Name: Znakowanie biocytyny Juxtasomal w celu zbadania zależności struktura-funkcja poszczególnych neuronów korowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-25T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Poznaj technikę znakowania biocytyną juxtasomalną do badania aktywności neuronów kory sensorycznej u szczurów. Ta metoda łączy rejestrację potencjałów czynnościowych z rekonstrukcją morfologiczną pojedynczych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować profesorom. Huibertowi Mansvelderowi i Bertowi Sakmannowi za szerokie wsparcie, dr Marcelowi Oberlaenderowi za owocne dyskusje i śledzenie neuronów oraz Brendanowi Lodderowi za pomoc techniczną. Dane zostały pozyskane za pomocą ntrode VI dla LabView, hojnie dostarczonego przez R. Bruno (Columbia Univ., NY, USA). Badania te były wspierane przez Towarzystwo Maxa Plancka i Bernstein Center for Computational Neuroscience w Tybindze (finansowane przez niemieckie Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań Naukowych (BMBF; FKZ: 01GQ1002))( R.T.N.), Centrum Neurogenomiki i Badań Kognitywnych (CNCR), Neuroscience Campus Amsterdam (NCA), finansowanie C.P.J.d.K. (NWO-ALW #822.02.013 i ENC-Network #p3-c3) oraz Uniwersytetu VU w Amsterdamie.

