Procedura i kluczowe strategie optymalizacyjne dla zautomatyzowanej metody immunologicznego opartego na elektroforetycznych naczyniach włosowatych
10 września 2017
Zademonstrowano test immunologiczny oparty na naczyniach włosowatych, wykorzystujący komercyjną platformę do pomiaru docelowych białek z całkowitych preparatów białkowych. Ponadto parametry testowe czasu ekspozycji, stężenia białka i rozcieńczenia przeciwciał są zoptymalizowane pod kątem systemu modelowego hodowli komórkowych.
Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie testu immunologicznego elektroforezy kapilarnej przy użyciu platformy komercyjnej. Platforma ta pozwoli na rozróżnienie i ilościowe określenie docelowe białek od próbki biologicznej, która może pochodzić z hodowli komórkowych, tkanek i płynów biologicznych. W procesie bada się białko na podstawie wielkości, która waha się od dwóch do 440 kilodaltonów.
Przewagą tej zautomatyzowanej procedury nad tradycyjnymi procedurami, takimi jak Western blot, jest to, że kapilarne elektroforetyczne testy immunologiczne eliminują potrzebę stosowania żeli, urządzeń transferowych i ręcznego mycia. Ponadto bezwzględna wymagana ilość białka jest około 10 razy mniejsza, co sprawia, że procedura jest idealna dla rzadkich typów komórek lub ograniczonych próbek. Ponadto wyniki uzyskuje się w ciągu zaledwie trzech godzin przy użyciu zautomatyzowanych systemów i wykazano, że są one bardziej ilościowe i powtarzalne niż konwencjonalne procedury Western blot.
Przygotuj próbki i odczynniki z zestawu, w tym bufor do próbek, ditiotreitol, wzorcową mieszankę fluorescencyjną i drabinkę biotynylową zgodnie z ulotką producenta. Przygotuj próbki białek swoją ulubioną metodą. Tutaj wyizolowaliśmy ekstrakt z całych komórek z kultur komórkowych BEAS-2B.
Rozcieńczyć próbki białek buforem do próbek. Zmieszać jedną część pięciokrotnie fluorescencyjnej mieszanki głównej z czterema częściami rozcieńczonej próbki, aby uzyskać pożądane końcowe stężenie białka. Pokazano przykładowe obliczenia dla uzyskania 70 mikrolitrów 0,2 mikrograma na mikrolitr końcowego stężenia białka, zaczynając od stężenia białka wyjściowego 1,2 mikrograma na mikrolitr.
Mieszanka główna to 1/5 całkowitej objętości, w tym przypadku 14 mikrolitrów. Aby obliczyć potrzebną objętość zapasu białka, pomnóż pożądane stężenie końcowe przez całkowitą objętość i podziel przez stężenie białka. Odejmij objętość mieszanki głównej i masy wyjściowej od całkowitej objętości, aby obliczyć objętość bufora próbki.
Przygotowane próbki i drabinę należy poddać denaturacji, ogrzewając w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Należy pamiętać, że niektóre białka mogą wymagać łagodniejszych warunków denaturacji. Na przykład 70 stopni przez 10 minut, aby zapobiec agregacji białek i poprawić migrację.
Rozważ tę opcję, jeśli występuje silne rozmazywanie przy wyższych masach cząsteczkowych. Przygotować pożądane rozcieńczenia przeciwciał w dostarczonym rozcieńczalniku. Należy pamiętać, że przeciwciała są zwykle stosowane w wyższych stężeniach w teście immunologicznym opartym na naczyniach włosowatych niż w tradycyjnym Western blot.
Przygotuj mieszaninę luminolu i nadtlenku jeden do jednego na świeżo przy każdym użyciu. Pobrać pipetą próbki i odczynniki na płytkę testową, używając objętości podanych w szablonie. Kodowanie kolorami reprezentuje prawidłowe ładowanie odczynników i próbek na płytkę testową.
Pipetować biotynylowaną drabinkę do studzienki A1, przygotować próbki do studzienek od A2 do A25. Dostarczony rozcieńczalnik przeciwciał do studzienek od B1 do B25 i dołka C1. Przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko studzienkom od C2 do C25. Streptawidyna HRP do studni D1. Przeciwciało wtórne do dołków od D2 do D25.
