Poprawa zastosowania biotynylowanej aminy dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej do śledzenia projekcji wzgórzowo-korowej u szczura

Ogólnym celem tego filmu jest zademonstrowanie wyrafinowanego protokołu stosowania BDA o dużej masie cząsteczkowej do badania optymalnego znakowania neuronalnego w ośrodkowym układzie nerwowym. Ta miara może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie sieci neuronowych. Poprzez wizualizację struktury ramowej etykietowania neuronowego za pomocą obwodów neuronowych.

Główną zaletą tej techniki jest to, że daje ona możliwość uruchomienia lokalnych obwodów neuronalnych i ich charakterystyki chemicznej. Przygotuj jedną mikrostrzykawkę o pojemności mikrolitrów, wyposażoną w szklaną mikropipetę i przetestuj ją, pobierając ciekłą parafinę. Po znieczuleniu szczura przy użyciu zatwierdzonego protokołu, potwierdź głębokie znieczulenie przez brak reakcji na uszczypnięcie ogona.

Następnie ogol czubek głowy zwierzęcia elektryczną maszynką do golenia i wyszoruj miejsce operowane 10% jodowidonem, a następnie 70% etanolem. Przymocuj szczura do urządzenia stereotaktycznego, wkładając paski douszne do uszu i umieszczając górne siekacze szczura w uchwycie ust. Nałóż maść okulistyczną na oczy.

Używaj sterylnych rękawic chirurgicznych i obłożeń, aby utrzymać sterylne warunki. Ponownie oczyść skórę głowy w miejscu operacji za pomocą 70% etanolu. Po wykonaniu strzałkowego nacięcia w skórze za pomocą skalpela, wzdłuż szwu strzałkowego, użyj sterylnych aplikatorów z bawełnianą końcówką, aby zeskrobać mięsień i okostną z czaszki.

Korzystając z predefiniowanych współrzędnych z atlasu, określ lokalizację kraniotomii. Wykonaj kraniotomię za pomocą wiertła do zadziorów z wiertłem z okrągłą końcówką, aby wywiercić na głębokość około jednego milimetra, aż opony mózgowe będą widoczne. Wyciąć oponę twardą za pomocą mikrokleszczy, aby odsłonić korę mózgową nad miejscem wstrzyknięcia.

Usunąć ciekłą parafinę z mikrostrzykawki, a następnie pobrać 10% roztwór BDA. Zamontować strzykawkę w aparacie do mikroiniekcji i podłączyć mikropompę. Pod mikroskopem stereoskopowym manipuluj aparatem do mikroiniekcji.

Włóż napełnioną szklaną mikropipetę do VPM przez powierzchnię korową mózgu na głębokość 5,8 milimetra. Następnie za pomocą mikropompy wstrzyknij pod ciśnieniem 100 nanolitrów 10% BDA do VPM w ciągu trzech minut. Po pięciu minutach powoli wyjmij pipetę.

Zszyj ranę sterylną nicią, a następnie umieść szczura w ciepłym miejscu do rekonwalescencji, aż odzyska przytomność i w pełni wyzdrowieje. Po eutanazji szczura użyj nożyczek i kleszczy, aby otworzyć klatkę piersiową szczura i uzyskać dostęp do serca. Wprowadzić cewnik dożylny do lewej komory, w kierunku aorty, a następnie otworzyć prawą małżowinę uszną.

Najpierw perfuzjuj 0,9% solą fizjologiczną w temperaturze fizjologicznej przez około jedną do dwóch minut, aż krew wychodząca z serca będzie czysta. A następnie kontynuuj z 250 do 300 mililitrami 4% paraformaldehydu w 0,1-molowym buforze fosforanowym. Po utrwaleniu wypreparowanego mózgu w 4% paraformaldehydzie przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.

Następnie przenieś mózg do 30% sacharozy w 0,1 molowym PBS i krioprotektor przez trzy dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po trzech dniach, gdy mózg zanurzy się w roztworze, podziel mózg na trzy bloki w kierunku koronalnym za pomocą macierzy mózgowej. Blok centralny zawiera brzuszne tylno-przyśrodkowe jądro wzgórza w pierwotnej korze somatosensorycznej.

Zamontuj centralny blok mózgu na etapie zamrażania przesuwanego mikrotomu w celu przekroju w płaszczyźnie koronalnej i przekrój na 40 mikronów po zamrożeniu. Zebrać skrawki w sześciodołkowym naczyniu zawierającym 0,1 molowego PBS. Barwienie należy rozpocząć od płukania skrawków w 0,1 molowym PBS przez około minutę z kołysaniem.

Następnie przenieś skrawki do zmieszanego roztworu streptawidyny-AF594 w zielonym fluorescencyjnym barwniku Nissl AF500/525 w 0,1 molowym PBS zawierającym 0,3% Triton X-100 i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Po zabarwieniu umyj skrawki trzykrotnie w 0,1 molowym PB z kołysaniem. Zamontuj skrawki na szkiełkach mikroskopowych przy użyciu standardowych technik histochemicznych.

Suszyć sekcje na powietrzu przez około godzinę. Nałóż 50% gliceryny w wodzie destylowanej na odcinki piersiowe i szkiełko nakrywkowe przed obrazowaniem szkiełek. To reprezentatywne zdjęcie mikrograficzne przedstawia miejsce wstrzyknięcia BDA w kolorze czerwonym brzusznego tylno-przyśrodkowego jądra wzgórza na tle zielonego zabarwienia Nissl.

Pokazano tutaj znakowanie torowe BDA, w tym aksony kortykolu talamylu w warstwie czwartej i neurony wzgórza korowe w warstwach piątej i szóstej. Dla porównania, ta mikrofotografia pokazuje, że konwencjonalne znakowanie BDA za pomocą standardowej procedury peroksydazy awidyno-biotynowej ujawnia podobny wzorzec znakowania neuronalnego do znakowania talizacyjnego BDA. Ten widok w większym powiększeniu odcinka oznaczonego BDA pokazuje szczegółowo oznaczone następczo altanki aksonalne na czerwono.

Szczegółowo pokazano tutaj wstecznie oznakowane ciało komórki neuronalnej, dendryty i kolce dendrytyczne. Po opanowaniu, kraniotomia i wstrzyknięcie stereotaktyczne mogą być wykonane w ciągu 20 do 30 minut, jeśli są wykonane prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zastosować BDA o dużej masie cząsteczkowej, aby ożywić połączenia neuronalne i szczegółową strukturę znakowania neuronalnego.