Name: Trójwymiarowa ilościowa identyfikacja śluzu jelitowego za pomocą obrazowania tkanek w całości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-12T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 10 s
Description: Poznaj metodę trójwymiarowej ilościowej analizy śluzu jelitowego z wykorzystaniem preparatów całotkankowych i mikroskopii wielofotonowej u myszy. Protokół umożliwia precyzyjną wizualizację dynamiki śluzu w odpowiedzi na różne bodźce.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Laboratorium Rdzenia Mikroskopii w Szpitalu Pamięci Chang Gung w Linkou za pomoc techniczną. Chcielibyśmy również podziękować Imaging Core Facility Narodowego Uniwersytetu Yang Ming Chiao Tung za usługę Zeiss LSM 7 MP Multi-Photon Microscope, a szczególnie panią Pei-jun Chen i Yung-yu Lu za wsparcie techniczne. Autorzy pragną podziękować za wsparcie NSTC 110-2320-B-A49A-544-MY3 oraz 113-2628-B-182-002-MY3 (dla YHT).

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach są zatwierdzane przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Chang Gung. Placówka zwierzęca Uniwersytetu Chang Gung posiada akredytację Stowarzyszenia ds. Oceny i Akredytacji Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (AAALAC). W tych badaniach nie zaobserwowano żadnych zagrożeń zdrowotnych zwierząt.
1. Przygotowanie bazy fiksacyjnej
<ol>
	<li>Wymieszaj proszek agarozowy z ddH2O do stężenia 4% (w/v) w kolbie podgrzewanej w mikrofalówce. Podgrzej w mikrofalówce przez 2-3 minuty, aż zacznie się gotować bez drobnych bąbelków. UWAGA: Objętość zależy od liczby próbek; około 10 mL na naczynie o średnicy 6 cm.</li>
	<li>Pozwól roztworowi agarozy ostygnąć do ~60 °C w ciągu ~3 minut. Wlej agarozę ostrożnie do misek o średnicy 6 cm, aż wysokość płynu osiągnie połowę pojemności (około 10 ml dla naczynia o średnicy 6 cm).</li>
	<li>Umieść naczynie z pokrywką w zamkniętej przestrzeni na 20-30 minut, aż agaroza całkowicie stwardnieje.</li>
</ol>
2. Przygotowanie materiału do utrwalania
<ol>
	<li>Przygotuj nowe przewody miedziane i przetnij je na długości 5 mm. Każdy kawałek tkanki wymaga 6-8 kawałków drutu.</li>
</ol>
3. Przygotowanie roztworu CCh
<ol>
	<li>Rozpuszczać krystaliczne CCh w sterylnym buforze PBS do końcowego stężenia 10 μM (200 μL dla jednej pętli jelitowej).</li>
</ol>
4. Przygotowanie środków znieczulanych do zastrzyków
<ol>
	<li>Aby przygotować roztwór zapasowy do znieczulenia, rozpuścić 2,2,2-tribrometanol w 2-metylo-2-butanolu.</li>
	<li>Użyj sterylnej soli fizjologicznej do rozcieńczenia roztworu zapasowego, tak aby końcowy roztwór roboczy zawierał 30 mg/mL 2,2,2-tribrometanolu oraz 3% (v/v) 2-metylo-2-butanolu.</li>
	<li>Dokładnie przeprowadź wir przez ~1 minutę, aż żaden granulat nie zostanie w roztworze (maksymalna szybkość: 8).</li>
	<li>Przechowuj roztwór wywarowy w ciemności w temperaturze 4 °C, aby uniknąć degradacji; Usuń bulion miesiąc po przygotowaniu.</li>
	<li>Przed znieczuleniem wciągnij roztwór wywarczy do sterylnego PBS i dobrze wymieszaj, aby zapewnić równomierną dyspersję, uzyskując ostateczną dawkę 250 mg/kg na mysz. UWAGA: 2,2,2-Tribrometanol ma neurotoksyczność, a 2-metylo-2-butanol jest lotny i ma drażniący zapach. Należy stosować odpowiedni sprzęt ochronny. Do utylizacji należy zebrać odpady w szczelnym pojemniku i stosować się do procedur utylizacji niebezpiecznych substancji chemicznych obowiązujących w instytucji.</li>
</ol>
5. Szczepienie jelit za pomocą wstrzyknięcia pętli
<ol>
	<li>Znieczulaj mysz w wieku 6-8 tygodni wstrzykiem do otrzewnowej 200 μL 2,2,2-tribrometanolu (250 mg/kg na mysz) i umieść mysz na termoforze, aby utrzymać temperaturę ciała. Potwierdź głębokość znieczulenia za pomocą uszczypnięcia palca.</li>
	<li>Po zdezynfekowaniu powierzchni skóry alkoholem wykonaj nacięcie w lewej dolnej części brzucha myszy nożyczkami do pracy i odsłonić cecum pod znieczuleniem.</li>
