Name: Przygotowanie ostrych wycinków mózgu przy użyciu zoptymalizowanej metody odzysku ochronnego N-metylo-D-glukaminy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną metodę ochronnego odzysku NMDG do przygotowania ostrych wycinków mózgu z dorosłych zwierząt. Technika zapewnia wysoką zachowawczość neuronów dla badań elektrofizjologicznych metodą patch clamp.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Allen Institute for Brain Science. Autorzy pragną podziękować założycielom Allen Institute, Paulowi G. Allenowi i Jody Allen, za ich wizję, zachętę i wsparcie. Dziękujemy również personelowi wsparcia technicznego Allen Institute za opiekę nad zwierzętami, hodowlę i genotypowanie.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Na+ Spike-In poprawia formowanie gigaomowych uszczelnień i pomyślne nagrywanie zacisków krosowych Pierwotna wersja metody odzysku ochronnego NMDG została specjalnie zaprojektowana dla zwierząt dorosłych i starzejącychsię 2,5. Niektórzy pierwsi użytkownicy starali się również zastosować tę metodologię do krojenia mózgów młodych zwierząt (tj. myszy w wieku <30 dni). Zauważono jednak, że w przeciwieństwie do wyjątkowego, wizualnie potwierdzonego zachowania neuronów za pomocą ochronnej metody odzyskiwania NMDG w tym przedziale wiekowym, tworzenie uszczelnień gigaomowych może często utknąć w martwym punkcie, co prowadzi do nieudanych prób nagrania klamry. Jedna z hipotez głosi, że kationy NMDG są łatwiej uwięzione w młodocianych wycinkach mózgu w porównaniu z dorosłymi wycinkami mózgu i mogą utrudniać tworzenie się fok; jednak gigaomowe uszczelki mogą łatwo się tworzyć, podczas gdy młode wycinki mózgu są całkowicie zanurzone w NMDG aCSF (dane nie pokazane), co wskazuje, że NMDG aCSF per se nie utrudnia tworzenia gigaomowych uszczelnień.
Szybkie przejście od roztworu o niskiej do wysokiej zawartości Na+ po zakończeniu początkowego etapu odzyskiwania wycinków mózgu powoduje uszkodzenie błon neuronalnych i zaburza proces tworzenia uszczelnień. Jest to intuicyjne, biorąc pod uwagę, że przejście od niskiej do wysokiej temperatury Na+, niskiej do ciepłej temperatury i dramatyczny wzrost stosunku Ca2+ do Mg2+ łącznie prowadzą do masowego odrodzenia spontanicznej aktywności synaptycznej. Ta hamująca faza odbicia w procedurze krojenia mózgu prawdopodobnie odzwierciedla uszkodzenie reperfuzyjne po urazie niedokrwiennym. W związku z tym, aby jeszcze bardziej złagodzić uszkodzenie błony neuronalnej w początkowej fazie rekonwalescencji, zastosowano procedurę stopniowego skoku Na+, w której wzrost stężenia Na+ w ochronnej komorze inkubacyjnej NMDG jest powoli i powtarzalnie zwiększany z precyzyjnym czasem. Podobnie jak w pierwotnej procedurze odzyskiwania ochronnego, korzystna jest czasowa dysocjacja wzrostu Na+ od temperatury i podniesienie stosunku Ca2+ / Mg2+. Ale dodatkowo, procedura skoku Na+ prowadzi do niewielkiego przyrostowego wzrostu zewnątrzkomórkowego stężenia Na+ we wczesnych punktach czasowych i dużego wzrostu w kierunku późnych punktów czasowych, dając w ten sposób tkance mózgowej możliwość lepszego dostosowania się do rosnących poziomów Na+. Procedura ta jest alternatywą dla stopniowej wymiany roztworu kontrolowanej przez pompę perfuzyjną lub grawitacyjne linie kroplujące, które prowadzą do stałego wzrostu poziomu