1. Przygotowanie zwierzęcia
Wszystkie procedury eksperymentalne są przeprowadzane zgodnie z prawem holenderskim i po ocenie przez lokalną komisję etyczną na Uniwersytecie VU w Amsterdamie, Holandia.
<ol>
	<li>Znieczulić szczura Wistar (P25-P45, ♂ /♀) izofluranem (2-3% tlenu), a następnie uretanem (20% w 0,9% NaCl, 1,6-1,7 g/kg) przez wstrzyknięcie dootrzewnowe. Oceń głębokość znieczulenia, monitorując wycofanie szczypania, odruchy powiek i ruchy wibrysów.</li>
	<li>Podać dodatkową dawkę uretanu (10% dawki początkowej) w przypadku, gdy zwierzę nie osiągnie wystarczającej głębokości znieczulenia lub gdy w trakcie eksperymentu zaobserwuje się drgawki wibrysów.</li>
	<li>Umieść znieczulone zwierzę na ramie stereotaktycznej wyposażonej w poduszkę grzewczą, włóż sondę temperatury doodbytniczej i utrzymuj temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37,5±0,5 °C za pomocą poduszki grzewczej.</li>
	<li>Umieść głowę zwierzęcia w ramie stereotaktycznej; przytnij włosy na czubku głowy za pomocą nożyczek, aby skóra była widoczna.</li>
	<li>Wstrzyknąć podskórnie 100 μl 1% lidokainy (w 0,9% NaCl) do znieczulenia miejscowego w miejscu operacji i odczekać 3-5 minut. Usunąć skórę pokrywającą powierzchnię czaszki, przecinając w kierunku ogonowo-rostralnym i oczyścić pozostałą tkankę.</li>
	<li>Dokładnie oczyść czaszkę za pomocą 0,9% NaCl i chłonnych wacików.</li>
	<li>Określ współrzędne obszaru docelowego na lewej półkuli (dla pierwszorzędowej kory somatosensorycznej (S1): 2,5 mm z tyłu i 5,5 mm z boku do bregmy). Zaznacz miejsce na czaszce markerem chirurgicznym do skóry.</li>
	<li>Delikatnie zeskrob kość wiertłem dentystycznym z obszaru zainteresowania, aż kość stanie się przezroczysta, a naczynia krwionośne będą wyraźnie widoczne.</li>
	<li>Wykonaj kraniotomię o wymiarach 0,5 mm x 0,5 mm, wycinając skalpelem okienko w przerzedzonej czaszce (#11), unikając uszkodzenia opony twardej i naczyń krwionośnych. Opcjonalnie: zaznacz krawędzie kraniotomii za pomocą markera chirurgicznego do skóry, aby poprawić widoczność.</li>
	<li>Nałóż cienką warstwę superglue na suchą czaszkę, a następnie cement dentystyczny, aby zbudować wannę (tj. komorę rejestracyjną) otaczającą kraniotomię.</li>
	<li>Przyciąć wąsy po stronie przeciwległej dokładnie do 5 mm od mieszków włosowych. Opcjonalnie: podkreśl przycięte wąsy czarnym tuszem do rzęs.</li>
</ol>
2. Zapisy Juxtasomal i znakowanie biocytyny
<ol>
	<li>Wykonać pipety krosowe ze szkła borokrzemianowego o średnicy wewnętrznej końcówki ~1 μm w celu uzyskania elektrod o rezystancji 3-5 MΩ. Uwaga: Idealna morfologia pipety do zapisu juktasomalnego to stopniowe, smukłe zwężenie, niski kąt stożka i końcówka o średnicy ~1 μm (ilustracja 1).</li>
	<li>W zależności od głębokości zapisu (w stosunku do powierzchni nagrywającej) należy dostosować wymiary stożka elektrody nagrywającej. Niezwykle ważne jest, aby średnica stożka była mniejsza niż 75 μm w miejscu wejścia do mózgu, aby uniknąć uszkodzeń mechanicznych lub naprężeń w obszarze nagrywania. Oznacza to, że w przypadku powierzchownych zapisów korowych wymagane jest zwężenie 300-500 μm przy średnicy zewnętrznej maksymalnie 75 μm (ryc. 1A), podczas gdy nagrania ze stosunkowo głębokich warstw korowych wymagają dłuższego stożka 1500-1800 μm, ponownie o maksymalnej średnicy zewnętrznej 75 μm (przy 1800 μm od końcówki elektrody).</li>
	<li>Załadować pipetę z plastrem zwykłym dzwonkiem dla szczurów (NRR) uzupełnionym 2% biocytyną (patrz Tabela 1 dla roztworów i odczynników) i zamontować pipetę z plastrem na stopniu głowicy przymocowanym do mikromanipulatora.</li>
	<li>Ustaw kąt uchwytu elektrody na 34° w stosunku do płaszczyzny strzałkowej, aby konkretnie celować w kolumnę D2 szczura S1.</li>
	<li>Podłącz stopień główny do amplifier w trybie mostka (tj. cęgi prądowe).</li>
	<li>Umieścić pipetę z plastrem w bliskiej odległości od kraniotomii. Napełnij wannę 0,9% NaCl i określ rezystancję elektrody, która powinna wynosić od 3 do 5 MΩ, ocenianą przez zastosowanie impulsu kwadratowego z wtryskiem prądu dodatniego (1 nA, 200 ms wł./wył.).</li>
	<li>Ustalić nadciśnienie na poziomie 100-150 mbar i przesuwać pipetę krosową w krokach co 1 μm, stosując prąd dodatni w postaci impulsów kwadratowych (1 nA, 200 ms wł./wył.). Monitoruj solidną zmianę oporu po nawiązaniu kontaktu z oponą twardą. W tym momencie ustaw współrzędne mikromanipulatora na "zero", aby umożliwić dokładne pomiary głębokości.</li>
	<li>Przesuwaj w trybie krokowym 1 μm, aż pipeta z plastrem przeniknie do opony twardej, co wskazuje na nagły spadek rezystancji elektrody. Zdjąć ciśnienie docisku pipety.</li>
	<li>Szukaj pojedynczych jednostek, posuwając się naprzód w krokach co 1 μm. Monitoruj rezystancję elektrody w sposób ciągły, stosując impulsy włączania/wyłączania 200 ms. Wzrost rezystancji elektrody zazwyczaj wskazuje na bliskość pojedynczego neuronu. Przesuwaj elektrodę, aż zostaną zarejestrowane przebiegi dodatniego potencjału czynnościowego (AP) wynoszące ~2 mV (rysunki 2A i 2B).</li>
	<li>Opcjonalnie: Nagraj spontaniczny wzorzec wystrzeliwania neuronu i określ impuls wywołany wąsem, na przykład doogonowo odchylając poszczególne wąsy przez 200 ms pod kątem 3,3° za pomocą urządzenia piezoelektrycznego18.</li>
	<li>Przesuwaj elektrodę do momentu, aż rezystancja wyniesie 25-35 MΩ, a skoki będą miały amplitudy 3-8 mV, aby uzyskać optymalne warunki wypełnienia juksomowego. Napełnianie mikroskopowe należy rozpocząć od przyłożenia impulsów kwadratowych prądu dodatniego (1 nA, 200 ms wł./wył.). Powoli i stopniowo zwiększaj prąd w krokach co 0,1 nA, jednocześnie monitorując przebieg i częstotliwość AP (rysunki 2A i 2B).</li>