I mieszanina luminolu i nadtlenku do studzienek od E1 do E25. Dodaj bufor do płukania do pierwszych trzech rzędów większych studzienek na płycie środkowej. Włącz kapilarny test immunologiczny i otwórz dołączone oprogramowanie.
Załaduj wkład kapilarny i płytkę testową do urządzenia zgodnie z instrukcjami producenta i rozpocznij pracę. Po zakończeniu przebiegu należy sprawdzić, czy wzorce fluorescencyjne są prawidłowo zidentyfikowane i w razie potrzeby skorygować. Ponadto sprawdź, czy drabina biotynylowana pokazuje prawidłowe piki rozmiaru dla używanego zestawu.
Więcej informacji można znaleźć w skróconej instrukcji obsługi producenta lub instrukcji obsługi produktu. Optymalizacja warunków testu, takich jak czas ekspozycji, stężenie białka i rozcieńczenie przeciwciał, jest ważna dla uzyskania dokładnych, powtarzalnych wyników. Warunki te są specyficzne dla każdej kombinacji przeciwciał w układzie modelowym i dlatego powinny być określane empirycznie dla każdego nowego testu.
Zdolność do generowania wyników ilościowych zależy od analizy czasu ekspozycji, w którym substrat luminolu nie ulega szybkiemu wyczerpaniu, ponieważ zubożenie substratu powoduje utratę sygnału lub przepalenie sygnału. Można to ustalić, analizując dane przy różnych czasach ekspozycji na chemiluminescencję, jak pokazano na rysunku drugim. Ekspozycje z użyciem instrumentu wahały się od pięciu do 480 sekund.
Widoki Lane wykazały malejące stężenia białka w ekstraktach BEAS-2B badanych przeciwciałem p53 DO-1 w rozcieńczeniu od jednego do 500. Współczynniki sygnału chemiluminescencji zgłaszane jako wysokości pików w oprogramowaniu przyrządu są nakładane na siebie. Natężenia pasm wizualnych są automatycznie dostosowywane przez instrument i nie są porównywalne z jednego panelu do drugiego.
Współczynnik sygnału zmniejsza się wraz z kolejno dłuższymi ekspozycjami, jeśli luminol zostanie wyczerpany, jak widać tutaj. Sygnał zaczyna zanikać, a szczyt rozdziela się przy dwóch najdłuższych ekspozycjach. Z tego powodu do analizy danych wybrano krótki czas naświetlania wynoszący 15 sekund.
Całkowity wkład białka powinien być również zoptymalizowany dla każdego konkretnego testu i systemu modelowego. Do celów oceny ilościowej pomiary muszą być wykonywane w liniowym zakresie dynamicznym każdego testu. Gdzie zmiany sygnału, mierzone powierzchnią piku, są proporcjonalne do zmian ilości białka w próbce.
Miareczkowanie lizatu pokazuje widoki pasa lizatu BEAS-2B podczas sondowania z jednym do 500 przeciwciałami p53 DO-1 lub jednym do 50 przeciwciał alfa-tubuliny. Analiza regresji liniowej potwierdza, że testy są liniowe w całym badanym zakresie. Całkowite stężenia białka w środku zakresu liniowego zostały dobrane tak, aby uwzględnić potencjalną zmienność białka docelowego w dowolnym kierunku.
Jako ostateczną kwestię optymalizacyjną należy ocenić prawidłowe rozcieńczenie przeciwciał pierwszorzędowych. Stosowanie przeciwciał w stężeniach do zszycia pomaga zapewnić, że wszelkie zmierzone zmiany sygnału są spowodowane wyłącznie zmianami ilości białka. Dwie próbki białka BEAS-2B, reprezentowane przez niebieskie i pomarańczowe kropki, badano seryjnie rozcieńczonym przeciwciałem alfa-tubuliny.
Sygnał chemiluminescencyjny, mierzony jako powierzchnia piku, został wykreślony w stosunku do rozcieńczenia przeciwciała. Nasycenie zaobserwowano w pobliżu rozcieńczenia od jednego do 50, gdzie krzywa zaczyna się zauważalny plateau. W związku z tym wybrano rozcieńczenie od 1 do 50 jako optymalne rozcieńczenie dla tego przeciwciała.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś czuć się komfortowo, przygotowując próbki, ładując próbki i wykonując analizę na kapilarnym teście immunologicznym ProteinSimple Wes. Po opanowaniu tej procedury cały przebieg można wykonać w ciągu trzech godzin przy użyciu 25 próbek. Podczas analizy serii ważne jest, aby przeprowadzić kontrolę jakości dla każdej kapilary i próbki.
