Name: Opracowanie i walidacja ultraczułego, cyfrowego testu immunoenzymatycznego z pojedynczą matrycą cząsteczek dla ludzkiego interferonu-α (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Poznaj cyfrowy test immunoenzymatyczny z pojedynczą matrycą cząsteczek do wykrywania ludzkiego interferonu-α. Ta metoda umożliwia niezwykle czułą detekcję podtypów IFN-α w próbkach pacjentów z chorobami autoimmunologicznymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

DD i YJC potwierdzają wsparcie ze strony ANR (Projekt IFNX, no. CE17001002) oraz ImmunoQure AG za dostarczanie przeciwciał monoklonalnych. Dziękujemy Brigitte Bader-Meunier, Nathalii Bellon, Christine Bodemer, Alexowi Belotowi, Isabelle Melki i Pierre'owi Quartierowi za dostarczenie próbek klinicznych. YJC przyjmuje do wiadomości Europejską Radę ds. Badań Naukowych (GA 309449: Fellowship to YJC) oraz dotację państwową zarządzaną przez Narodową Agencję Badawczą (Francja) w ramach programu "Investments for the Future" o numerze referencyjnym ANR-10-IAHU-01.

<ol><li>Isaacs, A., Lindenmann, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13465720">Classics in Oncology Virus Interference: I. The Interferon.</a> Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 258-267 (1957).</li>
<li>Isaacs, A., Lindenmann, J., Valentine, R. C., Alerts, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pillars+Article%3A+Virus+Interference.+II.+Some+Properties+of+Interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+London.+Ser.+B%2C+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Pillars Article: Virus Interference. II. Some Properties of Interferon.</a> Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 268-273 (1957).</li>
<li>Hunt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombotic+Microangiopathy+Associated+with+Interferon+Beta%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Thrombotic Microangiopathy Associated with Interferon Beta.</a> N. Engl. J. Med. 370, 1270-1271 (2014).</li>
<li>Hooks, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+Interferon+in+the+Circulation+of+Patients+with+Autoimmune+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Immune Interferon in the Circulation of Patients with Autoimmune Disease.</a> N. Engl. J. Med. 301, 5-8 (1979).</li>
<li>Greenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-alpha%2Fbeta+Mediated+Innate+Immune+Mechanisms+in+Dermatomyositis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Interferon-alpha/beta Mediated Innate Immune Mechanisms in Dermatomyositis.</a> Ann. Neurol. 57, 664-678 (2005).</li>
<li>Crow, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+interferonopathies+a+novel+set+of+inborn+errors+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Type I interferonopathies a novel set of inborn errors of immunity.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1238, 91-98 (2011).</li>
<li>Rodero, M. P., Crow, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+interferon+-+mediated+monogenic+autoinflammation%3A+The+type+I+interferonopathies%2C+a+conceptual+overview%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Type I interferon - mediated monogenic autoinflammation: The type I interferonopathies, a conceptual overview.</a> J. Exp. Med. 213, 2527-2538 (2016).</li>
<li>Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+biological+assay+for+interferons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive biological assay for interferons.</a> J. Immunol. Methods. 185, 9-17 (1995).</li>
<li>Meager, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+assays+for+interferons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Biological assays for interferons.</a> J. Immunol. Methods. 261, 21-36 (2002).</li>
<li>Hua, J., Kirou, K., Lee, C., Crow, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Assay+of+Type+I+Interferon+in+Systemic+Lupus+Erythematosus+Plasma+and+Association+With+Anti+-+RNA+Binding+Protein+Autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Functional Assay of Type I Interferon in Systemic Lupus Erythematosus Plasma and Association With Anti - RNA Binding Protein Autoantibodies.</a> Arthritis Rheumatol. 54, 1906-1916 (2006).</li>
<li>Niewold, T. B., Kariuki, S. N., Morgan, G. A., Shrestha, S., Pachman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+serum+interferon-alpha+activity+in+juvenile+dermatomyositis%3A+associations+with+disease+activity+at+diagnosis+and+after+thirty-six+months+of+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Elevated serum interferon-alpha activity in juvenile dermatomyositis: associations with disease activity at diagnosis and after thirty-six months of therapy.</a> Arthritis Rheumatol. 60, 1815-1824 (2009).</li>
<li>Seo, Y., Kim, G., Kwak, H., Nam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+HeLa+Mx2+%2F+Luc+Reporter+Cell+Line+for+the+Quantification+of+Human+Type+I+Interferons%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Validation of a HeLa Mx2 / Luc Reporter Cell Line for the Quantification of Human Type I Interferons.</a> Pharmacology. 84, 135-144 (2009).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+surface+expression+of+Fc%CE%B3+receptor+RI+%28+CD64+%29%2C+a+biomarker+reflecting+type-I+interferon+levels+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res.+Ther%22%5BJournal%5D)">Monocyte surface expression of Fcγ receptor RI ( CD64 ), a biomarker reflecting type-I interferon levels in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Res. Ther. 12, 1-12 (2010).</li>
<li>Berger-Rentsch, M., Zimmer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Vesicular+Stomatitis+Virus+Replicon-Based+Bioassay+for+the+Rapid+and+Sensitive+Determination+of+Multi-Species+Type+I+Interferon%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Vesicular Stomatitis Virus Replicon-Based Bioassay for the Rapid and Sensitive Determination of Multi-Species Type I Interferon.</a> PLoS One. 6, e25858(2011).</li>
<li>Rissin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+enzyme-linked+immunosorbent+assay+detects+serum+proteins+at+subfemtomolar+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations.</a> Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).</li>
<li>Wu, D., Milutinovic, M. D., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+array+%28Simoa%29+assay+with+optimal+antibody+pairs+for+cytokine+detection+in+human+serum+samples%5BTitle%5D)+AND+%22R.+Soc.+Chem%22%5BJournal%5D)">Single molecule array (Simoa) assay with optimal antibody pairs for cytokine detection in human serum samples.</a> R. Soc. Chem. 140, 6277-6282 (2015).</li>
<li>Simoa. Scientific Principle of SimoaTM (Single Molecule Array) Technology. <a target="_blank" href="http://www.healthtech.com/uploadedFiles/Conferences/White_Papers/MXA/Scientific-Principles-of-Simo-Technology.pdf">Whitepaper 1.0</a>. , Quanterix Corp. 1-2 (2013).</li>
<li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+enzyme-linked+immunosorbent+assays+Theoretical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single molecule enzyme-linked immunosorbent assays Theoretical considerations.</a> J. Immunol. Methods. 378, 102-115 (2012).</li>
<li>Yeung, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+highly+sensitive+immunoassay+technologies+for+quantitative+measurements+of+sub-pg+%2F+mL+levels+of+cytokines+in+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of highly sensitive immunoassay technologies for quantitative measurements of sub-pg / mL levels of cytokines in human serum.</a> J. Immunol. Methods. 437, 53-63 (2016).</li>
<li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+measurements+of+tumor+necrosis+factor+%CE%B1+and+interleukin-6+in+the+plasma+of+patients+with+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single molecule measurements of tumor necrosis factor α and interleukin-6 in the plasma of patients with Crohn's disease.</a> J. Immunol. Methods. 372, 177-186 (2011).</li>
<li>Meissner, E. G., Decalf, J., Casrouge, A., Masur, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Changes+of+Post-Translationally+Modified+Forms+of+CXCL10+and+Soluble+DPP4+in+HCV+Subjects+Receiving+Interferon-Free+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dynamic Changes of Post-Translationally Modified Forms of CXCL10 and Soluble DPP4 in HCV Subjects Receiving Interferon-Free Therapy.</a> PLoS One. 10, e0133236(2015).</li>
<li>Decalf, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+DPP4+activity+in+humans+establishes+its+in+vivo+role+in+CXCL10+post-translational+modification%3A+prospective+placebo-controlled+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Inhibition of DPP4 activity in humans establishes its in vivo role in CXCL10 post-translational modification: prospective placebo-controlled clinical studies.</a> EMBO Mol. Med. 8, 679-683 (2016).</li>