Na+ i wymagają zwrócenia uwagi zarówno na dopływ, jak i odpływ, aby uniknąć przepełnienia komory plastrów. Warto zauważyć, że w tej procedurze nakłuwania Na+ osmolalność roztworu w komorze plastrów stopniowo wzrasta w ciągu kilku minut, zanim plastry powrócą do normalnego roztworu osmolalności, ale nie wpłynęło to negatywnie na zdrowie plastra ani sukces zapisu zacisku krosowego. Roztwór tnący o wysokiej osmolalności był wcześniej stosowany do przygotowywania plastrów śródmózgowia w celu lepszego zachowania neuronów dopaminowych do zapisów patch clamp57,58, wykazując w ten sposób, że ta tymczasowa hiperosmolalność może być korzystna w niektórych kontekstach.
Dzięki wdrożeniu zoptymalizowanej procedury łączącej metodę ochronnego odzyskiwania NMDG i stopniowy krok skoku Na+, użyteczność tej metodologii wycinków mózgu została rozszerzona na wiek młodocianych i dojrzałych dorosłych. Ten zaktualizowany protokół jest teraz odpowiedni dla szerokiego zakresu wieku zwierząt przy użyciu jednego optymalnego preparatu i procedury NMDG aCSF. W razie potrzeby procedura nastawiania Na+ może być stosowana z coraz dłuższym opóźnieniem i/lub wolniejszym czasem w celu zwiększenia żywotności wycinków mózgu starszych zwierząt, a my przedstawiliśmy podstawowy przewodnik po zalecanych harmonogramach nawijania w zależności od wieku zwierzęcia (patrz Tabela 2). Chociaż dostarczyliśmy podstawową strukturę odpowiednią dla szerokiej gamy zastosowań, dodatkowe zaawansowane kroki mogą być badane w celu dalszego zwiększenia żywotności i długowieczności wycinków mózgu od dorosłych i starzejących się zwierząt. Na przykład, strategie odbudowy glutationu są szczególnie skuteczne w tym zakresie i mogą być wdrażane zgodnie z opisem w innym miejscu 2,6.
Zwiększanie przepustowości w przypadku wymagających eksperymentów Analiza połączeń synaptycznych za pomocą zapisu patch clamp jest wymagającym zastosowaniem, które wymaga doskonałego zachowania zarówno struktury, jak i funkcji neuronów w celu osiągnięcia wysokiej niezawodności sukcesu. Ponieważ liczba neuronów, które mają być jednocześnie rejestrowane, rośnie liniowo, poziom trudności technicznej wzrasta nadliniowo. Istnieje wiele trybów awarii, a jedną z najczęstszych przyczyn awarii jest niemożność uformowania odpowiednich gigaomowych uszczelek na jednym lub więcej docelowych ogniwach. Może to znacznie spowolnić postęp, szczególnie gdy trzy lub więcej neuronów musi być rejestrowanych jednocześnie. Zgodnie z odkryciem szybszego czasu tworzenia uszczelnienia gigaomowego za pomocą zoptymalizowanej metody odzyskiwania ochronnego NMDG, nastąpiła wyraźna poprawa wskaźnika sukcesu i przepustowości eksperymentów z zapisem klamry z wieloma neuronami zarówno na wycinkach mózgu dorosłych transgenicznych myszy, jak i na neurochirurgicznych wycinkach mózgu dorosłego człowieka. Zwiększona wydajność jest prawie na pewno spowodowana zarówno szybszym i bardziej niezawodnym tworzeniem uszczelnień gigaomowych, jak i lepszym zachowaniem neuronów w warstwach dzięki temu protokołowi. Chociaż protokół ten koncentruje się wyraźnie na korzyściach dla aplikacji do nagrywania z zaciskiem krosowym, przewiduje się, że podobne korzyści pojawią się w przypadku innych wymagających zastosowań eksperymentalnych, w których najważniejsza jest żywotność wycinków mózgu.