Obejmuje to weryfikację wzorców fluorescencyjnych w drabinie biotynylowej. Jeśli piki są nieprawidłowo zidentyfikowane, oprogramowanie analityczne powinno być używane głównie do identyfikacji prawidłowych pików i eliminacji nieprawidłowo zidentyfikowanych pików. Podobnie jak w przypadku wszystkich technik biologii molekularnej w laboratorium, należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, aby chronić siebie i swoje próbki.
Obejmuje to fartuch laboratoryjny, rękawice, okulary ochronne i buty z zakrytymi palcami. Ważne jest, aby pamiętać, że optymalizacja powinna być przeprowadzana dla każdego nowego celu, który jest mierzony lub gdy używane są różne źródła próbek. Walidacja i kroki następcze obejmują ocenę swoistości i sygnału przeciwciał przy użyciu oczyszczonego białka lub epitopu.
Badanie zakresu dynamicznego testu przy użyciu serii rozcieńczeń próbki i optymalizacja rozcieńczenia przeciwciał poprzez ocenę nasycenia sygnału w zakresie stężeń przeciwciał. Po zoptymalizowaniu, ta procedura immunologii kapilarnej powinna zapewnić szybszą, bardziej ilościową metodę pomiaru docelowego białka próbek biologicznych w porównaniu z tradycyjnymi metodami, takimi jak Western blot.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia kapilarny test immunoenzymatyczny z wykorzystaniem komercyjnej platformy do pomiaru białek docelowych w próbkach biologicznych. Metoda ta optymalizuje parametry analizy, takie jak czas ekspozycji, stężenie białka oraz rozcieńczenie przeciwciał, w celu poprawy dokładności i powtarzalności.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Techniki immunoanalizy
- Elektroforeza kapilarna
- Ilościowe oznaczanie białek
Wstęp
- Immunoanalizy z wykorzystaniem elektroforezy kapilarnej umożliwiają rozróżnianie i ilościowe oznaczanie białek w próbkach biologicznych.
- Metoda ta wymaga znacznie mniejszej ilości białka niż tradycyjne techniki, takie jak Western blotting.
- Wyniki można uzyskać w krótkim czasie, co zwiększa wydajność analizy białek.
- Optymalizacja warunków analizy jest kluczowa dla uzyskania dokładnych wyników.
Cel badania
- W celu zademonstrowania skuteczności platformy do immunoassay opartej na kapilarach.
- W celu optymalizacji parametrów analizy dla konkretnych systemów modelowych.
- W celu zapewnienia wiarygodnej alternatywy dla tradycyjnych metod ilościowego oznaczania białek.
Zastosowane metody
- Przygotowanie próbek białek z hodowli komórkowych.
- Optymalizacja rozcieńczeń przeciwciał i czasu ekspozycji.
- Wykorzystanie systemów zautomatyzowanych w celu zwiększenia powtarzalności.
- Ocena sygnałów chemiluminescencyjnych do analizy ilościowej.
Główne wyniki
- Kapilarne testy immunologiczne zapewniają wyniki ilościowe przy zmniejszonych objętościach próbek.
- Optymalizacja czasu ekspozycji jest niezbędna, aby zapobiec wyczerpaniu sygnału.
- Potwierdzono liniowy zakres dynamiczny dla różnych stężeń białek.
- Odpowiednie rozcieńczenie przeciwciał zapewnia dokładny pomiar poziomów białek.
Wnioski
- Immunoassay oparty na kapilarach stanowi realną alternatywę dla metod tradycyjnych.
- Zoptymalizowane warunki pozwalają na uzyskanie bardziej wiarygodnych i powtarzalnych wyników.
