Opracowanie i walidacja ultraczułego, cyfrowego testu immunoenzymatycznego z pojedynczą matrycą cząsteczek dla ludzkiego interferonu-α

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące natury, regulacji i biologicznego wpływu odpowiedzi indukowanych interferonem w różnych warunkach chorobowych, w tym w autoimmunizacji i infekcjach. Główną zaletą tej techniki jest jej własna czułość. Technika ta ma ogromny potencjał w zakresie odkrywania biomarkerów w celu poprawy leczenia pacjentów w wielu chorobach, ponieważ może określać ilościowo cytokiny z niespotykaną dotąd czułością.

Ważnym krokiem w tym podejściu było zneutralizowanie działań związanych z pacjentami z autoimmunologicznym układem poliindokrynowym typu pierwszego. Na początek załaduj 280 milionów kulek paramagnetycznych do probówki z mikrofugą, zwracając uwagę na objętość. Następnie pulsacyjnie zakręć koralikami i umieść rurkę na separatorze magnetycznym na minutę.

Usunąć i wyrzucić roztwór rozcieńczalnika, izolując w ten sposób kulki. Następnie umyj koraliki dwukrotnie BWB i dwukrotnie BCB. Do każdego prania dodaj 200 mikrolitrów i wiruj rurkę przez pięć sekund.

Następnie oddziel kulki od roztworu za pomocą separatora magnetycznego. Po minucie separacji wyrzuć rozcieńczalnik. Następnie dodaj 190 mikrolitrów BCB na objętość kulki.

Następnie krótko odwiruj rurkę, pulsacyjnie zakręć rurką i połóż umyte kulki na lodzie. Aby aktywować kulki, połącz jeden mililitr zimnego BCB z 10 miligramami EDC i wiruj, aż roztwór będzie jednorodny. Pracuj szybko i bezpiecznie podczas korzystania z EDC, ze względu na jego nieodłączną niestabilność i rozwiązanie equinus.

Następnie dodaj 10 mikrolitrów zimnego, rozcieńczonego EDC na objętość kulki do zawiesiny kulek i krótko zmieszaj kulki. Następnie połóż koraliki na shakerze w temperaturze pokojowej na 30 minut. Aby skoniugować przeciwciała przeciwko kulkom, najpierw wir i puls obracają aktywowane kulki.

Następnie umieść kulki w separatorze magnetycznym na minutę i wyrzuć supernatant BCB. Następnie wyjmij rurkę z magnesu i umyj koraliki dwukrotnie 200 mikrolitrami BCB. Następnie wiruj, wiruj impulsowo i magnetycznie oddzielaj koraliki, aby usunąć bufor.

Następnie szybko dodaj 200 mikrolitrów zimnego przeciwciała z wymienną buforacją do aktywowanych kulek. Po przemieszaniu kulek do roztworu, umieść zawiesinę na wytrząsarce o temperaturze pokojowej na dwie godziny z prędkością 1 000 obr./min. Zacznij od nadania zawiesinie kulki pokrytej przeciwciałem pulsacyjnego wirowania, a następnie użyj kolumny magnetycznej do usunięcia buforu.

Następnie sprawdź stężenie białka w buforze. Użyj spektrafotometru o małej objętości. W tym momencie przeciwciała są sprzężone z kulkami, a każda wartość powyżej zera oznacza, że kulki są nasycone przeciwciałami.

Teraz umyj koraliki 200 mikrolitrami BWB, tak jak we wszystkich poprzednich praniach. Następnie przenieś supernatant do nowej probówki i sprawdź stężenie białka. Kwantyfikacja białek uwalnianych z kulek umożliwia pomiar sprzężenia przeciwciał.

Następnie ponownie umyj koraliki 200 mikrolitrami BWB. Następnie dodaj 200 mikrolitrów buforu blokującego kulki, wiruj rurkę przez pięć sekund i przenieś ją do wytrząsarki o temperaturze pokojowej na 30 minut. Po 30 minutach koraliki zostaną zablokowane.