Przygotowanie ostrego wycinka mózgu jest niezbędnym eksperymentalnym systemem modelowym w neurobiologii. Przez około pół wieku platforma ta umożliwiała dynamiczne badania funkcjonalne żywego mózgu w wielu różnych anatomicznych regionach mózgu i gatunkach zwierząt. Niezależnie od tego, czy zamierzonym zastosowaniem jest biochemia, obrazowanie funkcjonalne, morfologia czy elektrofizjologia, niezwykle ważne jest zapewnienie optymalnej integralności i żywotności pokrojonej tkanki. Z tego powodu do tej pory najbardziej preferowany był wysoce odporny preparat z wycinków mózgu młodych gryzoni (tj. młodszy niż 30 dzień po urodzeniu myszy). Trudność w uzyskaniu wystarczająco zdrowych wycinków mózgu od dojrzałych dorosłych i starzejących się zwierząt okazała się ogromnym wyzwaniem dla większości i nałożyła poważne ograniczenia na badanie funkcjonalnej architektury dojrzałego mózgu. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku rejestracji patch clamp, techniki, która wymaga doskonałego zachowania morfologicznego i funkcjonalnego oraz jest niezbędna do scharakteryzowania szczegółowych właściwości wewnętrznych i synaptycznych zidentyfikowanych pojedynczych neuronów. W ciągu ostatnich kilku dekad zdecydowana większość elektrofizjologów z klamrą punktową polegała na metodzie "cięcia ochronnego" z użyciem podstawionej sacharozą aCSF1 o niskiej zawartości Na+ w celu przygotowania zdrowych wycinków mózgu od młodych i w znacznie mniejszym stopniu młodych dorosłych zwierząt. Metoda ta opiera się na założeniu, że bierny napływ Na+, a następnie wnikanie wody i pęcznienie komórek podczas etapu krojenia plastrów jest dominującą zniewagą, która prowadzi do słabej przeżywalności neuronów, szczególnie w przypadku neuronów znajdujących się w warstwach powierzchownych, które są najbardziej narażone na bezpośrednie urazy spowodowane ruchem ostrza. Jednak metoda cięcia ochronnego nadal pozostawia wiele do życzenia w przygotowaniu plastrów mózgu od dojrzałych dorosłych zwierząt, niezależnie od konkretnego zastosowanego preparatu aCSF.
Proste, ale skuteczne rozwiązanie tego problemu zostało opisane2,3,4,5,6 i nazwane metodą "ochronnego odzyskiwania" wycinków mózgu. Pierwotna wersja tej metody wykorzystuje aCSF podstawiony NMDG, ponieważ NMDG został zidentyfikowany jako najbardziej wszechstronny i skuteczny spośród różnych innych potencjalnych substytutów jonów sodu (w tym sacharozy, glicerolu, choliny i Tris). Formuła pożywki została dodatkowo ulepszona przez dodanie HEPES, aby przeciwdziałać obrzękowi wycinków mózgu i zapewnić silniejsze buforowanie pH7, a także dodanie suplementów przeciwdziałających szkodliwym skutkom stresu oksydacyjnego (Tabela 1). Empirycznie ustalono, że początkowy etap inkubacji regeneracji w niskim Na+, niskim Ca2+ i wysokim Mg2+ NMDG aCSF bezpośrednio po pokrojeniu dorosłej tkanki mózgowej był zarówno konieczny, jak i wystarczający do poprawy zachowania neuronów w szerokim zakresie regionów mózgu, typów komórek i wieku zwierząt3,5,6.
Warto zauważyć, że wcześniejsze wcielenia tego, co obecnie nazywa się metodą odzyskiwania ochronnego, można znaleźć w literaturze1,8,9,10,11,12,13, chociaż pełny potencjał zapisu wycinków mózgu dojrzałych i starzejących się zwierząt nie został rozpoznany ani zademonstrowany w tych wcześniejszych pracach. Ponadto wciąż pojawiają się niuanse proceduralne wspierające konkretne zastosowania eksperymentalne4,14,15,16. Zbiorowy dorobek tych licznych grup badawczych daje duże zaufanie do solidności ochronnej metody odzyskiwania w celu poprawy konserwacji tkanek. Ochronna metoda odzyskiwania NMDG została obecnie szeroko przyjęta i wdrożona w licznych opublikowanych badaniach naukowych z wykorzystaniem preparatów z wycinków mózgu dorosłych zwierząt. Te badania nad ostrym cięciem obejmują korę nową3,17,18, hipokamp<sup class="xref">15,19,20,21, striatal22,23,24, śródmózgowie25,26,27,28,29, and hindbrain30,31,32,33,34 regiony oraz różne typy neuroprzekaźników i neuromodulatorów, w tym glutaminergiczne4,30, GABAergic18,20,31,35,36, dopaminergic24,29,37,38, cholinergic14,37, 38,39, noradrenergic40, and serotonergic27,28 neurotransmisja. Metoda ta doskonale nadaje się również do optogenetycznej kontroli aktywności neuronalnej w wycinkach pochodzących od zwierząt transgenicznych3,39 lub po iniekcjach wirusowych in vivo17,27,28,40,41,42,43, a także funkcjonalne obrazowanie aktywności neuronalnej Ca2+2,44,45,46. Zgłoszono analizy zarówno plastyczności krótkoterminowej4,47,48 jak i różnych form plastyczności długoterminowej16,35,48. W niedawnym badaniu zastosowano metodę odzyskiwania ochronnego NMDG, aby ułatwić rozległe i systematyczne sondowanie połączeń synaptycznych w korze wzrokowej w dojrzałych wycinkach mózgu dorosłych myszy przy użyciu konfiguracji nagrywania oktopatch49 — potężna demonstracja użyteczności i solidności tej metody. Ochronna metoda odzyskiwania została nawet z powodzeniem zastosowana w wcześniej nieprzewidzianych kontekstach eksperymentalnych, takich jak poprawa zachowania naczyń krwionośnych i perycytów w wycinkach mózgu dorosłych korowych50, zapis patch clamp z przeszczepionych populacji interneuronów w 1–1,5-letnich modelach myszy z chorobą Alzheimera20, oraz test transportu receptorów wycinków mózgu dla dorosłych51.
Poniższy protokół opisuje krok po kroku procedury wdrażania zoptymalizowanej metody odzyskiwania NMDG w celu przygotowania wycinków mózgu w celu poprawy żywotności ostrych wycinków mózgu. Omówiono zasady poprawy zachowania neuronów, a także wykazano wyraźne korzyści płynące z tej metodologii w złożonych eksperymentach z zapisem wieloneuronowych naszywek zarówno w wycinkach mózgu młodych dorosłych transgenicznych myszy, jak i dojrzałych dorosłych neurochirurgicznych wycinkach mózgu człowieka. Poniższy protokół został zatwierdzony dla myszy w wieku od 21 dni do ponad jednego roku, a także dla ludzkich próbek neurochirurgicznych pochodzących od dorosłych pacjentów.

