Name: Poprawa zastosowania biotynylowanej aminy dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej do śledzenia projekcji wzgórzowo-korowej u szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Poznaj udoskonaloną metodę biotynylowanego dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej do śledzenia projekcji wzgórzowo-korowych u szczura. Technika umożliwia szczegółową analizę obwodów nerwowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (kod projektu nr 81373557; nr 81403327).

To badanie zostało zatwierdzone przez komisję etyki Chińskiej Akademii Nauk Medycznych (numer referencyjny 20160014). Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Waszyngton, D.C., 1996). W badaniu wykorzystano cztery dorosłe samce szczurów (o masie ciała 250-280 g). Wszystkie zwierzęta trzymano w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność z kontrolowaną temperaturą i wilgotnością, z możliwością swobodnego dostępu do pożywienia i wody. Instrumenty i materiały użyte w niniejszym badaniu zostały pokazane w <silna klasa="xfig">Rysunek 1. Przed operacją wszystkie instrumenty, takie jak rama stereotaktyczna i szklana pipeta, zostały oczyszczone przy użyciu 70% etanolu.
1. Zabiegi chirurgiczne
<ol>
	<li>Określ obszar zainteresowania współrzędnych w VPM za pomocą atlasu stereotaktycznego9 (Rysunek 2A).</li>
	<li>Przygotuj mikrostrzykawkę o pojemności 1 μl wyposażoną w szklaną mikropipetę (o średnicy końcówki około 10-20 μm) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D) i przetestuj ją ciekłą parafiną.</li>
	<li>Znieczulić szczury 7% hydratem chloralu (0,7 ml/100 g) przez wstrzyknięcie dootrzewnowe.</li>
	<li>Gdy głębokie znieczulenie zostanie potwierdzone za pomocą szczypania ogona i odruchu wycofania pedału, ogol czubek głowy zwierzęcia elektryczną maszynką do golenia i wyszoruj miejsce operacji 3 razy odpowiednio 10% jodowidonu, a następnie 70% etanolu.</li>
	<li>Umieść szczura w urządzeniu stereotaktycznym, umieszczając paski uszne w uszach i umieść górne siekacze szczura w uchwycie ust (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1E), a następnie nałóż maść okulistyczną na oczy.</li>
	<li>Ponownie oczyść skórę głowy w miejscu operacji przy użyciu 70% etanolu. Używaj sterylnych rękawic chirurgicznych i ręczników, aby utrzymać operację w sterylnych warunkach.</li>
	<li>Wykonaj strzałkowe nacięcie w skórze skalpelem wzdłuż szwu strzałkowego (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1F).</li>
	<li>Zeskrob mięsień i okostną z czaszki za pomocą sterylnych aplikatorów z bawełnianą końcówką przez cały czas trwania operacji, aby zatamować krwawienie (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 1F).</li>
	<li>Korzystając z predefiniowanych współrzędnych z atlasu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A), określ lokalizację (-3,3 mm punkt Bregma, 2,6 mm od prawej do linii środkowej) kraniotomii (<silna klasa="xfig">Rysunek 1G).</li>
	<li>Wykonaj kraniotomię za pomocą wiertła do zadziorów z wiertłem z okrągłą końcówką (#106) (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1H) i kontynuuj wiercenie na głębokość około 1 mm w ciągu kilku minut, aż dotrzesz do opon mózgowych (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1I).</li>
	<li>Wytnij oponę twardą za pomocą mikrokleszczyków, aby odsłonić korę mózgową nad miejscem wstrzyknięcia (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1I).</li>
	<li>Zamień ciekłą parafinę w mikrostrzykawce na 10% roztwór BDA (10 000 mas cząsteczkowych, w wodzie destylowanej) (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1J).</li>
	<li>Zamontuj strzykawkę w aparacie do mikroiniekcji i podłącz do mikropompy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1K). 
	UWAGA: Wstrzykiwana objętość zależy od prędkości mikropompy. Tutaj został on dostosowany do 30 nL/min (<silna klasa="xfig">Rysunek 1L).</li>
	<li>Pod mikroskopem stereoskopowym wprowadzić szklaną mikropipetę ręcznie za pomocą aparatu do mikroiniekcji do VPM przez korową powierzchnię mózgu na głębokości 5,8 mm (<klasa silna = "xfig">Ryc. 1M).</li>
	<li>Wstrzykiwać ciśnieniowo 100 nL 10% BDA do VPM przez 3 minuty (35 nL/min) za pomocą mikropompy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1L, M).</li>
	<li>Po wstrzyknięciu należy trzymać pipetę na miejscu przez dodatkowe 5 minut, a następnie powoli ją wyjmować.</li>
	<li>Zszyj ranę sterylną nicią (<silna klasa="xfig">Rysunek 1N). Postępuj zgodnie z wytycznymi lokalnej komisji ds. opieki nad zwierzętami dotyczącymi analgezji przed- i pooperacyjnej. </li>
	<li>Umieść szczura w ciepłym miejscu do rekonwalescencji, aż odzyska przytomność i w pełni wyzdrowieje. </li>
	<li>Zwróć odzyskanego szczura z powrotem do klatki.</li>
</ol>
2. Perfuzje i sekcje
<ol>
	<li>Po okresie przeżycia wynoszącym zazwyczaj 10 dni należy wstrzyknąć zwierzęciu nadmierną dawkę 10% uretanu (2 ml/100 g) we wstrzyknięciu dootrzewnowym w celu wywołania eutanazji.</li>
	<li>Wykonaj fuzję na szczurach doświadczalnych w kapturze (<silna klasa="xfig">Rysunek 1O).
	<ol>
		<li>Gdy oddech ustaje, za pomocą nożyczek i kleszczy otwórz klatkę piersiową szczura, aby uzyskać dostęp do serca. Wprowadzić cewnik dożylny do lewej komory w kierunku aorty, a następnie otworzyć prawą małżowinę uszną.</li>
		<li>Najpierw przetopić 0,9% solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w temperaturze fizjologicznej (37 °C) około 1-2 minut, aż krew wypływająca z serca będzie czysta, a następnie kontynuować z 250-300 ml 4% paraformaldehydu w 0,1 M buforze fosforanowym (PB, pH 7,4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po perfuzji naciąć skórę głowy i otworzyć czaszkę, a następnie wypreparować mózg szczura. Po utrwaleniu wypreparowanego mózgu w 4% paraformaldehydzie przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (26 °C), a następnie krioprotekcję w 30% sacharozy w 0,1 M PBS (pH 7,4) przez 3 dni w temperaturze 4 °C, aż mózg zostanie zanurzony w roztworze (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1P).</li>