Następnie umyj je raz za pomocą 200 mikrolitrów BWB, a następnie umyj je dwukrotnie 200 mikrolitrami buforu rozcieńczalnika do kulek do każdego prania. Następnie przechowuj powlekane i zablokowane kulki w 200 mikrolitrach buforu rozcieńczalnika do kulek w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W tej części filmu zasugerowano strategie dostosowywania warunków testu za pomocą oprogramowania do analizowania matryc pojedynczych cząsteczek w konfiguracji naparu domowego.

Zacznij od przetestowania różnych kombinacji kulek sprzężonych z przeciwciałami wychwytującymi i przeciwciał wykrywających biotynylację w obu kombinacjach przeciwciał. Następnie przetestuj kombinacje trzech różnych stężeń przeciwciał wychwytujących z dwoma różnymi współczynnikami biotynylacji w celu wykrywania i wychwytywania przeciwciał i odwrotnie. Następnie wybierz kombinację, która oferuje najniższy poziom wykrywania i użyj jej do dalszych kroków.

W tym przypadku stosunek biotyny do przeciwciała w stosunku 30 do jednego daje najlepszą granicę wykrywalności. Następnie porównaj konfigurację dwuetapową z konfiguracją trzyetapową. Konfiguracje trzyetapowe mają trzy różne etapy inkubacji.

Jeden z przeciwciałem wychwytującym, drugi z przeciwciałem wykrywającym, a ostatni, trzeci do znakowania enzymu SBG. Konfiguracje dwuetapowe łączą inkubację wychwytywania i detekcji. Uruchom analizator z matrycą jednocząsteczkową, korzystając z wybranych stężeń i dawek przeciwciał wychwytujących i detektorowych w konfiguracjach dwu- i trzyetapowych, wstępnie skonfigurowanych w analizatorze, zgodnie z instrukcjami producenta.

Następnie wybierz konfigurację, która pozwala na najwyższą czułość i zachowaj ją na przyszłe kroki. W tym przypadku konfiguracja dwuetapowa daje nieco wyższą czułość w każdym punkcie testowym. Następnie zoptymalizuj stężenia przeciwciała detektora i SBG.

Przetestuj trzy różne stężenia przeciwciała detektora z trzema różnymi stężeniami SBG. Wybierz stężenia, które dają najwyższą czułość i zachowaj je na przyszłe kroki. W tym przypadku 0,3 mikrograma na mililitr przeciwciała i 150 pica molowych SBG mają optymalny poziom wykrywalności przy niskich poziomach tła przy przypadkowej amplitudzie pożywki.

Aby uzyskać dodatkowe kroki optymalizacji, zapoznaj się z protokołem tekstowym. Znajdują się w nim procedury optymalizacji swoistości i odtwarzalności testu oraz test konkurencji białek. Za pomocą testu zoptymalizowanego do wykrywania 13 podklas interferonu alfa, przeanalizowano osocze i surowicę u pacjentów z TRU, pacjentami z MZSM i zdrowymi osobami z grupy kontrolnej.

Wysokie poziomy białka interferonu-alfa wykryto w obu kohortach chorobowych. Linia przerywana wskazuje poziom wykrywalności konwencjonalnego, dostępnego na rynku leku Eliza, który nie wykryłby białka interferonu-alfa w tych grupach pacjentów, pomimo znanej roli tej cytokiny w tych chorobach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak opracować i zweryfikować test macierzy pojedynczych cząsteczek dla wybranej analizy.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że podczas wyboru komórek przeciwciała jest. Od czasu jego opracowania, test ten pozwolił na lepsze scharakteryzowanie roli interferonu-alfa w różnych chorobach i infekcjach autoimmunologicznych. Test ten posłużył również do monitorowania odpowiedzi na nowe terapie i identyfikacji aktorów komórkowych odpowiedzialnych za niektóre zaburzenia autoimmunologiczne.