Name: Zoptymalizowana minimalnie inwazyjna technika przeztwardówkowego wstrzykiwania podsiatkówkowego u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-25T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną minimalnie inwazyjną technikę przeztwardówkowego wstrzykiwania podsiatkówkowego u myszy. Ta metoda zwiększa powtarzalność procedury i minimalizuje uszkodzenia chirurgiczne siatkówki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Johnowi Flannery'emu (Uniwersytet Kalifornijski w Berkeley) za dostarczenie nam wirusa AAV1-Best1-GFP. Otrzymane dofinansowanie: NIH R01 EY031748 (CBR), NIH P30 EY005722 (dla Duke University); Nagroda FFB Free Family AMD Award (CBR); nieograniczony grant z Research to Prevent Blindness (Duke Eye Center); Program Akceleracji Badań Translacyjnych FFB TA-GT-0424-0875-DUKE-TRAP (VA), NIH K08 EY033857 (OA); Nagroda Silnego Start (OA) dla lekarza i naukowca Uniwersytetu Duke'a.

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Komitetem ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Duke'a oraz Oświadczeniem Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką dotyczącą wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych.
1. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Wstrzyknięcie dootrzewnowe w postaci 1 mg/kg atropiny (w całkowitej objętości 50 μl) należy wykonać 30 minut przed wykonaniem wstrzyknięcia podsiatkówkowego. Ten krok znacznie zwiększa wskaźniki sukcesu, zapobiegając potencjalnie śmiertelnym odruchom okołosercowym i okołooddechowym wywołanym przejściowym wzrostem ciśnienia wewnątrzgałkowego podczas wstrzyknięcia11,12. UWAGA: Nasza dawka atropiny jest zoptymalizowana dla myszy C57BL/6 i może być konieczne dostosowanie jej do innych szczepów myszy. Nie zaobserwowaliśmy żadnych istotnych różnic między płciami lub wiekiem w dawkowaniu atropiny.</li>
	<li>Podczas całego zabiegu trzymaj mysz na ciepłej powierzchni, aby zmaksymalizować komfort zwierzęcia i zmniejszyć rozwój zimnej zaćmy.</li>
	<li>Znieczulenie myszy za pomocą 2% wdychanego izofluranu w tlenie (2 l/min) do momentu, gdy zaobserwuje się leżenie, a zwierzę przestanie reagować na szczypanie palców. Nałóż kroplę 0,5% proparakainy na oko w celu znieczulenia miejscowego.</li>
	<li>Nałóż kroplę mieszaniny 0,2% cyklopentolanu i 1% fenylefryny na oko, aby rozszerzyć źrenicę do pooperacyjnego obrazowania pęcherzyka podsiatkówkowego przez OCT. Fenylefryna służy również do zmniejszenia krwawienia śródoperacyjnego poprzez zwężenie powierzchownych naczyń krwionośnych13.</li>
</ol>
2. Sklerotomia
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem zabiegu należy naładować szklaną mikroigłę żądaną objętością roztworu, który ma zostać wstrzyknięty. Przymocować igłę do mikroiniektora z ciśnieniem kompensacyjnym ustawionym na 5 hektopaskali (hPa), aby przeciwdziałać działaniu kapilarnemu. Zazwyczaj używamy objętości 1 μl do wstrzyknięć podsiatkówkowych.</li>
	<li>Umieść mysz pod mikroskopem stereoskopowym do preparowania. Użyj 20-krotnego powiększenia dla kroków 2.3-2.6 i 50-krotnego powiększenia dla kroków 2.7-3.5.</li>
	<li>W przypadku młodych myszy przed zabiegiem należy wykonać kantotomię boczną, aby zapewnić wystarczający dostęp i wizualizację pola operacyjnego.</li>
	<li>Odsłoń górny otwór za pomocą wykonanego na zamówienie miniaturowego wziernika drucianego (ryc. 1C). Unieruchomij wziernik, aby umożliwić wycofanie górnej powieki bez użycia rąk.</li>
	<li>Za pomocą kątowych nożyczek Vannas wykonaj nacięcie przylimbalne (~1 mm za rąbkiem) w spojówce górnej i torebce Tenona, aby odsłonić górne 3-4 godziny zegarowe twardówki. Uważaj, aby nie przebić zatoki żylnej zaoczodołowej. Ostrożnie, ale dokładnie usunąć wszelkie pozostałości kapsułki Tenona leżące nad zamierzonym miejscem wstrzyknięcia.</li>
	<li>Chwyć przednią krawędź peritomii spojówki i tenotomii za pomocą kleszczy zębatych blokujących i delikatnie opuść gałkę ziemską, aby odsłonić twardówkę górną. Unieruchom zablokowane kleszcze, aby umożliwić inferodukcję bez użycia rąk.</li>
	<li>Natychmiast nałóż kroplę zrównoważonej buforowanej soli fizjologicznej (BSS) na oko, aby zapobiec wysuszeniu gołej twardówki. Uważamy również, że pomocne jest powiększenie optyczne wytwarzane przez kroplę BSS.</li>
	<li>Za pomocą noża diamentowego wykonaj punktową sklerotomię na godzinie ~12 i ~1-2 mm od rąbka. Ustaw ostrze w płaszczyźnie stycznej w stosunku do twardówki, aby upewnić się, że sklerotomia jest tak mała i płytka, jak to tylko możliwe. UWAGA: Odbywa się to z dwóch powodów: (1) mała sklerotomia pozwala na ścisłe dopasowanie szklanej igły, zmniejszając w ten sposób refluks podczas etapu wstrzykiwania, oraz (2) płytka sklerotomia ma kluczowe znaczenie, aby uniknąć penetracji siatkówki. Należy pamiętać, że w miejscu sklerotomii może pojawić się niewielka ilość krwi naczyniówkowej, co nie wiąże się z żadnymi negatywnymi konsekwencjami dla wyniku zabiegu.</li>
</ol>
3. Iniekcja przeztwardówkowa podsiatkówkowa
<ol>
	<li>Przygotowując się do wstrzyknięcia, użyj gąbki chirurgicznej, aby delikatnie usunąć wszystkie BSS z powierzchni oka.</li>
	<li>Trzymaj igłę pod kątem do twardówki i powoli i ostrożnie wprowadzaj końcówkę do sklerotomii, aby uzyskać dostęp do przestrzeni podsiatkówkowej. Aby uniknąć penetracji siatkówki, rób to pod stosunkowo płytkim kątem i na tyle głęboko, aby oczyścić otwór sklerotomii o 0,5-1 mm. UWAGA: Skos igły jest ustawiony w dół, aby zminimalizować możliwość porodu naczyniówkowego i zmniejszyć prawdopodobieństwo przebicia siatkówki przez posuwającą się końcówkę igły.</li>
	<li>Trzymając igłę w stabilnej pozycji, rozpocząć wstrzykiwanie przy ciśnieniu 500 hPa za pomocą pedału nożnego i utrzymywać nieprzerwane ciśnienie przez 15 sekund.</li>
	<li>Aby zakończyć wstrzyknięcie, należy utrzymać ciśnienie wstrzyknięcia, aż igła zostanie całkowicie usunięta ze sklerotomii. Jeśli ciśnienie zostanie przedwcześnie przerwane, gdy igła nadal znajduje się w przestrzeni podsiatkówkowej, duża część wstrzykniętego ładunku może szybko opuścić oko z powrotem do igły poprzez działanie kapilarne.</li>
	<li>Po wyjęciu igły należy zauważyć częściowy refluks wstrzykniętego roztworu przez miejsce sklerotomii. Jest to oczekiwane, biorąc pod uwagę, że objętość 1 μl przekracza pojemność przestrzeni podsiatkówkowej nawet u dorosłych myszy. Brak refluksu może wskazywać na nieudane wstrzyknięcie z powodu niezamierzonego podania naczyniówkowego lub doszklistkowego.</li>
	<li>Usuń kleszcze blokujące i wziernik powieki z oka. Należy uważać, aby nie wywierać nacisku na kulę, ponieważ może to spowodować dalszy refluks wstrzykiwanego roztworu.</li>
	<li>Bezpośrednio po wstrzyknięciu należy nałożyć na oko dużą ilość smarującej maści do oczu, aby umożliwić wizualizację pęcherzyka podsiatkówkowego do14 października.</li>
	<li>Zastosuj miejscową maść erytromycyny do oka i zapewnij zwierzęciu ogólną opiekę pooperacyjną.</li>
</ol>