	<li>Monitoruj otwarcie membrany jako wyraźny wzrost częstotliwości AP podczas włączania fazy impulsu blokowego (rysunek 2C). Przebieg skoku podczas napełniania wykazuje zwiększoną szerokość i zmniejszoną hiperpolaryzację wtórną (rysunki 2C i 2D). Dodatkowe parametry to zwiększony szum lub małe (1-5 mV) ujemne przesunięcie DC.</li>
	<li>Zwiększ lub zmniejsz prąd (1 nA) podczas napełniania, aby utrzymać stabilną infuzję biocytyny. Zmniejsz lub zatrzymaj impulsy prądu po nagłym wzroście częstotliwości AP, aby uniknąć toksyczności spowodowanej nadmiernym napływem jonów zewnątrzkomórkowych, takich jak jony sodu. Uwaga: każdy neuron będzie inaczej reagował na bieżące wstrzyknięcie, a parametry znakowania juktasomów muszą być dostosowane w zależności od indywidualnych warunków nagrywania.</li>
	<li>Uważnie monitoruj sygnał po zatrzymaniu wtrysku prądu. Przebieg skoku po sesji napełniania jest zwykle poszerzony i wykazuje znacznie zmniejszony po hiperpolaryzacji. Poczekaj na regenerację neuronu, która jest widoczna, gdy przebieg kolca powróci do swoich pierwotnych właściwości (tj. obecności normalnej hiperpolaryzacji pooperacyjnej, ryc. 2).</li>
	<li>Powtórz sesje napełniania biocytyną po całkowitym wyzdrowieniu neuronu, aby zwiększyć obciążenie biocytyną i poprawić jakość barwienia.</li>
	<li>Cofać pipetę z plastrem w krokach co 1 μm, aż amplituda kolca zmniejszy się, aby zmniejszyć wszelkie naprężenia mechaniczne ogniwa. Odczekaj co najmniej 1 godzinę, aż biocytyna rozdyfunduje się wewnątrzkomórkowo, ściśle monitorując temperaturę ciała i oddech zwierzęcia.</li>
</ol>
3. Perfuzja zwierzęcia i usunięcie mózgu
<ol>
	<li>Przygotuj zestaw do perfuzji, przepłucz i wstępnie naładuj rurkę 0,9% NaCl.</li>
	<li>Umieść zwierzę na tacy chirurgicznej i zabezpiecz standardową taśmą do etykietowania. Zapewnić odpowiednią głębokość znieczulenia; Szczypanie stóp i odruchy powiek powinny być nieobecne.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie przyśrodkowe lub boczne (5-6 cm) przez ścianę brzucha tuż pod klatką piersiową i postępuj w kierunku tylno-przednim, aby odsłonić mostek. Pociągnij mostek do przodu i ostrożnie oddziel wątrobę od przepony.</li>
	<li>Wykonaj małe nacięcie w przeponie, przetnij dolne żebra i kontynuuj nacięcie na całej długości jamy brzusznej, aby odsłonić serce.</li>
	<li>Usuń osierdzie.</li>
	<li>Włóż igłę do lewej komory i wykonaj nacięcie w prawym przedsionku. Perfaktorować 0,9% NaCl (~8 ml/min) aż do całkowitego odbarwienia wątroby.</li>
	<li>Zmień napar na 4% paraformaldehyd (PFA), aż do momentu, gdy pojawi się sztywność przedniej łapy i dolnej szczęki.</li>
	<li>Odetnij głowę szczura za pomocą nożyczek</li>
	<li>Usuń pozostałe mięśnie szyi i całkowicie odsłoń czaszkę.</li>
	<li>Umieść nożyczki w pniu mózgu po stronie grzbietowej i ostrożnie przetnij kość wzdłuż szwu strzałkowego, utrzymując pozycję grzbietową.</li>
	<li>Usuń kości z obu stron szwu strzałkowego, aby odsłonić mózg za pomocą kleszczy. Ostrożnie wyjmij oponę twardą, aby uniknąć uszkodzenia.</li>
	<li>Ostrożnie włóż szpatułkę do brzusznej strony mózgu i delikatnie wyjmij mózg.</li>
	<li>Po utrwaleniu całego mózgu przez noc w PFA w temperaturze 4 °C. Przełącz mózg na 0,05 M bufor fosforanowy (PB) i przechowuj w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
4. Krojenie mózgu na styczne odcinki
<ol>
	<li>Wyjmij mózg z 0,05 M PB i umieść go na bibule filtracyjnej skierowanej do przodu. Użyj ostrej żyletki, aby odciąć móżdżek wzdłuż płaszczyzny koronalnej i oddzielić półkule, przecinając wzdłuż środkowej płaszczyzny strzałkowej.</li>
	<li>Nałóż superglue na platformę montażową i zamontuj lewą półkulę na jej płaszczyźnie strzałkowej z przodem skierowanym w prawo. Przymocuj platformę montażową pod kątem 45° na wibratomie i zanurz mózg w 0,05 M PB.</li>
	<li>Przymocuj żyletkę do wibratomu i upewnij się, że pierwszy kontakt z powierzchnią mózgu znajduje się w środku przednio-tylnej płaszczyzny półkuli. Wyciąć 24 odcinki o wielkości 100 μm i zebrać je na 24-dołkowej płytce zawierającej 0,05 M PB.</li>
</ol>
5. Procedury histologiczne
<ol>
	<li>Wykonać protokoły histologiczne barwienia oksydazą cytochromową24 i metodą peroksydazy awidyny-biotyny zgodnie z wcześniej opisanymi metodami25. Opcjonalnie: wizualizacja biocytyny za pomocą fluorescencyjnych koniugatów awidyna/streptawidyna-Alexa. Umożliwia to dodatkowo podwójne barwienie za pomocą technik śledzenia wstecznego lub następczego.</li>
	<li>Przemyć skrawki 5 x 5 min 0,05 M PB i przygotować roztwór zawierający tetrachlorowodorek 3,-3'-diaminobenzydyny (DAB) do barwienia oksydazą cytochromową w celu uwidocznienia beczek w warstwie 4 (L4) S1 (patrz tabela 2 dla roztworów i odczynników). Inkubować sekcje 6-12 z pia w podgrzanym roztworze przez 30-45 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przepłukać skrawki 0,05 M PB przez 6 x 5 min i wygasić aktywność endogennej peroksydazy poprzez inkubację wszystkich sekcji w 3% H2O2 w 0,05 M PB przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Przepłukać skrawki 0,05 M PB przez 5 x 10 min. Inkubować sekcje w roztworze ABC (patrz Tabela 3 dla roztworów i odczynników) przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przepłukać skrawki 0,05 M PB przez 5 x 10 minut i przygotować roztwór DAB do wizualizacji neuronu wypełnionego biocytyną (patrz Tabela 4 dla roztworów i odczynników). Inkubować skrawki w przefiltrowanym roztworze przez 45-60 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przepłukać skrawki za pomocą 0,05 M PB przez 5 x 10 min. Zamontuj skrawki na szkiełkach mikroskopowych i szkiełku nakrywkowym za pomocą Mowiolu (patrz Tabela 5 dla roztworów i odczynników).</li>
	<li>Określ jakość etykietowania za pomocą mikroskopii świetlnej.</li>
</ol>

