Name: Korelacyjna superrozdzielczość i mikroskopia elektronowa w celu ustalenia lokalizacji białek w siatkówce danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Poznaj metodę korelacyjnej superrozdzielczości i mikroskopii elektronowej do lokalizacji białek w siatkówce Danio rerio. Technika ta umożliwia precyzyjne badanie rozwoju siatkówki i funkcji komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie ION i RGB: Szwajcarska Narodowa Fundacja Nauki Ambizione-SCORE przyznaje PZ00P3 142404/1 i PZ00P3 163979.

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych i zostały zatwierdzone przez lokalne władze.
1. Przygotowanie ultracienkich przekrojów na płytkach krzemowych
<ol>
	<li>Utrwalanie próbki
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór utrwalający zawierający 0,1% aldehydu glutarowego, 4% formaldehydu w 0,1 M buforze kakodylowym. 
		UWAGA: UWAGA! Należy zachować ostrożność podczas pracy z aldehydem glutarowym, formaldehydem i buforem kakodylowym, nosić odpowiednie środki ochrony osobistej i pracować pod wyciągiem.</li>
		<li>Poddaj eutanazji 5 dni po zapłodnieniu (5 dpf) larw danio pręgowanego trikainą (metanosulfonian 3-aminobenzoesanu etylu, 0,4% w/v w PBS (sól fizjologiczna buforu fosforanowego, pH 7)) zgodnie z wcześniejszym opisem15.</li>
		<li>Utrwalić larwy przez zanurzenie we wstępnie schłodzonym roztworze utrwalającym na lodzie. Zdjąć głowę i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie kołysząc.</li>
		<li>Wypreparuj oczy, przycinając tkankę wokół oka za pomocą cienkich kleszczy i skalpela do mikrodysekcji (pod lornetką) w schłodzonym roztworze utrwalającym na 1% płytce pokrytej agarozą. Przenieś oczy do tubki ze świeżym, wstępnie schłodzonym utrwalaczem.</li>
		<li>Płukać dwukrotnie w PBS (bufor fosforanowy, sól fizjologiczna, pH 7,4) przez 5 minut każde płukanie w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Infiltracja i montaż żelatyny
	<ol>
		<li>Rozgrzej 15 ml lokalnej marki spożywczej żelatyny 12% w/v w PB (bufor fosforanowy, 0,1 M pH 7,4) w temperaturze 40 °C. Usuń PBS i dodaj roztwór żelatyny do probówek zawierających oczy. Delikatnie postukać w probówkę, aby upewnić się, że żelatyna infiltruje próbkę i inkubować przez 10-30 minut w temperaturze 40 °C w termobloku z delikatnym wstrząsem lub w łaźni wodnej.</li>
		<li>Płaskie formy do zatapiania o wymiarach 12 mm x 5 mm x 3 mm z silikonu lub polietylenu napełnić ciepłą żelatyną w łaźni wodnej o temperaturze 40 °C. Dodać dwa oczka do formy za pomocą pipety, wyrównać je odpowiednio pod lornetką za pomocą igły do wypreparowania i pozostawić żelatynę do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 1 minutę i stwardnieć w temperaturze 4 °C przez 20 minut.</li>
		<li>Ponownie przytnij blok żelatyny pod lornetką, aby dopasować jedno oko na blok za pomocą żyletki.</li>
		<li>Przenieść oczka zatopione w żelatynie do 2,3 M sacharozy w PB na lodzie. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Wymienić na nowy 2,3 M roztwór sacharozy i przechowywać w temperaturze 4 °C lub -20 °C; po tym etapie próbki są gotowe do podziału lub mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni lub miesięcy.</li>
		<li>Ponownie przytnij blok żelatyny do wielkości prawie oka przed przeniesieniem do krioszpilki. Zamrozić w ciekłym azocie i przenieść do krio-ultramikrotomu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kriosekcja
	<ol>
		<li>Ciąć odcinki o grubości 110 nm w temperaturze -120 °C za pomocą noża diamentowego w krio-ultramikrotomie.</li>