<ol><li>Trapani, I., Banfi, S., Simonelli, F., Surace, E. M., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+of+inherited+retinal+degenerations%3A+prospects+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene therapy of inherited retinal degenerations: prospects and challenges.</a> Hum Gene Ther. 26, 193-200 (2015).</li>
<li>Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+Injection%3A+A+Review+on+the+Novel+Route+of+Therapeutic+Delivery+for+Vitreoretinal+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Res%22%5BJournal%5D)">Subretinal Injection: A Review on the Novel Route of Therapeutic Delivery for Vitreoretinal Diseases.</a> Ophthalmic Res. 58, 217-226 (2017).</li>
<li>Simunovic, M. P., Xue, K., Jolly, J. K., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+Functional+Recovery+Following+Limited+Iatrogenic+Macular+Detachment+for+Retinal+Gene+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Structural and Functional Recovery Following Limited Iatrogenic Macular Detachment for Retinal Gene Therapy.</a> JAMA Ophthalmol. 135, 234-241 (2017).</li>
<li>Parikh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Alternative+and+Validated+Injection+Method+for+Accessing+the+Subretinal+Space+via+a+Transcleral+Posterior+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach.</a> J Vis Exp. (118), e54808(2016).</li>
<li>Testa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-year+follow-up+after+unilateral+subretinal+delivery+of+adeno-associated+virus+in+patients+with+Leber+congenital+Amaurosis+type+2%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Three-year follow-up after unilateral subretinal delivery of adeno-associated virus in patients with Leber congenital Amaurosis type 2.</a> Ophthalmology. 120, 1283-1291 (2013).</li>
<li>Ghazi, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+retinitis+pigmentosa+due+to+MERTK+mutations+by+ocular+subretinal+injection+of+adeno-associated+virus+gene+vector%3A+results+of+a+phase+I+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Treatment of retinitis pigmentosa due to MERTK mutations by ocular subretinal injection of adeno-associated virus gene vector: results of a phase I trial.</a> Hum Genet. 135, 327-343 (2016).</li>
<li>Bennett, J., Anand, V., Acland, G. M., Maguire, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-species+comparison+of+in+vivo+reporter+gene+expression+after+recombinant+adeno-associated+virus-mediated+retinal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Cross-species comparison of in vivo reporter gene expression after recombinant adeno-associated virus-mediated retinal transduction.</a> Methods Enzymol. 316, 777-789 (2000).</li>
<li>Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garcia Garrido, M., Biel, M., Seeliger, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+technique+for+subretinal+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimized technique for subretinal injections in mice.</a> Methods Mol Biol. 935, 343-349 (2013).</li>
<li>Hejri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-surgical+method+for+subretinal+delivery+by+trans-scleral+microneedle+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">A non-surgical method for subretinal delivery by trans-scleral microneedle injection.</a> Bioeng Transl Med. 10 (3), e10755(2025).</li>
<li>Sastry, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscope-Integrated+OCT-Guided+Volumetric+Measurements+of+Subretinal+Blebs+Created+by+a+Suprachoroidal+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Vis+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Microscope-Integrated OCT-Guided Volumetric Measurements of Subretinal Blebs Created by a Suprachoroidal Approach.</a> Transl Vis Sci Technol. 10, 24(2021).</li>
<li>Blanc, V. F., Jacob, J. L., Milot, J., Cyrenne, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oculorespiratory+reflex+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Anaesth%22%5BJournal%5D)">The oculorespiratory reflex revisited.</a> Can J Anaesth. 35, 468-472 (1988).</li>
<li>Dewar, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oculocardiac+reflex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+Med%22%5BJournal%5D)">The oculocardiac reflex.</a> Proc R Soc Med. 69, 373-374 (1976).</li>
<li>Katzung, B. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKatzung%2C+BG+%22Basic+%26amp%3B+clinical+pharmacology%22">Basic &amp; clinical pharmacology</a>. , 9th ed, Lange Medical Books/McGraw Hill. New York, USA. (2004).</li>
<li>Mai, X., Huang, S., Chen, W., Ng, T. K., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Optical+Coherence+Tomography+to+a+Mouse+Model+of+Retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Application of Optical Coherence Tomography to a Mouse Model of Retinopathy.</a> J Vis Exp. (179), e63421(2022).</li>
<li>L'Abbate, D., Prescott, K., Geraghty, B., Kearns, V. R., Steel, D. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+considerations+for+optimising+subretinal+injections%5BTitle%5D)+AND+%22Surv+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Biomechanical considerations for optimising subretinal injections.</a> Surv Ophthalmol. 69, 722-732 (2024).</li>
<li>Huang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+injection+in+mice+to+study+retinal+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Subretinal injection in mice to study retinal physiology and disease.</a> Nat Protoc. 17, 1468-1485 (2022).</li>
<li>Stockslager, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+method+for+automated+measurement+of+glass+micropipette+tip+geometry%5BTitle%5D)+AND+%22Precis+Eng%22%5BJournal%5D)">Optical method for automated measurement of glass micropipette tip geometry.</a> Precis Eng. 46, 88-95 (2016).</li>
<li>Li, Q., Rycaj, K., Chen, X., Tang, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+and+cell+size%3A+A+causal+link%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells and cell size: A causal link.</a> Semin Cancer Biol. 35, 191-199 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana tutaj technika wprowadza kilka ulepszeń do wcześniej opisanego podejścia do iniekcji przeztwardówkowej4, które zwiększają niezawodność procedury i dodatkowo zmniejszają chirurgiczne uszkodzenie oka. Jednym z takich ulepszeń jest użycie wziernika do cofnięcia górnej powieki, co pozwala na stabilny, nieskrępowany i bezdotykowy dostęp do oka. Wzierniki komercyjne są często słabo zoptymalizowane, nawet dla dorosłych myszy i wręcz niedostępne dla młodocianych. Aby pokonać tę przeszkodę, zaproje...