<ol><li>Brown, S. P., Hestrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type+identity%3A+a+key+to+unlocking+the+function+of+neocortical+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).</li>
<li>DeFelipe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+classification+and+nomenclature+of+cortical+GABAergic+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons.</a> Nat. Rev. Neurosci. 14 (3), 202-216 (2013).</li>
<li>Dean, P., Porrill, J., Ekerot, C. F., Jorntell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cerebellar+microcircuit+as+an+adaptive+filter%3A+experimental+and+computational+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The cerebellar microcircuit as an adaptive filter: experimental and computational evidence.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11 (1), 30-43 (2010).</li>
<li>Oberlaender, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+three-dimensional+structure+of+thalamocortical+circuits+in+a+column+of+rat+vibrissal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb.+Cortex%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex.</a> Cereb. Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).</li>
<li>Dyer, M. A., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulating+proliferation+during+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulating proliferation during retinal development.</a> Nat. Rev. Neurosci. 2 (5), 333-342 (2001).</li>
<li>Klausberger, T., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+diversity+and+temporal+dynamics%3A+the+unity+of+hippocampal+circuit+operations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations.</a> Science. 321 (5885), 53-57 (2008).</li>
<li>Urban, N., Tripathy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroscience%3A+Circuits+drive+cell+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuroscience: Circuits drive cell diversity.</a> Nature. 488 (7411), 289-290 (2012).</li>
<li>Gentet, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+functional+properties+of+somatostatin-expressing+GABAergic+neurons+in+mouse+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Unique functional properties of somatostatin-expressing GABAergic neurons in mouse barrel cortex.</a> Nat. Neurosci. 15 (4), 607-612 (2012).</li>
<li>Burgalossi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcircuits+of+functionally+identified+neurons+in+the+rat+medial+entorhinal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microcircuits of functionally identified neurons in the rat medial entorhinal cortex.</a> Neuron. 70 (4), 773-786 (2011).</li>
<li>Bock, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+anatomy+and+in+vivo+physiology+of+visual+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons.</a> Nature. 471 (7337), 177-182 (2011).</li>
<li>Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wiring+specificity+in+the+direction-selectivity+circuit+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina.</a> Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).</li>
<li>Herfst, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friction-based+stabilization+of+juxtacellular+recordings+in+freely+moving+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Friction-based stabilization of juxtacellular recordings in freely moving rats.</a> J. Neurophysiol. 108 (2), 697-707 (2012).</li>
<li>Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+biocytin+labeling+and+neuronal+3D+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction.</a> Nat. Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).</li>
<li>Bruno, R. M., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortex+is+driven+by+weak+but+synchronously+active+thalamocortical+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses.</a> Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).</li>
<li>Oberlaender, M., Ramirez, A., Bruno, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+experience+restructures+thalamocortical+axons+during+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensory experience restructures thalamocortical axons during adulthood.</a> Neuron. 74 (4), 648-655 (2012).</li>
<li>Joshi, S., Hawken, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loose-patch-juxtacellular+recording+in+vivo-a+method+for+functional+characterization+and+labeling+of+neurons+in+macaque+V1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Loose-patch-juxtacellular recording in vivo-a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1.</a> J. Neurosci. Methods. 156 (1-2), 37-49 (2006).</li>
<li>Pinault, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+single-cell+staining+procedure+performed+in+vivo+under+electrophysiological+control%3A+morpho-functional+features+of+juxtacellularly+labeled+thalamic+cells+and+other+central+neurons+with+biocytin+or+Neurobiotin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin.</a> J. Neurosci. Methods. 65 (2), 113-136 (1996).</li>
<li>de Kock, C. P., Bruno, R. M., Spors, H., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer+and+cell+type+specific+suprathreshold+stimulus+representation+in+primary+somatosensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Layer and cell type specific suprathreshold stimulus representation in primary somatosensory cortex.</a> J. Physiol. 581 (1), 139-154 (2007).</li>
<li>Egger, R., Narayanan, R. T., Helmstaedter, M., de Kock, C. P., Oberlaender, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+reconstruction+and+standardization+of+the+rat+vibrissal+cortex+for+precise+registration+of+single+neuron+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">3D reconstruction and standardization of the rat vibrissal cortex for precise registration of single neuron morphology.</a> PLoS Comput. Biol. 8 (12), (2012).</li>
<li>Oberlaender, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+axon+morphologies+of+individual+layer+5+neurons+indicate+cell+type-specific+intracortical+pathways+for+whisker+motion+and%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional axon morphologies of individual layer 5 neurons indicate cell type-specific intracortical pathways for whisker motion and.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (10), 4188-4193 (2011).</li>
<li>Sakata, S., Harris, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+structure+of+spontaneous+and+sensory-evoked+population+activity+in+auditory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex.</a> Neuron. 64 (3), 404-418 (2009).</li>
<li>de Kock, C. P., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+action+potential+bursts+%28%3Eor%3D+100+Hz%29+in+L2%2F3+and+L5B+thick+tufted+neurons+in+anaesthetized+and+awake+rat+primary+somatosensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">High frequency action potential bursts (>or= 100 Hz) in L2/3 and L5B thick tufted neurons in anaesthetized and awake rat primary somatosensory cortex.</a> J. Physiol. 586 (14), 3353-3364 (2008).</li>
<li>de Kock, C. P., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiking+in+primary+somatosensory+cortex+during+natural+whisking+in+awake+head-restrained+rats+is+cell-type+specific%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (38), 16446-16450 (2009).</li>
<li>Wong-Riley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+visual+system+of+monocularly+sutured+or+enucleated+cats+demonstrable+with+cytochrome+oxidase+histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry.</a> Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).</li>
<li>Horikawa, K., Armstrong, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+means+of+intracellular+labeling%3A+injection+of+biocytin+and+its+detection+with+avidin+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A versatile means of intracellular labeling: injection of biocytin and its detection with avidin conjugates.</a> J. Neurosci. Methods. 25 (1), 1-11 (1988).</li>
<li>O'Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+activity+in+barrel+cortex+underlying+vibrissa-based+object+localization+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice.</a> Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).</li>
<li>Veinante, P., Deschenes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+study+of+motor+cortex+projections+to+the+barrel+field+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Single-cell study of motor cortex projections to the barrel field in rats.</a> J. Comp. Neurol. 464 (1), 98-103 (2003).</li>
<li>Boudewijns, Z. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-specific+high-frequency+action+potential+spiking+in+the+prefrontal+cortex+of+awake+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Layer-specific high-frequency action potential spiking in the prefrontal cortex of awake rats.</a> Front. Cell. Neurosci. 7, 99 (2013).</li>
<li>Oberlaender, M., Bruno, R. M., Sakmann, B., Broser, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmitted+light+brightfield+mosaic+microscopy+for+three-dimensional+tracing+of+single+neuron+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Transmitted light brightfield mosaic microscopy for three-dimensional tracing of single neuron morphology.</a> J. Biomed. Opt. 12 (6), 064029 (2007).</li>
<li>Boudewijns, Z. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-automated+three-dimensional+reconstructions+of+individual+neurons+reveal+cell+type-specific+circuits+in+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Commun.+Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Semi-automated three-dimensional reconstructions of individual neurons reveal cell type-specific circuits in cortex.</a> Commun. Integr. Biol. 4 (4), 486-488 (2011).</li>
<li>Bruno, R. M., Hahn, T. T., Wallace, D. J., de Kock, C. P., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+experience+alters+specific+branches+of+individual+corticocortical+axons+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sensory experience alters specific branches of individual corticocortical axons during development.</a> J. Neurosci. 29 (10), 3172-3181 (2009).</li>
<li>Schubert, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+without+disturbing%3A+how+different+cortical+neuron+classes+represent+tactile+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Observing without disturbing: how different cortical neuron classes represent tactile stimuli.</a> J. Physiol. 581 (1), 5 (2007).</li>
<li>Neumann, E., Kakorin, S., Toensing, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+electroporative+delivery+of+drugs+and+genes%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochem.+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes).</a> Bioelectrochem. Bioenerg. 48 (1), 3-16 (1999).</li>
<li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).</li>
</ol>

