Znakowanie biocytyny Juxtasomal w celu zbadania zależności struktura-funkcja poszczególnych neuronów korowych

Ogólnym celem tej procedury jest powiązanie specyficznych dla typu komórek potencjałów czynnościowych w korze sensorycznej podczas przetwarzania informacji z tożsamością morfologiczną rejestrowanych neuronów. Osiąga się to poprzez wstępne chirurgiczne przygotowanie szczura do rejestracji juksosomatycznej. Po przygotowaniu elektroda rejestruje spontaniczną i wywołaną bodźcami sensorycznymi aktywność impulsową, a następnie zarejestrowany neuron zostaje wypełniony biocydyną za pomocą prądu i iniekcji.

Następnie mózg jest poddawany obróbce w celu barwienia biotyną. Na koniec neuron wypełniony biotyną jest rekonstruowany cyfrowo z kolejnych sekcji w celu klasyfikacji typu komórki. Ostatecznie rejestracje jukstasomalne poszczególnych neuronów pozwalają na badanie przetwarzania sensorycznego i informacji strukturalnych w obrębie sieci korowej.

Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neuronauki, takie jak: jaka jest rola poszczególnych typów komórek i warstw podczas przetwarzania sensorycznego? Zazwyczaj osoby potrzebujące tej metody napotykają trudności, ponieważ podczas procedury wypełniania bardzo łatwo jest doprowadzić do śmierci neuronów. Szanse na pomyślne wypełnienie biocydyną zwiększa przygotowanie pipet o optymalnej jakości, a dodatkowo niezbędne jest doświadczenie w kontrolowaniu wstrzykiwań prądu w wąskim pasmie.

Z tego powodu zwiększenie skuteczności odzyskiwania prawidłowo wypełnionych neuronów wymaga doświadczenia. Aby rozpocząć, umieść znieczulonego szczura szczepu Wistar w aparacie stereotaktycznym wyposażonym w matę grzewczą. Potwierdź głębokość sedacji, sprawdzając odruch cofania łapy po uciśnięciu palca.

Następnie wprowadź sondę odbytniczą, aby utrzymać prawidłową temperaturę ciała. Unieruchom głowę zwierzęcia i usuń sierść z pola operacyjnego. Nałóż maść do oczu, aby zapobiec ich wysychaniu.

Odczekaj od trzech do pięciu minut po wstrzyknięciu lidokainy w miejscu operacji, a następnie usuń skórę pokrywającą powierzchnię czaszki. Następnie usuń wszelkie pozostałe tkanki i dokładnie oczyść czaszkę 0,9% roztworem chlorku sodu. Wyznacz współrzędne pierwotnej kory somatosensorycznej w lewej półkuli i zaznacz to miejsce na czaszce za pomocą chirurgicznego markera do skóry.

Używając wiertła stomatologicznego, zeskrob kość z obszaru zainteresowania. Kontynuuj skrobanie kości, aż stanie się ona przezroczysta, a naczynia krwionośne będą wyraźnie widoczne. Następnie skalpelem wytnij małe okno w cienkiej czaszce.

Należy uważać, aby nie uszkodzić opony twardej oraz naczyń krwionośnych. Krawędzie kraniotomii należy zaznaczyć za pomocą chirurgicznego pisaka do skóry. Aby poprawić widoczność, na suchą czaszkę należy nanieść cienką warstwę superglue, a następnie zastosować cement dentystyczny w celu wykonania kąpieli.

Podczas zamykania kraniotomii przytnąć wibrysy po przeciwnej stronie do dokładnie pięciu milimetrów, aby zwiększyć ich widoczność. Przed rozpoczęciem rejestracji zaznaczyć przycięte wibrysy czarnym tuszem do rzęs; wykonać pipety do patch-clampu ze szkła borokrzemianowego. Idealna morfologia pipety to stopniowe, smukłe zwężenie, mały kąt stożka oraz wewnętrzna średnica końcówki wynosząca około jednego mikrona.

Napełnij pipetę patch normalnym roztworem Ringera dla gryzoni, uzupełnionym o 2% biotyny, a następnie zamocuj pipetę w uchwycie do pipet przymocowanym do głowicy i połączonym z mikromanipulatorem. Aby precyzyjnie skierować się na kolumnę D2 w obszarze S1 szczura, ustaw kąt uchwytu elektrody na 34 stopnie względem płaszczyzny strzałkowej. Następnie umieść pipetę patch w bezpośrednim sąsiedztwie otworu trepanacyjnego.

Napełnij kąpiel 0,9% roztworem chlorku sodu. Przy ustawionym wzmacniaczu w trybie mostkowym przyłóż impulsy prostokątne z dodatnim wstrzykiwaniem prądu, aby wyznaczyć rezystancję elektrody. Optymalna rezystancja elektrody mieści się w przedziale od trzech do pięciu megaohmów.

Ustanowić nadciśnienie od 100 do 150 millibar i przesuwać pipetę patch w krokach o wielkości jednej mikrona, przykładając dodatni prąd w postaci impulsów prostokątnych. Monitorować wyraźną zmianę rezystancji po nawiązaniu kontaktu z oponą twardą. W tym momencie ustawić współrzędne mikromanipulatora na zero, aby umożliwić dokładne pomiary głębokości.