Iniekcja podsiatkówkowa to zabieg chirurgiczny oka, w którym materiał jest dostarczany do potencjalnej przestrzeni między siatkówką a nabłonkiem barwnikowym siatkówki (RPE). W porównaniu z innymi metodami dostarczania leków do tylnego odcinka, takimi jak iniekcje doszklistkowe lub nadnaczyniówkowe, iniekcje podsiatkówkowe zapewniają najszybszy dostęp zarówno do fotoreceptorów, jak i RPE. W przypadku dostarczania cząsteczek wirusowej terapii genowej, wstrzyknięcie podsiatkówkowe osiąga znacznie wyższe wskaźniki transdukcji fotoreceptorów i RPE, co pozwala na obniżenie miana wirusa i zmniejszenie ryzyka toksyczności wirusowej1. Dodatkowo przestrzeń podsiatkówkowa jest anatomicznie ograniczona, co ogranicza ogólnoustrojowe rozprzestrzenianie się cząstek wirusa i zmniejsza ryzyko odpowiedzi immunologicznej2. U ludzi profil bezpieczeństwa wstrzyknięć podsiatkówkowych jest bardzo korzystny, a struktura i funkcja siatkówki wracają do poziomu wyjściowego w ciągu 1 miesiąca po wstrzyknięciu 3,4. Iniekcje podsiatkówkowe są stosowane w wielu zastosowaniach, takich jak przeszczep komórek macierzystych i dostarczanie leków małocząsteczkowych2, przy czym ich najczęstszym zastosowaniem jest dostarczanie wektorów wirusowych do leczenia chorób siatkówki terapią genową. Stosunkowo niskie miana wirusów, minimalna ekspozycja ogólnoustrojowa oraz wysoka szybkość i swoistość transdukcji związana z iniekcjami podsiatkówkowymi sprawiły, że są one niezastąpioną techniką w polu siatkówki. Iniekcje podsiatkówkowe są z powodzeniem stosowane u pacjentów w leczeniu dziedzicznych zaburzeń siatkówki, w tym barwnikowego zwyrodnienia siatkówki i wrodzonej ślepotyLebera 5,6.
Biorąc pod uwagę jej znaczenie dla tej dziedziny, zdolność do wykonywania iniekcji podsiatkówkowych u myszy ma kluczowe znaczenie dla badań przedklinicznych badających terapie dziedzicznych chorób siatkówki. Jednak obecne metody wstrzykiwań podsiatkówkowych u myszy mają wysoki wskaźnik niepowodzeń i często powodują chirurgiczne uszkodzenie siatkówki, co może ograniczać wiarygodność i spójność funkcjonalnych pomiarów wyników. Tradycyjnie iniekcje podsiatkówkowe u gryzoni wykonuje się przezsiatkówkowo, tak że igła przenika przez przednią siatkówkę, przechodzi przez soczewkę i wchodzi do przestrzeni podsiatkówkowej w wyniku drugiej penetracji siatkówki 7,8 (ryc. 1A). Chociaż procedura ta jest stosunkowo łatwa do wykonania, wprowadza wyraźną niespójność w wynikach eksperymentalnych ze względu na zmienny zakres uszkodzeń chirurgicznych. Jest to szczególnie ograniczające w przypadku badań wykorzystujących behawioralne i funkcjonalne miary wyników widzenia. Ponadto soczewka krystaliczna jest nieproporcjonalnie duża u myszy w porównaniu z ludźmi; To znacznie zwiększa ryzyko uszkodzenia soczewki podczas wstrzyknięcia przezsiatkówkowego, co sprawia, że zwierzę nie nadaje się do oceny funkcjonalnej wzroku4.
Alternatywną opcją jest droga wstrzyknięcia przeztwardówkowego, która pozwala uniknąć tych problemów poprzez dostęp do przestrzeni podsiatkówkowej przy użyciu dostępu tylnego, gdzie igła penetruje twardówkę, naczyniówkę, błonę Brucha i RPE 4,9 (ryc. 1B). Takie podejście minimalizuje uszkodzenia siatkówki, całkowicie unikając penetracji siatkówki. Wiąże się to również ze zmniejszonym refluksem wstrzykiwanego materiału z przestrzeni podsiatkówkowej10, co pozwala na uzyskanie bardziej spójnych wyników i mniejszych kohort eksperymentalnych. Chociaż technika przeztwardówkowego wstrzykiwania podsiatkówkowego u myszy została już wcześniej opisana w literaturze, jej powszechne zastosowanie pozostaje ograniczone ze względu na trudności techniczne, które mogą utrudniać wskaźnik powodzenia4. W tym miejscu opisujemy kilka ulepszeń procedury wstrzyknięcia przeztwardówkowego, które ułatwiają i przyspieszają jej wykonanie, zmniejszają zmienność eksperymentalną i poprawiają wskaźniki powodzenia wstrzyknięć. Ulepszenia te obejmują opracowanie wziernika powiek myszy, przedoperacyjne podawanie atropiny, stworzenie punktowej sklerotomii za pomocą diamentowego noża oraz optymalizację rozmiaru igły i podejścia do wstrzykiwań. Technika ta pozwala uzyskać doskonałe pokrycie transdukcji wirusowej fotoreceptorów i RPE, nie powodując przy tym żadnych skutków chirurgicznych wykrywalnych przez ERG.