		<li>Wybierz sekcje z przewodową pętlą zawierającą kroplę 2% metylocelulozy (w wodzie) i 2,3 M roztworu sacharozy (1:1). Przenieś sekcje na płytkę krzemową o wymiarach 7 mm x 7 mm. Przechowywać skrawki w temperaturze 4 °C do czasu dalszej obróbki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Znakowanie immunologiczne
<ol>
	<li>Myć wafle PBS w temperaturze 0 °C przez 20 minut na czterech kroplach, kładąc wafle do góry nogami na kroplach. Prać w PBS 2x 2 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować 3 razy w 0,15% glicynie w PBS, po 1 minutę każdy. Prać 3x po 1 min/pranie z PBS. Wstępną inkubację z PBG (PBS z 0,5% albuminą BSA w surowicy bydlęcej i 0,2% żelatyny typu B) przez 5 minut.</li>
	<li>Inkubować z króliczym anty-Tom20 (patrz tabela materiałów) w PBG (4 μg/ml) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Prać 6x po 1 min/pranie w PBG. Wstępną inkubację z PBG przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Inkubację z anty-króliczą Alexa 647 F(ab')2 (patrz Tabela Materiałów) w PBG (7,5 μg/ml) przez 30 minut.</li>
	<li>Prać 6x po 1 min/pranie w PBG. Prać 3x 2 min w PBS. Inkubować z DAPI (4 μg/ml) w PBS przez 10 s. Prać 2x 2 min w PBS.</li>
</ol>
3. Mikroskopia superrozdzielcza
<ol>
	<li>Krótko inkubować płytkę (10 s), umieszczając ją na kropli roztworu glicerolu w stosunku 1:1 (80%) i buforze obrazowania zawierającym system oczyszczania tlenu (200 mM bufor fosforanowy zawierający 10% glukozy, 0,5 mg/ml oksydazy glukozowej, 40 μg/ml katalazy, 15 mM chlorowodorek beta-merkaptoetyloaminy (MEA HCL), pH 8,0).</li>
	<li>Przenieść płytki (sekcja skierowana w dół) na szklane dno (grubość 170 ± 5 μm) na szalkę Petriego na świeżą kroplę mieszaniny glicerolu (80%) i buforu do obrazowania w stosunku 1:1 (jak w kroku 3.1).</li>
	<li>Usuń ze wszystkich stron pipetą większość płynu znajdującego się pod wafelkiem. Użyj silikonowych pasków, aby przymocować wafel do dna szalki Petriego. 
	UWAGA: Paski silikonowe wykonane są z dwuskładnikowego kleju silikonowego (3 mm x 12 mm).</li>
	<li>Wycinki obrazu na mikroskopie odwróconym przy użyciu wysokiej apertury numerycznej (np. 160X / NA 1,43; patrz tabela materiałów), immersji olejkiem, super rozdzielczości, dedykowanego obiektywu. Przed obrazowaniem należy pozwolić, aby próbka zrównoważyła się z temperaturą mikroskopu, aby zminimalizować/zmniejszyć dryf poprzeczny i osiowy.</li>
	<li>Wyśrodkuj obszar zainteresowania i uzyskaj pierwsze szerokokątne obrazy referencyjne epifluorescencji. Zmień na tryb pracy w super rozdzielczości. Dostosuj czas naświetlania aparatu na 15 ms i ustaw wzmocnienie zwielokrotnienia elektronów (EM) na maksimum 300.</li>
	<li>Oświetlić próbkę laserem o fali ciągłej 642 nm przy maksymalnej mocy lasera (odpowiadającej ~2,8 kW/cm2) w trybie epifluorescencji. Gdy tylko pojedyncze cząsteczki mrugnięcia zostaną dobrze oddzielone w każdej klatce, tak aby prawdopodobieństwo nałożenia się poszczególnych sygnałów było niskie, ustaw moc lasera na ~0,7 kW/cm2. Zapisz surowy obraz w trybie epifluorescencji, rejestrując co najmniej 30 000 klatek. 
	UWAGA: Wszystkie te parametry mogą się różnić w zależności od różnych próbek i gęstości etykietowania.</li>
	<li>Na podstawie surowych danych wygeneruj listę zdarzeń rekonstrukcji (lokalizacje każdej pojedynczej cząsteczki na surowym obrazie) przy użyciu progu detekcji wynoszącego 30 fotonów (należy go dostosować zgodnie z próbką), klikając "Oceń" w "analizie serii t" w sekcji "Narzędzia".</li>
	<li>Wizualizuj obraz w super rozdzielczości za pomocą Gaussian fitting16, stosując rozmiar piksela renderowania 4 nm, klikając "Utwórz obraz" w "panelu przetwarzania listy zdarzeń" w sekcji "Narzędzia". 