	<li>Zidentyfikuj jelita jelimowego lub okrężnicę bliższą, umieść pętlę jelitową na sterylnej gazie i użyj zacisków tętniczych, aby zabezpieczyć oba końce, tworząc zamkniętą pętlę o długości 3 cm.</li>
	<li>Płucz organ na gazie sterylnym PBS.</li>
	<li>Wstrzyknąć sterylny odczynnik PBS lub CCh w objętości nie większej niż 200 μL do podwiązanej pętli jelitowej pod znieczuleniem. UWAGA: Regularnie płucz odsłonięte jelito solą fizjologiczną przez cały okres leczenia, aby utrzymać wilgotność. Regularnie monitoruj głębokość znieczulenia (uszczypanie palca) oraz monitorowanie parametrów życiowych.</li>
</ol>
6. Pobieranie, utrwalanie i barwienie tkanek
<ol>
	<li>Po 30 minutach leczenia uśpij mysz przez zwichnięcie szyjki i pobierz pętlę jelitową.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby przytrzymać pętlę jelitową i delikatnie ją spłukać sterylnym PBS.</li>
	<li>Delikatnie rozciąć pętlę jelitową podłużnie i spłukać tkankę sterylnym PBS.</li>
	<li>Spłaszcz tkankę i użyj miedzianych drutów, aby zakotwiczyć ją na agarozie w misce o średnicy 6 cm.</li>
	<li>Utrwalić tkankę 10 mL roztworu paradehydu 4% na 12-24 godziny w naczyniu.</li>
	<li>Przemyj tkankę PBS co najmniej 3 razy, aby usunąć pozostałości paraformaldehydu.</li>
	<li>Zanurz tkankę w 10 mL buforu blokującego (PBS uzupełniony 0,4% Triton X-100 i 3% albuminy surowicy bydłej [BSA]) w temperaturze 4 °C przez 12-24 godziny w naczyniu.</li>
	<li>Barw tkankę aglutininą z kiełków pszennych (WGA, 1:200) i falloidyną (1:500) w buforze blokującym, potrząsając w 120 obr./min przy 4 °C przez 12-24 godziny w naczyniu. UWAGA: Aby zminimalizować zużycie barwnika, tkankę można zakotwiczyć na stwardniałej agarozie w naczyniu o średnicy 3 cm zanurzonej w 2 mL buforu barwnika do barwienia. UWAGA: Paradehyd stanowi zagrożenie wdychania. Podczas obsługi należy stosować odpowiedni sprzęt ochronny, na przykład podczas pracy w okapie wyparowym. Do utylizacji należy zebrać odpady w szczelnym pojemniku i stosować się do procedur utylizacji niebezpiecznych substancji chemicznych obowiązujących w instytucji.</li>
</ol>
7. Przechwytywanie obrazów za pomocą mikroskopii wielofotonowej
<ol>
	<li>Zmyj pozostałe środki do bejcowania co najmniej 3 razy PBS.</li>
	<li>Zakotwicz tkankę na agarozie za pomocą miedzianych drutów w 6-cm misce w 10 mL PBS.</li>
	<li>Pobierz 100 sekcji optycznych (o głębokości 99 μm) tkanki jelitowej i powiązanego śluzu za pomocą mikroskopu wielofotonowego wyposażonego w obiektyw o wysokiej zawartości NA do głębokiego obrazowania tkanek. Do mikroskopii wielofotonowej użyj źródła wzbudzenia ustawionego na długość fali 750 nm. Zbieraj sygnały emisyjne za pomocą filtrów pasmowych BP500-550 nm oraz BP565-610 nm. Ustaw prędkość skanowania na 8. UWAGA: W mikroskopii wielofotonowej maksymalna prędkość skanowania wynosi 9, a wyższe wartości oznaczają szybsze pozyskiwanie. Ustawienie prędkości zależy od pojemności mikroskopu. Korzystając z platformy obrazowania używanej do pozyskiwania stosów 3D, zalecamy prędkość skanowania 8, aby zrównoważyć czas akwizycji i jakość obrazu.</li>
</ol>
8. Analiza obrazów i ilościowa ilościowa analiza śluzu (Rysunek 1)
<ol>
	<li>Aby zmierzyć objętość każdej cząstki śluzu (w kanale WGA), otwórz stos obrazów w Imaris, przeciągając i upuszczając plik na stronę Areny. Kliknij ikonę Powierzchnia , aby rozpocząć proces tworzenia powierzchni. Postępuj zgodnie ze standardowymi krokami segmentacji i ilościowej ilości objętości cząstek w z-stacku. Szczegółowe parametry i kroki przetwarzania opisano na Rysunku 1.</li>
	<li>Wyklucz cząstki śluzu mniejsze niż 1 000 μm3, które są głównie komórkami pucharowymi (Rysunek 2A,B).</li>
	<li>Podsumuj objętość wydzielanego śluzu dla każdej grupy.</li>
</ol>
9. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Przeanalizuj i porównaj całkowity wolumen dla każdej grupy. Wprowadź wartość objętości śluzu w kolumnie i przeanalizuj za pomocą nieparametrycznego testu Manna-Whitneya.</li>
</ol>