<table><tbody><tr><td>Compresstome VF-200</td><td>Instrumenty precyzyjne</td><td>VF-200</td><td>Wibracyjna krajalnica do tkanek (zalecana)</td></tr><tr><td>N-metylo-D-glukamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004</td><td>składnik aCSF</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td>składnik aCSF</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td>składnik aCSF</td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy dwuwodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71505</td><td>aCSF składnik</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td>składnik aCSF</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td>składnik aCSF</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td>składnik CSF</td></tr><tr><td>Askorbinian sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4034</td><td>składnik</td></tr> <tr><td>aCSFTiomocznik</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8656</td><td>składnik CSF</td></tr><tr><td>pirogronian sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5280</td><td>składnik aCSF</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902</td><td>składnik CSF</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1880</td><td>składnik CSF</td></tr><tr><td>2,2,2-tribromoetanol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T48402</td><td>Składnik znieczulający 1</td></tr><tr><td>2-metylo-2-butanol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>240486</td><td>Komponent anestezjologiczny 2</td></tr><tr><td>Zakrzywione kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>11065-07</td><td>Narzędzia do preparowania mózgu</td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki preparacyjne (supercut)</td><td>Narzędzia do nauk ścisłych</td><td>14058-09</td><td>Narzędzia do preparowania mózgu</td></tr><tr><td>Duże, wytrzymałe nożyczki 7''</td><td>Narzędzia do nauki o dużej</td> wytrzymałości <td>14000-18</td><td>Narzędzia do preparowania mózgu</td></tr><tr><td>Metalowa szpatułka</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z511455-1PAK</td><td>Narzędzia do preparowania mózgu</td></tr><tr><td>Żyletki</td><td>VWR</td><td>89031-954</td><td>Narzędzia do preparowania mózgu</td></tr><tr><td>Brain Slice Keeper-4</td><td>Automate</td><td>Scientific S-BSK4</td><td>komora do przytrzymywania plasterków mózgu</td></tr> siatka <tr><td>nylonowa&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0198</td><td>Do budowy małych studzienek do odzysku plastrów</td></tr><tr><td>Zlewki ze szkła pyrexowego (250 ml)</td><td>VWR</td><td>89090-434</td><td>Do budowy małych komór do odzysku plastrów</td></tr><tr><td>Naczynie z tworzywa sztucznego 35 mm, okrągłe</td><td>VWR</td><td>100488-376</td><td>Do budowy małych studzienek</td></tr><tr><td>do odzysku plastrów Kamienie dyfuzora gazu (10 &mikro; m)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>59277</td><td>Do stałego karbonowania (drobne pęcherzyki)</td></tr> <tr><td>Agaroza Typ I-B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0576</td><td>Do zatapiania próbek mózgu Końcówki</td></tr><tr><td>do mikroładowarek</td><td>Eppendorf</td><td>22491229</td><td>Do napełniania elektrod zaciskowych</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>VWR</td><td>102092-312</td><td>Do wykonania niestandardowej platformy preparacyjnej</td></tr><tr><td>Kwas solny&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1758-100ML</td><td>Do regulacji pH podłoża</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221465-25G</td><td>Do regulacji pH podłoża</td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221473</td><td>Do regulacji pH mediów</td></tr><tr><td>Plastikowe pipety transferowe z podziałką 3 ml</td><td>VWR</td><td>89497-676</td><td>Do przenoszenia plastrów</td></tr><tr><td>Ceramiczne łopatki wtryskiwaczy z cyrkonu</td><td>Ostrza specjalistyczne</td><td>EF-INZ10</td><td>http://cadenceinc.com/</td></tr> <tr><td>KG-33 szkło borokrzemowe kapilara z żarnikiem</td><td>King Glass Company</td><td>niestandardowa wycena</td><td>ID: 0,87 mm, OD 1,50 mm</td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4261</td><td>Roztwór do pipet wewnętrznych</td></tr><tr><td>Fosfokreatyna disodowa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7936</td><td>Roztwór do pipet Intern</td></tr><tr><td>Glukonian</td><td>potasu Sigma Aldrich</td><td>G4500-100G</td><td>Roztwór do pipet Intern</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td>Roztwór do pipet wewnętrznych</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9187</td><td>Roztwór do pipet wewnętrznych</td></tr><tr><td>Na2-GTP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51120</td><td>Roztwór do pipet wewnętrznych</td></tr><tr><td>sacharoza</td><td>Sigma</td><td>Aldrich S0389</td><td>Roztwór do pipet wewnętrznych</td></tr><tr><td>Podgrzewana kąpiel wodna (2,5 l)</td><td>VWR</td><td>13491-060</td> Różne Bibuła <td>filtracyjna</td></tr><tr><td> </td><td>krążki VWR</td><td>28456-022</td><td>Różne</td></tr><tr><td>Klej cyjanoakrylowy</td><td>Amazon</td><td>B000BQRBO6</td><td>Różne</td></tr><tr><td>Szklana szalka Petriego</td><td>VWR</td><td>89000-326</td><td>Różne</td></tr><tr><td>10X Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493</td><td>Różne</td></tr><tr><td>Strzykawki 30 ml</td><td>VWR</td><td>BD302832</td><td>Różne</td></tr><tr><td>Strzykawki 1 ml</td><td>VWR</td><td>BD-309628</td><td>Różne</td></tr><tr><td>25 igieł o rozmiarze 5/8</td><td>VWR</td><td>89219-292</td><td></td></tr><tr><td>Różne Termomiksery (z blokiem probówek 1,5 ml)</td><td>VWR</td><td>89232-908</td><td>Do utrzymywania stopionej agarozy&nbsp;</td></tr></tbody></table>