	<li>Gdy mózg zostanie zanurzony w roztworze, podziel mózg na trzy bloki w kierunku koronalnym na matrycach mózgowych (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1Q). Blok centralny zawiera VPM i S1.</li>
	<li>Przeciąć centralny blok mózgu na głębokości 40 μm na etapie zamrażania, przesuwając system mikrotomowy w kierunku koronalnym. Zbierz te sekcje w uporządkowany sposób w 6-dołkowym naczyniu z 0,1 M PBS (pH 7,4) (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1R, S).</li>
</ol>
3. Standardowe barwienie ABC
UWAGA: Swobodnie pływające sekcje z co trzeciej sekcji czołowej mózgu zostały użyte do wizualizacji etykietowania BDA za pomocą standardowej procedury ABC10.
<ol>
	<li>Przepłukać skrawki w 0,1 M PBS przez około 1 minutę.</li>
	<li>Inkubować skrawki w 1% roztworze ABC w 0,1 M PB (pH 7,4) zawierającym 0,3% Triton X-100 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj skrawki trzykrotnie w 50 mM buforze Tris (pH 7,4).</li>
	<li>Wybarwić skrawki w roztworze zawierającym 0,02% tetrachlorowodorku 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) i 0,01%H2O2 2 w 50 mM buforze Tris przez około 2-5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj skrawki trzykrotnie w 50 mM buforze Tris (pH 7,4).</li>
	<li>Zamontuj skrawki na szkiełkach mikroskopowych przy użyciu standardowych technik histochemicznych (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1T; patrz Dodatkowy plik wideo III, perfuzja i sekcje).</li>
	<li>Wysuszyć sekcje na powietrzu przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Krótko odwodnić skrawki w serii roztworów alkoholu (50%, 70%, 95%, 100%). Zanurz szkiełka w każdym roztworze na około 15 s. Nie pozwól, aby szkiełka wyschły między każdym krokiem.</li>
	<li>Oczyść skrawki z ksylenu trzy razy, około 20 minut.</li>
	<li>Nałóż 2 lub 3 krople balsamu na plasterki, a następnie ułóż szkiełka nakrywkowe na kawałkach.</li>
</ol>
4. Podwójne barwienie fluorescencyjne dla BDA i podstawowych elementów nerwowych w korze mózgowej
UWAGA: W przeciwieństwie do tego, przeprowadzono podwójne barwienie fluorescencyjne w celu zaobserwowania korelacji znakowania BDA i podstawowych elementów nerwowych na sąsiednich odcinkach do wyżej użytego ze streptawidyną-AF594 i przeciwbarwionego fluorescencyjnym barwnikiem Nissl AF500/525.
<ol>
	<li>Przepłukać skrawki w 0,1 M PBS przez około 1 minutę.</li>
	<li>Skrawki inkubować w mieszanym roztworze streptawidyny-AF594 (1:500) i AF500/525 zielonego fluorescencyjnego barwnika Nissla (1:1,000) w 0,1 M PBS (pH 7,4) zawierającym 0,3% Triton X-100 przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyć skrawki trzykrotnie w 0,1 M PB (pH 7,4).</li>
	<li>Zamontuj skrawki na szkiełkach mikroskopowych przy użyciu standardowych technik histochemicznych. Suszyć sekcje na powietrzu przez około 1 godzinę.</li>
	<li>Przed obserwacją nałóż szkiełka nakrywkowe na skrawki fluorescencyjne z 50% gliceryną w wodzie destylowanej.</li>
</ol>
5. Podwójne barwienie fluorescencyjne dla BDA i interneuronów w korze mózgowej
UWAGA: Przeprowadzono podwójne barwienie fluorescencyjne w celu obserwacji korelacji znakowania BDA i interneuronów na reprezentatywnych odcinkach w celu korowym ze streptawidyną-AF594 i PV-immunochemią.
<ol>
	<li>Przepłukać reprezentatywne skrawki w 0,1 M PBS (pH 7,4) przez około 1 minutę.</li>
	<li>Inkubować skrawki w roztworze blokującym zawierającym 3% normalnej surowicy koziej i 0,3% Triton X-100 w 0,1 M PBS przez 30 minut.</li>
	<li>Przenieść skrawki do roztworu mysiej monoklonalnej anty-PV IgG (1:1 000) w 0,1 M PBS (pH 7,4) zawierającej 1% normalnej surowicy koziej i 0,3% Triton X-100 na noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Następnego dnia umyj skrawki trzykrotnie w 0,1 M PBS (pH 7,4).</li>
	<li>Wystawić skrawki na działanie mieszanego roztworu koziego przeciwciała drugorzędowego anty-mysiego AF488 (1:500), streptawidyny-AF594 (1:500) i dichlorowodorku 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI, 1:40,000) w 0,1 M PBS (pH 7,4) zawierającego 1% normalnej surowicy koziej i 0,3% Triton X-100 przez 1 godzinę.</li>
	<li>Powtórz kroki od 4.3 do 4.5.</li>
</ol>
6. Obserwacja
<ol>
	<li>Zrób zdjęcia VPM, aksonów wzgórzowo-korowych i neuronów korowo-wzgórzowych.
	<ol>
		<li>Obserwuj próbki fluorescencyjne za pomocą systemu obrazowania konfokalnego wyposażonego w soczewki obiektywowe (4x, NA: 0,13; 10x, NA: 0,40; i 40x, NA: 0,95). Użyj długości fal wzbudzenia i emisji 405 (niebieski), 488 (zielony) i 559 (czerwony) nm. 
		UWAGA: W tym przypadku otworek konfokalny wynosi 152 μm (4x, 10x) i 105 μm (40x). Rozdzielczość przestrzenna przechwytywania obrazu wynosi 1024 × 1024 pikseli (4x, 10x) i 640 × 640 pikseli (40x).</li>
		<li>Wykonaj dwadzieścia zdjęć w kolejnych klatkach po 2 μm z każdej sekcji o grubości 40 μm (seria Z).</li>
		<li>Zintegruj obrazy w jeden ostry obraz z systemem oprogramowania do przetwarzania obrazu konfokalnego do analizy trójwymiarowej w następujący sposób: ustaw początkową płaszczyznę ogniskową → ustaw końcową płaszczyznę ogniskowej → ustaw rozmiar kroku → wybierz wzór głębi → przechwytywanie obrazu → serii Z.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zdjęcia w jasnym polu można wykonywać za pomocą mikroskopu świetlnego wyposażonego w kamerę cyfrową (obiektywy 4x, NA: 0,13; 10x, NA: 0,40; i 40x, NA: 0,95). Czas naświetlania wynosi 500 ms. Użyj oprogramowania do edycji zdjęć, aby dostosować jasność i kontrast obrazów oraz dodać etykiety.</li>
</ol>