- Metoda ta jest szczególnie przydatna do analizy rzadkich typów komórek lub próbek o ograniczonej objętości.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Immunoanalizy kapilarne stanowią ilościową, zautomatyzowaną alternatywę dla tradycyjnego Westernu, zmniejszając wymagania dotyczące ilości białka wejściowego i skracając czas oczekiwania na wynik. Pozwala to na bardziej efektywną walidację celów oraz identyfikację związków wiodących we wczesnej fazie odkrywania, szczególnie w przypadku ograniczonych lub rzadkich typów próbek. Optymalizacja parametrów analizy zapewnia, że dane mieszczą się w liniowym zakresie dynamicznym, co wspiera niezawodne ograniczanie ryzyka mechanistycznego oraz zwiększa pewność prognostyczną w zakresie modulacji białek docelowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościowy pomiar poziomów białek docelowych w systemach istotnych dla przebiegu choroby.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego, zapewniając powtarzalną separację i detekcję białek na podstawie wielkości, bez artefaktów typowych dla metod żelowych.
- Wartość prognostyczna: Potwierdzenie liniowego zakresu dynamicznego pozwala na dokładną ocenę modulacji celu, co wspiera selekcję projektów w portfolio oraz podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go).
Przesiewy i opracowanie analizy
- Wartość naukowa: Przygotowuje walidowane systemy biologiczne do dalszych etapów analizy poprzez ustalenie liniowości testu oraz optymalnego rozcieńczenia przeciwciała.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność testu dzięki zastosowaniu zautomatyzowanej elektroforezy kapilarnej, co minimalizuje zmienność wynikającą z błędów operatora.
- Skalowalność: Umożliwia wiarygodną ocenę związków dzięki wysokiej przepustowości (25 próbek w ok. 3 godzinach) oraz możliwości ponownego wykorzystania platformy dla różnych białek docelowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wspiera przejście od etapu odkrywania do walidacji przedklinicznej poprzez utrzymanie spójnego, ilościowego pomiaru białek w różnych typach próbek.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Optymalizacja czasu ekspozycji i stężenia przeciwciał zapobiega wypaleniu sygnału oraz nasyceniu, zapewniając integralność danych dla dopasowania biomarkerów.
- Mechanistyczne ograniczanie ryzyka: Koncentracja na zakresie liniowym i krzywych nasycenia zwiększa pewność prognostyczną w zakresie angażowania celu i modulacji szlaków.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu badawczego, od wczesnego etapu odkrywania (Early Discovery) poprzez identyfikację wiodących związków (Lead Identification), aż po prace przedkliniczne, umożliwiając weryfikację hipotez, wyjaśnianie szlaków sygnałowych oraz ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki ilościowej analizie białek.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez ilościowe oznaczanie białek na podstawie ich wielkości w lizatach komórkowych.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy dzięki zoptymalizowanym czasom ekspozycji, stężeniom białek i rozcieńczeniom przeciwciał, co gwarantuje ilościowe i powtarzalne wyniki.
- Analityka: Umożliwia pomiary sygnału chemiluminescencyjnego (pole/wysokość piku), co pozwala na porównanie poziomów białek w różnych warunkach i po zastosowaniu różnych zabiegów.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość w badaniach przedklinicznych, umożliwiając spójną kwantyfikację białek od hodowli komórkowych po próbki płynów biologicznych.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Stanowi możliwość ponownego wykorzystania w odniesieniu do wielu celów i systemów modelowych po empirycznym ustaleniu parametrów specyficznych dla danej analizy.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Pewność predykcyjna w walidacji celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej oraz poprawa ilościowego charakteru danych.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność dzięki automatyzacji oraz skróceniu czasu pracy manualnej.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), efektywność kapitałowa oraz zredukowane ryzyko biologiczne na późnych etapach dzięki wczesnym i wiarygodnym danym dotyczącym modulacji celu.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko oraz decyzje o dalszym rozwoju oparte na liniowych pomiarach białek z potwierdzonym nasyceniem.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w projektowaniu testów immunologicznych, zasadach elektroforezy kapilarnej oraz detekcji chemiluminescencyjnej.
- Zależne od aparatury umożliwiającej zautomatyzowane wprowadzanie próbek, rozdział i detekcję (np. platforma ProteinSimple Wes).
- Wymaga standaryzacji protokołów przygotowania próbek, obchodzenia się z przeciwciałami oraz analizy danych pomiędzy zespołami.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji podczas przenoszenia metody między systemami modelowymi lub źródłami próbek ze względu na efekty macierzy i stabilność białek.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność empirycznej optymalizacji dla każdej kombinacji przeciwciało-antygen oraz potencjalne zakłócenia sygnału przez białka o wysokiej zawartości.