Authros nie mają nic do wyjawienia.

Metoda juktasomalna umożliwia rejestrację in vivo wzrostu potencjału czynnościowego z pojedynczych jednostek w różnych stanach behawioralnych (znieczulony, przytomny, unieruchomiony lub swobodnie poruszający się) z opcją znakowania biocytyną zarejestrowanego neuronu w celu klasyfikacji typu komórek post hoc i/lub rekonstrukcji 3D. Główną zaletą jest uzyskanie parametrów fizjologicznych w konfiguracji zewnątrzkomórkowej (a więc nieinwazyjnej), przy jednoczesnej możliwości wewnątrzkomórkowego znakowania n...

Sieci neuronalne składają się z wielu typów komórek, charakteryzujących się bardzo specyficznymi właściwościami morfologicznymi i fizjologicznymi1-7. W związku z tym poszczególne typy komórek wykonują wyspecjalizowane zadania w sieci (zob. np. Gentet i wsp.8 oraz Burgalossi i wsp.9). Dopiero zaczynamy rozumieć funkcje specyficzne dla typu komórki w sieciach neuronowych i wiele wciąż pozostaje do odkrycia. W tym celu wiele laboratoriów wdraża podejścia eksperymentalne, które pozwalają na analizę właściwości morfologicznych tej samej populacji neuronów, z której uzyskano parametry fizjologiczne1,10-15. Tutaj demonstrujemy technikę znakowania juxtasomal16,17, która polega na zapisach elektrofizjologicznych przy użyciu konwencjonalnych pipet z plastrami w konfiguracji zewnątrzkomórkowej (a więc nieinwazyjnej) w połączeniu z elektroporacją zarejestrowanego neuronu za pomocą biocytyny. Główną zaletą tego podejścia jest to, że nieinwazyjny charakter zapewnia, że impuls potencjału czynnościowego poszczególnych neuronów jest rejestrowany bez zmiany (np. dializy) wewnątrzkomórkowej zawartości komórki. Po elektroporacji, podejście juktasomalne zapewnia możliwość identyfikacji i rekonstrukcji komórek post hoc w celu powiązania funkcji (fizjologii) ze strukturą (morfologia). Zazwyczaj rekonstrukcja morfologiczna obejmuje rekonstrukcję morfologii dendrytycznej i aksonalnej, która może być rozszerzona o ilościowe określenie gęstości kręgosłupa i/lub boutonu, a nawet rekonstrukcję morfologii neuronów w rozdzielczości nanometrowej przy użyciu mikroskopii elektronowej. Technika zapisu juxtasomal może być stosowana do zapisów in vivo różnych typów komórek w warstwach korowych lub w obszarach podkorowych u wielu gatunków, chociaż większość badań stosowała tę technikę u małych gryzoni, takich jak myszy lub szczury. Nasze badania koncentrują się na rejestrowaniu i znakowaniu neuronów z pierwotnej kory somatosensorycznej szczura (S1) i obejmują wizualną identyfikację zarejestrowanych neuronów18, rekonstrukcje dendrytyczne w połączeniu z precyzyjną rejestracją w ustandaryzowanym układzie odniesienia w celu inżynierii wstecznej sieci korowych4,19 oraz szczegółową rekonstrukcję architektury aksonalnej w celu scharakteryzowania specyficznych dla typu komórki lokalnych i dalekosiężnych celów projekcyjnych20.
W porównaniu do alternatywnych technik zapisu in vivo (wewnątrzkomórkowych lub całokomórkowych), zapisy juxtasomalne są względnie stabilne i dlatego mogą być stosowane w różnych stanach behawioralnych, w tym znieczulonych21,22, uspokojonych14, obudzonych23, a nawet swobodnie poruszających się zwierząt9. Tutaj pokazujemy znakowanie przyklustomalne w S1 szczura znieczulonego uretanem, chociaż podkreślamy ogólne zastosowanie tej techniki do wielu preparatów z wyboru.

<table><tbody><tr><td>System sterowania SM-6</td><td>Luigs Neumann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LN- Mini 23 XYZ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LN- Mini 55 Manipulatorblock X2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz Lynx-8</td><td>Neuralynx</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz Axoclamp-2B</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Osada model EXL-M40</td><td>Osada, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie piezoelektryczne</td><td>Physik Instrumente</td><td>PL140.10</td><td></td></tr><tr><td>LabView</td><td>National Instruments, Austin, TX, USA</td><td></td><td>Oprogramowanie do akwizycji LabView</td></tr><tr><td>Ntrode Virtual Instrument&nbsp;</td><td>R. Bruno, Columbia Univ., NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waciki chłonne Sugi</td><td>Kettenbach</td><td>30601</td><td></td></tr><tr><td>Cytochrom C z serca konia</td><td>Sigma</td><td>C2506</td><td></td></tr><tr><td>Katalaza z wątroby bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>DAB</td><td>Sigma</td><td>D5637</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Boom</td><td>7047</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain standard ABC-kit</td><td>Vector</td><td>PK6100</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Uretan</td><td>Sigma</td><td>U2500</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Pharmachemie</td><td>45.112.110</td><td></td></tr><tr><td>Lidokaina</td><td>Sigma</td><td>L5647</td><td></td></tr><tr><td>Simplex szybki cement dentystyczny</td><td>Kemdent</td><td>ACR308/ACR924</td><td></td></tr><tr><td>Biocytyna</td><td>Molekula</td><td>36219518</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Merck Millipore</td><td>8187151000</td><td></td></tr><tr><td>Baza Trizma</td><td>Sigma</td><td>T4661</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol klasy analitycznej</td><td>Fluka</td><td>49767</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60130</td><td></td></tr><tr><td>CaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22,350-6</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fluka</td><td>63072</td><td></td></tr></tbody></table>

znakowanie biocytyny juxtasomal w celu zbadania zależności struktura-funkcja poszczególnych neuronów korowych

Juxtasomal Biocytin Labeling to Study the Structure-function Relationship of Individual Cortical Neurons

Kora mózgowa charakteryzuje się wieloma warstwami i wieloma różnymi typami komórek, które razem jako sieć są odpowiedzialne za wiele wyższych funkcji poznawczych, w tym podejmowanie decyzji, zachowania sterowane sensorycznie lub pamięć. Aby zrozumieć, w jaki sposób tak skomplikowane sieci neuronowe wykonują takie zadania, kluczowym krokiem jest określenie funkcji (lub aktywności elektrycznej) poszczególnych typów komórek w sieci, preferencyjnie, gdy zwierzę wykonuje odpowiednie zadanie poznawcze. Dodatkowo równie ważne jest określenie budowy anatomicznej sieci i architektury morfologicznej poszczególnych neuronów, aby umożliwić inżynierię wsteczną sieci korowej. Dostępne obecnie przełomowe rozwiązania techniczne pozwalają na rejestrowanie aktywności komórkowej u obudzonych, zachowujących się zwierząt z cenną opcją identyfikacji post hoc zarejestrowanych neuronów. Tutaj demonstrujemy technikę znakowania biocytyny przez juktasomalną, która polega na rejestrowaniu skoków potencjału czynnościowego w konfiguracji zewnątrzkomórkowej (lub luźnej) za pomocą konwencjonalnych pipet z plastrami. Konfiguracja zapisu przybuksomalnego jest stosunkowo stabilna i ma zastosowanie w różnych warunkach behawioralnych, w tym w znieczuleniu, sedacji, obudzonej z głową, a nawet u swobodnie poruszającego się zwierzęcia. W ten sposób metoda ta pozwala na powiązanie specyficznego dla typu komórki potencjału czynnościowego wzrastającego podczas zachowania zwierząt z rekonstrukcją pojedynczych neuronów, a ostatecznie całego mikroobwodu korowego. W tym manuskrypcie wideo pokazujemy, w jaki sposób poszczególne neurony w konfiguracji juktasomalnej mogą być znakowane biocytyną u szczura znieczulonego uretanem w celu identyfikacji post hoc i rekonstrukcji morfologicznej.