<ol><li>Haber, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+survey+of+the+small+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell survey of the small intestinal epithelium.</a> Nature. 551 (7680), 333-339 (2017).</li>
<li>Bergstrom, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximal+colon-derived+O-glycosylated+mucus+encapsulates+and+modulates+the+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Proximal colon-derived O-glycosylated mucus encapsulates and modulates the microbiota.</a> Science. 370 (6515), 467-472 (2020).</li>
<li>Johansson, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inner+of+the+two+muc2+mucin-dependent+mucus+layers+in+colon+is+devoid+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The inner of the two muc2 mucin-dependent mucus layers in colon is devoid of bacteria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (39), 15064-15069 (2008).</li>
<li>Nyström, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intercrypt+subpopulation+of+goblet+cells+is+essential+for+colonic+mucus+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An intercrypt subpopulation of goblet cells is essential for colonic mucus barrier function.</a> Science. 372 (6539), eabb1590(2021).</li>
<li>Van Der Post, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+weakening+of+the+colonic+mucus+barrier+is+an+early+event+in+ulcerative+colitis+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Structural weakening of the colonic mucus barrier is an early event in ulcerative colitis pathogenesis.</a> Gut. 68 (12), 2142-2151 (2019).</li>
<li>Van Der Sluis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muc2-deficient+mice+spontaneously+develop+colitis%2C+indicating+that+muc2+is+critical+for+colonic+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Muc2-deficient mice spontaneously develop colitis, indicating that muc2 is critical for colonic protection.</a> Gastroenterology. 131 (1), 117-129 (2006).</li>
<li>Velcich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+cancer+in+mice+genetically+deficient+in+the+mucin+muc2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Colorectal cancer in mice genetically deficient in the mucin muc2.</a> Science. 295 (5560), 1726-1729 (2002).</li>
<li>Birchenough, G. M., Nyström, E. E., Johansson, M. E., Hansson, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sentinel+goblet+cell+guards+the+colonic+crypt+by+triggering+NLRP6-dependent+Muc2+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A sentinel goblet cell guards the colonic crypt by triggering NLRP6-dependent Muc2 secretion.</a> Science. 352 (6293), 1535-1542 (2016).</li>
<li>Dolan, B., Ermund, A., Martinez-Abad, B., Johansson, M. E., Hansson, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+small+intestinal+crypts+involves+goblet+cell+mucus+secretion+by+intracellular+granule+rupture+and+enterocyte+ion+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Clearance of small intestinal crypts involves goblet cell mucus secretion by intracellular granule rupture and enterocyte ion transport.</a> Sci Signal. 15 (752), eabl5848(2022).</li>
<li>Gustafsson, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+method+for+studying+mucus+formation%2C+properties%2C+and+thickness+in+human+colonic+biopsies+and+mouse+small+and+large+intestinal+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">An ex vivo method for studying mucus formation, properties, and thickness in human colonic biopsies and mouse small and large intestinal explants.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (4), G430-G438 (2012).</li>
<li>Sawaed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotics+damage+the+colonic+mucus+barrier+in+a+microbiota-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Antibiotics damage the colonic mucus barrier in a microbiota-independent manner.</a> Sci Adv. 10 (37), eadp4119(2024).</li>
<li>Bergstrom, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Core+1-and+3-derived+o-glycans+collectively+maintain+the+colonic+mucus+barrier+and+protect+against+spontaneous+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Core 1-and 3-derived o-glycans collectively maintain the colonic mucus barrier and protect against spontaneous colitis in mice.</a> Mucosal Immunol. 10 (1), 91-103 (2017).</li>
<li>Cortez, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrovirus+infects+actively+secreting+goblet+cells+and+alters+the+gut+mucus+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Astrovirus infects actively secreting goblet cells and alters the gut mucus barrier.</a> Nat Commun. 11 (1), 2097(2020).</li>
<li>Knoop, K. A., Mcdonald, K. G., Mccrate, S., Mcdole, J. R., Newberry, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+sensing+by+goblet+cells+controls+immune+surveillance+of+luminal+antigens+in+the+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microbial sensing by goblet cells controls immune surveillance of luminal antigens in the colon.</a> Mucosal Immunol. 8 (1), 198-210 (2015).</li>
<li>Nikitas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcytosis+of+Listeria+monocytogenes+across+the+intestinal+barrier+upon+specific+targeting+of+goblet+cell+accessible+E-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Transcytosis of Listeria monocytogenes across the intestinal barrier upon specific targeting of goblet cell accessible E-cadherin.</a> J Exp Med. 208 (11), 2263-2277 (2011).</li>
<li>Tsai, Y. H., Disson, O., Bierne, H., Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murinization+of+internalin+extends+its+receptor+repertoire%2C+altering+Listeria+monocytogenes+cell+tropism+and+host+responses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Murinization of internalin extends its receptor repertoire, altering Listeria monocytogenes cell tropism and host responses.</a> PLoS Pathog. 9 (5), e1003381(2013).</li>
<li>Birchenough, G. M., Johansson, M. E., Gustafsson, J. K., Bergstrom, J. H., Hansson, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+developments+in+goblet+cell+mucus+secretion+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">New developments in goblet cell mucus secretion and function.</a> Mucosal Immunol. 8 (4), 712-719 (2015).</li>
<li>Maheras, K. J., Gow, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+anesthesia+time+using+2%2C2%2C2-tribromoethanol-chloral+hydrate+with+low+impact+on+mouse+psychoacoustics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Increased anesthesia time using 2,2,2-tribromoethanol-chloral hydrate with low impact on mouse psychoacoustics.</a> J Neurosci Methods. 219 (1), 61-69 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Przedstawiamy tutaj metodę trójwymiarowej ilościowej ilościowej wykorzystywania barwienia tkanek całokształtnych, mikroskopii wielofotonowej oraz analizy za pomocą oprogramowania Imaris. Procedura ta pozwala obserwować nieciągły rozkład śluzu w błonie jelitowej i zapewnia bezwzględny pomiar objętości śluzu.
Nieciągły rozkład śluzu po stymulacji zaobserwowano również w systemach hodowli tkanek z roślin8. W poprzednich badaniach z wykorzystaniem ex vivo explant, ...