	UWAGA: Do wygenerowania obrazu o wysokiej rozdzielczości wykorzystano zintegrowane narzędzia programowe systemu wykorzystane w tym badaniu. Jednak opisane obrazowanie w super rozdzielczości można przeprowadzić w dowolnym innym systemie opartym na lokalizacji pojedynczej cząsteczki, a dane mogą być przetwarzane za pomocą narzędzi oprogramowania open source, takich jak thunderSTORM17.</li>
</ol>
4. Platynowe cienie
<ol>
	<li>Usuń silikonowe paski i dodaj kroplę PBS blisko krawędzi wafla, aby podnieść go z szalki Petriego. Umyj wafel 2x 2 minuty w PBS, a następnie utrwal go 0,1% aldehydem glutarowym w PBS przez 5 minut. Prać 2x po 2 min/pranie w PBS.</li>
	<li>Inkubować płytkę dwukrotnie przez 5 minut/inkubację w 1 kropli metylocelulozy 2 % w wodzie na lodzie. Włóż wafel do probówki wirówkowej i wiruj przy 14 100 x g przez 90 s. Zamontuj go na króćcu aluminiowym SEM z przewodzącym cementem węglowym.</li>
	<li>Dodać warstwę od 2 do 10 nm platyny/węgla na próbkę przez obrotowe cieniowanie pod kątem 8° przy użyciu urządzenia do odparowywania wiązką elektronów ustawienia: 1,55 kV, 55 mA, przy 0,3 nm/s i kącie 8°, poziom obrotu 4.</li>
</ol>
5. Skaningowa mikroskopia elektronowa
<ol>
	<li>Wycinki obrazu za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego pod napięciem 1,5 kV, odległości roboczej 2 mm oraz z detektorem elektronów wtórnych w soczewce.</li>
</ol>
6. Wyrównanie obrazów z mikroskopii świetlnej i elektronowej
<ol>
	<li>Otwórz oba typy obrazów za pomocą Fiji18, klikając "Plik|Otwórz". Dostosuj rozmiar płótna, klikając "Obraz| Dostosuj| Rozmiar płótna" i umieść oba obrazy w stosie, klikając "Obraz| Stosy| Obrazy do stosu". Zapisz stos jako typ pliku tiff.</li>
	<li>Na Fidżi otwórz nowy interfejs TrackEM219, klikając "File|new|TrackEM2 (nowy)". Zaimportuj stos z obydwoma obrazami, klikając prawym przyciskiem myszy czarne okno i wybierając "Importuj stos".</li>
	<li>Ręcznie dopasuj obraz mikroskopii świetlnej do obrazu mikroskopii elektronowej z punktami orientacyjnymi, klikając obraz prawym przyciskiem myszy i wybierając "Wyrównaj|Ręczne wyrównanie warstwy ze znakami orientacyjnymi".
	<ol>
		<li>Wybierz narzędzie do zaznaczania (strzałka), aby dodać punkty orientacyjne. Użyj kształtu jąder jako odniesienia, aby zaznaczyć te same krawędzie na obu obrazach (rysunek uzupełniający 1). Dodaj kilka punktów (należy wybrać minimum trzy punkty). Zastosuj wyrównanie do modelu afinicznego, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając "Zastosuj transformację| Model afiniczny".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmień przezroczystość warstwy (patrz rysunek uzupełniający 1), aby ocenić jakość wyrównania.</li>
</ol>

<ol><li>Hauser, M., Wojcik, M., Kim, D., Mahmoudi, M., Li, W., Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+Super-Resolution+Microscopy%3A+New+Dimensions+and+New+Opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Correlative Super-Resolution Microscopy: New Dimensions and New Opportunities.</a> Chem Rev. , (2017).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li>
<li>Fölling, J., Bossi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+nanoscopy+by+ground-state+depletion+and+single-molecule+return%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return.</a> Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).</li>
<li>Betzig, E., Patterson, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science (New York, N.Y.). 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Kopek, B. G., Shtengel, G., Grimm, J. B., Clayton, D. A., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+photoactivated+localization+and+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+one%22%5BJournal%5D)">Correlative photoactivated localization and scanning electron microscopy.</a> PLOS one. 8 (10), e77209(2013).</li>
<li>Paez-Segala, M. G., Sun, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation-resistant+photoactivatable+fluorescent+proteins+for+CLEM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM.</a> Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).</li>
<li>Narayan, K., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beams+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Focused ion beams in biology.</a> Nat Methods. 12 (11), 1021-1031 (2015).</li>
<li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemistry+on+ultrathin+frozen+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+J%22%5BJournal%5D)">Immunochemistry on ultrathin frozen sections.</a> Histochem J. 12 (4), 381-403 (1980).</li>