<ol><li>Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylated+dextran+amine+as+an+anterograde+tracer+for+single-+and+double-labeling+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies.</a> J Neurosci Methods. 41, 239-254 (1992).</li>
<li>Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway+tracing+using+biotinylated+dextran+amines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Pathway tracing using biotinylated dextran amines.</a> J Neurosci Methods. 103, 23-37 (2000).</li>
<li>Ling, C., Hendrickson, M. L., Kalil, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+detailed+structure+of+cortical+and+thalamic+neurons+in+the+adult+rat+brain+with+refined+biotinylated+dextran+amine+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Resolving the detailed structure of cortical and thalamic neurons in the adult rat brain with refined biotinylated dextran amine labeling.</a> PLoS One. 7, e45886(2012).</li>
<li>Zhang, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterograde+and+retrograde+tracing+with+high+molecular+weight+biotinylated+dextran+amine+through+thalamocortical+and+corticothalamic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Anterograde and retrograde tracing with high molecular weight biotinylated dextran amine through thalamocortical and corticothalamic pathways.</a> Microsc Res Tech. 80, 260-266 (2017).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylated+dextran+amine+anterograde+tracing+of+the+canine+corticospinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen+Res%22%5BJournal%5D)">Biotinylated dextran amine anterograde tracing of the canine corticospinal tract.</a> Neural Regen Res. 7, 805-809 (2012).</li>
<li>Armstrong-James, M., Callahan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamo-cortical+processing+of+vibrissal+information+in+the+rat.+II.+spatiotemporal+convergence+in+the+thalamic+ventroposterior+medial+nucleus+%28VPm%29+and+its+relevance+to+generation+of+receptive+fields+of+S1+cortical+%26%2334%3Bbarrel%26%2334%3B+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. II. spatiotemporal convergence in the thalamic ventroposterior medial nucleus (VPm) and its relevance to generation of receptive fields of S1 cortical &#34;barrel&#34; neurones.</a> J Comp Neurol. 303, 211-224 (1991).</li>
<li>Armstrong-James, M., Callahan, C. A., Friedman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamo-cortical+processing+of+vibrissal+information+in+the+rat.+I.+Intracortical+origins+of+surround+but+not+centre-receptive+fields+of+layer+IV+neurones+in+the+rat+S1+barrel+field+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. I. Intracortical origins of surround but not centre-receptive fields of layer IV neurones in the rat S1 barrel field cortex.</a> J Comp Neurol. 303, 193-210 (1991).</li>
<li>Agmon, A., Yang, L. T., Jones, E. G., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+precision+in+the+thalamic+projection+to+neonatal+mouse+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Topological precision in the thalamic projection to neonatal mouse barrel cortex.</a> J Neurosci. 15, 549-561 (1995).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+rat+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The rat brain in stereotaxic coordinates</a>. , Academic Press. San Diego. (1998).</li>
<li>Davidoff, M., Schulze, W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1692015">Standard avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) staining combination of the peroxidase anti-peroxidase (PAP)-and avidin-biotin-peroxidase complex (ABC)-techniques: an amplification alternative in immunocytochemical staining.</a> Histochemistry. 93, 531-536 (1990).</li>
<li>Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+axonal+diffusion+of+3000+molecular+weight+dextran+amines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast axonal diffusion of 3000 molecular weight dextran amines.</a> J Neurosci Methods. 50, 95-103 (1993).</li>
<li>Kaneko, T., Saeki, K., Lee, T., Mizuno, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+retrograde+axonal+transport+and+subsequent+visualization+of+tetramethylrhodamine+%28TMR%29+-dextran+amine+by+means+of+an+acidic+injection+vehicle+and+antibodies+against+TMR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved retrograde axonal transport and subsequent visualization of tetramethylrhodamine (TMR) -dextran amine by means of an acidic injection vehicle and antibodies against TMR.</a> J Neurosci Methods. 65, 157-165 (1996).</li>
<li>Medina, L., Reiner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efferent+projections+of+the+dorsal+and+ventral+pallidal+parts+of+the+pigeon+basal+ganglia%2C+studied+with+biotinylated+dextran+amine%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The efferent projections of the dorsal and ventral pallidal parts of the pigeon basal ganglia, studied with biotinylated dextran amine.</a> Neuroscience. 81, 773-802 (1997).</li>
<li>DE Venecia, R. K., Smelser, C. B., McMullen, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parvalbumin+is+expressed+in+a+reciprocal+circuit+linking+the+medial+geniculate+body+and+auditory+neocortex+in+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Parvalbumin is expressed in a reciprocal circuit linking the medial geniculate body and auditory neocortex in the rabbit.</a> J Comp Neurol. 400, 349-362 (1998).</li>
<li>Ojima, H., Takayanagi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+two+anterograde+axon+tracers+to+label+distinct+cortical+neuronal+populations+located+in+close+proximity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of two anterograde axon tracers to label distinct cortical neuronal populations located in close proximity.</a> J Neurosci Methods. 104, 177-182 (2001).</li>
<li>Kobbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+concepts+in+neuroanatomical+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Current concepts in neuroanatomical tracing.</a> Prog Neurobiol. 62, 327-351 (2000).</li>
<li>Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+techniques+for+tracing+pathways+in+the+central+nervous+system+of+developing+and+adult+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals.</a> Brain Res Bull. 51, 11-28 (2000).</li>
<li>Liao, C. C., Reed, J. L., Kaas, J. H., Qi, H. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracortical+connections+are+altered+after+long-standing+deprivation+of+dorsal+column+inputs+in+the+hand+region+of+area+3b+in+squirrel+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Intracortical connections are altered after long-standing deprivation of dorsal column inputs in the hand region of area 3b in squirrel monkeys.</a> J Comp Neurol. 524, 1494-1526 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wybór odpowiedniego znacznika jest kluczowym krokiem dla udanego eksperymentu ze śledzeniem neuronowym. W rodzinie BDA zaleca się preferowany transport BDA o wysokiej masie cząsteczkowej (10 000 masy cząsteczkowej) przez następczy szlak nerwowy, w przeciwieństwie do BDA o niskiej masie cząsteczkowej (3 000 masy cząsteczkowej)2,3,11,12,13. Jednak wiele badań su...