Środowisko śluzowe przewodu pokarmowego ssaków jest bardzo dynamiczne, wspierając kolonizację różnorodnej społeczności mikroorganizmów. Nabłonek jelitowy składa się z różnych wyspecjalizowanych komórek, które współpracują, aby wchłaniać składniki odżywcze, utrzymywać integralność bariery oraz komunikować się z układem odpornościowym1. Wśród nich komórki pucharowe magazynują granulki śluzu i wydzielają śluz do lumenu w warunkach ustabilizowanych. Ta śluz tworzy kluczową barierę fizyczną, uniemożliwiając bezpośredni kontakt mikroorganizmów z warstwą nabłonkową, modulując stan zapalny tkanek i utrzymując homeostazę jelit. 2,3. Zaburzenia wydzielania śluzu osłabiają funkcję bariery i są związane ze stanem zapalnym oraz nowotworem 4,5,6,7.
Wydzielanie śluzu jelitowego może być wywołane przez czynniki wewnętrzne, takie jak neuroprzekaźnik acetylocholina, oraz przez składniki drobnoustrojowe pochodzące z komensali 8,9. Biorąc pod uwagę złożoność środowiska jelitowego, wiele czynników wpływających na wydzielanie śluzu z pucharów pozostaje niezbadanych. Dlatego precyzyjna metoda ilościowego określania śluzu świetlnego jest niezbędna do badania, jak różne bodźce wpływają na dynamikę wydzielania. Tradycyjne podejścia opierają się głównie na względnej ilościowości: na przykład pomiarze gęstości śluzu za pomocą cząstek fluorescencyjnych lub węgla drzewnego w systemach ex vivo jelitowego explant10,11 lub ocenie odległości między drobnoustrojami luminalnymi a nabłonkiem w przekrojach tkanki barwionej12,13. Chociaż te metody są wygodne do porównań względnych, mogą nie oddawać pełnego rozmieszczenia lub trójwymiarowej struktury wydzielanego śluzu, zwłaszcza że wydzielany śluz nie zawsze pokrywa nabłonek jednolicie.
W tym badaniu przedstawiamy metodę trójwymiarowej wizualizacji i bezwzględnej ilościowej ilościowej wykorzystości tkanek jelitowych z całokształtnymi mocowaniami. To podejście wymaga utrwalania świeżej tkanki odpowiednim utrwalaczem, aby zachować integralność strukturalną i morfologię, a następnie fluorescencyjnego barwienia i obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego lub wielofotonowego. Poprzez podawanie środków testowych bezpośrednio do podwiązanych pętli jelitowych głęboko znieczulonych myszy, a następnie natychmiastowe utrwalenie, metoda zachowuje natywną architekturę śluzu i umożliwia analizę kinetyki wydzieliny. W porównaniu do tkanek przeciętych, gdzie głębokość obrazowania jest głównie ograniczona grubością tkanki, głębokość obrazowania tkanek całych (bez delipidacji) osiąga około 200-300 μm, ograniczoną przez rozpraszanie światła i nieprzezroczystość tkanek. Stosując tę technikę, wykazujemy, że chlorek karbamoilocholiny (CCh), analog acetylocholiny, którego receptory są ekspresjonowane na komórkach pucharowych14, silnie indukuje szybkie wydzielanie śluzu. Warto zauważyć, że wydzielany śluz tworzy zarówno ciągłą warstwę wzdłuż nabłonka, jak i nieciągłe struktury wewnątrz lumenu, co jest trudne do wykrycia w konwencjonalnych przekrojach tkanek. Protokół ten zapewnia solidną platformę do ilościowego określania trójwymiarowego rozkładu śluzu jelitowego oraz do porównywania potencjału wywołującego śluz różnych bodźców.

