Przygotowanie ostrych wycinków mózgu przy użyciu zoptymalizowanej metody odzysku ochronnego N-metylo-D-glukaminy

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie zdrowych wycinków mózgu z dojrzałych dorosłych zwierząt, które nadają się do eksperymentów elektrofizjologicznych z zaciskiem łatowym. Tak więc ta zoptymalizowana metoda odzyskiwania ochronnego NMDG do przygotowania wycinków mózgu pozwala naukowcom badać wewnętrzne i synaptyczne właściwości typów komórek mózgowych w wielu różnych regionach mózgu i u zwierząt w praktycznie każdym wieku. Tak więc główną zaletą tej konkretnej techniki jest to, że pozwala ona na przygotowanie wycinków mózgu, które mają wyższy stopień zachowania neuronów w porównaniu z wcześniejszymi metodologiami.

A także, że te wycinki mózgu są bardziej odpowiednie do nagrywania z zaciskiem krosowym. Metoda ta została zoptymalizowana pod kątem tkanki mózgowej dorosłej myszy. Może być stosowany do wielu innych gatunków, w tym neurochirurgicznie wyciętej ludzkiej tkanki mózgowej.

Aby rozpocząć tę procedurę, ustaw stację krojenia z krajalnicą do tkanek i narzędziami chirurgicznymi. Przymocuj cyrkonowo-ceramiczne ostrze wtryskiwacza do ramienia ostrza za pomocą szybkiego kleju samoprzylepnego. Następnie włóż uchwyt na próbkę i wyrównaj krawędź natarcia ostrza z obręczą uchwytu próbki.

Pozostawiając niewielką szczelinę, aby ostrze nie ocierało się o metal. Napełnij zlewkę o pojemności 250 mililitrów 200 mililitrami NMDG HEPES aCSF. I wstępnie schładzaj go na lodzie ze stałą karbonizacją przez ponad 10 minut.

Następnie skonfiguruj początkową komorę odzyskiwania wycinków mózgu, wypełniając ją 150 mililitrami NMDG HEPES aCSF. I umieść komorę w łaźni wodnej o temperaturze od 32 do 34 stopni Celsjusza. Aby ustawić komorę do przechowywania wycinków mózgu, napełnij zbiornik 450 mililitrami HEPES aCSF i pozwól mu ogrzać się do temperatury pokojowej przy stałym karbonizacji do momentu użycia.

Następnie przygotuj stopioną agarozę do zatopienia w tkance, wycinając blok 2% agarozy z wcześniej przygotowanego naczynia za pomocą otwartego końca 50-mililitrowej stożkowej fiolki. Luźno zakręć stożkową fiolkę, a następnie podgrzewaj ją w kuchence mikrofalowej przez 10 do 30 sekund, aż agaroza zacznie się topić. Nie przegrzewaj.

Wlej stopioną agarozę do 1,5 mililitrowych probówek. Utrzymuj agarozę w stanie stopionym za pomocą termomiksera ustawionego na 42 stopnie Celsjusza z energicznym potrząsaniem. I ostrożnie upewnij się, że stopiona agaroza nie zestala się przedwcześnie.

W tym czasie wstępnie schłodzić dodatkowy blok chłodzący krajalnicy na lodzie. W tej procedurze wykonaj nacięcie na skórze głowy, aby odsłonić jarmułkę. Następnie użyj cienkich, super ciętych nożyczek, aby odciąć skórę nad jarmułką.

I wykonaj małe nacięcia boczne po obu stronach ogonowej brzusznej podstawy czaszki. Wykonaj dodatkowe płytkie nacięcia, zaczynając od ogonowej grzbietowej części czaszki, przesuwając się w kierunku rostralnym w górę grzbietowej linii środkowej. Uważaj, aby nie uszkodzić leżącego pod spodem mózgu.

Następnie wykonaj końcowe cięcie w kształcie litery T prostopadle do linii środkowej na poziomie opuszki węchowej. Następnie użyj kleszczy z okrągłą końcówką, aby chwycić czaszkę, zaczynając od przyśrodkowego aspektu rostralnego i oderwać w kierunku bocznym ogona po jednej stronie. Powtórz tę procedurę, aby druga strona się otworzyła.

I usuń grzbietowe połówki czapki czaszki, aby odsłonić mózg. Delikatnie zgarnij nienaruszony mózg do zlewki z wstępnie schłodzonym NMDG HEPES aCSF. I pozwól mózgowi równomiernie ostygnąć przez około minutę.

Teraz użyj dużej szpatułki, aby przenieść mózg ze zlewki na szalkę Petriego pokrytą bibułą filtracyjną. Przytnij i zamontuj mózg zgodnie z preferowanym kątem krojenia i pożądanym obszarem mózgu zainteresowania. Pracuj szybko, aby uniknąć długotrwałego niedoboru tlenu podczas przenoszenia.

Następnie przymocuj blok mózgu do uchwytu na próbkę za pomocą kleju klejącego. Cofnij wewnętrzną część uchwytu próbki, aby całkowicie wycofać blok mózgu do środka. Następnie wlej stopioną agarozę bezpośrednio do uchwytu, aż blok mózgu zostanie całkowicie pokryty agarozą.