Wysoka masa cząsteczkowa BDA (10 000 masa cząsteczkowa), bardzo czuły znacznik, jest używany do śledzenia ścieżek nerwowych w ośrodkowym układzie nerwowym od ponad 20 lat1. Chociaż użycie BDA jest powszechną techniką śledzenia dróg nerwowych, na jakość etykietowania BDA u zwierząt mogą mieć wpływ różne czynniki1,2,3. Nasze ostatnie badania wykazały, że optymalna struktura znakowania BDA jest nie tylko związana z odpowiednim czasem przeżycia po iniekcji, ale także skorelowana z metodą barwienia4. Do tej pory konwencjonalny kompleks awidyna-biotyna-peroksydaza (ABC), izotiocyjanian streptawidyny-fluoresceiny i streptawidyna-AF594 były stosowane w celu ujawnienia znakowania BDA w poprzednich badaniach2,3,4,5. Dla porównania, barwienie fluorescencyjne dla BDA można łatwo wykonać.
W celu rozszerzenia zastosowania BDA o wysokiej masie cząsteczkowej, w niniejszym badaniu wprowadzono udoskonalony protokół. Po wstrzyknięciu BDA do VPM wzgórza w mózgu szczura, znakowanie BDA zostało ujawnione za pomocą zwykłej metody standardowego barwienia ABC, jak również przez barwienie podwójnie fluorescencyjne, które przeprowadzono w celu obserwacji korelacji znakowania BDA i podstawowych elementów nerwowych lub interneuronów w celu korowym ze streptawidyną-AF594 i fluorescencyjną histochemią Nissla lub PV-immunochemią, odpowiednio. Poprzez wzajemne ścieżki neuronowe między VPM a pierwszorzędową korą somatosensoryczną (S1)6,7,8, skupiliśmy naszą obserwację na znakowaniu BDA w aksonach rzutowanych wzgórzowo-korowych i somy komórek rzutowanych korowo-wzgórzowych w S1. Spodziewaliśmy się, że dzięki temu procesowi dostarczymy nie tylko szczegółowy protokół uzyskiwania wysokiej jakości znakowania neuronalnego za pomocą BDA o wysokiej masie cząsteczkowej, ale także wyrafinowany protokół łączenia fluorescencyjnego znakowania BDA i innych fluorescencyjnych markerów nerwowych z histochemią lub immunochemią. Takie podejście jest preferowane do badania lokalnych obwodów neuronalnych i ich charakterystyki chemicznej pod konfokalną laserową mikroskopią skaningową.