przygotowanie ostrych wycinków mózgu przy użyciu zoptymalizowanej metody odzysku ochronnego n-metylo-d-glukaminy

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Ten protokół jest praktycznym przewodnikiem po ochronnej metodzie odzyskiwania N-metylo-D-glukaminy (NMDG) podczas przygotowywania wycinków mózgu. Liczne ostatnie badania potwierdziły przydatność tej metody w zwiększaniu zachowania neuronów i ogólnej żywotności wycinków mózgu. Wdrożenie tej techniki przez wczesnych użytkowników ułatwiło szczegółowe badania funkcji mózgu przy użyciu różnorodnych zastosowań eksperymentalnych i obejmujących szeroki zakres wieku zwierząt, regionów mózgu i typów komórek. Przedstawiono kroki w celu przeprowadzenia techniki ochronnego wycinka mózgu z wykorzystaniem zoptymalizowanego preparatu pożywki ze sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego NMDG (aCSF) oraz ulepszonej procedury w celu niezawodnego uzyskania zdrowych wycinków mózgu do elektrofizjologii klamry łatkowej. Dzięki temu zaktualizowanemu podejściu obserwuje się znaczną poprawę szybkości i niezawodności tworzenia gigaomowych uszczelnień podczas ukierunkowanych eksperymentów z nagrywaniem patch clamp, przy jednoczesnym zachowaniu doskonałej ochrony neuronów, ułatwiając w ten sposób trudne zastosowania eksperymentalne. Przedstawiono reprezentatywne wyniki eksperymentów z zapisem wieloneuronowych łatek w celu zbadania połączeń synaptycznych w wycinkach mózgu kory nowej przygotowanych z młodych dorosłych myszy transgenicznych i dojrzałych dorosłych ludzkich próbek neurochirurgicznych. Co więcej, zoptymalizowana metoda odzyskiwania ochronnego NMDG polegająca na krojeniu mózgu jest kompatybilna zarówno z młodymi, jak i dorosłymi zwierzętami, rozwiązując w ten sposób ograniczenie oryginalnej metodologii. Podsumowując, pojedynczy preparat podłoża i procedura krojenia mózgu mogą być wdrożone u różnych gatunków i w różnym wieku, aby osiągnąć doskonałą żywotność i zachowanie tkanek.

Ten protokół demonstruje implementację zoptymalizowanej metody ochronnego odzyskiwania N-metylo-D-glukaminy (NMDG) do przygotowania wycinków mózgu. Pojedynczy preparat podłoża jest używany do niezawodnego uzyskiwania zdrowych wycinków mózgu od zwierząt w każdym wieku i do różnych zastosowań eksperymentalnych.

Przygotowanie ostrych wycinków mózgu przy użyciu zoptymalizowanej metody odzysku ochronnego N-metylo-D-glukaminy