<table><tbody><tr><td>2,2,2-tribrometanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>2-metylo-2-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240486</td><td></td></tr><tr><td>6 cm miseczki &nbsp;</td><td>Alpha Plus</td><td>16021-1</td><td></td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>Hispanagar</td><td>A02599</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>BioShop</td><td>ALB001</td><td></td></tr><tr><td>chlorek karbamoylcholiny &ge; 98% (miareczkowanie), krystaliczne</td><td>SIGMA</td><td>SI-C4382-1G</td><td></td></tr><tr><td>Przewód miedziany (nowy)</td><td>TOP TECH WIRE & PRZEMYSŁOWY KABEL</td><td>IW00125</td><td>Przewód miedziany bez warstwy izolacyjnej</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Shineteh</td><td>ST-M110</td><td></td></tr><tr><td>Gaza, sterylna</td><td>GMTH</td><td>May-40</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8&nbsp;</td><td>Oprogramowanie GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>CONFORT</td><td>SY-666</td><td></td></tr><tr><td>IMARIS 10.0.0</td><td>OXFORD INSTRUMENTS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>BIOVOVAS</td><td>BL0415-1000</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GENESTAR</td><td>BL0180-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sondy znakowania falloidyny</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Shineteh</td><td>02-1250.18</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>1.08603.1000</td><td></td></tr><tr><td>Aglutininy i zarodków pszenicy (WGA) Sprzęgane</td><td>Biot</td><td>29027</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 7MP z W Plan-Apochromat 20 x/1.0 DIC III do zanurzenia w wodzie (NA 1.0), Spectra-Physics Mai Tai HP ti szafirowy laser femtosekundowy (bez modułu DeepSee) z detektorami BP500 nm-550 nm i BP565 nm-610 nm oraz laserową długością fali 750 nm</td><td></td><td></td><td>platforma obrazowania używana do pozyskiwania stosów 3D z obiektywem o wysokiej zawartości NA do głębokiego obrazowania tkanek; Źródło wzbudzenia do mikroskopii wielofotonowej ustawionej na długość fali 750 nm</td></tr></tbody></table>