<table><tbody><tr><td>Biotynylowana dekstranoamina (BDA)</td> <td>Sondy molekularne</td><td>D1956</td><td>10 000 masa cząsteczkowa</td></tr><tr><td>Streptavidin-Alexa Fluor 594</td><td>Sondy molekularne</td><td>S32356</td><td>Chronić przed światłem</td></tr><tr><td>500/525 zielona fluorescencyjna plama Nissl</td><td>Sondy molekularne</td><td>N21480</td><td>Chronić przed światłem</td></tr><tr><td>Instrument stereotaksji mózgu</td><td>Narishige</td><td>SR-50</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom do zamrażania</td><td>Thermo</td><td>Microm International GmbH</td><td></td></tr><tr><td>Obrazowanie konfokalne</td><td>System</td><td></td> Olympus FV1200 <td></td></tr><tr><td>Micro Drill</td><td>Saeyang Microtech</td><td>Marathon-N7</td><td></td></tr><tr><td>Sprague Dawley</td><td>Instytut Laboratoryjnych Nauk o Zwierzętach, Chińska Akademia Nauk Medycznych</td><td>SCKX (JUN) 2012-004</td><td></td></tr><tr><td></td> Vectastain <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zestaw ABC</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-4000</td><td></td></tr><tr><td>superfrost plus preparaty mikroskopowe</td><td>Thermo</td><td>#4951PLUS-001</td><td>25x75x1mm</td></tr><tr><td>Photoshop i ilustracja</td><td>Adobe</td><td>CS5</td><td></td></tr></tbody></table>

poprawa zastosowania biotynylowanej aminy dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej do śledzenia projekcji wzgórzowo-korowej u szczura

Improving the Application of High Molecular Weight Biotinylated Dextran Amine for Thalamocortical Projection Tracing in the Rat