Następnie zacisnąć wstępnie schłodzony dodatkowy blok chłodzący wokół uchwytu próbki przez dziesięć sekund, aż agaroza zastygnie. Włóż uchwyt próbki do pojemnika w krajalnicy i sprawdź prawidłowe wyrównanie. Następnie napełnij zbiornik pozostałym wstępnie schłodzonym natlenionym NMDG HEPES aCSF ze zlewki o pojemności 250 mililitrów i umieść kamień bąbelkowy w zbiorniku na czas krojenia, aby zapewnić odpowiednie natlenienie.

Następnie wyreguluj mikrometr, aby rozpocząć przesuwanie próbki mózgu zatopionej w agarozie. Uruchom krajalnicę i empirycznie dostosuj prędkość posuwu i częstotliwość oscylacji do żądanego poziomu. Kontynuuj posuwanie się naprzód i krojenie tkanki w odstępach co 300 mikrometrów, aż obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania zostanie w pełni przecięty.

Całkowity czas procedury krojenia powinien być krótszy niż 15 minut. Do początkowego odzyskiwania NMDG. Po zakończeniu procedury dzielenia zbierz wszystkie plastry za pomocą odciętej plastikowej pipety pastwiskowej i przenieś je do komory regeneracyjnej o temperaturze 34 stopni Celsjusza wypełnionej 150 mililitrami NMDG HEPES aCSF.

Czas etapu regeneracji ostrego wycinka mózgu jest bardzo ważny, aby móc osiągnąć równowagę między zachowaniem morfologicznym a funkcjonalnym przywróceniem właściwości elektrofizjologicznych każdego neuronu. Po ustaleniu optymalnego harmonogramu skoków sodu, w zależności od wieku myszy, należy przeprowadzić procedurę skokowego sodu Kroku Y, dodając wskazane objętości roztworu sodu we wskazanym czasie. Dodaj roztwór sodowy bezpośrednio do komina bełkotki początkowej komory odzysku, aby ułatwić szybkie mieszanie.

Harmonogram skoków sodu, który został dostarczony dla wielu różnych przedziałów wiekowych, jest naprawdę dobrym punktem wyjścia. Ale powinien być zoptymalizowany i wykorzystany do własnego, specyficznego projektu eksperymentalnego. Następnie przenieś wszystkie plastry do komory długoterminowego przetrzymywania HEPES aCSF utrzymywanej w temperaturze pokojowej.

Pozwól plastrom zregenerować się przez kolejną godzinę w komorze trzymającej HEPES przed eksperymentami z zapisem zacisku krosowego. Pokazano tutaj reprezentatywne obrazy IR DIC, które zostały uzyskane z różnych obszarów mózgu i ostrych wycinków od trzymiesięcznej myszy w celu oceny morfologicznego zachowania neuronów. Przedstawione tutaj wyniki pochodzą z zastosowania kontrolnej metody cięcia ochronnego NMDG bez etapu odzyskiwania ochronnego.

Natomiast wyniki te pochodzą ze zoptymalizowanej metody odzyskiwania ochronnego NMDG. Ogólnie rzecz biorąc, poprawę zachowania neuronów obserwuje się dzięki zoptymalizowanej metodzie odzyskiwania ochronnego NMDG. Zoptymalizowaną metodę odzyskiwania ochronnego NMDG z procedurą stopniowego zwiększania sodu porównano z oryginalną metodą odzyskiwania ochronnego NMDG.

Średni czas tworzenia uszczelnienia GigaOhm i rejestracji zacisku krosowego został radykalnie i znacznie skrócony, gdy zastosowano procedurę stopniowego zwiększania sodu wraz z etapem odzyskiwania ochronnego NMDG. Lepsze zachowanie neuronów osiągnięte dzięki tej metodzie wycinków mózgu ułatwia trudne zastosowania eksperymentalne, w tym między innymi elektrofizjologię z wieloelektrodowymi zaciskami plastrowymi w celu zbadania lokalnych połączeń synaptycznych. Jak wykazano tutaj, przy użyciu wycinków mózgu ex vevo ex vevo z kory nowej pochodzących z neurochirurgii.

Oglądając ten film, naukowcy powinni dobrze zrozumieć, jak wdrożyć naszą zoptymalizowaną metodę odzyskiwania NMDG Protective Recovery, w tym nową procedurę skoku sodu, którą opisaliśmy, w celu przygotowania wycinków mózgu, które są odpowiednie do nagrań z zaciskiem łatowym. Tak więc po opanowaniu tego protokołu powinno być możliwe wykonanie procedury wycinka mózgu w czasie krótszym niż jedna godzina każdego dnia. Powinien dać wysokiej jakości powtarzalne wycinki mózgu i będzie działał dla zwierząt w praktycznie każdym wieku.

Tak więc ta procedura, ta metoda może pomóc w przygotowaniu wycinków mózgu, które są odpowiednie do odpowiedzi na pytania dotyczące funkcji mózgu przy użyciu technik takich jak elektrofizjologia, obrazowanie optyczne na żywo i optogenetyka, testy transportu receptorów i inne rodzaje testów funkcjonalnych do badania funkcji typów komórek mózgowych. Technika ta jest również przydatna, ponieważ pomoże naukowcom w funkcjonalnym badaniu różnych obszarów mózgu, w tym obszarów mózgu, które tradycyjnie nie są podatne na rejestrację za pomocą kropek od dorosłych zwierząt w wycinkach mózgu.