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie zdrowych wycinków mózgu z dojrzałych dorosłych zwierząt, które nadają się do eksperymentów elektrofizjologicznych z zaciskiem łatowym. Tak więc ta zoptymalizowana metoda odzyskiwania ochronnego NMDG do przygotowania wycinków mózgu pozwala naukowcom badać wewnętrzne i synaptyczne właściwości typów komórek mózgowych w wielu różnych regionach mózgu i u zwierząt w praktycznie każdym wieku. Tak więc główną zaletą tej konkretnej techniki jest to, że pozwala ona na przygotowanie wycinków mózgu, które mają wyższy stopień zachowania neuronów w porównaniu z wcześniejszymi metodologiami.A także, że te wycinki mózgu są bardziej odpowiednie do nagrywania z zaciskiem krosowym. Metoda ta została zoptymalizowana pod kątem tkanki mózgowej dorosłej myszy. Może być stosowany do wielu innych gatunków, w tym neurochirurgicznie wyciętej ludzkiej tkanki mózgowej.Aby rozpocząć tę procedurę, ustaw stację krojenia z krajalnicą do tkanek i narzędziami chirurgicznymi. Przymocuj cyrkonowo-ceramiczne ostrze wtryskiwacza do ramienia ostrza za pomocą szybkiego kleju samoprzylepnego. Następnie włóż uchwyt na próbkę i wyrównaj krawędź natarcia ostrza z obręczą uchwytu próbki.Pozostawiając niewielką szczelinę, aby ostrze nie ocierało się o metal. Napełnij zlewkę o pojemności 250 mililitrów 200 mililitrami NMDG HEPES aCSF. I wstępnie schładzaj go na lodzie ze stałą karbonizacją przez ponad 10 minut.Następnie skonfiguruj początkową komorę odzyskiwania wycinków mózgu, wypełniając ją 150 mililitrami NMDG HEPES aCSF. I umieść komorę w łaźni wodnej o temperaturze od 32 do 34 stopni Celsjusza. Aby ustawić komorę do przechowywania wycinków mózgu, napełnij zbiornik 450 mililitrami HEPES aCSF i pozwól mu ogrzać się do temperatury pokojowej przy stałym karbonizacji do momentu użycia.Następnie przygotuj stopioną agarozę do zatopienia w tkance, wycinając blok 2% agarozy z wcześniej przygotowanego naczynia za pomocą otwartego końca 50-mililitrowej stożkowej fiolki. Luźno zakręć stożkową fiolkę, a następnie podgrzewaj ją w kuchence mikrofalowej przez 10 do 30 sekund, aż agaroza zacznie się topić. Nie przegrzewaj.Wlej stopioną agarozę do 1,5 mililitrowych probówek. Utrzymuj agarozę w stanie stopionym za pomocą termomiksera ustawionego na 42 stopnie Celsjusza z energicznym potrząsaniem. I ostrożnie upewnij się, że stopiona agaroza nie zestala się przedwcześnie.W tym czasie wstępnie schłodzić dodatkowy blok chłodzący krajalnicy na lodzie. W tej procedurze wykonaj nacięcie na skórze głowy, aby odsłonić jarmułkę. Następnie użyj cienkich, super ciętych nożyczek, aby odciąć skórę nad jarmułką.I wykonaj małe nacięcia boczne po obu stronach ogonowej brzusznej podstawy czaszki. Wykonaj dodatkowe płytkie nacięcia, zaczynając od ogonowej grzbietowej części czaszki, przesuwając się w kierunku rostralnym w górę grzbietowej linii środkowej. Uważaj, aby nie uszkodzić leżącego pod spodem mózgu.Następnie wykonaj końcowe cięcie w kształcie litery T prostopadle do linii środkowej na poziomie opuszki węchowej. Następnie użyj kleszczy z okrągłą końcówką, aby chwycić czaszkę, zaczynając od przyśrodkowego aspektu rostralnego i oderwać w kierunku bocznym ogona po jednej stronie. Powtórz tę procedurę, aby druga strona się otworzyła.I usuń grzbietowe połówki czapki czaszki, aby odsłonić mózg. Delikatnie zgarnij nienaruszony mózg do zlewki z wstępnie schłodzonym NMDG HEPES aCSF. I pozwól mózgowi równomiernie ostygnąć przez około minutę.Teraz użyj dużej szpatułki, aby przenieść mózg ze zlewki na szalkę Petriego pokrytą bibułą filtracyjną. Przytnij i zamontuj mózg zgodnie z preferowanym kątem krojenia i pożądanym obszarem mózgu zainteresowania. Pracuj szybko, aby uniknąć długotrwałego niedoboru tlenu podczas przenoszenia.Następnie przymocuj blok mózgu do uchwytu na próbkę za pomocą kleju klejącego. Cofnij wewnętrzną część uchwytu próbki, aby całkowicie wycofać blok mózgu do środka. Następnie wlej stopioną agarozę bezpośrednio do uchwytu, aż blok mózgu zostanie całkowicie pokryty agarozą.Następnie zacisnąć wstępnie schłodzony dodatkowy blok chłodzący wokół uchwytu próbki przez dziesięć sekund, aż agaroza zastygnie. Włóż uchwyt próbki do pojemnika w krajalnicy i sprawdź prawidłowe wyrównanie. Następnie napełnij zbiornik