Wysokocząsteczkowa biotynylowana amina dekstranu (BDA) była używana jako bardzo czuły znacznik neuroanatomiczny przez wiele dziesięcioleci. Ponieważ na jakość jego znakowania miały wpływ różne czynniki, tutaj przedstawiamy wyrafinowany protokół stosowania BDA o wysokiej masie cząsteczkowej do badania optymalnego znakowania neuronalnego w ośrodkowym układzie nerwowym. Po stereotaktycznym wstrzyknięciu BDA do brzusznego tylno-przyśrodkowego jądra (VPM) wzgórza u szczura za pomocą delikatnej szklanej pipety, BDA wybarwiono fluorescencyjną streptawidyną-Alexa (AF) 594 i przeciwbarwiono fluorescencyjnym barwnikiem Nissl AF500/525. Na tle zielonego barwienia Nisslem, czerwone znakowanie BDA, w tym ciała komórek neuronalnych i zakończenia aksonalne, było wyraźniej widoczne w korze somatosensorycznej. Ponadto przeprowadzono podwójne barwienie fluorescencyjne dla BDA i parwalbuminy białka wiążącego wapń (PV) w celu zaobserwowania korelacji znakowania BDA i interneuronów PV-dodatnich w celu korowym, co dało możliwość zbadania lokalnych obwodów neuronalnych i ich charakterystyki chemicznej. Tak więc ta udoskonalona metoda nadaje się nie tylko do wizualizacji wysokiej jakości znakowania neuronalnego za pomocą BDA o wysokiej masie cząsteczkowej poprzez wzajemne ścieżki neuronowe między wzgórzem a korą mózgową, ale także pozwoli na jednoczesną demonstrację innych markerów neuronalnych za pomocą fluorescencyjnej histochemii lub immunochemii.

Przetrwanie przez 10 dni po wstrzyknięciu BDA do VPM było wystarczające do uzyskania intensywnego znakowania neuronów w odpowiadających obszarach kory po stronie ipsilateralnej względem miejsca wstrzyknięcia (Rysunek 2). Zarówno konwencjonalna procedura ABC, jak i fluorescencyjne barwienie BDA ujawniły podobny wzór znakowania neuronów w obrębie S1, obejmujący znakowane anterogradnie aksony wzgórzowo-korowe oraz znakowane retrogradnie neurony korowo-wzgórzowe ...

Tutaj prezentujemy wyrafinowany protokół, który skutecznie ujawnia znakowanie biotynylowanej aminy dekstranu (BDA) metodą barwienia fluorescencyjnego poprzez wzajemną ścieżkę neuronową. Nadaje się do analizy drobnej struktury znakowania BDA i odróżniania jej od innych elementów nerwowych pod konfokalnym laserowym mikroskopem skaningowym.

Poprawa zastosowania biotynylowanej aminy dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej do śledzenia projekcji wzgórzowo-korowej u szczura

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of ...