Szczegółowa wiedza na temat struktury 3D poszczególnych neuronów jest kluczowa dla wyjaśnienia zasad organizacji sieci neuronalnych. Nasza metoda obejmuje procedurę pozwalającą na uzyskanie wysokiej jakości znakowania biocytyną w preparacie in vivo, co umożliwia późniejszą (post hoc) klasyfikację neuronalną oraz szczegółową rekonstrukcję architektury dendrytycznej i aksonalnej pojedynczych neuronów w wysokiej rozdzielczości. W zależności od jakości znakowania juxtasomalnego, neurony są odzyskiwane z róż...

Aby zrozumieć strukturę sieci neuronowych, konieczna jest funkcjonalna i morfologiczna charakterystyka poszczególnych neuronów. Tutaj demonstrujemy znakowanie biocytyny przykłasomalnej, które umożliwia zapisy elektrofizjologiczne w konfiguracji zewnątrzkomórkowej, zachowując jednocześnie zdolność do wewnątrzkomórkowego znakowania neuronu w celu rekonstrukcji post hoc architektury dendrytycznej i aksonalnej.

Znakowanie biocytyny Juxtasomal w celu zbadania zależności struktura-funkcja poszczególnych neuronów korowych

The cerebral cortex is characterized by multiple layers and many distinct cell-types that together as a network are responsible for many higher cognitive ...