<li>Suleiman, H., Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+protein+architecture+of+the+kidney+glomerular+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Nanoscale protein architecture of the kidney glomerular basement membrane.</a> eLife. 2, e01149(2013).</li>
<li>Kopek, B. G., Shtengel, G., Xu, C. S., Clayton, D. A., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+3D+superresolution+fluorescence+and+electron+microscopy+reveal+the+relationship+of+mitochondrial+nucleoids+to+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Correlative 3D superresolution fluorescence and electron microscopy reveal the relationship of mitochondrial nucleoids to membranes.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 109 (16), 6136-6141 (2012).</li>
<li>Avanesov, A., Malicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+retina+in+the+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the retina in the zebrafish model.</a> Methods Cell Biol. 100, 153-204 (2010).</li>
<li>Bachmann-Gagescu, R., Phelps, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ciliopathy+gene+cc2d2a+controls+zebrafish+photoreceptor+outer+segment+development+through+a+role+in+Rab8-dependent+vesicle+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Gen%22%5BJournal%5D)">The ciliopathy gene cc2d2a controls zebrafish photoreceptor outer segment development through a role in Rab8-dependent vesicle trafficking.</a> Hum Mol Gen. 20 (20), 4041-4055 (2011).</li>
<li>Bachmann-Gagescu, R., Dona, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ciliopathy+Protein+CC2D2A+Associates+with+NINL+and+Functions+in+RAB8-MICAL3-Regulated+Vesicle+Trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Gen%22%5BJournal%5D)">The Ciliopathy Protein CC2D2A Associates with NINL and Functions in RAB8-MICAL3-Regulated Vesicle Trafficking.</a> PLOS Gen. 11 (10), e1005575(2015).</li>
<li>Mateos, J. M., Guhl, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+contrast+of+ultrathin+cryo-sections+for+correlative+super-resolution+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Topographic contrast of ultrathin cryo-sections for correlative super-resolution light and electron microscopy.</a> Sci Rep. 6, 34062(2016).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
<li>Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ThunderSTORM%3A+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Cardona, A., Saalfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+one%22%5BJournal%5D)">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLOS one. 7 (6), e38011(2012).</li>
<li>Wurm, C. A., Neumann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+distribution+of+mitochondrial+import+receptor+Tom20+is+adjusted+to+cellular+conditions+and+exhibits+an+inner-cellular+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nanoscale distribution of mitochondrial import receptor Tom20 is adjusted to cellular conditions and exhibits an inner-cellular gradient.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 108 (33), 13546-13551 (2011).</li>
<li>Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17947990">Cryosectioning and immunolabeling.</a> Nat Prot. 2 (10), 2480-2491 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metoda ta łączy superrozdzielczą lokalizację białek z informacjami kontekstowymi w celu określenia dokładnej pozycji białek w organelli. Pokazujemy tutaj zakończenie eksperymentu w celu wizualizacji ekspresji Tom20 w zewnętrznej błonie mitochondriów i jego związku z innymi organellami, takimi jak jądra lub zewnętrzne segmenty fotoreceptora w siatkówce larwy danio pręgowanego.
Kriosekcja tokuyasu wymaga pewnego treningu, aby uzyskać dobrze zachowane sekcje. Jest to jednak metoda stosowana w wielu laboratoriach z udokumentowanym sukcesem21. Przeniesienie przekrojów na płytkę krzemową jest bardzo proste i nie wymaga żadnych specjalnych rozważań. Zastosowanie glicerolu w buforze obrazowania jest bardzo krytycznym krokiem, aby uniknąć wysuszenia skrawków. W przypadku obrazowania o wysokiej rozdzielczości najlepsze wyniki uzyskuje się, gdy płytka znajduje się bardzo blisko szklanego dna szalki Petriego. Silikonowe paski pomagają utrzymać wafel w tej pozycji. Należy zachować szczególną ostrożność podczas usuwania pasków, aby uniknąć uszkodzenia sekcji.