<li>Rabing Brix Petersen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+in+plasma+from+patients+with+diabetic+retinopathy+-+development+and+validation+of+digital+ELISA+by+Single+Molecule+Array+%28Simoa%29+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin in plasma from patients with diabetic retinopathy - development and validation of digital ELISA by Single Molecule Array (Simoa) technology.</a> J. Immunol. Methods. 446, 60-69 (2017).</li>
<li>Disanto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+Neurofilament+Light%3A+A+Biomarker+of+Neuronal+Damage+in+Multiple+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Serum Neurofilament Light: A Biomarker of Neuronal Damage in Multiple Sclerosis.</a> Ann. Neurol. 81, 857-870 (2017).</li>
<li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+digital+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+ultrasensitive+measurement+of+amyloid-+%CE%B2+1+-+42+peptide+in+human+plasma+with+utility+for+studies+of+Alzheimer%27s+disease+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers.+Res.+Ther%22%5BJournal%5D)">A digital enzyme-linked immunosorbent assay for ultrasensitive measurement of amyloid- β 1 - 42 peptide in human plasma with utility for studies of Alzheimer's disease therapeutics.</a> Alzheimers. Res. Ther. 8, 1-15 (2016).</li>
<li>Passaes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+HIV-1+p24+Assay+Detects+Single+Infected+Cells+and+Differences+in+Reservoir+Induction+by+Latency+Reversal+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive HIV-1 p24 Assay Detects Single Infected Cells and Differences in Reservoir Induction by Latency Reversal Agents.</a> J. Virol. 91, e02296(2017).</li>
<li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Detection+of+Bacterial+Genomic+DNA+at+Sub-Femtomolar+Concentrations+Using+Single+Molecule+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct Detection of Bacterial Genomic DNA at Sub-Femtomolar Concentrations Using Single Molecule Arrays.</a> Anal. Chem. 85, 1932-1939 (2013).</li>
<li>Cohen, L., Hartman, M. R., Amardey-wellington, A., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+direct+detection+of+microRNAs+using+single+molecule+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Digital direct detection of microRNAs using single molecule arrays.</a> Nucleic Acids Res. 45, e137(2017).</li>
<li>Meyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AIRE-Deficient+Patients+Harbor+Unique+High-Affinity+Disease-Ameliorating+Autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">AIRE-Deficient Patients Harbor Unique High-Affinity Disease-Ameliorating Autoantibodies.</a> Cell. 166, 582-595 (2016).</li>
<li>Simoa. Homebrew Assay Development Guide. Simoa HD-1 Analyzer & Quanterix SR-X. User-0021 08. , Quanterix corporation. (2017).</li>
<li>Rodero, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+interferon+alpha+protein+reveals+differential+levels+and+cellular+sources+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Detection of interferon alpha protein reveals differential levels and cellular sources in disease.</a> J. Exp. Med. 214, 1547-1555 (2017).</li>
<li>Pleil, J., Angrish, M., Madden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemistry+for+high-throughput+screening+of+human+exhaled+breath+condensate+%28EBC%29+media+implementation+of+automated+Quanterix+SIMOA+instrumentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Breath+Res%22%5BJournal%5D)">Immunochemistry for high-throughput screening of human exhaled breath condensate (EBC) media implementation of automated Quanterix SIMOA instrumentation.</a> J. Breath Res. 9, 047108(2015).</li>
<li>Schiess, R., Wollscheid, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Proteomic+Strategy+for+Clinical+Biomarker+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Targeted Proteomic Strategy for Clinical Biomarker Discovery.</a> Mol. Oncol. 3, 33-44 (2009).</li>
<li>Wilson, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Simoa+HD-1+Analyzer%3A+A+Novel+Fully+Automated+Digital+Immunoassay+Analyzer+with+Single-Molecule+Sensitivity+and+Multiplexing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Autom%22%5BJournal%5D)">The Simoa HD-1 Analyzer: A Novel Fully Automated Digital Immunoassay Analyzer with Single-Molecule Sensitivity and Multiplexing.</a> J. Lab. Autom. 21, 533-547 (2016).</li>
<li>Rivnak, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fully-automated%2C+six-plex+single+molecule+immunoassay+for+measuring+cytokines+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A fully-automated, six-plex single molecule immunoassay for measuring cytokines in blood.</a> J. Immunol. Methods. 424, 20-27 (2015).</li>
<li>Anderson, N. L., Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Plasma+Proteome.+History%2C+character%2C+and+diagnostic+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+proteomics%22%5BJournal%5D)">The Human Plasma Proteome. History, character, and diagnostic prospects.</a> Mol. Cell. proteomics. 1, 845-867 (2002).</li>
<li>Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+in+the+multiplex+era%3A+Potentials+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin.+Appl%22%5BJournal%5D)">ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls.</a> Proteomics Clin. Appl. 9, 406-422 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszym artykule opisaliśmy rozwój i walidację wysoce powtarzalnego, ultraczułego cyfrowego testu ELISA z pojedynczą matrycą molekuł do bezpośredniego oznaczania ilościowego białka IFN-α w próbkach ludzkich (kroki podsumowane w tabeli 1). Jednym z najważniejszych etapów rozwoju testu jest wybór pary przeciwciał16, przy czym charakterystyka pod względem kinetyki i wiązania epitopów jest kluczem do udanego testu. Ważne jest, aby unikać stosowania sparowanych przeciwciał monoklonalnych, które są ukierunkowane na ten sam epitop lub powodują utrudnienie steryczne. Przeciwciała poliklonalne mogą być stosowane jako przeciwciała wykrywające w celu przezwyciężenia takich ograniczeń. Jeśli na którymkolwiek etapie pożądana czułość nie zostanie osiągnięta, należy rozważyć dalsze możliwości optymalizacji. Może to obejmować stosowanie alternatywnych par przeciwciał, zmiany parametrów, takich jak typ białka (np. BSA < kazeina), pH (6,0 - 8,5), siła jonowa, zdolność buforowa (np. stężenie NaCl i fosforanów), kulki nośnikowe i/lub obecność środków powierzchniowo czynnych. Szeroki zakres parametrów może być zoptymalizowany podczas opracowywania testu z matrycą pojedynczych cząsteczek. Jednak ogólnie rzecz biorąc, preferowane są warunki, które dają wysokie proporcje sygnału do tła i minimalne poziomy szczegółowości (zob. rys. 1, rys. 2 i rys. 3).
Jeśli chodzi o swoistość, test IFN-α nie wykazał reaktywności krzyżowej dla żadnych innych badanych IFN (β, γ, λ1, λ2, ω) (Figura 4a) i był w stanie wykryć wszystkie 13 podtypów IFN-α (Rysunek 4b). Jednak test wykazał mniejsze powinowactwo do podtypu IFN-α2 (Figura 4b i Tabela Uzupełniająca 4). Co ciekawe, zaobserwowano również różne czułości dla różnych klas IFN-α2 (a, b, c), co może wynikać z odmiennych procedur wytwarzania lub różnych sekwencji aminokwasów, ponieważ podtypy IFN-α2 uzyskano od różnych dostawców komercyjnych. Z tym jedynym wyjątkiem, wszystkie gatunki IFN-α dawały bardzo podobne odpowiedzi. Specyficzność testu została dodatkowo wykazana przez wstępne potraktowanie próbek klonem anty-IFN-α A, który zniósł sygnał (rysunek 6 i tabela uzupełniająca 6).
Jedną z głównych zalet tej technologii jest to, że każdy analit będący przedmiotem zainteresowania może być potencjalnie ukierunkowanyna 16. Ponadto można badać różne próbki biologiczne, takie jak surowica, osocze, płyn mózgowo-rdzeniowy, lizaty komórkowe, supernatanty hodowlane31 , a nawet oddech32. Zwykle przeprowadza się rozcieńczenie osocza w stosunku 1:3, aby uniknąć potencjalnego zatkania analizatora macierzy jednocząsteczkowej. Jednak analit będący przedmiotem zainteresowania może być obecny w bardzo niskich stężeniach w odpowiedniej próbce biologicznej i mogą być wymagane wyższe stężenia próbki (w zależności od czułości testu)33. Chociaż istnieje potencjał multipleksowania przy zachowaniu dobrej czułości34, jest to trudniejszy proces, a testy do pomiaru więcej niż 6 białek w tych samych eksperymentach nie zostały jeszcze opracowane35.
Zdolność do wykrywania i ilościowego oznaczania cytokin i innych biologicznie istotnych białek w tak niskich stężeniach otwiera zupełnie nowy zakres zastosowań33,36. Powszechnie wiadomo, że wiele białek wywiera swoje działanie nawet przy bardzo niskich stężeniach, które do tej pory znajdowały się poniżej granicy wykrywalności najlepszych testów ELISA37. Podczas gdy inne technologie testów immunologicznych oferują przewagę nad konwencjonalnym testem ELISA19, wykazaliśmy tutaj, że cyfrowy test ELISA z pojedynczą matrycą molekuł jest powtarzalną i solidną platformą do ultraczułego wykrywania cytokin o niskim stężeniu w próbkach ludzkich. W związku z tym technologia ta oferuje ogromny potencjał w zakresie odkrywania biomarkerów i lepszego zarządzania pacjentami w szerokim zakresie chorób.