<table><tbody><tr><td>0,9% wtrysk chlorku sodu, USP</td><td>Hospira</td><td>PAA130066</td><td></td></tr><tr><td>1% roztwór okulistyczny siarczanu atropiny, USP</td><td>Akorn powiedział:</td><td>NDC 17478-215-05</td><td></td></tr><tr><td>30&deg; nóż diamentowy</td><td>Kastena</td><td>Zobacz materiał K2-6560</td><td></td></tr><tr><td>Podwójny oświetlacz AmScope 6W LED na gęsiej szyi</td><td>AmScope</td><td>LED-11CR</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki kątowe Vannas</td><td>Roboz powiedział:</td><td>Złącze RS-5618</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny roztwór do irygacji BSS</td><td>Alcon</td><td>289010-0902</td><td></td></tr><tr><td>Cyklomydryl rozszerzające krople do oczu</td><td>Alcon</td><td>0065-0359-02</td><td>0,2% cyklopentolan, 1% fenylefryna</td></tr><tr><td>epT.I.P.S. MicroloaderTM Końcówki do pipet</td><td>Eppendorf powiedział:</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr><tr><td>Mikroiniektor FemtoJet 4i</td><td>Eppendorf powiedział:</td><td>E5252000021</td><td>Produkt wycofany</td></tr><tr><td>GenTeal Tears lubrykantna maść do oczu</td><td>Alcon</td><td>16027802</td><td></td></tr><tr><td>Szklane igły do mikroiniekcji</td><td>Naukowy Clunbury</td><td>B100-58-50</td><td>30&deg; skos. Średnica: 50 i mikro; m zewnętrzny, 29 i mikro; m wewnętrzny</td></tr><tr><td>Roztwór izofluranu</td><td>Chciwość</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop do obrazowania siatkówki MICRON IV z OCT pod kontrolą obrazu</td><td>Feniks</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy SteREO Discovery.V8</td><td>Zeiss</td><td>495015-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze zębate blokujące Stern-Castroviejo</td><td>Kastena</td><td>Zobacz materiał K5-2552 TGL</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze zębate</td><td>Roboz powiedział:</td><td>Złącze RS-5172</td><td></td></tr><tr><td>Druty czyszczące wolframowe do igieł o rozmiarze 23s</td><td>Hamilton</td><td>18306</td><td></td></tr><tr><td>Włócznie do oczu Ultracell PVA</td><td>Brytyjskie Wyspy Dziewicze (BVI) Medyczn</td><td>40400-8</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki insulinowe Ultra-Fine2015&nbsp;</td><td>BD</td><td>328438</td><td>3/10 ml, 8 mm (5/16"), 31G</td></tr></tbody></table>