pozostałym wstępnie schłodzonym natlenionym NMDG HEPES aCSF ze zlewki o pojemności 250 mililitrów i umieść kamień bąbelkowy w zbiorniku na czas krojenia, aby zapewnić odpowiednie natlenienie.Następnie wyreguluj mikrometr, aby rozpocząć przesuwanie próbki mózgu zatopionej w agarozie. Uruchom krajalnicę i empirycznie dostosuj prędkość posuwu i częstotliwość oscylacji do żądanego poziomu. Kontynuuj posuwanie się naprzód i krojenie tkanki w odstępach co 300 mikrometrów, aż obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania zostanie w pełni przecięty.Całkowity czas procedury krojenia powinien być krótszy niż 15 minut. Do początkowego odzyskiwania NMDG. Po zakończeniu procedury dzielenia zbierz wszystkie plastry za pomocą odciętej plastikowej pipety pastwiskowej i przenieś je do komory regeneracyjnej o temperaturze 34 stopni Celsjusza wypełnionej 150 mililitrami NMDG HEPES aCSF.Czas etapu regeneracji ostrego wycinka mózgu jest bardzo ważny, aby móc osiągnąć równowagę między zachowaniem morfologicznym a funkcjonalnym przywróceniem właściwości elektrofizjologicznych każdego neuronu. Po ustaleniu optymalnego harmonogramu skoków sodu, w zależności od wieku myszy, należy przeprowadzić procedurę skokowego sodu Kroku Y, dodając wskazane objętości roztworu sodu we wskazanym czasie. Dodaj roztwór sodowy bezpośrednio do komina bełkotki początkowej komory odzysku, aby ułatwić szybkie mieszanie.Harmonogram skoków sodu, który został dostarczony dla wielu różnych przedziałów wiekowych, jest naprawdę dobrym punktem wyjścia. Ale powinien być zoptymalizowany i wykorzystany do własnego, specyficznego projektu eksperymentalnego. Następnie przenieś wszystkie plastry do komory długoterminowego przetrzymywania HEPES aCSF utrzymywanej w temperaturze pokojowej.Pozwól plastrom zregenerować się przez kolejną godzinę w komorze trzymającej HEPES przed eksperymentami z zapisem zacisku krosowego. Pokazano tutaj reprezentatywne obrazy IR DIC, które zostały uzyskane z różnych obszarów mózgu i ostrych wycinków od trzymiesięcznej myszy w celu oceny morfologicznego zachowania neuronów. Przedstawione tutaj wyniki pochodzą z zastosowania kontrolnej metody cięcia ochronnego NMDG bez etapu odzyskiwania ochronnego.Natomiast wyniki te pochodzą ze zoptymalizowanej metody odzyskiwania ochronnego NMDG. Ogólnie rzecz biorąc, poprawę zachowania neuronów obserwuje się dzięki zoptymalizowanej metodzie odzyskiwania ochronnego NMDG. Zoptymalizowaną metodę odzyskiwania ochronnego NMDG z procedurą stopniowego zwiększania sodu porównano z oryginalną metodą odzyskiwania ochronnego NMDG.Średni czas tworzenia uszczelnienia GigaOhm i rejestracji zacisku krosowego został radykalnie i znacznie skrócony, gdy zastosowano procedurę stopniowego zwiększania sodu wraz z etapem odzyskiwania ochronnego NMDG. Lepsze zachowanie neuronów osiągnięte dzięki tej metodzie wycinków mózgu ułatwia trudne zastosowania eksperymentalne, w tym między innymi elektrofizjologię z wieloelektrodowymi zaciskami plastrowymi w celu zbadania lokalnych połączeń synaptycznych. Jak wykazano tutaj, przy użyciu wycinków mózgu ex vevo ex vevo z kory nowej pochodzących z neurochirurgii.Oglądając ten film, naukowcy powinni dobrze zrozumieć, jak wdrożyć naszą zoptymalizowaną metodę odzyskiwania NMDG Protective Recovery, w tym nową procedurę skoku sodu, którą opisaliśmy, w celu przygotowania wycinków mózgu, które są odpowiednie do nagrań z zaciskiem łatowym. Tak więc po opanowaniu tego protokołu powinno być możliwe wykonanie procedury wycinka mózgu w czasie krótszym niż jedna godzina każdego dnia. Powinien dać wysokiej jakości powtarzalne wycinki mózgu i będzie działał dla zwierząt w praktycznie każdym wieku.Tak więc ta procedura, ta metoda może pomóc w przygotowaniu wycinków mózgu, które są odpowiednie do odpowiedzi na pytania dotyczące funkcji mózgu przy użyciu technik takich jak elektrofizjologia, obrazowanie optyczne na żywo i optogenetyka, testy transportu receptorów i inne rodzaje testów funkcjonalnych do badania funkcji typów komórek mózgowych. Technika ta jest również przydatna, ponieważ pomoże naukowcom w funkcjonalnym badaniu różnych obszarów mózgu, w tym obszarów mózgu, które tradycyjnie nie są podatne na rejestrację za pomocą kropek od dorosłych zwierząt w wycinkach mózgu.

