Znakowanie biocytyny Juxtasomal w celu zbadania zależności struktura-funkcja poszczególnych neuronów korowych
25 lutego 2014
Aby zrozumieć strukturę sieci neuronowych, konieczna jest funkcjonalna i morfologiczna charakterystyka poszczególnych neuronów. Tutaj demonstrujemy znakowanie biocytyny przykłasomalnej, które umożliwia zapisy elektrofizjologiczne w konfiguracji zewnątrzkomórkowej, zachowując jednocześnie zdolność do wewnątrzkomórkowego znakowania neuronu w celu rekonstrukcji post hoc architektury dendrytycznej i aksonalnej.
Ogólnym celem tej procedury jest powiązanie specyficznego dla typu komórki potencjału czynnościowego wzrastającego w korze czuciowej podczas przetwarzania informacji z morfologiczną tożsamością zarejestrowanych neuronów. Osiąga się to poprzez uprzednie chirurgiczne przygotowanie szczura do nagrań somalnych. Po przygotowaniu elektroda rejestruje spontaniczną i czuciową aktywność impulsową, a zarejestrowany neuron jest ładowany biocydyną za pomocą prądu i zastrzyków.
Następnie mózg jest przetwarzany pod kątem barwienia biotyną. Na koniec neuron wypełniony biotyną jest cyfrowo rekonstruowany z kolejnych odcinków w celu klasyfikacji typów komórek. Ostatecznie, zestawienia somalne pojedynczych neuronów pozwalają na badanie przetwarzania sensorycznego i informacji strukturalnych w sieci korowej.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w neurobiologii, takie jak: jaka jest rola poszczególnych typów i warstw komórek podczas przetwarzania sensorycznego? Ogólnie rzecz biorąc, osoby potrzebujące tej metody będą miały trudności, ponieważ bardzo łatwo jest zabić neurony podczas procedury napełniania. Szanse na skuteczne napełnienie biocydyną zwiększa przygotowanie pipet optymalnej jakości, a dodatkowo niezbędne jest wprawne oko do kontrolowania wstrzyknięć prądu wąskopasmowego.
Dlatego potrzeba doświadczenia, aby zwiększyć wskaźnik sukcesu w odzyskiwaniu dobrze wypełnionych neuronów. Na początek umieść znieczulonego szczura wistar na stereotaktycznej ramie wyposażonej w poduszkę grzewczą. Potwierdź głębokość sedacji, testując odruch szczypania palca u nogi.
Następnie włóż sondę doodbytniczą, aby utrzymać prawidłową temperaturę ciała. Zabezpiecz głowę zwierzęcia i usuń włosy z miejsca operacji. Nałóż maść na oczy, aby zapobiec wysuszeniu.
Odczekaj trzy do pięciu minut po wstrzyknięciu lidokainy w miejscu operacji i usuń skórę pokrywającą powierzchnię czaszki. Następnie usuń pozostałą tkankę i dokładnie oczyść czaszkę 0,9% olejkiem sodu. Określ współrzędne pierwszorzędowej kory somatosensorycznej w lewej półkuli i zaznacz miejsce na czaszce za pomocą markera chirurgicznego do skóry.
Użyj wiertła dentystycznego, aby zeskrobać kość z obszaru zainteresowania. Kontynuuj skrobanie kości, aż stanie się przezroczysta, a naczynia krwionośne będą wyraźnie widoczne. Następnie wytnij skalpelem małe okienko w cienkiej czaszce.
Uważając, aby nie uszkodzić opony twardej i naczyń krwionośnych. Zaznacz krawędzie kraniotomii za pomocą markera chirurgicznego do skóry. Aby poprawić widoczność, nałóż cienką warstwę super kleju na suchą czaszkę, a następnie cement dentystyczny, aby zbudować wannę.
Zamykając kraniotomię, przytnij wąsy po stronie przeciwnej dokładnie do pięciu milimetrów, aby poprawić ich widoczność. Przed rozpoczęciem nagrań podkreśl przycięte wąsy czarnym tuszem do rzęs, wykonaj pipety z plastrów ze szkła Boro Silicic. Idealna morfologia pipety to stopniowe, smukłe stożki, niski kąt stożka i wewnętrzna średnica końcówki wynosząca około jednego mikrona.
Załaduj pipetę z plastrem zwykłym dzwonkiem radiowym, uzupełnionym 2% biotyną i zamontuj pipetę z plastrem na uchwycie na pipetę, przymocowanym do stopnia głowicy i podłączonym do manipulatora mikrom. Aby konkretnie celować w kolumnę D dwie szczura S jeden, ustaw kąt uchwytu elektrody na 34 stopnie w stosunku do płaszczyzny strzałkowej. Następnie umieść pipetę z plastrem w bliskiej odległości od kraniotomii.
Napełnij kąpiel 0,9% chlorkiem sodu. Gdy wzmacniacz jest w trybie mostka, zastosuj impulsy kwadratowe z dodatnim wtryskiem prądu, aby określić rezystancję elektrody. Optymalna rezystancja elektrody wynosi od trzech do pięciu megametrów.