IFN typu I to rodzina cytokin, które odgrywają kluczową rolę w organizowaniu przeciwwirusowych odpowiedzi immunologicznych. Po raz pierwszy zostały odkryte przez Isaacsa i Lindenmanna 60 lat temu1,2 i obecnie wiadomo, że ta niejednorodna rodzina polipeptydów obejmuje 14 różnych podklas (13 podtypów IFN-α i 1 IFN-β). IFN typu I są niezbędne do usuwania infekcji wirusowych, ale są również zaangażowane w patologię różnych stanów chorobowych człowieka, w tym zaburzeń autoimmunologicznych tocznia rumieniowatego układowego (SLE), młodzieńczego zapalenia skórno-mięśniowego (JDM) i interferonopatii typu I, w których konstytutywna sygnalizacja indukowana przez IFN typu I powoduje patologię3,4,5,6, 7.
Badanie poziomów białka IFN typu I w próbkach biologicznych było wyzwaniem od czasu jego początkowej identyfikacji jako "substancji zakłócającej"1,2. Obecnie test immunosorbentowy sprzężony z enzymem kanapkowym (ELISA) jest najczęściej stosowaną metodą wykrywania białka IFN-α. Pomimo tego, że są specyficzne, proste i szybkie, testy ELISA IFN typu I mają poważne ograniczenia, takie jak ograniczona czułość. Ponadto pomiar wszystkich podtypów IFN-α wymaga użycia wielu testów, z których każdy ma własną zdolność wykrywania i czułość. Chociaż istnieją komercyjne testy ELISA, które wykrywają różne podtypy IFN-α, ich czułość jest ograniczona (odpowiednio 1,95 pg/mL, 12,5 pg/ml i 12,5 pg/ml), co często jest niewystarczające do wykrycia białka IFN-α w próbkach biologicznych. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, opracowano kilka biologicznych testów zastępczych w celu ilościowego określenia IFN typu I poprzez pomiar indukowanej ekspresji genów lub aktywności funkcjonalnej8,9,10,11,12,13,14. Niemniej jednak testy te nie zapewniają bezpośredniego pomiaru białka IFN-α.
W tym badaniu, technologia cyfrowego testu ELISA z pojedynczą matrycą molekuł została wykorzystana do opracowania testu do wykrywania pojedynczych cząsteczek białka IFN-α. Cyfrowy test ELISA wykorzystuje tę samą podstawową chemię, co konwencjonalna funkcja ELISA, jednak reakcja zachodzi w tablicach składających się z 50 000 indywidualnych studzienek o rozmiarach 46 femtolitrów15,16. Pojedyncze cząsteczki białka są wychwytywane przez kulki paramagnetyczne pokryte przeciwciałem i znakowane biotynylowanym przeciwciałem detekcyjnym, a następnie wiązane jest koniugatem enzymu, streptawidyną-β-galaktozydazą (SBG). Następnie kulki są zawieszane za pomocą fluorogennego substratu enzymatycznego, rezorufin-β-D-galaktopyranozydu (RGP), w układach jednocząsteczkowych. Zmniejszając reakcję objętościową 2 miliardy razy17, osiąga się wysokie lokalne stężenie sygnału fluorescencyjnego i liczba pojedynczych cząsteczek staje się możliwa, ponieważ każda cząsteczka generuje sygnał, który można teraz wiarygodnie zmierzyć18. Zasadniczo macierze pojedynczych cząsteczek są zdolne do zliczania pojedynczych immunokompleksów i określania średniej liczby enzymów na kulkę (AEB). Liczenie mikrostudzienek, w których wykryty jest sygnał, pozwala na kwantyfikację/digitalizację cząsteczek białka, ponieważ istnieje bezpośrednia korelacja między stężeniem białka a stosunkiem między kulkami immunokompleksowymi a całkowitą liczbą kulek obecnych w komorach o rozmiarach femtolitrów.
Yeung et al. przeprowadzili obszerne badanie oceniające na różnych platformach, używając dziewięciu różnych technologii i czterech testów immunologicznych cytokin w celu porównania precyzji testu, czułości i korelacji danych na różnych platformach19. Jednym z kluczowych ustaleń badania było to, że macierze pojedynczych cząsteczek i test immunologiczny zliczający pojedyncze cząsteczki wykazały najwyższą czułość wykrywania cytokin w ludzkiej surowicy w zakresie stężeń sub-pg/mL. Cyfrowe testy cytokin ELISA z pojedynczą matrycą cząsteczek zostały wykorzystane do zbadania roli TNF-α i IL-6 w chorobie Leśniowskiego-Crohna20, IFN-α u pacjentów z interferonopatią i autoimmunologią <klasa sup="xref">7 oraz różne zmodyfikowane potranslacyjnie formy chemokiny motywu C-X-C 10 (CXCL10) u przewlekłego zapalenia wątroby i zdrowych dawców otrzymujących sitagliptynę21,22. Inne zastosowania obejmują pomiar rodopsyny u pacjentów z retinopatią cukrzycową23; badanie patologii mózgu poprzez pomiary surowicy/osocza światła neurofilamentu24 i peptydu amyloid-β 1-42<klasa sup="xref">25, odpowiednio w kontekście stwardnienia rozsianego i choroby Alzheimera. Testy z matrycą jednocząsteczkową mogą być również wykorzystywane do lepszego wykrywania patogenów, takich jak charakterystyka rezerwuaru wirusa HIV26, a także do wykrywania DNA27 i mikro RNAs28. Główną zaletą technologii macierzy pojedynczych cząsteczek jest wysoka wszechstronność, ponieważ test przeciwko dowolnemu analitowi będącemu przedmiotem zainteresowania można opracować, jeśli dostępna jest określona para przeciwciał. Ponadto na rynku dostępne są zestawy testowe homebrew, co pozwala na opracowywanie nowych testów, których protokół jest szczegółowo opisany w zmodyfikowanej formie poniżej.
Tutaj przedstawiono szczegółowy opis etapów rozwoju i walidacji testu z pojedynczą matrycą molekuł, co skutkuje zwiększoną czułością wykrywania białek IFN-α. Przeciwciała do testów z matrycą jednocząsteczkową powinny być wysoce specyficzne, unikając reaktywności krzyżowej z pokrewnymi białkami (w razie potrzeby z uwzględnieniem swoistości gatunkowej). Idealnie powinny być wybrane przeciwciała oK D mniejszym niż 10-9 M; Wysokie powinowactwo zapewnia silne wiązanie, przy produkcji wyższego sygnału. Kinetyka wiązania przeciwciało-antygen jest również ważna, a szybkiewłączanie i powolnewyłączanie K będzie sprzyjać składaniu kompleksu antygen-przeciwciało. Rozpoczęcie od pary przeciwciał, która ma dobre wyniki w klasycznym teście ELISA, z granicą wykrywalności (LOD) 1 - 100 pg/mL, zwiększa szanse na uzyskanie wysoce czułego testu macierzy pojedynczej cząsteczki. Chang i jego koledzy przeprowadzili szczegółowe badania kinetyczne interakcji biomolekularnych zachodzących na każdym etapie, proponując zestaw równań do przewidywania czułości analitycznej18. Wykazali, że cyfrowy test ELISA z pojedynczą matrycą molekularną wydaje się być skuteczny w szerokim zakresie powinowactwa przeciwciał (KD~10−11 - 10−9 M), a także, że generowanie sygnału jest bardziej zależne od szybkości takich przeciwciał.