trójwymiarowa ilościowa identyfikacja śluzu jelitowego za pomocą obrazowania tkanek w całości

Three-dimensional Quantification of Intestinal Mucus Using Whole-mount Tissue Imaging

Śluz odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy jelit, ułatwiając trawienie, tworząc barierę przeciw mikroorganizmom oraz regulując odpowiedzi immunologiczne w jelitach. Jego wydzielanie jest modulowane przez różne czynniki wewnętrzne i zewnętrzne, w tym infekcje drobnoustrojowe i stany zapalne. Podczas gdy tradycyjne metody analizy śluzu opierają się na względnej ilościowości, takiej jak pomiar grubości śluzu w przekrojach histologicznych, te podejścia dają ograniczony wgląd w rzeczywistą objętość i przestrzenny rozkład wydzielanego śluzu w świetle jelit. Przedstawiamy tutaj szczegółową metodologię absolutnej, trójwymiarowej ilościowej analizy śluzu z wykorzystaniem tkanek jelit z pełnym montażem oraz mikroskopii wielofotonowej. Protokół ten obejmuje przygotowanie podwiązanych pętli jelitowych, leczenie chlorkiem karbamoylcholiny jako bodźcem do aktywacji komórek pucharowych, utrwalenie tkanek oraz barwienie do obrazowania. Za pomocą mikroskopii wielofotonowej wykonujemy obrazy powierzchni luminalnej w stosach Z. Są one przetwarzane w oprogramowaniu Imaris, aby ilościowo określić objętość i przestrzenny rozkład wydzielanego śluzu. Wykazujemy, że chlorek karbamoilocholiny silnie indukuje wydzielanie śluzu zarówno w tkankach jelitowych, jak i okrężnych w ciągu 30 minut. Wydzielany śluz pojawia się sporadycznie i nieciągło w całym świetle, podkreślając znaczenie analizy objętościowej w porównaniu z tradycyjnymi podejściami dwuwymiarowymi. Protokół ten umożliwia badaczom uzyskanie absolutnych danych ilościowych oraz wizualizację rozkładu śluzu na miejscu, stanowiąc potężne narzędzie do badania dynamiki śluzu jelit w warunkach fizjologicznych i patologicznych.

W tej metodzie zmierzyliśmy objętość śluzu jelitowego na podstawie ułożonych obrazów tkanek całkowitych uzyskanych za pomocą mikroskopii wielofotonowej. Tkanki jelit zostały zabarwione fluorescencyjną falloidyną i aglutyniną zarodków pszenicy (WGA), aby zobrazować komórkę F-aktyny i śluzu, odpowiednio15,16. W tkankach jelita i jelita grubego leczone PBS, śluz WGA+ był wykrywany głównie w komórkach pucharowych na powierzchni nabłonka. Po podaniu chlorku...

Badanie to przedstawia metodę obrazowania 3D z wykorzystaniem tkanek jelitowych w całości oraz mikroskopii wielofotonowej do ilościowego określenia wydzielanego śluzu, umożliwiając precyzyjną analizę objętościową i wizualizację dynamiki śluzu w odpowiedzi na bodźce takie jak chlorek karbamoilocholiny.

Trójwymiarowa ilościowa identyfikacja śluzu jelitowego za pomocą obrazowania tkanek w całości

Mucus plays a critical role in maintaining intestinal homeostasis by facilitating digestion, forming a barrier against microbes, and regulating immune ...