zoptymalizowana minimalnie inwazyjna technika przeztwardówkowego wstrzykiwania podsiatkówkowego u myszy

Optimized Minimally Invasive Transscleral Subretinal Injection Technique in Mouse

Konwencjonalna metoda dostarczania materiału do przestrzeni podsiatkówkowej u myszy polega na podwójnej perforacji siatkówki nerwowej, co powoduje rozległe uszkodzenia chirurgiczne. Prowadzi to do zmienności w późniejszych pomiarach wyników funkcji wzrokowej, takich jak zapisy elektroretinogramu (ERG) lub testy widzenia behawioralnego, które zakłócają oceny skuteczności eksperymentalnych środków terapeutycznych. Aby pokonać te bariery, zoptymalizowaliśmy przeztwardówkową, minimalnie inwazyjną technikę wstrzykiwania podsiatkówkowego u myszy. W tej technice dostęp do sklepienia górnego uzyskuje się za pomocą wykonanego na zamówienie wziernika powiek z drutu wolframowego w celu wykonania peritomii spojówki i tenotomii. Sklerotomię punktową wykonuje się za pomocą diamentowego noża bez penetracji siatkówki, przez którą ostrożnie wprowadza się cienką szklaną igłę pod płytkim kątem. Ładunek jest dostarczany do przestrzeni podsiatkówkowej za pomocą pompy do mikroiniekcji. Optyczna koherentna tomografia (OCT) służy do oceny wielkości i położenia pęcherzyka podsiatkówkowego bezpośrednio po wstrzyknięciu. Porównaliśmy wyniki tej techniki z konwencjonalną metodą transsiatkówkową wykonywaną przy użyciu strzykawki sprężynowej ze sklerotomią igłową 33G. Zapisy ERG wykazały doskonałe zachowanie funkcji siatkówki u myszy, którym wstrzyknięto przeztwardówkowo, porównywalne z myszami kontrolnymi, którym wstrzyknięto nie. Natomiast znaczne zmniejszenie sygnału ERG zaobserwowano w kohortach otrzymujących konwencjonalne wstrzyknięcia. Podsumowując, zoptymalizowaliśmy minimalnie inwazyjną technikę wstrzykiwania podsiatkówkowego u myszy. Wykazaliśmy, że technika ta jest solidną i skuteczną metodą podawania terapii genowej, która minimalizuje anatomiczne uszkodzenia siatkówki i ma minimalny wpływ na funkcję siatkówki. Metoda ta obniża próg rozwoju terapii ukierunkowanych zarówno na nabłonek barwnikowy siatkówki, jak i fotoreceptory w leczeniu szerokiego zakresu chorób siatkówki i plamki żółtej.

