Trójwymiarowa ilościowa identyfikacja śluzu jelitowego za pomocą obrazowania tkanek w całości

Nasze badania koncentrują się na mechanizmach wstrzyknięć mikroorganizmów w tkanki śluzowe, podkreślając kluczową rolę śluzu w modulacji tych interakcji. Tradycyjne dwuwymiarowe ilościowe ilości śluzu pomija szczegóły przestrzenne i wolumetryczne. Nasz protokół umożliwia dokładną analizę 3D, ujawniając zmiany strukturalne i rozmieszczone przez interwencje molekularne, które są pomijane w istniejących metodach.

Protokół ten łączy obrazowanie hormonalne z ilościową ilościową 3D, zapewniając solidne, powtarzalne pomiary architektury śluzu jelitowego stosowalne do różnych schorzeń eksperymentalnych i interwencji molekularnych przewyższających konwencjonalne oceny 2D. Na początek umieść znieczuloną mysz w wieku sześciu do ośmiu tygodni na poduszce grzewczej, aby utrzymać jej temperaturę ciała. Dezynfekuj powierzchnię skóry myszy alkoholem i wykonaj nacięcie w lewej dolnej części brzucha, aby odsłonić cekumę, jednocześnie utrzymując znieczulenie.

Teraz zidentyfikować jelita kręta, czyli okrężnicę proksymalną. Załóż pętlę jelitową na sterylną gazę. Przepłucz sterylnym PBS i zabezpiecz oba końce zaciskami tętniczymi, tworząc zamkniętą pętlę o długości trzech centymetrów.

W znieczuleniu wstrzyknąć nie więcej niż 200 mikrolitrów sterylnego odczynnika PBS lub chlorku karbamoilocholiny do podwiązanej pętli jelitowej. Po 30 minutach leczenia pobierz pętlę jelitową od uśpionego zwierzęcia. Za pomocą kleszczy trzymaj pętlę jelitową i delikatnie ją spłuknij sterylnym PBS.

Przetnij pętlę jelitową podłużnie, z małą, nieprzeciętą kawałkiem, i ponownie przepłucz tkankę sterylnym PBS. Spłaszcz tkankę w sześciocentymetrowej misce i rozetnij pozostałą część. Użyj miedzianych segmentów drutu, aby zakotwiczyć go do podstawy agarozowej.

Następnie dodaj 10 mililitrów roztworu 4% paraformaldehydu do naczynia, aby utrwalić tkankę przez 12 do 24 godzin. Po inkubacji usuń roztwór paraformaldehydu i przemyj tkankę co najmniej trzy razy PBS, aby usunąć resztki paraformaldehydu. Następnie zanurz tkankę w 10 mililitrach buforu blokującego składającego się z PBS uzupełnionego 0,4% Triton X-100 i 3% BSA, przechowywany w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 12 do 24 godzin.

Usuń bufor blokujący. Barw tkankę roztworem barwniczym zawierającym agglutininę i falloidynę z kiełków pszenicznych. W tkankach jelita cienkiego i okrężnicy poddawanej PBS, śluz WGA-dodatni był głównie lokalizowany w komórkach pucharowych na powierzchni nabłonka.

Po leczeniu chlorkiem karbamoilocholiny ilość śluzu WGA-dodatniego w światłości jelit wyraźnie wzrosła zarówno w jelicie cienkim, jak i jelicie grubym, jednak śluz był rozpraszany sporadycznie, zamiast tworzyć ciągłą warstwę. Objętość śluzu WGA-dodatniego z komórek pucharowych była istotnie zmniejszona po leczeniu chlorkiem karbamoilocholiny zarówno w jelicie cienkim, jak i jelicie grubym, co wskazuje na aktywną sekreturę. Wszystkie objętości śluzu z komórek pucharowych w tkankach objętych PBS były poniżej 1 000 mikrometrów sześciennych.

Przedmioty WGA-pozytywne przekraczające 1 000 mikrometrów sześciennych zostały sklasyfikowane jako wydzielany śluz w lumenie. Leczenie chlorkiem karbamoylcholiny zwiększyło całkowitą objętość wydzielanego śluzu około pięciokrotnie do dwudziestkrotnie zarówno w tkankach jelita cienkiego, jak i jelita grubego.