Aby wykorzystać przeciwciała o wysokim powinowactwie, wykorzystaliśmy przeciwciała wyizolowane od pacjentów z autoimmunologicznym zespołem poliendokrynopatii typu 1/autoimmunologicznej poliendokrynopatii-kandydozy-dystrofii ektodermalnej (APS1/APECED)29. Z powodów, które nie są jeszcze zrozumiałe, zdecydowana większość osób z niedoborem AIRE rozwija podstawowy zestaw przeciwciał o wysokiej awidności przeciwko wszystkim podtypom IFN-α29, a my wybraliśmy dwa klony przeciwciał anty-IFN-α o komplementarnym powinowactwie wiązania dla różnych podtypów IFN-α, jak oszacowano przez IC50 Wartości. Połączenie tych unikalnych przeciwciał o wysokim powinowactwie z technologią macierzy jednocząsteczkowych umożliwiło bezpośrednie oznaczanie ilościowe IFN-α w stężeniach attomolowych (fg/ml). Takie ultraczułe wykrywanie białka IFN-α przyczyni się do lepszego zrozumienia natury, regulacji i biologicznego wpływu odpowiedzi indukowanej przez IFN w różnych warunkach chorobowych.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało anty-IFN-&alpha A (klon 8H1)</td><td>ImmunoQure AG</td><td>NA</td><td>Niedostępne w handlu</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-IFN-&alfa B (klon 12H5)</td><td>ImmunoQure AG</td><td>NA</td><td>Niedostępne na rynku</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-IFN-&alfa Klon EBI-1</td><td>eBioscience</td><td>BMS216C</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-IFN-&alfa BMS216BK klon</td><td>eBioscience</td><td>BMS216BK</td><td>Nie zestaw ELISA, ale masowy abs</td></tr><tr><td>IFN i alfa; 2c</td><td>eBioscience</td><td>BMS305</td><td>OK</td></tr><tr><td>IFN &alpha; I (17)</td><td>PBL</td><td>11150-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; 2a</td><td>PBL</td><td>11100-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; 2a</td><td>PeproTech</td><td>Nie jest już dostępny</td><td></td></tr><tr><td>IFN i alfa; 2b</td><td>PBL</td><td>11105-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; 1</td><td>PBL</td><td>11175-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; 4a (M1)</td><td>PBL</td><td>11177-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; 4b (a4)</td><td>PBL</td><td>11180-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; B2 (a8)</td><td>PBL</td><td>11115-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; C (a10)</td><td>PBL</td><td>11120-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; D (a1)</td><td>PBL</td><td>11125-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; G (a5)</td><td>PBL</td><td>11135-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; F (a21)</td><td>PBL</td><td>11130-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; H2 (a14)</td><td>PBL</td><td>11145-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; J1 (a7)</td><td>PBL</td><td>11160-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; K (a6)</td><td>PBL</td><td>11165-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; WA (a16)</td><td>PBL</td><td>11190-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &lambda; 1</td><td>PeproTech</td><td>300-02L</td><td></td></tr><tr><td>IFN i lambda; 2</td><td>PeproTech</td><td>300-02K</td><td></td></tr><tr><td>IFN i omega;</td><td>PeproTech</td><td>300-02J</td><td></td></tr><tr><td>IFN & beta;</td><td>PeproTech</td><td>300-02BC</td><td></td></tr><tr><td>IFN &gamma;</td><td>PeproTech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>Anty-IFN-&alfa; ELISA</td><td>PBL</td><td>41115.1</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki</td><td>Corning</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>ISRE-Reporter</td><td>Qiagen</td><td>CCS-008L</td><td></td></tr><tr><td>Fu-GENE HD Odczynnik do transfekcji</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Zredukowana surowica Mediuem</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Test reporterowy z podwójną lucyferazy</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40 Substitute</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr NanoDrop 1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nie jest już dostępny</td><td></td></tr><tr><td>Probówki mikocentryczne Amicon - filtry 0,5 ml</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC505096</td><td></td></tr><tr><td>Bead Conjugation Buffer</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>Nie można zamówić osobno</td></tr><tr><td>Niekodowany Koraliki paramagnetyczne</td><td>Quanterix</td><td>101360</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do płukania koralików</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>Nie można zamówić osobno</td></tr><tr><td>EDC</td><td>Fisher Scientific</td><td>11844071</td><td></td></tr><tr><td>Bufor blokujący koraliki</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>Nie można zamówić osobno</td></tr><tr><td>Bufor rozcieńczalnika kulek</td><td>Quanterix</td><td>101362</td><td></td></tr><tr><td>Detektor i próbka Diluent</td><td>Quanterix</td><td>101359</td><td></td></tr><tr><td>Bufor reakcyjny biotynylacji</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>Nie można zamówić osobno</td></tr><tr><td>NHS-PEG4-Biotin</td><td>Fisher Scientific</td><td>11891195</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka diH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>do probówek do mikrowirówek 1,7 ml (wirówka Heraens Fresco 21)</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002478</td><td></td></tr><tr><td>Standardowy laboratoryjny mieszalnik wirowy (MS2 Minishaker)</td><td>Pipety IKA</td><td>MS2</td><td></td></tr><tr><td>(10, 20, 200 i 1000 &mu; l)</td> <td>Wskazówki Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(10, 20, 200 i 1000 &mu; l)</td> <td>Probówki do</td> mikrowirówek Thermo Scientific <td></td><td></td></tr><tr><td>1,7 ml</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Separator magnetyczny, który mieści probówki do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml (Life Technologies DynaMag-2)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Mini wirówka stołowa (Galaxy MinisStar)</td> <td>VWR</td><td>521-2844</td><td></td></tr><tr><td>Mieszarka/wytrząsarka (Eppendorf Thermomixer Comfort)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single Molecule Array: odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SBG, etykiety z kodami kreskowymi z kulkami i detektorami</td><td></td><td></td> Butelki z odczynnikami Quanterix 101652 <td></td></tr><tr><td>15 ml</td><td>Quanterix</td><td>102411</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe do próbek Simoa</td><td>Quanterix</td><td>101457</td><td></td></tr><tr><td>Krążki Simoa</td><td>Quanterix</td><td></td><td></td>100001</tr><tr><td>Simoa 2.0 końcówki przewodzące</td><td>Kuwety Quanterix</td><td>101726</td><td></td></tr><tr><td>Simoa</td><td>Quanterix</td><td>100803</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Simoa SBG</td><td>Quanterix</td><td>102295</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Simoa RGP</td><td>Quanterix</td><td>101736</td><td></td></tr><tr><td>Simoa System Buffer 1</td><td>Quanterix</td><td>100486</td><td></td></tr><tr><td>Simoa System Buffer 2</td><td>Quanterix</td><td>100487</td><td></td></tr><tr><td>Olej uszczelniający</td><td>Quanterix</td><td>100206</td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analizator Simoa HD-1</td><td>Quanterix</td><td>100032</td><td></td></tr><tr><td>Technologies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tablica jednocząsteczkowa (Simoa)</td><td>Quanterix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zliczanie pojedynczych cząsteczek Systemy testów immunologicznych Erenna</td><td>Singluex</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