Ustalić nadciśnienie na poziomie od 100 do 150 milibarów i przesuwać pipetę łatkową w krokach co jeden mikron, stosując prąd dodatni w postaci impulsów prostokątnych. Monitoruj solidną zmianę oporu po nawiązaniu kontaktu z oponą twardą. W tym momencie ustaw współrzędne mikromanipulatora na zero, aby umożliwić dokładne pomiary głębokości.
Przesuwaj się w trybie kroku jednomikronowego, aż pipeta z plastrem przeniknie do opony twardej, co wskazuje na nagły spadek rezystancji elektrody. Zdjąć ciśnienie docisku pipety. Następnie szukaj pojedynczych jednostek, posuwając się naprzód w krokach co jeden mikron.
Monitoruj rezystancję elektrody w sposób ciągły, stosując 200-milisekundowe impulsy wyłączania, a wzrost rezystancji elektrody zazwyczaj wskazuje na bliskość pojedynczego neuronu, przesuwaj elektrodę, aż do pozytywnego działania. Rejestrowane są przebiegi potencjału wynoszące około dwóch miliwoltów. Opcjonalnie rejestruj spontaniczną aktywność wyciskania i określ cofniętą aktywność wybijania wąsów poprzez dziwne odchylanie poszczególnych wąsów za pomocą urządzenia elektrycznego pizo, aby uzyskać optymalne warunki do wypełnienia juxta somal.
Przesuwaj elektrodę, aż rezystancja wyniesie od 25 do 35. Mega omy i skoki mają amplitudy od trzech do ośmiu miliwoltów, aby rozpocząć wypełnienie juxta somal. Zastosuj dodatnie impulsy prądu kwadratowego, zaczynając od jednego nanoampera.
Powoli i stopniowo zwiększaj prąd krokowo o 0,1 nanoampera, monitorując kształt fali i częstotliwość AP. Monitoruj otwarcie membrany jako wyraźny wzrost częstotliwości AP podczas fazy włączenia impulsu blokowego, fala kolca podczas napełniania wykazuje zwiększoną szerokość i zmniejsza się po hiperpolaryzacji, zwiększa lub zmniejsza prąd podczas napełniania, aby utrzymać stabilny wlew biotyny, zmniejsz lub zatrzymaj impulsy prądu po nagłym wzroście częstotliwości AP. Aby uniknąć toksyczności spowodowanej nadmiernym napływem jonów zewnątrzkomórkowych, takich jak jony sodu.
Ważne jest, aby pamiętać, że każdy neuron będzie inaczej reagował na procedurę napełniania. W związku z tym parametry etykietowania juxta somal muszą być dostosowywane w zależności od warunków nagrywania. Uważnie monitoruj sygnał po zatrzymaniu wtrysku prądu.
Forma fali kolca po sesji napełniania jest zwykle poszerzona i wykazuje silnie zmniejszoną po hiperpolaryzacji oczekiwanie na regenerację neuronu, co jest widoczne, gdy kształt fali skokowej powraca do swoich pierwotnych właściwości, aby zmniejszyć wszelkie naprężenia mechaniczne komórki. Cofaj pipetę z plastrem w krokach co jeden mikron, aż amplituda skoku zmniejszy się, odczekaj co najmniej godzinę, aż biotyna rozdyfunduje się wewnątrzkomórkowo, ściśle monitorując temperaturę ciała i oddech zwierzęcia. Na koniec pobiera się i przetwarza próbki mózgu, aby ujawnić jakość znakowania somów juxta.
Obrazy te pokazują obrazy neuronów wypełnionych juxta mally w pierwotnej korze somatosensorycznej. Ten styczny widok neuronu parametalicznego pokazuje różnicę w wielkości między dendrytami a aksonami. W tej cyfrowej rekonstrukcji neuronu oznaczonego jako juxta, obraz projekcji neuronu jest pokazany w wysokiej rozdzielczości, ale w małym powiększeniu, a na automatyczną rekonstrukcję cyfrową nałożono akson odpowiednio na niebiesko, a dendryt na czerwono.
Tutaj obszar pudełka jest rozszerzony, aby pokazać bhuton aksonu na całej długości aksonu. W tej ostatniej animacji pokazujemy przykład procesu rekonstrukcji jednego warstwy pięciowarstwowego grubego tuftowanego neuronu parametalicznego z pierwszorzędowej kory somatosensorycznej szczura. Rurociąg obejmuje rekonstrukcję morfologii dendrytycznej i aksonalnej przy 100-krotnym powiększeniu oraz konturów lufy przy czterokrotnym powiększeniu.
Rezultatem jest pełna rekonstrukcja 3D, która jest następnie rejestrowana w znormalizowanym układzie odniesienia w celu przeprowadzenia ilościowej analizy cech morfologicznych. W ten sposób etykietowanie somalne in vivo pozwala na wyjątkową jakość etykietowania w celu niezawodnej rekonstrukcji pełnej morfologii 3D. Tutaj pokazaliśmy metodę u zwierząt znieczulonych uretanem.