Prawidłowe wstrzyknięcie z zastosowaniem tej techniki transskleralnej powoduje powstanie pęcherzyka podsiatkówkowego, który jest widoczny w badaniu OCT bezpośrednio po procedurze iniekcji (Rycina 2A). Ze względu na trudność techniczną tej metody, etap obrazowania jest niezbędny do zidentyfikowania zwierząt, u których iniekcja przebiegła pomyślnie. Badaczom planującym wykorzystanie tej techniki w eksperymentach z zakresu terapii genowej zalecamy przeprowadzenie iniekcji próbnych z użyciem czą...

Iniekcje podsiatkówkowe są nieodzowną techniką w przedklinicznym rozwoju terapii chorób fotoreceptorowych i RPE. Opisujemy zoptymalizowaną technikę przeztwardówkowego wstrzykiwania podsiatkówkowego u myszy, która poprawia wskaźniki powodzenia śródoperacyjnego i minimalizuje uszkodzenie siatkówki.

Zoptymalizowana minimalnie inwazyjna technika przeztwardówkowego wstrzykiwania podsiatkówkowego u myszy

The conventional method of material delivery to the subretinal space in the mouse involves dual perforation of the neural retina, which causes extensive ...

Iniekcje podsiatkówkowe są ważnym narzędziem w badaniach przedklinicznych terapii dziedzicznych chorób siatkówki. W tym filmie przedstawiamy zoptymalizowaną, minimalnie inwazyjną technikę iniekcji podsiatkówkowej u myszy. Iniekcje przeztwardówkowe podsiatkówkowe są doskonałym sposobem na dostarczenie materiału do fotoreceptorów i RPE.Technika ta jest jednak technicznie trudna i wymaga opracowania zoptymalizowanego protokołu w celu zwiększenia jego powtarzalności i dostępności. Nasze ulepszenia obejmują opracowanie wziernika powieki myszy, przedoperacyjne podawanie atropiny, stworzenie punktowej sklerotomii za pomocą noża diamentowego oraz optymalizację rozmiaru igły i podejścia do iniekcji. Mamy nadzieję, że spójność, powtarzalność, doskonałe pokrycie transdukcji i minimalne uszkodzenia chirurgiczne naszej metody poprawią dostępność iniekcji podsiatkówkowych dla społeczności naukowej.Nasze optymalizacje ułatwiają i przyspieszają wykonywanie iniekcji podsiatkówkowych u myszy, zmniejszają zmienność eksperymentalną i poprawiają wskaźniki powodzenia wstrzyknięć. Technika ta ułatwi przyszłe przedkliniczne badania translacyjne siatkówki. Na początek podaj jeden miligram na kilogram atropiny dootrzewnowej w całkowitej objętości 50 mikrolitrów 30 minut przed wykonaniem wstrzyknięcia podsiatkówkowego.Załadować szklaną mikroigłę żądaną objętością roztworu do wstrzykiwań. Przymocuj igłę do mikroiniektora i ustaw ciśnienie kompensacyjne na pięć hektopaskalów, aby przeciwdziałać działaniu kapilarnemu. Umieść znieczuloną mysz pod mikroskopem stereoskopowym do preparacji.Nałóż kroplę 0,5% proparakainy na oko, aby uzyskać znieczulenie miejscowe. Nanieść kroplę mieszaniny zawierającej 0,2% cyklopentolanu i 1% fenylefryny na oko, aby rozszerzyć źrenicę w celu pooperacyjnego obrazowania pęcherzyka podsiatkówkowego i zmniejszenia krwawienia śródoperacyjnego. Używając niestandardowego miniaturowego wziernika drucianego, odsłoń górny otwór i unieruchom, aby umożliwić cofnięcie górnej powieki bez użycia rąk.Używając kątowych nożyczek Vannas, wykonaj nacięcie rąbkowe około jednego milimetra za rąbkiem w górnej spojówce i torebce Tenona, aby odsłonić górną twardówkę. Ostrożnie usunąć wszelkie pozostałości kapsułki Tenona z miejsca wstrzyknięcia. Teraz chwyć przednią krawędź peritomii spojówki i tenotomii za pomocą kleszczy zębatych blokujących.Następnie delikatnie zmniejsz kulę ziemską, aby odsłonić twardówkę górną. Natychmiast nałóż kroplę zbalansowanej buforowanej soli fizjologicznej na oko, aby utrzymać nawilżenie twardówki i uzyskać większe powiększenie optyczne. Za pomocą noża diamentowego wykonaj punktową sklerotomię około godziny 12 i w odległości od jednego do dwóch milimetrów od rąbka.Ustawienie ostrza stycznie do twardówki, aby upewnić się, że sklerotomia jest mała i płytka. Użyj gąbki chirurgicznej, aby delikatnie usunąć całą zrównoważoną buforowaną sól fizjologiczną z powierzchni oka. Przytrzymaj igłę pod płytkim kątem do twardówki i