opracowanie i walidacja ultraczułego, cyfrowego testu immunoenzymatycznego z pojedynczą matrycą cząsteczek dla ludzkiego interferonu-α

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Głównym celem tego protokołu jest opisanie rozwoju i walidacji testu ELISA, cyfrowego testu immunosorbentowego (ELISA) z interferonem (IFN)-α pojedynczej cząsteczki. System ten umożliwia ilościowe oznaczanie ludzkiego białka IFN-α z niespotykaną dotąd czułością i bez reaktywności krzyżowej dla innych gatunków IFN.
Pierwszym kluczowym krokiem protokołu jest wybór pary przeciwciał, następnie koniugacja przeciwciała wychwytującego z kulkami paramagnetycznymi i biotynylacja przeciwciała wykrywającego. Po tym etapie można modyfikować różne parametry, takie jak konfiguracja testu, stężenie przeciwciał w detektorze i skład buforu, aż do osiągnięcia optymalnej czułości. Na koniec ocenia się swoistość i odtwarzalność metody, aby zapewnić pewność wyników. Tutaj opracowaliśmy test macierzy jednocząsteczkowej IFN-α z granicą wykrywalności 0,69 fg / ml przy użyciu autoprzeciwciał o wysokim powinowactwie wyizolowanych od pacjentów z mutacjami biallelicznymi w białku regulatora autoimmunologicznego (AIRE) powodującym autoimmunologiczny zespół poliendokrynopatii typu 1 / autoimmunologiczną poliendokrynopatię-kandydozę-dystrofię ektodermalną (APS1 / APECED). Co ważne, przeciwciała te umożliwiły wykrycie wszystkich 13 podtypów IFN-α.
Ta nowa metodologia pozwala po raz pierwszy na wykrywanie i kwantyfikację białka IFN-α w ludzkich próbkach biologicznych przy stężeniach attomolowych. Takie narzędzie będzie bardzo przydatne w monitorowaniu poziomu tej cytokiny w ludzkim zdrowiu i stanach chorobowych, w szczególności infekcji, autoimmunizacji i autozapaleniu.