Ogólnym celem tego filmu jest zaprezentowanie udoskonalonego protokołu zastosowania wysokocząsteczkowego BDA w celu badania optymalnego znakowania neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym. Pomiar ten może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny sieci neuronowych poprzez wizualizację struktury szkieletowej znakowania neuronów w obwodach neuronalnych.Główną zaletą tej techniki jest to, że daje ona możliwość badania lokalnych obwodów neuronalnych i ich charakterystyki chemicznej. Przygotować mikrosyringę o objętości 1 µL, wyposażoną w szklaną mikropipetę, i przetestować ją, zasysając parafinię ciekłą. Po znieczuleniu szczura zgodnie z zatwierdzonym protokołem, potwierdzić głębokość znieczulenia brakiem reakcji na uszczypnięcie ogona.Następnie należy zgolić górną część głowy zwierzęcia maszynką elektryczną i przemyć miejsce operacyjne 10% povidone iodine, a następnie 70% ethanol. Unieruchomić szczura w urządzeniu stereotaksycznym, wprowadzając tępe pręty uszne do uszu i umieszczając górne siekacze szczura w uchwycie szczęki. Nanieść maść oftalmiczną na oczy.W celu zachowania warunków sterylnych należy używać sterylnych rękawiczek chirurgicznych i obłożeń. Skórę głowy w miejscu operacyjnym należy ponownie oczyścić 70% etanolem. Po wykonaniu skalpelem cięcia strzałkowego skóry wzdłuż szwu strzałkowego, należy użyć sterylnych aplikatorów z bawełnianą końcówką, aby odsunąć mięśnie i okostną od czaszki.Wykorzystując zdefiniowane wcześniej współrzędne z atlasu, wyznacz miejsce wykonania kraniotomii. Przeprowadź kraniotomię za pomocą wiertarki stomatologicznej z wiertłem o okrągłym czubku, wiercąc na głębokość około 1 mm, aż do momentu uwidocznienia opon mózgowych. Wycięcie opony twardej wykonaj za pomocą mikropincety, aby odsłonić korę mózgową w miejscu wstrzyknięcia.Wypchnij ciekłą parafinę z mikrosstrzykawki, a następnie pobierz 10% roztwór BDA. Zamocuj strzykawkę w aparacie do mikroiniekcji i podłącz mikropompę. Za pomocą stereomikroskopu manipuluj aparatem do mikroiniekcji.Wprowadź wypełnioną szklaną mikropipetę do VPM przez powierzchnię kory mózgowej na głębokość 5,8 milimetra. Następnie, używając mikropompy, wstrzyknij pod ciśnieniem 100 nanolitrów 10% BDA do VPM w czasie trzech minut. Po pięciu minutach powoli wycofaj pipetę.Zaszyj ranę sterylną nicią, a następnie umieść szczura w ciepłym miejscu do rekonwalescencji, aż odzyska przytomność i w pełni powróci do zdrowia. Po uśmierceniu szczura użyj nożyczek i pęsety, aby otworzyć jamę klatki piersiowej i uzyskać dostęp do serca. Wprowadź cewnik dożylny do lewej komory, w kierunku aorty, a następnie otwórz prawy przedsionek.W pierwszej kolejności przeprowadź perfuzję 0,9% roztworem soli fizjologicznej w temperaturze fizjologicznej przez około jedną do dwóch minut, aż krew wypływająca z serca stanie się przejrzysta. Następnie kontynuuj perfuzję 250 do 300 ml 4% paraformaldehydu w 0,1 M buforze fosforanowym. Wypreparowany mózg poddaj post-fiksacji w 4% paraformaldehydzie przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.Następnie przenieś mózg do 30% sacharozy w 0,1 molarnym PBS i poddaj krioprotekcji przez trzy dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po trzech dniach, gdy mózg opadnie na dno roztworu, podziel go na trzy bloki w płaszczyźnie coronalnej przy użyciu matrycy mózgu. Blok centralny zawiera jądro brzuszne tylno-przyśrodkowe wzgórza w pierwotnej korze somatosensorycznej.Zamocuj centralny blok mózgu na stole mrożącym mikrotomu ślizgowego w celu wykonania przekrojów w płaszczyźnie wieńcowej i wykonaj sekcje o grubości 40 µm po zamrożeniu. Zbierz przekroje do płytki sześciodołkowej zawierającej 0,1 M PBS. Rozpocznij barwienie, płucząc przekroje w 0,1 M PBS przez około jedną minutę przy jednoczesnym kołysaniu.Następnie przenieście przekroje do mieszanego roztworu streptawidyny-AF594 oraz zielonego fluorescencyjnego barwnika Nissla AF500/525 w 0,1 M PBS zawierającym 0,3% Triton X-100 i inkubujcie przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Po barwieniu przemyjcie przekroje trzykrotnie w 0,1 M PB przy użyciu wytrząsarki rotacyjnej. Zamontujcie przekroje na szkiełkach mikroskopowych, stosując standardowe techniki histochemiczne.Suszyć skrawki na powietrzu przez około godzinę. Na skrawki fluorescencyjne nałożyć 50% glicerynę w wodzie destylowanej i przykryć szkiełkiem nakrywkowym przed wykonaniem zdjęć preparatów. Ta reprezentatywna fotomikrografia przedstawia miejsce wstrzyknięcia BDA (kolor czerwony) w brzuszny rdzeń posteromedialny wzgórza na tle zielonego barwienia metodą Nissla.Przedstawiono tutaj znakowanie thorescent BDA, obejmujące aksony wzgórzowo-korowe w warstwie czwartej oraz neurony korowo-wzgórzowe w warstwach piątej i szóstej. Dla porównania, ta fotomikrografia wykazuje, że konwencjonalne znakowanie BDA przy użyciu standardowej procedury z awidyną-biotynową peroksydazą ujawnia podobny wzór znakowania neuronalnego co znakowanie thorescent BDA. Ten widok przy większym powiększeniu przekroju znakowanego thorescent BDA szczegółowo pokazuje anterogradnie znakowane drzewa aksonalne w kolorze czerwonym.Tutaj szczegółowo pokazano wstecznie oznakowane ciało komórki neuronalnej, dendryty oraz kolce dendrytyczne. Po opanowaniu techniki, kraniotomia i wstrzykiwanie stereotaktyczne mogą zostać wykonane w ciągu 20 do 30 minut, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak stosować BDA o wysokiej masie cząsteczkowej do badania połączeń neuronalnych oraz szczegółowej struktury oznakowania neuronów.

improving-application-high-molecular-weight-biotinylated-dextran

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano metodę znakowania neuronów barwnikami fluorescencyjnymi w określonych funkcjonalnych mikrodomenach kory nowej. Po pierwsze, obrazowanie optyczne sygnału wewnętrznego służy do uzyskania mapy funkcjonalnej. Następnie mikroskopia dwufotonowa jest używana do oznaczania i obrazowania neuronów w mikrodomenie mapy.

Celowane znakowanie neuronów w specyficznej funkcjonalnej mikrodomenie kory nowej poprzez połączenie sygnału wewnętrznego i obrazowania dwufotonowego

Śledzenie transsynaptyczne stało się potężnym narzędziem do analizy centralnych eferentów regulujących cele obwodowe za pomocą obwodów wielosynaptycznych. Tutaj przedstawiamy protokół, który wykorzystuje transsynaptycznego wirusa wścieklizny rzekomej do identyfikacji i lokalizacji funkcjonalnego obwodu mózgu, a następnie klasyczne techniki śledzenia dróg w celu walidacji określonych połączeń w obwodzie między zidentyfikowanymi grupami neuronów.