Ogólnym celem tej procedury jest powiązanie specyficznych dla typu komórek potencjałów czynnościowych w korze sensorycznej podczas przetwarzania informacji z tożsamością morfologiczną rejestrowanych neuronów. Osiąga się to poprzez wstępne chirurgiczne przygotowanie szczura do rejestracji juksosomatycznej. Po przygotowaniu elektroda rejestruje spontaniczną i wywołaną bodźcami sensorycznymi aktywność impulsową, a następnie zarejestrowany neuron zostaje wypełniony biocydyną za pomocą prądu i iniekcji.Następnie mózg jest poddawany obróbce w celu barwienia biotyną. Na koniec neuron wypełniony biotyną jest rekonstruowany cyfrowo z kolejnych sekcji w celu klasyfikacji typu komórki. Ostatecznie rejestracje jukstasomalne poszczególnych neuronów pozwalają na badanie przetwarzania sensorycznego i informacji strukturalnych w obrębie sieci korowej.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neuronauki, takie jak: jaka jest rola poszczególnych typów komórek i warstw podczas przetwarzania sensorycznego? Zazwyczaj osoby potrzebujące tej metody napotykają trudności, ponieważ podczas procedury wypełniania bardzo łatwo jest doprowadzić do śmierci neuronów. Szanse na pomyślne wypełnienie biocydyną zwiększa przygotowanie pipet o optymalnej jakości, a dodatkowo niezbędne jest doświadczenie w kontrolowaniu wstrzykiwań prądu w wąskim pasmie.Z tego powodu zwiększenie skuteczności odzyskiwania prawidłowo wypełnionych neuronów wymaga doświadczenia. Aby rozpocząć, umieść znieczulonego szczura szczepu Wistar w aparacie stereotaktycznym wyposażonym w matę grzewczą. Potwierdź głębokość sedacji, sprawdzając odruch cofania łapy po uciśnięciu palca.Następnie wprowadź sondę odbytniczą, aby utrzymać prawidłową temperaturę ciała. Unieruchom głowę zwierzęcia i usuń sierść z pola operacyjnego. Nałóż maść do oczu, aby zapobiec ich wysychaniu.Odczekaj od trzech do pięciu minut po wstrzyknięciu lidokainy w miejscu operacji, a następnie usuń skórę pokrywającą powierzchnię czaszki. Następnie usuń wszelkie pozostałe tkanki i dokładnie oczyść czaszkę 0,9% roztworem chlorku sodu. Wyznacz współrzędne pierwotnej kory somatosensorycznej w lewej półkuli i zaznacz to miejsce na czaszce za pomocą chirurgicznego markera do skóry.Używając wiertła stomatologicznego, zeskrob kość z obszaru zainteresowania. Kontynuuj skrobanie kości, aż stanie się ona przezroczysta, a naczynia krwionośne będą wyraźnie widoczne. Następnie skalpelem wytnij małe okno w cienkiej czaszce.Należy uważać, aby nie uszkodzić opony twardej oraz naczyń krwionośnych. Krawędzie kraniotomii należy zaznaczyć za pomocą chirurgicznego pisaka do skóry. Aby poprawić widoczność, na suchą czaszkę należy nanieść cienką warstwę superglue, a następnie zastosować cement dentystyczny w celu wykonania kąpieli.Podczas zamykania kraniotomii przytnąć wibrysy po przeciwnej stronie do dokładnie pięciu milimetrów, aby zwiększyć ich widoczność. Przed rozpoczęciem rejestracji zaznaczyć przycięte wibrysy czarnym tuszem do rzęs; wykonać pipety do patch-clampu ze szkła borokrzemianowego. Idealna morfologia pipety to stopniowe, smukłe zwężenie, mały kąt stożka oraz wewnętrzna średnica końcówki wynosząca około jednego mikrona.Napełnij pipetę patch normalnym roztworem Ringera dla gryzoni, uzupełnionym o 2% biotyny, a następnie zamocuj pipetę w uchwycie do pipet przymocowanym do głowicy i połączonym z mikromanipulatorem. Aby precyzyjnie skierować się na kolumnę D2 w obszarze S1 szczura, ustaw kąt uchwytu elektrody na 34 stopnie względem płaszczyzny strzałkowej. Następnie umieść pipetę patch w bezpośrednim sąsiedztwie otworu trepanacyjnego.Napełnij kąpiel 0,9% roztworem chlorku sodu. Przy ustawionym wzmacniaczu w trybie mostkowym przyłóż impulsy prostokątne z dodatnim wstrzykiwaniem prądu, aby wyznaczyć rezystancję elektrody. Optymalna rezystancja elektrody mieści się w przedziale od trzech do pięciu megaohmów.Ustanowić nadciśnienie od 100 do 150 millibar i przesuwać pipetę patch w krokach o wielkości jednej mikrona, przykładając dodatni prąd w postaci impulsów prostokątnych. Monitorować wyraźną zmianę rezystancji po nawiązaniu kontaktu z oponą twardą. W tym momencie ustawić współrzędne mikromanipulatora na zero, aby umożliwić dokładne pomiary głębokości.Przesuwaj w trybie kroków jedno-mikronowych, aż pipeta do patch-clampu przebije oponę twardą, co zostanie zasygnalizowane nagłym spadkiem oporności elektrody. Usuń ciśnienie podtrzymujące w pipecie. Następnie wyszukuj pojedynczych jednostek, przesuwając się w krokach jedno-mikronowych.Stale monitoruj rezystancję elektrody, aplikując impulsy włącz/wyłącz o czasie trwania 200 milisekund; wzrost rezystancji elektrody zazwyczaj wskazuje na bliskość pojedynczego neuronu. Przesuwaj elektrodę do momentu zarejestrowania dodatnich potencjałów czynnościowych o amplitudzie około dwóch milivoltów. Opcjonalnie zarejestruj spontaniczną aktywność impulsową i określ aktywność impulsową wywołaną ruchem wibrysów, odchylając poszczególne wibrysy za pomocą urządzenia piezoelektrycznego, aby uzyskać optymalne warunki do wypełniania jukstasomatycznego.Przesuwaj elektrodę, aż rezystancja wyniesie od 25 do 35 MΩ, a amplitudy impulsów (spikes) będą wynosić od 3 do 8 mV, aby rozpocząć wypełnianie juxtasomalne. Przykładaj dodatnie prostokątne impulsy prądu, zaczynając od 1 nA.Powoli i stopniowo zwiększaj natężenie prądu w krokach o 0.1 nA, monitorując kształt i częstotliwość potencjałów czynnościowych (AP). Monitoruj otwieranie błony jako wyraźny wzrost częstotliwości AP podczas fazy włączonej impulsu blokującego; podczas napełniania kształt fali kolca wykazuje zwiększoną szerokość i zredukowaną hiperpolaryzację następczą. Zwiększaj lub zmniejszaj natężenie prądu podczas napełniania, aby utrzymać stabilną infuzję biotyny; zmniejsz lub przerwij impulsy prądowe w przypadku nagłego wzrostu częstotliwości AP. Należy to robić, aby uniknąć toksyczności spowodowanej nadmiernym napływem jonów zewnątrzkomórkowych, takich jak jony sodu.Należy zauważyć, że każdy neuron będzie reagował inaczej na procedurę wypełniania. W związku z tym parametry znakowania przysomaatycznego muszą być dostosowane do warunków rejestracji. Należy uważnie monitorować sygnał po zaprzestaniu wstrzykiwania prądu.Kształt impulsu po sesji wypełniania jest zazwyczaj poszerzony i wykazuje silnie zredukowaną hiperpolaryzację następczą; należy odczekać do regeneracji neuronu, co jest widoczne, gdy kształt impulsu powróci do swoich pierwotnych właściwości, aby zminimalizować naprężenia mechaniczne komórki. Wycofać pipetę patch w krokach o wielkości jednego mikrona, aż amplituda impulsu ulegnie zmniejszeniu; odczekać co najmniej jedną godzinę, aby biotyna mogła rozprzestrzenić się wewnątrzkomórkowo, uważnie monitorując temperaturę ciała i oddychanie zwierzęcia. Na koniec pobiera się próbki mózgu i poddaje je obróbce, aby ocenić jakość znakowania jujtasomatycznego.Zdjęcia te przedstawiają neurony w korze somatosensorycznej pierwotnej, wypełnione metodą juxtasomalną. Ten widok styczny neuronu parametralnego obrazuje różnicę w rozmiarze między dendrytami a aksonami. Na tej cyfrowej rekonstrukcji neuronu znakowanego metodą juxtasomalną, obraz projekcji neuronu przedstawiono w wysokiej rozdzielczości, ale przy małym powiększeniu, z nałożoną automatyczną rekonstrukcją cyfrową, gdzie akson zaznaczono kolorem niebieskim, a dendryt kolorem czerwonym.Tutaj obszar zaznaczony ramką został powiększony, aby ukazać kolbiki aksonalne na całej długości aksonu. W tej końcowej animacji prezentujemy proces rekonstrukcji dla jednego grubego neuronu parametalicznego z warstwy V pierwotnej kory somatosensorycznej szczura. Proces ten obejmuje rekonstrukcję morfologii dendrytów i aksonów przy powiększeniu 100x oraz konturów beczułek przy powiększeniu 4x.Wynikiem jest pełna rekonstrukcja 3D, która jest następnie dopasowywana do zestandaryzowanej ramy odniesienia w celu przeprowadzenia ilościowej analizy cech morfologicznych. Zatem znakowanie przysomatyczne in vivo zapewnia wyjątkową jakość znakowania, umożliwiającą wiarygodną rekonstrukcję pełnej morfologii 3D. W niniejszej pracy zaprezentowano tę metodę na zwierzętach znieczulonych uretanem.Niemniej jednak rejestracje typu Jux Somal mogą być również stosowane u czuwających zwierząt z unieruchomioną głową, aby badać rolę poszczególnych typów komórek i warstw podczas aktywnej eksploracji środowiska. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć lepsze zrozumienie tego, jak przeprowadzić znakowanie Biocydyną pojedynczych neuronów w celu ich późniejszej identyfikacji i rekonstrukcji morfologicznej.

juxtasomal-biocytin-labeling-to-study-structure-function-relationship

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Oznaczanie biocytyną w pobliżu ciał komórkowych w celu zbadania relacji struktura-funkcja pojedynczych korowych neuronów

Prezentujemy zastosowanie pistoletu genowego do wprowadzania barwników fluorescencyjnych, takich jak DiI, do neuronów wyrytych z plastrów mózgu gryzoni oraz naczelnych innych niż człowiek w różnym wieku. W tym konkretnym przypadku wykorzystujemy dorosłe myszy (w wieku 3–6 miesięcy) oraz dorosłe makaki krabikowate (w wieku 9–15 lat). Technika ta, pierwotnie opisana przez laboratorium dr. Lichtmana (Gan et al., 2000), jest odpowiednia do badania rozgałęzień dendrytycznych oraz morfologii kolców...