Podsumowując, opracowano pan-IFN-α test macierzy pojedynczych cząsteczek z granicą wykrywalności 0,69 fg/mL, wykorzystujący dwuetapową konfigurację z kuleczkami wychwytującymi pokrytymi przeciwciałem anty-IFN-α A w stężeniu 0,3 mg/mL oraz przeciwciałem detekcyjnym anty-IFN-α B biotynilowanym w stosunku biotyny do przeciwciała wynoszącym 30. Stężenia zastosowane dla biotynilowanego przeciwciała detekcyjnego i SBG wynosiły odpowiednio 0,3 µg/mL oraz 150 pM. Ten wysoce specyficzny test umożliwia wykrywanie wszystkich 13 podtypów IFN-α i nie wykazuje reakcji krzyżowej z innymi typami IFN. W związku z tym, choć nie jest możliwe zidentyfikowanie i ilościowe oznaczenie każdego poszczególnego gatunku IFN-α, wszystkie one mogą być wykrywane i mierzone wspólnie, co daje całkowitą wartość stężenia IFN-α, obejmującą 13 różnych podklas.
Aby zbadać potencjalną wartość diagnostyczną nowo opracowanego testu, zmierzono poziom białka IFN-α w osoczu i surowicy zdrowych osób i porównano go z próbkami pobranymi od pacjentów cierpiących na SLE i JDM. Jak pokazano na Ryc. 7, w obu grupach z chorobami wykryto wysokie poziomy białka IFN-α w porównaniu z grupą kontrolną osób zdrowych. Linia przerywana oznacza LOD konwencjonalnego, dostępnego komercyjnie testu ELISA, co ilustruje, że podejście to nie wykryłoby białka IFN-α w tych grupach pacjentów, pomimo znanych powiązań tej cytokiny z tymi fenotypami. Ponadto białko IFN-α można było kwantyfikować w zakresie 5 rzędów wielkości, co wykazuje szeroki zakres dynamiczny testu, a wykrywalne poziomy między 1 - 10 fg/mL potwierdzają wysoką czułość tej metody.
<img alt="Wykres stężenia IFNα; wykres rozrzutu porównujący grupę zdrową, SLE i JDM wraz z analizą rozkładu danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57421/57421fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rycina 7: Ilościowe oznaczenie białka IFN-α w osoczu i surowicy z kohort pacjentów. Rysunek zmodyfikowano na podstawie publikacji Rodero i wsp.. 2017. Plazmę od zdrowych osób kontrolnych (n = 20) oraz pacjentów cierpiących na SLE (n = 72) i JDM (n = 43) przebadano za pomocą testu pan-IFNα w technologii single molecule array. Analizę przeprowadzono z wykorzystaniem jednoczynnikowego testu ANOVA (Kruskal-Wallis) oraz testu wielokrotnych porównań Dunna pomiędzy grupami. Przedstawiono medianę. Linia przerywana wskazuje granicę wykrywalności (LOD) referencyjnego testu ELISA dla ludzkiego anty-IFN-α (1,95 pg/ml = 1950 fg/ml). <a href="/files/ftp_upload/57421/57421fig7large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Krok</td>
			<td>Uwagi i wskazówki</td>
			<td>Bibliografia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">1. Wybór pary przeciwciał</td>
			<td>Celowanie w różne epitopy</td>
			<td rowspan="3">Tabela 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wysokie powinowactwo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Szybki Kwłączony Wolna kinetyka (Slow K)wyłączony</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Orientacja pary przeciwciał</td>
			<td rowspan="3">Wybierz warunki z najniższą granicą wykrywalności</td>
			<td rowspan="3">Rycina 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Stężenie przeciwciała wychwytującego</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. Stosunek biotyny do przeciwciała detekcyjnego</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5. Konfiguracja 2- a 3-etapowa</td>
			<td>Wybierz warunek z najwyższym stosunkiem sygnału do tła</td>
			<td>Rycina 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6. Stężenie przeciwciała detekcyjnego</td>
			<td rowspan="2">Wybierz warunki z najniższą granicą wykrywalności</td>
			<td rowspan="2">Rysunek 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7. Stężenie SBG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8. Specyficzność</td>
			<td>Ocena reaktywności krzyżowej</td>
			<td rowspan="2">Rycina 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9. Czułość</td>
			<td>Ocena rozpoznania podtypów (jeśli dotyczy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10. Powtarzalność</td>
			<td>Ocena zmienności analizy</td>
			<td>Rycina 5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Podsumowanie etapów opracowania i optymalizacji testu macierzy pojedynczych cząsteczek. Tabela ta podsumowuje poszczególne kroki niezbędne do opracowania i optymalizacji testu macierzy pojedynczych cząsteczek, od wstępnego wyboru pary przeciwciał aż po ocenę powtarzalności.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr>
			<td>Antygen</td>
			<td>8H1 (A)</td>
			<td>12H5 (B)</td>
			<td>Sifalimumab</td>
			<td>Rontalizumab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFNα1</td>
			<td>28.3</td>
			<td>51.3</td>
			<td>460</td>
			<td>2.63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFNα2</td>
			<td>2563</td>
			<td>10.7</td>
			<td>9.02</td>
			<td>2.15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFNα4</td>
			<td>5.1</td>
			<td>2.9</td>
			<td>35.35</td>
			<td>325.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFNα5</td>
			<td>2.01</td>
			<td>19.6</td>
			<td>93.29</td>
			<td>2.49</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFNα6</td>
			<td>64.7</td>
			<td>3.03</td>
			<td>4.97</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFNα7</td>
			<td>0.9</td>
			<td>0.63</td>
			<td>23.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFNα8</td>
			<td>302</td>
			<td>0.83</td>
			<td>691</td>
			<td>10.86</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFNα10</td>
			<td>2.54</td>
			<td>0.71</td>
			<td>43.2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFNα14</td>
			<td>3224</td>
			<td>2.1</td>
			<td>14.52</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFNα16</td>
			<td>1.83</td>
			<td>32.9</td>
			<td>59.18</td>
			<td>28.65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFNα17</td>
			<td>2.21</td>
			<td>0.7</td>
			<td>890.9</td>
			<td>23.86</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFNα21</td>
			<td>2.78</td>
			<td>12.87</td>
			<td>1769</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Wybór przeciwciała pan-alfa. IC50 (ng/mL) wyznaczono za pomocą testu neutralizacji z wykorzystaniem elementu odpowiedzi stymulowanej interferonem (ISRE)-lucyferazy. Tabela przedstawia wartości IC50 dla przeciwciał monoklonalnych (mAbs) użytych w teście Single Molecule Array dla wszystkich podtypów IFN-α. 10 0 komórek HEK 293 MSR wysiano na białe płytki 96-dołkowe o zredukowanej powierzchni i poddano odwrotnej transfekcji 50 ng gotowych konstruktów raportujących ISRE-lucyferaza świetlikowa oraz lucyferaza Renilla, stosując odczynniki do transfekcji zgodnie z instrukcją producenta. Konstrukt wykazujący ekspresję lucyferazy służył jako wewnętrzna kontrola normalizacji. Komórki inkubowano przez noc w pożywce Reduced Serum Medium uzupełnionej o 0,1 mM niezbędnych aminokwasów, 1 mM pirogronianu sodu i 0,5% płodowej surowicy bydlęcej w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 w atmosferze zwilżonej. Po inkubacji nocnej komórki stymulowano przez 24 h pożywką zawierającą mieszaniny rekombinowanego ludzkiego IFN-α z lub bez przeciwciał monoklonalnych anty-IFN-α lub kontrolnego IgG, które poddano wstępnej inkubacji przez 1 h w 37 °C. Po 24 h stymulacji przeprowadzono podwójne testy raportujące lucyferazą zgodnie z instrukcją producenta. « - » Nie wyznaczono. Sifalimumab jest w pełni ludzkim przeciwciałem monoklonalnym klasy immunoglobulin G1 κ, które wiąże i neutralizuje większość podtypów IFN-α; Rontalizumab jest humanizowanym przeciwciałem monoklonalnym przeciwko IFN-α. Zaadaptowano z Meyer et al. 2016 oraz Rodero et al. 2017.
Tabela uzupełniająca 1: Dobór orientacji przeciwciał, stężenia przeciwciała wychwytującego na kulkach oraz stopnia biotynylacji. Przetestowano dwie możliwe konfiguracje, stosując anty-IFN-α A jako przeciwciało wychwytujące i anty-IFN-α B jako przeciwciało detekcyjne (A) oraz odwrotnie (B). Jako antygen zastosowano IFNα-2c. Dla obu konfiguracji przetestowano różne stężenia przeciwciał wychwytujących oraz różne stosunki biotyny do przeciwciała (B:A). Saturation (Sat). Kolor pomarańczowy: wartości AEB wykorzystane do obliczenia LOD; stężenia te uznano za tło, ponieważ wartości AEB pozostały stałe. LOD obliczono jako średnia z tła + 3SD. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_1.xlsx">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 2: Test konfiguracji 2- i 3-etapowej. Konfiguracje 2- i 3-etapowe oceniono, wykorzystując IFNα-2c jako antygen. Dla obu warunków przedstawiono wartości AEB oraz stosunki sygnału do tła (S/B). <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_2.xlsx">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 3: Optymalizacja stężenia detektora i SBG. Oceniono trzy różne stężenia biotynilowanego przeciwciała detekcyjnego (0,1, 0,3 i 0,6 µg/mL) wraz z trzema różnymi stężeniami SBG (50, 150 i 250 pM). Przedstawiono wartości AEB dla dziewięciu badanych warunków. Kolor pomarańczowy: wartości AEB wykorzystane do obliczenia LOD; stężenia te uznano za tło, ponieważ wartości AEB pozostały stabilne. LOD obliczono jako średnia tła + 3SD. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_3.xlsx">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 4: Specyficzność i czułość zoptymalizowanego testu Single Molecule Array dla IFNα. Przedstawiono średnie wartości liczby enzymów na kuleczkę dla przetestowanych białek rekombinowanych IFN-β, IFN-λ1, IFN-λ2, IFN-ω oraz IFN-γ (A), wraz z 16 podtypami IFN-α (B). « - » Nie określono. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_4.xlsx">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 5: Powtarzalność zoptymalizowanego testu pojedynczych cząsteczek (Simoa) dla IFNα. Średnie wartości AEB dla trzech niezależnych serii pomiarowych przedstawiono dla stężeń do 10.0 fg/mL. « - » Nie określono. Nasycenie (Sat). <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_5.xlsx">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 6: Analiza konkurencji białek. Przedstawiono średnie wartości ilości enzymu na kuleczki dla wszystkich badanych warunków. Pomiary wykonano w duplikacie. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_6.xlsx">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Tutaj prezentujemy protokół opisujący rozwój i walidację cyfrowego testu ELISA z pojedynczą matrycą molekuł, który umożliwia ultraczułe wykrywanie wszystkich podtypów IFN-α w próbkach ludzkich.