preparation-acute-brain-slices-using-an-optimized-n-methyl-d

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film opisuje protokół uzyskiwania wycinków mózgu za pomocą metody odzyskiwania ochronnej opartej na N-metylo-D-glukaminie (NMDG). Wypreparowany mózg jest inkubowany w aCSF z NMDG i HEPES w celu zminimalizowania śmierci i uszkodzenia komórek neuronalnych podczas sekcji. Sekcja może zostać zregenerowana w aCSF w celu przywrócenia aktywności...

Przygotowanie wycinków mózgu przy użyciu ochronnej metody odzyskiwania opartej na NMDG

Opisujemy dwie metody wizualizacji i kwantyfikacji arboryzacji dendrytycznej w hipokampie modeli mysich: obrazowanie w czasie rzeczywistym i rozszerzoną głębię ostrości. Podczas gdy pierwsza metoda pozwala na zaawansowane śledzenie topograficzne i ilościowe określenie zakresu rozgałęzień, druga pozwala na szybką wizualizację drzewa dendrytycznego.

Ocena arboryzacji dendrytycznej w zakręcie zębatym okolicy hipokampa u myszy

Ten protokół opisuje stabilizację poziomu tlenu w małej objętości buforu z recyklingu oraz metodologiczne aspekty rejestrowania plastyczności synaptycznej zależnej od aktywności w zanurzonych ostrych wycinkach hipokampa.

Rejestrowanie plastyczności synaptycznej w ostrych wycinkach hipokampa utrzymywanych w systemie komór do recyklingu, perfuzji i zanurzenia o małej objętości

Mikroglej, komórki odpornościowe rezydujące w mózgu, szybko reagują zmianami morfologicznymi na modyfikacje swojego środowiska. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wykorzystać mikroskopię dwufotonową do badania przyciągania procesów mikrogleju w kierunku serotoniny lub ATP w ostrych wycinkach mózgu myszy.

Dwufotonowe obrazowanie przyciągania procesów mikroglejowych do ATP lub serotoniny w ostrych wycinkach mózgu

To jest protokół do przygotowania ostrych plastrów z dorosłych i starzejących się hipokampów myszy, który wykorzystuje transcardialną perfuzję i cięcie plastrów za pomocą lodowatego NMDG-aCSF w celu zmniejszenia niedotlenienia tkanki. Uzyskane w ten sposób plastry pozostają zdrowe przez wiele godzin i nadają się do długotrwałych nagrań typu patch-clamp i nagrań terenowych.

Minimalizacja niedotlenienia w plastrach hipokampa od dorosłych i starzejących się myszy

Ten artykuł ma na celu opisanie systematycznego protokołu uzyskiwania poziomych wycinków mózgu hipokampa u myszy. Celem tej metodologii jest zachowanie integralności szlaków włókien hipokampa, takich jak ścieżka perforantu i szlak włókien omszałych, w celu oceny procesów neurologicznych związanych z zakrętem zębatym.

Poziome wycinki hipokampa mózgu myszy

Przedstawiamy protokół przygotowania ostrych plastrów z grzbietowo-pośredniego hipokampa myszy. Porównujemy ten preparat poprzeczny z cięciem koronalnym pod względem jakości zapisów i zachowania cech morfologicznych zarejestrowanych neuronów.

Przygotowanie ostrych wycinków z grzbietowego hipokampa do zapisu całych komórek i rekonstrukcji neuronów w zakręcie zębatym dorosłych myszy

Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa (SBEM) jest stosowana do obrazowania i analizy kolców dendrytycznych w mysim hipokampie.

Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa typu block-face (SBEM) do badania kolców dendrytycznych

Tutaj pokazano, jak model urazu głowy w stanie czuwania może być wykorzystany do zbadania wpływu powtarzających się łagodnych urazów mózgu (r-mTBI) na plastyczność synaptyczną w hipokampie. Model replikuje ważne cechy r-mTBI u pacjentów i jest stosowany w połączeniu z elektrofizjologią in vitro.

Ocena zmian plastyczności synaptycznej przy użyciu modelu łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu w stanie czuwania

To badanie przedstawia protokół tworzenia wysoce powtarzalnego zwierzęcego modelu transformacji krwotocznej (HT) przy użyciu okluzji/reperfuzji tętnicy środkowej mózgu (MCAO/R) u myszy C57BL/6 z ostrą hiperglikemią.

Mysi model transformacji krwotocznej wywołanej ostrą hiperglikemią w połączeniu z przejściowym ogniskowym niedokrwieniem

Poznaj zoptymalizowaną metodę ochronnego odzysku NMDG do przygotowania ostrych wycinków mózgu z dorosłych zwierząt. Technika zapewnia wysoką zachowawczość neuronów dla badań elektrofizjologicznych metodą patch clamp.

Przygotowanie ostrych wycinków mózgu przy użyciu zoptymalizowanej metody odzysku ochronnego N-metylo-D-glukaminy

Przeglądaj więcej filmów