzymaj igłę pod płytkim kątem do twardówki i powoli włóż końcówkę do sklerotomii, przesuwając się zaledwie o 0,5 do jednego milimetra, aby uzyskać dostęp do przestrzeni podsiatkówkowej bez penetracji siatkówki.

Trzymając igłę nieruchomo, rozpocząć wstrzykiwanie w odległości 500 hektopaskalów za pomocą pedału nożnego i utrzymywać ciągły nacisk przez 15 sekund. Wyjąć igłę i zaobserwować częściowy refluks wstrzykniętego roztworu przez miejsce sklerotomii, co wskazuje na pomyślne poród, ponieważ przestrzeń podsiatkówkowa nie jest w stanie pomieścić pełnej objętości wstrzykniętego roztworu. Ostrożnie usuń kleszcze blokujące i wziernik powieki bez wywierania nacisku na gałkę ziemską, aby uniknąć dodatkowego refluksu.

Natychmiast po wstrzyknięciu nałóż dużą ilość nawilżającej maści do oczu na oko, aby pomóc w wizualizacji pęcherzyków podsiatkówkowych. Pęcherzyk podsiatkówkowy był wyraźnie widoczny na OCT bezpośrednio po wstrzyknięciu przeztwardówkowym, potwierdzając pomyślny poród. Aby ocenić nabłonek barwnikowy siatkówki lub RPE, wstrzyknięto ukierunkowaną dystrofinę AAV-8 1-GFP, co spowodowało rozległą zieloną fluorescencję w warstwie nabłonka, co wskazuje na wydajną i szeroką transdukcję RPE przy użyciu podejścia przeztwardówkowego.

Ropopsyna AAV-8 GFP doprowadziła do silnego zielonego sygnału fluorescencyjnego w fotoreceptorach pręcików, widocznego zarówno w przekrojach poprzecznych, jak i w widokach dna oka, co wskazuje na skuteczne celowanie i ekspresję w komórkach fotoreceptorów. AAV8-CAG-mCherry wytworzył szeroką czerwoną fluorescencję w warstwach siatkówki, demonstrując zdolność tej techniki do wspierania uogólnionej ekspresji transgenu poza określonymi typami komórek. Western blot lizatów siatkówki wykazał również silną ekspresję białka zielonej fluorescencji z najwyższymi poziomami odpowiadającymi środkowi pęcherzyka iniekcyjnego, potwierdzając transdukcję fotoreceptorów za pomocą rodopsyny AAV8 GFP.

Optymalizacja miana AAV za pomocą analizy immunofluorescencyjnej odcinków siatkówki pozwala na wybór miana wirusa, które osiąga transdukcję około 90% komórek docelowych. Na przykład w tym przypadku rozcieńczenie 1 do 10 rodopsyny GFP wywołało ekspresję transgenu w prawie wszystkich fotoreceptorach. Natomiast rozcieńczenie od 1 do 100 skutkowało niewystarczającą szybkością transdukcji.

Elektroretinogram wykazał, że iniekcje przeztwardówkowe zachowywały normalną funkcję siatkówki, podczas gdy iniekcje przezsiatkówkowe prowadziły do znacznie zmniejszonych odpowiedzi załamka A i załamka B, co wskazuje na uszkodzenie siatkówki.