Przesuwaj w trybie kroków jedno-mikronowych, aż pipeta do patch-clampu przebije oponę twardą, co zostanie zasygnalizowane nagłym spadkiem oporności elektrody. Usuń ciśnienie podtrzymujące w pipecie. Następnie wyszukuj pojedynczych jednostek, przesuwając się w krokach jedno-mikronowych.

Stale monitoruj rezystancję elektrody, aplikując impulsy włącz/wyłącz o czasie trwania 200 milisekund; wzrost rezystancji elektrody zazwyczaj wskazuje na bliskość pojedynczego neuronu. Przesuwaj elektrodę do momentu zarejestrowania dodatnich potencjałów czynnościowych o amplitudzie około dwóch milivoltów. Opcjonalnie zarejestruj spontaniczną aktywność impulsową i określ aktywność impulsową wywołaną ruchem wibrysów, odchylając poszczególne wibrysy za pomocą urządzenia piezoelektrycznego, aby uzyskać optymalne warunki do wypełniania jukstasomatycznego.

Przesuwaj elektrodę, aż rezystancja wyniesie od 25 do 35 MΩ, a amplitudy impulsów (spikes) będą wynosić od 3 do 8 mV, aby rozpocząć wypełnianie juxtasomalne. Przykładaj dodatnie prostokątne impulsy prądu, zaczynając od 1 nA.

Powoli i stopniowo zwiększaj natężenie prądu w krokach o 0.1 nA, monitorując kształt i częstotliwość potencjałów czynnościowych (AP). Monitoruj otwieranie błony jako wyraźny wzrost częstotliwości AP podczas fazy włączonej impulsu blokującego; podczas napełniania kształt fali kolca wykazuje zwiększoną szerokość i zredukowaną hiperpolaryzację następczą. Zwiększaj lub zmniejszaj natężenie prądu podczas napełniania, aby utrzymać stabilną infuzję biotyny; zmniejsz lub przerwij impulsy prądowe w przypadku nagłego wzrostu częstotliwości AP. Należy to robić, aby uniknąć toksyczności spowodowanej nadmiernym napływem jonów zewnątrzkomórkowych, takich jak jony sodu.

Należy zauważyć, że każdy neuron będzie reagował inaczej na procedurę wypełniania. W związku z tym parametry znakowania przysomaatycznego muszą być dostosowane do warunków rejestracji. Należy uważnie monitorować sygnał po zaprzestaniu wstrzykiwania prądu.

Kształt impulsu po sesji wypełniania jest zazwyczaj poszerzony i wykazuje silnie zredukowaną hiperpolaryzację następczą; należy odczekać do regeneracji neuronu, co jest widoczne, gdy kształt impulsu powróci do swoich pierwotnych właściwości, aby zminimalizować naprężenia mechaniczne komórki. Wycofać pipetę patch w krokach o wielkości jednego mikrona, aż amplituda impulsu ulegnie zmniejszeniu; odczekać co najmniej jedną godzinę, aby biotyna mogła rozprzestrzenić się wewnątrzkomórkowo, uważnie monitorując temperaturę ciała i oddychanie zwierzęcia. Na koniec pobiera się próbki mózgu i poddaje je obróbce, aby ocenić jakość znakowania jujtasomatycznego.

Zdjęcia te przedstawiają neurony w korze somatosensorycznej pierwotnej, wypełnione metodą juxtasomalną. Ten widok styczny neuronu parametralnego obrazuje różnicę w rozmiarze między dendrytami a aksonami. Na tej cyfrowej rekonstrukcji neuronu znakowanego metodą juxtasomalną, obraz projekcji neuronu przedstawiono w wysokiej rozdzielczości, ale przy małym powiększeniu, z nałożoną automatyczną rekonstrukcją cyfrową, gdzie akson zaznaczono kolorem niebieskim, a dendryt kolorem czerwonym.

Tutaj obszar zaznaczony ramką został powiększony, aby ukazać kolbiki aksonalne na całej długości aksonu. W tej końcowej animacji prezentujemy proces rekonstrukcji dla jednego grubego neuronu parametalicznego z warstwy V pierwotnej kory somatosensorycznej szczura. Proces ten obejmuje rekonstrukcję morfologii dendrytów i aksonów przy powiększeniu 100x oraz konturów beczułek przy powiększeniu 4x.

Wynikiem jest pełna rekonstrukcja 3D, która jest następnie dopasowywana do zestandaryzowanej ramy odniesienia w celu przeprowadzenia ilościowej analizy cech morfologicznych. Zatem znakowanie przysomatyczne in vivo zapewnia wyjątkową jakość znakowania, umożliwiającą wiarygodną rekonstrukcję pełnej morfologii 3D. W niniejszej pracy zaprezentowano tę metodę na zwierzętach znieczulonych uretanem.

Niemniej jednak rejestracje typu Jux Somal mogą być również stosowane u czuwających zwierząt z unieruchomioną głową, aby badać rolę poszczególnych typów komórek i warstw podczas aktywnej eksploracji środowiska. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć lepsze zrozumienie tego, jak przeprowadzić znakowanie Biocydyną pojedynczych neuronów w celu ich późniejszej identyfikacji i rekonstrukcji morfologicznej.