Grubość kriosekcji, około 100 nm, cieńsza niż rozdzielczość optyczna w wymiarze Z, dodatkowo ułatwia dokładność tej metody korelacyjnej, ponieważ sygnał mikroskopii superrozdzielczej pochodzi tylko z tej cienkiej warstwy, a sygnał skaningowego mikroskopu elektronowego wyświetla topografię próbki. Metodę tę można również połączyć z obrazowaniem wielobarwnym. Należy jednak zwrócić szczególną uwagę na to, aby próbka mogła być obrazowana w tych samych warunkach (np. bufor obrazowania) i aby zapobiec przesłuchom.
Jednym z ograniczeń tej metody jest jej dwuwymiarowe podejście, ponieważ można zebrać tylko ograniczoną liczbę odcinków szeregowych (około 3 do 7 na płytkę). Tym samym projekty zajmujące się analizą wolumenu nie byłyby idealne. Jest to jednak metoda, którą można zastosować do wykrywania ekspresji białka w dowolnym typie tkanki poprzez proste cięcie próbki. Oferujemy metodę bez użycia klasycznych środków kontrastowych, takich jak octan uranylu czy cytrynian ołowiu. Kontrast dzięki cieniowaniu platynowym zapewnia bardzo pouczający kontrast topograficzny, ale w niektórych przypadkach membrany są trudne do rozwiązania. Może to stanowić problem dla projektów, które muszą na przykład określić ekspresję białek w małych pęcherzykach.
Nasz protokół, oparty na kriosekcjach Tokuyasu, wykorzystuje standardowy sprzęt do uzyskiwania wyników korelacyjnych z superrozdzielczych i skaningowych mikroskopów elektronowych. Zbiór sekcji poświęconych płytkom krzemowym i zastosowanie platyny do kontrastu to proste kroki zapewniające stabilność i odtwarzalność przygotowania próbki.

Metody określania subkomórkowej lokalizacji białek i ich związku z różnymi przedziałami komórki są niezbędnymi narzędziami do zrozumienia ich funkcji i możliwych interakcji. Mikroskopia superrozdzielcza w połączeniu z mikroskopią elektronową dostarcza takich informacji1. Mikroskopia zubożenia stanu podstawowego, po której następuje powrót pojedynczej cząsteczki (GSDIM) to technologia mikroskopii superrozdzielczej, kompatybilna z szeroką gamą organicznych i genetycznie kodowanych fluoroforów2 i osiąga rozdzielczość boczną do 20 nm3. Zastosowanie metod o wyższej rozdzielczości niż standardowa mikroskopia z ograniczoną dyfrakcją poprawia dokładność korelacji4,5,6. W celu osiągnięcia najlepszej korelacji ekspresji białka ze specyficznym przedziałem subkomórkowym i zmniejszenia objętości niepewności7 zaleca się użycie tego samego ultracienkiego przekroju do mikroskopii świetlnej i elektronowej. Wśród różnych metod sekcji, protokół kriosekcji Tokuyasu nie wymaga odwodnienia ani zatapiania żywicy, a ponadto zachowuje antygenowość wielu epitopów i zapewnia dobrą ultrastrukturę tkanek8. Kilka metod wykazało możliwość zastosowania tych sekcji w korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM)4,5,9,10.
Siatkówka danio pręgowanego jest cennym modelem do badania rozwoju wzrokowego i mechanizmów chorobowych u ludzi, biorąc pod uwagę jej wysoce zachowaną strukturę i funkcję u kręgowców. W szczególności fotoreceptory siatkówki wykazują taką samą architekturę jak fotoreceptory ssaków, z synapsą podstawną, wydłużonym jądrem wierzchołkowo-podstawnym, skupiskiem mitochondriów w bardziej wierzchołkowym segmencie wewnętrznym i zewnętrznym segmentem złożonym z krążków błony w najbardziej wierzchołkowej pozycji11. Lokalizacja białek w różnych przedziałach komórkowych jest zachowana między danio pręgowanym a człowiekiem, co pozwala na badanie biologicznej funkcji białek istotnych dla chorób u ludzi12,13.