Opracowanie i walidacja ultraczułego, cyfrowego testu immunoenzymatycznego z pojedynczą matrycą cząsteczek dla ludzkiego interferonu-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące natury, regulacji i biologicznego wpływu odpowiedzi indukowanych interferonem w różnych warunkach chorobowych, w tym w autoimmunizacji i infekcjach. Główną zaletą tej techniki jest jej własna czułość. Technika ta ma ogromny potencjał w zakresie odkrywania biomarkerów w celu poprawy leczenia pacjentów w wielu chorobach, ponieważ może określać ilościowo cytokiny z niespotykaną dotąd czułością.Ważnym krokiem w tym podejściu było zneutralizowanie działań związanych z pacjentami z autoimmunologicznym układem poliindokrynowym typu pierwszego. Na początek załaduj 280 milionów kulek paramagnetycznych do probówki z mikrofugą, zwracając uwagę na objętość. Następnie pulsacyjnie zakręć koralikami i umieść rurkę na separatorze magnetycznym na minutę.Usunąć i wyrzucić roztwór rozcieńczalnika, izolując w ten sposób kulki. Następnie umyj koraliki dwukrotnie BWB i dwukrotnie BCB. Do każdego prania dodaj 200 mikrolitrów i wiruj rurkę przez pięć sekund.Następnie oddziel kulki od roztworu za pomocą separatora magnetycznego. Po minucie separacji wyrzuć rozcieńczalnik. Następnie dodaj 190 mikrolitrów BCB na objętość kulki.Następnie krótko odwiruj rurkę, pulsacyjnie zakręć rurką i połóż umyte kulki na lodzie. Aby aktywować kulki, połącz jeden mililitr zimnego BCB z 10 miligramami EDC i wiruj, aż roztwór będzie jednorodny. Pracuj szybko i bezpiecznie podczas korzystania z EDC, ze względu na jego nieodłączną niestabilność i rozwiązanie equinus.Następnie dodaj 10 mikrolitrów zimnego, rozcieńczonego EDC na objętość kulki do zawiesiny kulek i krótko zmieszaj kulki. Następnie połóż koraliki na shakerze w temperaturze pokojowej na 30 minut. Aby skoniugować przeciwciała przeciwko kulkom, najpierw wir i puls obracają aktywowane kulki.Następnie umieść kulki w separatorze magnetycznym na minutę i wyrzuć supernatant BCB. Następnie wyjmij rurkę z magnesu i umyj koraliki dwukrotnie 200 mikrolitrami BCB. Następnie wiruj, wiruj impulsowo i magnetycznie oddzielaj koraliki, aby usunąć bufor.Następnie szybko dodaj 200 mikrolitrów zimnego przeciwciała z wymienną buforacją do aktywowanych kulek. Po przemieszaniu kulek do roztworu, umieść zawiesinę na wytrząsarce o temperaturze pokojowej na dwie godziny z prędkością 1 000 obr./min. Zacznij od nadania zawiesinie kulki pokrytej przeciwciałem pulsacyjnego wirowania, a następnie użyj kolumny magnetycznej do usunięcia buforu.Następnie sprawdź stężenie białka w buforze. Użyj spektrafotometru o małej objętości. W tym momencie przeciwciała są sprzężone z kulkami, a każda wartość powyżej zera oznacza, że kulki są nasycone przeciwciałami.Teraz umyj koraliki 200 mikrolitrami BWB, tak jak we wszystkich poprzednich praniach. Następnie przenieś supernatant do nowej probówki i sprawdź stężenie białka. Kwantyfikacja białek uwalnianych z kulek umożliwia pomiar sprzężenia przeciwciał.Następnie ponownie umyj koraliki 200 mikrolitrami BWB. Następnie dodaj 200 mikrolitrów buforu blokującego kulki, wiruj rurkę przez pięć sekund i przenieś ją do wytrząsarki o temperaturze pokojowej na 30 minut. Po 30 minutach koraliki zostaną zablokowane.Następnie umyj je raz za pomocą 200 mikrolitrów BWB, a następnie umyj je dwukrotnie 200 mikrolitrami buforu rozcieńczalnika do kulek do każdego prania. Następnie przechowuj powlekane i zablokowane kulki w 200 mikrolitrach buforu rozcieńczalnika do kulek w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W tej części filmu zasugerowano strategie dostosowywania warunków testu za pomocą oprogramowania do analizowania matryc pojedynczych cząsteczek w konfiguracji naparu domowego.Zacznij od przetestowania różnych kombinacji kulek sprzężonych z przeciwciałami wychwytującymi i przeciwciał wykrywających biotynylację w obu kombinacjach przeciwciał. Następnie przetestuj kombinacje trzech różnych stężeń przeciwciał wychwytujących z dwoma różnymi współczynnikami biotynylacji w celu wykrywania i wychwytywania przeciwciał i odwrotnie. Następnie wybierz kombinację, która oferuje najniższy poziom wykrywania i użyj jej do dalszych kroków.W tym przypadku stosunek biotyny do przeciwciała w stosunku 30 do jednego daje najlepszą granicę wykrywalności. Następnie porównaj konfigurację dwuetapową z konfiguracją trzyetapową. Konfiguracje trzyetapowe mają trzy różne etapy inkubacji.Jeden z przeciwciałem wychwytującym, drugi z przeciwciałem wykrywającym, a ostatni, trzeci do znakowania enzymu SBG. Konfiguracje dwuetapowe łączą inkubację wychwytywania i detekcji. Uruchom analizator z matrycą jednocząsteczkową, korzystając z wybranych stężeń i dawek przeciwciał wychwytujących i detektorowych w konfiguracjach dwu- i trzyetapowych, wstępnie skonfigurowanych w analizatorze, zgodnie z instrukcjami producenta.Następnie wybierz konfigurację, która pozwala na najwyższą czułość i zachowaj ją na przyszłe kroki. W tym przypadku konfiguracja dwuetapowa daje nieco wyższą czułość w każdym punkcie testowym. Następnie zoptymalizuj stężenia przeciwciała detektora i SBG.Przetestuj trzy różne stężenia przeciwciała detektora z trzema różnymi stężeniami SBG. Wybierz stężenia, które dają najwyższą czułość i zachowaj je na przyszłe kroki. W tym przypadku 0,3 mikrograma na mililitr przeciwciała i 150 pica molowych SBG mają optymalny poziom wykrywalności przy niskich poziomach tła przy przypadkowej amplitudzie pożywki.Aby uzyskać dodatkowe kroki optymalizacji, zapoznaj się z protokołem tekstowym. Znajdują się w nim procedury optymalizacji swoistości i odtwarzalności testu oraz test konkurencji białek. Za pomocą testu zoptymalizowanego do wykrywania 13 podklas interferonu alfa, przeanalizowano osocze i surowicę u pacjentów z TRU, pacjentami z MZSM i zdrowymi osobami z grupy kontrolnej.Wysokie poziomy białka interferonu-alfa wykryto w obu kohortach chorobowych. Linia przerywana wskazuje poziom wykrywalności konwencjonalnego, dostępnego na rynku leku Eliza, który nie wykryłby białka interferonu-alfa w tych grupach pacjentów, pomimo znanej roli tej cytokiny w tych chorobach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak opracować i zweryfikować test macierzy pojedynczych cząsteczek dla wybranej analizy.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że podczas wyboru komórek przeciwciała jest. Od czasu jego opracowania, test ten pozwolił na lepsze scharakteryzowanie roli interferonu-alfa w różnych chorobach i infekcjach autoimmunologicznych. Test ten posłużył również do monitorowania odpowiedzi na nowe terapie i identyfikacji aktorów komórkowych odpowiedzialnych za niektóre zaburzenia autoimmunologiczne.