powoli włóż końcówkę do sklerotomii, przesuwając się zaledwie o 0,5 do jednego milimetra, aby uzyskać dostęp do przestrzeni podsiatkówkowej bez penetracji siatkówki.Trzymając igłę nieruchomo, rozpocząć wstrzykiwanie w odległości 500 hektopaskalów za pomocą pedału nożnego i utrzymywać ciągły nacisk przez 15 sekund. Wyjąć igłę i zaobserwować częściowy refluks wstrzykniętego roztworu przez miejsce sklerotomii, co wskazuje na pomyślne poród, ponieważ przestrzeń podsiatkówkowa nie jest w stanie pomieścić pełnej objętości wstrzykniętego roztworu. Ostrożnie usuń kleszcze blokujące i wziernik powieki bez wywierania nacisku na gałkę ziemską, aby uniknąć dodatkowego refluksu.Natychmiast po wstrzyknięciu nałóż dużą ilość nawilżającej maści do oczu na oko, aby pomóc w wizualizacji pęcherzyków podsiatkówkowych. Pęcherzyk podsiatkówkowy był wyraźnie widoczny na OCT bezpośrednio po wstrzyknięciu przeztwardówkowym, potwierdzając pomyślny poród. Aby ocenić nabłonek barwnikowy siatkówki lub RPE, wstrzyknięto ukierunkowaną dystrofinę AAV-8 1-GFP, co spowodowało rozległą zieloną fluorescencję w warstwie nabłonka, co wskazuje na wydajną i szeroką transdukcję RPE przy użyciu podejścia przeztwardówkowego.Ropopsyna AAV-8 GFP doprowadziła do silnego zielonego sygnału fluorescencyjnego w fotoreceptorach pręcików, widocznego zarówno w przekrojach poprzecznych, jak i w widokach dna oka, co wskazuje na skuteczne celowanie i ekspresję w komórkach fotoreceptorów. AAV8-CAG-mCherry wytworzył szeroką czerwoną fluorescencję w warstwach siatkówki, demonstrując zdolność tej techniki do wspierania uogólnionej ekspresji transgenu poza określonymi typami komórek. Western blot lizatów siatkówki wykazał również silną ekspresję białka zielonej fluorescencji z najwyższymi poziomami odpowiadającymi środkowi pęcherzyka iniekcyjnego, potwierdzając transdukcję fotoreceptorów za pomocą rodopsyny AAV8 GFP.Optymalizacja miana AAV za pomocą analizy immunofluorescencyjnej odcinków siatkówki pozwala na wybór miana wirusa, które osiąga transdukcję około 90% komórek docelowych. Na przykład w tym przypadku rozcieńczenie 1 do 10 rodopsyny GFP wywołało ekspresję transgenu w prawie wszystkich fotoreceptorach. Natomiast rozcieńczenie od 1 do 100 skutkowało niewystarczającą szybkością transdukcji.Elektroretinogram wykazał, że iniekcje przeztwardówkowe zachowywały normalną funkcję siatkówki, podczas gdy iniekcje przezsiatkówkowe prowadziły do znacznie zmniejszonych odpowiedzi załamka A i załamka B, co wskazuje na uszkodzenie siatkówki.

optimized-minimally-invasive-transscleral-subretinal-injection

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Niniejsza technika chirurgiczna przedstawia wstrzykiwanie wektorów terapii genowej oraz komórek macierzystych do przestrzeni podsiatkówkowej oka myszy.

Podsiatkówkowe wstrzykiwanie wektorów terapii genowej i komórek macierzystych do oka myszy w okresie okołodniowym

Źródło: Park, S. W., et al. Podejście rąbkowe - podsiatkówkowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych do terapii genowej u myszy nabłonek barwnikowy siatkówki. J. Vis. Exp. (2015)Film opisuje metodę podsiatkówkowego wstrzykiwania wektorów wirusowych do nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) w modelu mysim. Szczegółowo opisano w nim procedurę, od znieczulenia i przygotowania oka po precyzyjne dostarczenie wektora lentiwirusowego, zapewniając integrację i ekspresję genów w RPE.

Podsiatkówkowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych do nabłonka barwnikowego siatkówki w modelu mysim

Źródło: Parikh, S., et al. Alternatywna i zwalidowana metoda iniekcji umożliwiająca dostęp do przestrzeni podsiatkówkowej przez przeztwardówkowe podejście tylne. J. Vis. Exp. (2016)Ten film pokazuje procedurę dostarczania barwnika fluorescencyjnego do przestrzeni podsiatkówkowej myszy. Proces polega na znieczuleniu myszy, przygotowaniu oka, wykonaniu precyzyjnych nacięć w celu uzyskania dostępu do przestrzeni podsiatkówkowej i wstrzyknięciu barwnika w celu uzyskania kontrolowanego odwarstwienia...