Nasze badania koncentrują się na mechanizmach wstrzyknięć mikroorganizmów w tkanki śluzowe, podkreślając kluczową rolę śluzu w modulacji tych interakcji. Tradycyjne dwuwymiarowe ilościowe ilości śluzu pomija szczegóły przestrzenne i wolumetryczne. Nasz protokół umożliwia dokładną analizę 3D, ujawniając zmiany strukturalne i rozmieszczone przez interwencje molekularne, które są pomijane w istniejących metodach.Protokół ten łączy obrazowanie hormonalne z ilościową ilościową 3D, zapewniając solidne, powtarzalne pomiary architektury śluzu jelitowego stosowalne do różnych schorzeń eksperymentalnych i interwencji molekularnych przewyższających konwencjonalne oceny 2D. Na początek umieść znieczuloną mysz w wieku sześciu do ośmiu tygodni na poduszce grzewczej, aby utrzymać jej temperaturę ciała. Dezynfekuj powierzchnię skóry myszy alkoholem i wykonaj nacięcie w lewej dolnej części brzucha, aby odsłonić cekumę, jednocześnie utrzymując znieczulenie.Teraz zidentyfikować jelita kręta, czyli okrężnicę proksymalną. Załóż pętlę jelitową na sterylną gazę. Przepłucz sterylnym PBS i zabezpiecz oba końce zaciskami tętniczymi, tworząc zamkniętą pętlę o długości trzech centymetrów.W znieczuleniu wstrzyknąć nie więcej niż 200 mikrolitrów sterylnego odczynnika PBS lub chlorku karbamoilocholiny do podwiązanej pętli jelitowej. Po 30 minutach leczenia pobierz pętlę jelitową od uśpionego zwierzęcia. Za pomocą kleszczy trzymaj pętlę jelitową i delikatnie ją spłuknij sterylnym PBS.Przetnij pętlę jelitową podłużnie, z małą, nieprzeciętą kawałkiem, i ponownie przepłucz tkankę sterylnym PBS. Spłaszcz tkankę w sześciocentymetrowej misce i rozetnij pozostałą część. Użyj miedzianych segmentów drutu, aby zakotwiczyć go do podstawy agarozowej.Następnie dodaj 10 mililitrów roztworu 4% paraformaldehydu do naczynia, aby utrwalić tkankę przez 12 do 24 godzin. Po inkubacji usuń roztwór paraformaldehydu i przemyj tkankę co najmniej trzy razy PBS, aby usunąć resztki paraformaldehydu. Następnie zanurz tkankę w 10 mililitrach buforu blokującego składającego się z PBS uzupełnionego 0,4% Triton X-100 i 3% BSA, przechowywany w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 12 do 24 godzin.Usuń bufor blokujący. Barw tkankę roztworem barwniczym zawierającym agglutininę i falloidynę z kiełków pszenicznych. W tkankach jelita cienkiego i okrężnicy poddawanej PBS, śluz WGA-dodatni był głównie lokalizowany w komórkach pucharowych na powierzchni nabłonka.Po leczeniu chlorkiem karbamoilocholiny ilość śluzu WGA-dodatniego w światłości jelit wyraźnie wzrosła zarówno w jelicie cienkim, jak i jelicie grubym, jednak śluz był rozpraszany sporadycznie, zamiast tworzyć ciągłą warstwę. Objętość śluzu WGA-dodatniego z komórek pucharowych była istotnie zmniejszona po leczeniu chlorkiem karbamoilocholiny zarówno w jelicie cienkim, jak i jelicie grubym, co wskazuje na aktywną sekreturę. Wszystkie objętości śluzu z komórek pucharowych w tkankach objętych PBS były poniżej 1 000 mikrometrów sześciennych.Przedmioty WGA-pozytywne przekraczające 1 000 mikrometrów sześciennych zostały sklasyfikowane jako wydzielany śluz w lumenie. Leczenie chlorkiem karbamoylcholiny zwiększyło całkowitą objętość wydzielanego śluzu około pięciokrotnie do dwudziestkrotnie zarówno w tkankach jelita cienkiego, jak i jelita grubego.

three-dimensional-quantification-intestinal-mucus-using-whole-mount

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ulepszona technologia obrazowania pozwala na trójwymiarowe obrazowanie organów podczas rozwoju. W tym miejscu opisujemy cały system hodowli narządów, który umożliwia obrazowanie na żywo rozwijających się kosmków w jelicie płodu myszy.