DIOLISTYCzne znakowanie neuronów w skrawkach mózgu gryzoni i naczelnych niebędących ludźmi

Niniejszy raport demonstruje technikę mechanicznej izolacji pojedynczych żywych neuronów z zachowaniem przytwierdzonych boutonów presynaptycznych. Neurony poddane wibrodysocjacji charakteryzują się zaletami takimi jak szybki czas przygotowania, doskonała kontrola farmakologiczna oraz usprawniona stabilizacja potencjału błonowego (space-clamp) bez wpływu komórek sąsiednich. Metoda ta może być wykorzystywana do obrazowania elementów synaptycznych oraz rejestracji metodą patch-clamp.

Wibrodysocjacja neuronów z plastrów mózgu gryzoni w celu badania transmisji synaptycznej i obrazowania terminali presynaptycznych

Ten film pokazuje procedurę barwienia utrwalonych wycinków mózgu szczura zawierających interneurony wypełnione biocytyną. Protokół obejmuje inkubację z kompleksem awidyny-biotyny (ABC), barwienie za pomocą HRP i substratu chromogennego, konserwację struktur tetratlenkiem osmu i zatopienie tkanki w żywicy w celu obrazowania.

Znakowanie interneuronów wypełnionych biocytyną w wycinkach hipokampa szczurów w celu wizualizacji

Opisano metodę znakowania neuronów barwnikami fluorescencyjnymi w określonych funkcjonalnych mikrodomenach kory nowej. Po pierwsze, obrazowanie optyczne sygnału wewnętrznego służy do uzyskania mapy funkcjonalnej. Następnie mikroskopia dwufotonowa jest używana do oznaczania i obrazowania neuronów w mikrodomenie mapy.

Celowane znakowanie neuronów w specyficznej funkcjonalnej mikrodomenie kory nowej poprzez połączenie sygnału wewnętrznego i obrazowania dwufotonowego

Ruch błony neuronalnej dynamicznie kontroluje dostępność białek błony plazmatycznej i znacząco wpływa na neuroprzekaźnictwo. Do tej pory trudno było zmierzyć neuronalny transport endocytarny w dorosłych neuronach. W tym miejscu opisujemy wysoce skuteczną, ilościową metodę pomiaru szybkich zmian ekspresji białek powierzchniowych ex vivo w ostrych wycinkach mózgu.

Biotynylacja wycinków mózgu: podejście ex vivo do pomiaru specyficznego dla regionu transportu białek błony plazmatycznej w dorosłych neuronach

Ten protokół opisuje projektowanie i chirurgiczne wszczepienie mechanizmu krępującego głowę do monitorowania aktywności neuronalnej w podkorowych strukturach mózgu u szczurów czujnych.  Wyznacza procedury izolowania pojedynczych neuronów w konfiguracji przyściennej i skutecznego identyfikowania ich lokalizacji anatomicznych.

Monitorowanie i lokalizacja pojedynczych neuronów w podkorowych strukturach mózgu czujnych, skrępowanych głową szczurów

Ten protokół przedstawia metodę morfologicznego odzyskiwania neuronów załatanych podczas zapisów elektrofizjologicznych za pomocą wypełnienia biocytyną i późniejszego immunohistochemicznego przetwarzania końcowego. Pokazujemy, że grube skrawki wypełnione biocytyną, które zostały wybarwione i przykryte, mogą być ponownie wybarwione drugim pierwotnym przeciwciałem kilka dni lub miesięcy później.

Barwienie immunologiczne skrawków wypełnionych i przetworzonych biocytyną pod kątem markerów neurochemicznych

Ten protokół opisuje metodę jednoczesnego obrazowania rozgałęzień aksonów wzgórza i tworzenia synaps w organotypowych kokulturach wzgórza i kory mózgowej. Poszczególne aksony wzgórzowo-korowe i ich zakończenia presynaptyczne są wizualizowane za pomocą techniki elektroporacji pojedynczej komórki z synaptofizyną znakowaną DsRed i GFP.

Wizualizacja rozgałęzień aksonów wzgórzowo-korowych i tworzenia synaps w kokulturach organotypowych

Tutaj opisujemy procedurę oczyszczania tkanek, znakowania fluorescencyjnego i wielkoskalowego obrazowania tkanki mózgowej myszy, która umożliwia wizualizację trójwymiarowej organizacji typów komórek w korze nowej.

Wielkoskalowe trójwymiarowe obrazowanie organizacji komórkowej w korze nowej myszy

Tutaj prezentujemy protokół do oceny organizacji sieci astrocytowych. Opisana metoda minimalizuje odchylenie, aby zapewnić opisowe pomiary tych sieci, takie jak liczba komórek, rozmiar, obszar i położenie w jądrze. Anizotropię ocenia się za pomocą analizy wektorowej.

Analiza rozmiaru, kształtu i kierunkowości sieci sprzężonych astrocytów

Opisany tutaj protokół opisuje analizę immunofluorescencyjną, odzyskiwanie biocytyny i wysokiej jakości rekonstrukcje interneuronów CA2 w hipokampie po wewnątrzkomórkowych zapisach elektrofizjologicznych in vitro, co pozwala na badanie charakterystyki neuronów i ostatecznie anatomii neuronalnej.

Odzyskiwanie biocytyny i rekonstrukcje 3D wypełnionych interneuronów CA2 w hipokampie

Poznaj technikę znakowania biocytyną juxtasomalną do badania aktywności neuronów kory sensorycznej u szczurów. Ta metoda łączy rejestrację potencjałów czynnościowych z rekonstrukcją morfologiczną pojedynczych komórek.

Znakowanie biocytyny Juxtasomal w celu zbadania zależności struktura-funkcja poszczególnych neuronów korowych

Przeglądaj więcej filmów