Tutaj prezentujemy protokół przygotowania próbek siatkówki larw danio pręgowanego do rozwiązania lokalizacji mitochondrialnego białka błony zewnętrznej Tom20 za pomocą korelacyjnego światła superrozdzielczego i mikroskopii elektronowej. Metoda opiera się na pobraniu kriosekcji na płytkach krzemowych i uzyskaniu kontrastu na podstawie informacji topograficznych powstałych po nałożeniu cienkiej warstwy platyny. Te kroki są wyraźnymi ulepszeniami technicznymi pod względem łatwości użycia, odtwarzalności i czasu do ukończenia eksperymentów. Niedawno wykazaliśmy możliwość zastosowania tej metody do wykrywania porów jądrowych i białek mitochondrialnych w tkance myszy14.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#158127</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy EM Grade</td><td>EMS, USA</td><td>#16220</td><td></td></tr><tr><td>Kakodylat</td><td>Merck</td><td>#8.20670</td><td></td></tr><tr><td>Trikaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#886-86-2</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza, peqGOLD Universal</td><td>VWR International GmbH</td><td>35-1020</td><td></td></tr><tr><td>Płaskie formy</td> <td>do zatapianiaBEEM Flat</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lokalna marka spożywcza żelatyna</td><td>Dr.Oetker</td><td>Extra Gold</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Merck</td><td>#1.07687</td><td></td></tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>Sigma</td><td>#M-6385</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma</td><td>#G-7126</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna typu B</td><td>Sigma</td><td>#G-6650</td><td></td></tr><tr><td>Aplikacja</td> <td>BSA</td><td>#A6588.0050</td><td></td></tr><tr><td>Wafel krzemowy</td><td>Si-Mat Materiały silikonowe</td><td></td><td>Rodzaj: P / Bor; Orientacja < 111> WŁ.; Metoda wzrostu: CZ; Rezystywność:1-30 omów/cm; Powierzchnia: polerowana; Wycinany laserowo na 7 x7 mm</td></tr><tr><td>Cryo-pin</td><td>Baltic Preparation</td><td>#16701950</td><td></td></tr><tr><td>Pętla przewodowa "Perfect loop"</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paski silikonowe</td><td>Picodent</td><td>Twinsil 22</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#G8270</td><td></td></tr><tr><td>oksydaza glukozowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#G7141</td><td></td></tr><tr><td>katalaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>#C40</tr><tr><td>chlorowodorek beta-merkaptoetyloaminy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#M6500</td><td></td></tr><tr><td>anty-Tom20</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>#sc - 11415</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 AffiniPure F(ab')2 fragment osła anty królika IgG</td><td>Jackson Immuno-Research</td><td>#711-606-152</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ROCHE, Szwajcaria#</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol rozwiązanie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#49782</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego ze szklanym dnem</td><td>Ibidi, Niemcy</td><td>u-Dish 35mm, wysokie szklane dno, #81158</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiowy króciec SEM</td><td>Agar Scientific</td><td>#G301F</td><td></td></tr><tr><td>Przewodnik cementu węglowego Leit-C</td><td>Plano, Niemcy</td><td>AG3300</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy<</td><td>strong>Komentarze</td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diamond Knife (Cryo Immuno)</td><td>Diatome</td><td>DCIMM3520</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-ultramicrotome</td><td>Leica</td><td>Microsystems Leica EM FCS</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop szerokokątny-TIRF GSD Leica SR GSD 3D</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw 160x 1.43 TIRF</td><td>Leica Microsystems</td><td>11523048</td><td></td></tr><tr><td>SEM - Zeiss Supra 50 VP</td><td>Zeiss</td><td>Supra 50 VP</td><td></td></tr><tr><td>FIB-SEM - Zeiss Auriga 40</td><td>Zeiss</td><td>Auriga 40</td><td></td></tr></tbody></table>

korelacyjna superrozdzielczość i mikroskopia elektronowa w celu ustalenia lokalizacji białek w siatkówce danio pręgowanego

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Prezentujemy metodę badania lokalizacji białka subkomórkowego w siatkówce larw danio pręgowanego poprzez połączenie superrozdzielczej mikroskopii świetlnej i skaningowej mikroskopii elektronowej. Możliwości rozdzielczości granicznej subdyfrakcyjnej mikroskopów świetlnych o wysokiej rozdzielczości pozwalają na poprawę dokładności skorelowanych danych. Krótko mówiąc, kriosekcje o grubości 110 nanometrów są przenoszone na płytkę krzemową i po barwieniu immunofluorescencyjnym są obrazowane za pomocą mikroskopii świetlnej o wysokiej rozdzielczości. Następnie skrawki są konserwowane w metylocelulozie i platynie w cieniu przed obrazowaniem w skaningowym mikroskopie elektronowym (SEM). Obrazy z tych dwóch modalności mikroskopowych można łatwo łączyć za pomocą punktów orientacyjnych tkanek z oprogramowaniem open source. Tutaj opisujemy metodę dostosowaną do siatkówki larwy danio pręgowanego. Jednak metoda ta ma również zastosowanie do innych typów tkanek i organizmów. Wykazujemy, że informacja komplementarna uzyskana w wyniku tej korelacji jest w stanie rozwiązać ekspresję białek mitochondrialnych w odniesieniu do błon i grzebień mitochondriów, a także do innych przedziałów komórki.