Jednak nagrania Jux Somal mogą być również wykorzystywane u zwierząt ze skrępowaną głową w stanie czuwania do badania roli poszczególnych typów i warstw komórek podczas aktywnej eksploracji środowiska. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś lepiej zrozumieć, jak przeprowadzić znakowanie biocydyny na poszczególnych neuronach w celu powojennej identyfikacji i rekonstrukcji morfologicznej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie koncentruje się na łączeniu wyboistości potencjału czynnościowego w korze sensorycznej z tożsamością morfologiczną neuronów. Wykorzystując etykietowanie biocytynowe sąsiadujące z komórką, naukowcy mogą rejestrować aktywność neuronów jednocześnie etykietując neurony w celu szczegółowej analizy strukturalnej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Elektrofizjologia
- Morfologia neuronów
Tło
- Rozumienie sieci neuronowych wymaga zarówno charakteryzacji funkcjonalnej, jak i morfologicznej.
- Rejestracji sąsiadujących z komórką umożliwiają badanie aktywności pojedynczych neuronów.
- Etykietowanie biocytyną pozwala na późniejszą rekonstrukcję struktur neuronów.
- To podejście pomaga w klasyfikacji typów komórek na podstawie ich morfologii i aktywności.
Cel badania
- Połączyć przetwarzanie sensoryczne z tożsamością strukturalną neuronów.
- Zwiększyć zrozumienie sieci korowych poprzez analizę pojedynczych neuronów.
- Wykorzystać etykietowanie biocytynowe do szczegółowych badań morfologicznych.
Zastosowanie metod
- Przygotowanie chirurgiczne szczurów do rejestracji sąsiadujących z komórką.
- Rejestrowanie elektrofizjologiczne spontanicznej i wywołanej sensorycznie aktywności wyboistościowej.
- Wprowadzanie biocytyny do rejestrowanych neuronów poprzez wstrzyknięcia prądu.
- Przetwarzanie tkanki mózgowej w celu barwienia biotyną i rekonstrukcji cyfrowej.
Główne wyniki
- Udane rejestrowanie potencjałów czynnościowych powiązanych z danymi morfologicznymi.
- Szczegółowa rekonstrukcja architektury neuronów na podstawie etykietowania biocytynowym.
- Wgląd w mechanizmy przetwarzania sensorycznego w sieciach korowych.
- Klasyfikacja neuronów na podstawie ich właściwości strukturalnych i funkcjonalnych.
Wnioski
- Rejestrowanie sąsiadujące z komórką stanowi potężną metodę badania pojedynczych neuronów.
- Łączenie morfologii i funkcji zwiększa zrozumienie ról neuronów w przetwarzaniu sensorycznym.
- To podejście może być zastosowane do dalszego badania sieci neuronowych w różnych kontekstach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Linking neuronal activity to structural identity enables mechanistic de-risking in target validation by clarifying cell-type-specific roles in sensory processing circuits. This approach supports predictive confidence in preclinical models by providing quantitative morphological and functional data for hypothesis testing. It addresses a key discovery-stage challenge: resolving how individual neuronal subtypes contribute to network-level information processing in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking action potential spiking patterns to neuronal morphology during sensory processing.
- Operational Value: Enables biological de-risking through post hoc identification of recorded neurons for cell-type classification.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by clarifying structure-function relationships in cortical microcircuits relevant to neuropsychiatric targets.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream assay standardization by establishing baseline morphological and electrophysiological profiles.
- Operational Value: Enhances screening readiness through reproducible juxtasomal recording conditions across behavioral states.
- Platform Reuse: Facilitates scalable application in awake, head-restrained, and freely moving models for longitudinal target engagement studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system continuity by enabling reverse engineering of cortical networks from functional to structural data.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions through quantitative 3D morphological reconstruction and standardized reference frame registration.
- Predictive Confidence: Strengthens translational biomarker alignment by correlating electrophysiological outputs with anatomical architecture in sensory cortex.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification by enabling mechanistic de-risking of neuronal targets in sensory processing pathways.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by correlating sensory-evoked spiking with dendritic and axonal morphology.
- Screening: Delivers assay readiness via stable juxtasomal configurations and quantitative spike waveform analysis during filling procedures.
- Analytics: Generates measurable outputs including action potential amplitude, frequency, and width for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through post hoc reconstruction enabling quantitative analysis of neuronal architecture in standardized reference frames.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for iterative target validation across anesthetic, sedated, awake, and freely moving conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through mechanistic de-risking of structure-function relationships in cortical neurons.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via controlled current injection parameters and pipette preparation protocols.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing late-stage biological risk in neuropsychiatric target advancement.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through integrated functional and morphological datasets for target validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, microsurgery, and morphological reconstruction to manage narrow-band current injections and avoid neuronal toxicity.
- Dependent on high-quality patch pipettes with sub-micron tip diameters and stable bath conditions for juxtasomal sealing.
- Necessitates cross-team standardization between electrophysiology and histology teams for consistent biocytin diffusion and staining protocols.
- Adaptation considerations include adjusting filling parameters based on neuronal response variability across recording conditions and behavioral states.
- Practical limitations include mechanical stress risks during pipette retraction and the need for post-filling recovery periods to ensure labeling quality.