System hodowli całego jelita moczowego u myszy płodu do manipulacji ex vivo szlakami sygnałowymi i trójwymiarowego obrazowania na żywo rozwoju kosmków

Dokładna identyfikacja i lokalizacja komórek nabłonkowych wzdłuż błony śluzowej jelit są niezbędne do zdefiniowania różnych linii komórkowych. Prawidłowe obrazowanie tkanek jelitowych ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji wzorców ekspresji białek z maksymalną rozdzielczością. Badanie to ma na celu nakreślenie optymalnych metod i warunków przetwarzania tkanek jelitowych myszy.

Ulepszona technika walcowania szwajcarskiego do przygotowania tkanki jelitowej do analiz immunohistochemicznych i immunofluorescencyjnych

Sondy specyficzne dla celu stanowią innowacyjne narzędzie do analizy mechanizmów molekularnych, takich jak ekspresja białek w różnych typach chorób (np. zapaleniu, infekcji i nowotworzenia). W tym badaniu opisano ilościową trójwymiarową ocenę tomograficzną infiltracji makrofagów jelitowych w mysim modelu zapalenia jelita grubego przy użyciu tomografii fluorescencyjnej specyficznej dla F4 / 80.

Tomografia fluorescencyjna do wykrywania i ilościowego oznaczania mysiego zapalenia jelit związanego z makrofagami

Opisujemy metodę wizualizacji IELs γδ znakowanych GFP za pomocą obrazowania przyżyciowego mysiego jelita cienkiego za pomocą mikroskopii konfokalnej z odwróconym wirującym dyskiem. Technika ta umożliwia śledzenie żywych komórek w błonie śluzowej przez okres do 4 godzin i może być wykorzystana do badania różnych interakcji jelitowych między układem odpornościowym a nabłonkiem.

Obrazowanie przyżyciowe limfocytów śródnabłonkowych w jelicie cienkim myszy

Korzystając z mikroskopii przyżyciowej, przedstawiona tutaj metoda umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym wydalania komórek nabłonka jelitowego u żywych zwierząt. W związku z tym miejscowo wybarwiona błona śluzowa jelit (akryflawina i rodamina B-dekstran) znieczulonych myszy jest obrazowana do rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Podejście oparte na mikroskopii przyżyciowej do oceny przepuszczalności jelit i wydajności wydalania komórek nabłonkowych

Ten uproszczony protokół szczegółowo opisuje proces wykrywania i obrazowania bakterii w złożonych próbkach tkanek, od utrwalania tkanki po barwienie mikrobów za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ.

Wizualizacja interakcji mikrobiota jelitowa z gospodarzem poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ, barwienie lektyną i obrazowanie

Aby zbadać, jak jelito cienkie radzi sobie z cząstkami o różnych rozmiarach, zmodyfikowaliśmy ustaloną metodę in vivo, aby określić pasaż jelita cienkiego.

Badanie mechanowykrywania cząstek świetlnych w jesionym jelicie cienkim

Tutaj opisujemy konstrukcję podstawowego, trójwymiarowego (3D) modelu linii komórkowej jelitowej oraz protokołu osadzania parafiny do mikroskopowej oceny stałych jelitowych odpowiedników. Barwienie wybranych białek umożliwia analizę wielu parametrów wzrokowych z jednego eksperymentu do potencjalnego wykorzystania w przedklinicznych badaniach przesiewowych leków.

Podstawowy trójwymiarowy (3D) model jelitowy z komponentem odpornościowym

Tutaj opisujemy procedurę, która umożliwia wykrywanie bakterii chorobotwórczych w całym narządzie podczas infekcji i ilościowe określanie aktywności fluorescencyjnego reportera.

Trójwymiarowa tomografia całego narządu o wysokiej rozdzielczości zakażeń bakteryjnych

Ten artykuł opisuje protokół immunofluorescencji multipleksowej zoptymalizowany pod kątem charakterystyki trójwymiarowej architektury przerzutów otrzewnowych.

Trójwymiarowe obrazowanie tkanki nośnej guza przy użyciu iteracyjnego wybielania rozszerza podejście multipleksywalne

Poznaj metodę trójwymiarowej ilościowej analizy śluzu jelitowego z wykorzystaniem preparatów całotkankowych i mikroskopii wielofotonowej u myszy. Protokół umożliwia precyzyjną wizualizację dynamiki śluzu w odpowiedzi na różne bodźce.

Trójwymiarowa ilościowa identyfikacja śluzu jelitowego za pomocą obrazowania tkanek w całości

Przeglądaj więcej filmów