development-validation-an-ultrasensitive-single-molecule-array

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Technologia detekcji kolorymetrycznej ampliPHOX jest przedstawiona jako niedroga alternatywa dla detekcji fluorescencyjnej w macierzach mikroukładów. W oparciu o fotopolimeryzację, ampliPHOX wytwarza stałe polimerowe plamki widoczne gołym okiem w zaledwie kilka minut. Wyniki są następnie obrazowane i automatycznie interpretowane za pomocą prostego, a zarazem wydajnego pakietu oprogramowania.

Kolorymetryczna detekcja ampliPHOX na mikrotablicy DNA do wykrywania grypy

Ilościowe, wysokoprzepustowe, w czasie rzeczywistym i bez znakowania wykrywanie biomolekuł (DNA, białek itp.) na powierzchniach SiO2 można osiągnąć za pomocą prostej techniki interferometrycznej, która opiera się na oświetleniu LED, minimalnej liczbie komponentów optycznych i kamerze. Sensor obrazowania odbiciowego interferometrycznego (IRIS) jest niedrogi, prosty w obsłudze i dostosowany do formatów mikromacierzy.

Detekcja biomolekularna z wykorzystaniem interferometrycznego czujnika obrazowania odbiciowego (IRIS)

Metoda ta opisuje zastosowanie systemu obrazowania opartego na barwnikach w podczerwieni do wykrywania H1N1 w płyku z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) zakażonych myszy z wysoką czułością. Metodykę tę można przeprowadzić na płytce 96- lub 384-dołkowej, wymaga ona objętości materiału badawczego &lt;10 μl i umożliwia jednoczesny screening wielu patogenów.

Metoda wysokoprzepustowego wykrywania wirusa grypy

Charakterystyka epitopów limfocytów T patogenów wywołujących infekcje miejscowe, takich jak wirus brodawczaka ludzkiego, stanowi wyzwanie ze względu na ograniczoną liczbę krążących limfocytów T. Opisano metodę, w której rzadkie limfocyty T zostały wyizolowane i scharakteryzowane, zaczynając od bardzo małej liczby komórek.

Wykorzystanie testu Enzyme-linked Immunospot (ELISpot) dla interferonu $\gamma$ do charakterystyki nowych epitopów limfocytów T wirusa papilomawirusa ludzkiego

Wykorzystując technologię mikrosfer xMAP firmy Luminex Corporation, opracowaliśmy wielowiązkowy fluorometryczny test immunoenzymatyczny (MFIA) do nadzoru serologicznego różnych gatunków zwierząt laboratoryjnych. MFIA to zawiesinowa macierz mikrosfer, w której antygen, kontrola tkankowa lub immunoglobuliny są kowalencyjnie powiązane z kolorowo kodowanymi mikrosferami polistyrenowymi. Omówiono metodę testową MFIA oraz różne zagadnienia związane z rozwiązywaniem problemów.

Metodyka przeprowadzania i rozwiązywanie problemów w multipleksowym fluorometrycznym immunoprzebiegu

Ten film demonstruje metodę obrazowania do wizualizacji in situ wydzielania interferonu gamma (IFN-γ) w śledzionie myszy. Po zakażeniu bakteryjnym i indukcji akumulacji IFN-γ w limfocytach T i komórkach NK pobiera się śledzionę od myszy. Po uzyskaniu skrawków tkanek wykonuje się barwienie immunologiczne w celu uwidocznienia IFN-γ wewnątrz komórek.

Test do identyfikacji wydzielania interferonu gamma w mysich narządach limfatycznych

Ten film demonstruje test wydzielania embrionalnej fosfatazy alkalicznej przy użyciu komórek reporterowych interferonu HEK-Blue α/β do ilościowego określenia interferonów typu I (IFN) uwolnionych po stymulacji plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych przez limfocyty T CD4+ zakażone HIV-1.

Oznaczanie ilościowe bioaktywnych interferonów typu I przy użyciu testu reporterowego wydzielanej embrionalnej fosfatazy alkalicznej

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy test qRT-PCR do analizy sygnatur ekspresji IFN typu I i III. Test dyskryminuje różnice w pojedynczej parze zasad między bardzo podobnymi transkryptami tych genów. Dzięki montażowi wsadowemu i zrobotyzowanemu pipetowaniu testy są spójne i powtarzalne.

Wysokoprzepustowy ilościowy test RT-PCR w czasie rzeczywistym do określania profili ekspresji podtypów interferonu typu I i III

Korzystając z drukowanej strategii mikromacierzy glikanowej, konwencjonalny test na 96-dołkowej płytce został zminiaturyzowany do analizy awidności hemaglutyniny wirusa grypy A i swoistości dla receptorów zawierających kwas sjalowy.

Zminiaturyzowany test mikromacierzy glikanów do oceny awidności i swoistości hemaglutynin wirusa grypy A

Obecna diagnostyka multipleksowa do wykrywania wirusów Zika, chikungunya i denga wymaga skomplikowanego przygotowania próbek i kosztownego oprzyrządowania, a także jest trudna do użycia w środowiskach o niskich zasobach. Pokazujemy diagnostykę, która wykorzystuje amplifikację izotermiczną z sondami z przemieszczonymi niciami specyficznymi dla celu, aby wykryć i zróżnicować te wirusy z wysoką czułością i swoistością.

Multipleksowana platforma diagnostyczna oparta na amplifikacji izotermicznej do wykrywania wirusów Zika, Chikungunya i Denga 1

Ten raport opisuje zautomatyzowany protokół do multipleksowych testów immunofluorescencyjnych (mIF) na automatycznym barwniku do szkiełek. Wykazano wysoką odtwarzalność proteomiki przestrzennej na standardowych autostainerach tkankowych o wysokiej przepustowości i obrazach fluorescencyjnych na całych szkiełkach, co jest idealne do niestandardowych testów mIF na dużej liczbie szkiełek tkankowych w badaniach translacyjnych.

Wysokowydajne zautomatyzowane multipleksowe testy immunofluorescencyjne do badań translacyjnych

Poznaj cyfrowy test immunoenzymatyczny z pojedynczą matrycą cząsteczek do wykrywania ludzkiego interferonu-α. Ta metoda umożliwia niezwykle czułą detekcję podtypów IFN-α w próbkach pacjentów z chorobami autoimmunologicznymi.

Opracowanie i walidacja ultraczułego, cyfrowego testu immunoenzymatycznego z pojedynczą matrycą cząsteczek dla ludzkiego interferonu-α (Wideo) | JoVE Journal

Opracowanie i walidacja ultraczułego, cyfrowego testu immunoenzymatycznego z pojedynczą matrycą cząsteczek dla ludzkiego interferonu-α

Przeglądaj więcej filmów