Dostarczanie barwnika fluorescencyjnego do przestrzeni podsiatkówkowej myszy

Tutaj prezentujemy akceptowany przez społeczność protokół w formacie multimedialnym do podsiatkówkowego wstrzykiwania bolusa komórek RPE szczurom i myszom. Podejście to można wykorzystać do określenia potencjałów ratunkowych, profili bezpieczeństwa i zdolności przeżycia przeszczepionych komórek RPE po implantacji w zwierzęcych modelach zwyrodnienia siatkówki.

Wykonywanie iniekcji podsiatkówkowych u gryzoni w celu dostarczenia komórek nabłonka barwnikowego siatkówki w zawiesinie

Bezpośrednia iniekcja do nerwu wzrokowego szczura jest przydatna do badań regeneracyjnych. Demonstrujemy minimalnie inwazyjną technikę bezpośredniego wstrzykiwania do nerwu wzrokowego szczura, która nie wymaga otwierania czaszki. Dzięki tej metodzie powikłania chirurgiczne są zminimalizowane, a powrót do zdrowia jest szybszy.

Minimalnie inwazyjna technika wstrzykiwania do nerwu wzrokowego szczura

Wstrzyknięcie podsiatkówkowe to technika chirurgiczna służąca skutecznemu dostarczaniu genów do nabłonka barwnikowego siatkówki w oku myszy.  Tutaj opisujemy łatwą i powtarzalną metodę subretinalnego wstrzykiwania wektorów wirusowych do nabłonka barwnikowego siatkówki u myszy eksperymentalnych.

Podejście rąbkowe - podsiatkówkowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych do terapii genowej u myszy Nabłonek barwnikowy siatkówki

Zastrzyki podsiatkówkowe są najczęstszą techniką dostarczania dużych środków terapeutycznych, takich jak białka i wektory wirusowe, do fotoreceptorów i nabłonka barwnikowego siatkówki. Alternatywna metoda u myszy, która z powodzeniem celuje w przestrzeń podsiatkówkową z minimalnymi uszkodzeniami ubocznymi i krótkim czasem rekonwalescencji, jest opisana tutaj.

Alternatywna i zwalidowana metoda iniekcji umożliwiająca dostęp do przestrzeni podsiatkówkowej przez przeztwardówkowy dostęp tylny

Wstrzyknięcie podsiatkówkowe jest szeroko stosowane w badaniach przedklinicznych terapii zastępczej komórkami macierzystymi w przypadku zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem. W tym zwizualizowanym artykule opisujemy mniej ryzykowną, powtarzalną i precyzyjnie zmodyfikowaną technikę wstrzykiwania podsiatkówkowego za pomocą podejścia przeztwardówkowego w celu dostarczenia komórek do oczu szczura.

Opracowanie udoskonalonego protokołu przeztwardówkowego przeszczepu podsiatkówkowego ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki do oczu szczurów

Tutaj demonstrujemy nowatorskie podejście do wykorzystania wysokiej rozdzielczości optycznej koherentnej tomografii spektralnej (HR-SD-OCT) do wspomagania dostarczania środków terapii genowej do przestrzeni podsiatkówkowej, oceny jej zasięgu powierzchniowego i charakteryzowania żywotności fotoreceptorów.

Optyczna koherentna tomografia myszy o ultrawysokiej rozdzielczości wspomagająca wstrzyknięcie do gałki ocznej w badaniach nad terapią genową siatkówki

Ten protokół przedstawia przezźrenicowe, sterowane widzeniem podejście przeztwardówkowe do bezpiecznego i precyzyjnego dostarczania przeszczepów komórkowych podsiatkówkowych, z niskim wskaźnikiem powikłań chirurgicznych, u myszy, biorców ze zwyrodnieniem siatkówki lub bez.

Przezźrenicowe przeszczepienie przeztwardówkowe przeszczepów podsiatkówkowych w mysim modelu zwyrodnienia siatkówki

Ten artykuł opisuje metody iniekcji podsiatkówkowej u szczurów, wykorzystując śródoperacyjną wizualizację do kontrolowania zarówno miejsca wstrzyknięcia, jak i obszaru odwarstwienia siatkówki.

Śródoperacyjna wizualizacja wstrzyknięcia podsiatkówkowego i odwarstwienia siatkówki u szczurów

Poznaj zoptymalizowaną minimalnie inwazyjną technikę przeztwardówkowego wstrzykiwania podsiatkówkowego u myszy. Ta metoda zwiększa powtarzalność procedury i minimalizuje uszkodzenia chirurgiczne siatkówki.

Zoptymalizowana minimalnie inwazyjna technika przeztwardówkowego wstrzykiwania podsiatkówkowego u myszy

Przeglądaj więcej filmów