Śledzenie transsynaptyczne od celów obwodowych z wirusem wścieklizny rzekomej, a następnie podwójne znakowanie toksyną i biotynylowanymi aminami dekstranu

Opisano metodę chirurgiczną polegającą na uwidocznieniu brzusznej czaszki u nowonarodzonych szczurów. Stosując to podejście, możliwe jest otwarcie kraniotomii w celu przeprowadzenia ostrej elektrofizjologii i eksperymentów z mikroskopią dwufotonową w pniu mózgu znieczulonych młodych.

Metoda wykonania kraniotomii na brzusznej czaszce noworodków gryzoni

Aby zrozumieć strukturę sieci neuronowych, konieczna jest funkcjonalna i morfologiczna charakterystyka poszczególnych neuronów. Tutaj demonstrujemy znakowanie biocytyny przykłasomalnej, które umożliwia zapisy elektrofizjologiczne w konfiguracji zewnątrzkomórkowej, zachowując jednocześnie zdolność do wewnątrzkomórkowego znakowania neuronu w celu rekonstrukcji post hoc architektury dendrytycznej i aksonalnej.

Znakowanie biocytyny Juxtasomal w celu zbadania zależności struktura-funkcja poszczególnych neuronów korowych

Protokoły immunohistochemiczne są używane do badania lokalizacji określonego białka w siatkówce. Techniki obrazowania wapnia są wykorzystywane do badania dynamiki wapnia w komórkach zwojowych siatkówki i ich aksonach.

Metody obrazowania immunohistochemicznego i wapniowego w siatkówce szczura

Aby zbadać reorganizację mózgu w warunkach patologicznych, użyliśmy pomp miniosmotycznych do bezpośredniego dostarczania białka do mózgu, omijając barierę krew-mózg. Następnie wstrzykuje się znaczniki dróg oddechowych w celu zbadania zmian w połączeniach mózgowych pod wpływem białka.

Implantacja pomp miniosmotycznych i dostarczanie znaczników dróg oddechowych w celu zbadania reorganizacji mózgu w stanach patofizjologicznych

Opisujemy technikę oznaczania neuronów i ich procesów poprzez iniekcje śladowe do jąder mózgowych za pomocą preparatu in vitro. Zmodyfikowaliśmy istniejącą metodę elektroporacji znaczników invitro, wykorzystując znakowane fluorescencyjnie mutanty myszy i podstawowy sprzęt optyczny w celu zwiększenia dokładności znakowania.

Laserowe śledzenie neuronów w eksplantatach mózgu

Ten protokół demonstruje metodologie dla mysiego modelu urazowego mózgu z otwartą czaszką i przeszczepu hodowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do miejsca urazu. W skrócie opisano również testy behawioralne i histologiczne wyników tych procedur.

Kontrolowany model wpływu kory mózgowej uszkodzenia mózgu myszy z terapeutycznym przeszczepem ludzkich pluripotencjalnych komórek nerwowych pochodzących z komórek macierzystych

Obecny protokół demonstruje prostą metodę śledzenia projekcji glutaminianu w brzusznym obszarze nakrywki (VTA) do hipokampa. Fotostymulację neuronów glutaminianu VTA połączono z zapisem CA1, aby zademonstrować, w jaki sposób zakończenia glutaminianu VTA modulują przypuszczalną szybkość wypalania CA1 w piramidzie in vivo.

Połączone anatomiczne i funkcjonalne śledzenie in vivo zakończeń glutaminianu w brzusznym obszarze nakrywki w hipokampie

Tutaj prezentujemy hydrofobową metodę oczyszczania tkanek, która pozwala na oglądanie docelowych cząsteczek jako części nienaruszonych struktur mózgu. Technika ta została teraz zwalidowana dla kontroli F344/N i transgenicznych szczurów HIV-1 obu płci.

Hydrofobowa metoda oczyszczania tkanki mózgowej szczura

Seryjna tomografia dwufotonowa (STPT) to technika obrazowania masy tkanki w jej trójwymiarowym kształcie poprzez połączenie obrazowania dwufotonowego z automatyczną kontrolą etapu i krojeniem mikrotomów. Tutaj opisujemy protokół jego implementacji dla mózgów marmozet, aby lepiej zrozumieć ich cechy strukturalne.

Seryjna tomografia dwufotonowa całego mózgu marmozety do analiz neuroanatomicznych

Poznaj udoskonaloną metodę biotynylowanego dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej do śledzenia projekcji wzgórzowo-korowych u szczura. Technika umożliwia szczegółową analizę obwodów nerwowych.

Poprawa zastosowania biotynylowanej aminy dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej do śledzenia projekcji wzgórzowo-korowej u szczura (Wideo) | JoVE Journal

Poprawa zastosowania biotynylowanej aminy dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej do śledzenia projekcji wzgórzowo-korowej u szczura

Przeglądaj więcej filmów