Ekspresję białka Tom20, podjednostki kompleksu translokazy zewnętrznej błony mitochondrialnej20, w cienkich przekrojach siatkówki larw zebrafish określono za pomocą mikroskopii świetlnej o wysokiej rozdzielczości (Rysunek 1), a uzyskane informacje uzupełniono sygnałem topograficznym otrzymanym w drodze skaningowej mikroskopii elektronowej po napylaniu platyną tych samych przekrojów. Te dane korelacją potwierdzają lokalizację białka w powiązaniu z konkretnym przedziałem, jakim jest zewnętrzna błona mitochondrialna, a ponadto dostarczają informacji o relacji tego białka z innymi organellami komórkowymi.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56113/56113fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: CLEM siatkówki danio pręgowanego. A. Obraz szerokopolowy przy niskim powiększeniu przekroju siatkówki danio pręgowanego w 5 dpf, jądra barwione DAPI (cyjan). B. Skaningowa mikroskopia elektronowa tego samego obszaru. C. Obraz szerokopolowy przy większym powiększeniu fragmentu z B. Jądra barwione DAPI (cyjan) oraz barwienie mitochondrialne Tom20 widoczne na czerwono. D. Obraz szerokopolowy tego samego przekroju przy większym powiększeniu. Wzorzec ekspresji Tom20 znajduje się w skupiskach mitochondriów. E. Ekspresja Tom20 (czerwone kropki) wykryta za pomocą mikroskopii GSDIM. Jądra barwione DAPI (cyjan). F. Ten sam przekrój co w E, łączący korelacyjną superrozdzielczość i skaningową mikroskopię elektronową. Barwienie Tom20 (czerwone kropki) widoczne w skupisku mitochondriów (M) na zewnętrznych błonach mitochondriów. Sygnał fluorescencyjny DAPI w jądrach (N) odpowiada topografii obrazu SEM. G. Obraz przy dużym powiększeniu fragmentu z F. Obraz z skaningowej mikroskopii elektronowej zapewnia kontekst dla obrazu GSDIM (czerwone kropki). Grzebienie mitochondrialne są wyraźnie widoczne, a barwienie Tom20 zlokalizowane jest na zewnętrznych błonach mitochondriów. Błony segmentu zewnętrznego fotoreceptorów (OS) są wyraźnie rozdzielone. Rozmiar piksela obrazu 5 nm. Paski skali: A, B i C: 10 µm; D: 2 µm; E i F: 1 µm oraz G: 0.2 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56113/56113fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Rysunek uzupełniający 1: Dopasowanie obrazów z mikroskopii świetlnej i elektronowej. A. Zrzut ekranu z interfejsu TrackEM2 z obrazem SEM i ponumerowanymi punktami orientacyjnymi (żółtymi) wzdłuż różnych jąder komórkowych. B. Zrzut ekranu z interfejsu TrackEM2 z obrazem fluorescencyjnym i ponumerowanymi punktami orientacyjnymi (żółtymi) wzdłuż różnych jąder barwionych DAPI. Do zmiany przezroczystości warstw można użyć suwaków w lewej górnej części menu. Pasek skali: 1 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56113/Supplementary_Figure_1.tif">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten protokół opisuje niezbędne kroki do uzyskania wyników lokalizacji białek subkomórkowych na siatkówce danio pręgowanego poprzez korelację obrazów z superrozdzielczej mikroskopii świetlnej i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Korelacyjna superrozdzielczość i mikroskopia elektronowa w celu ustalenia lokalizacji białek w siatkówce danio pręgowanego

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Ogólnym celem tej metody mikroskopowej jest precyzyjna lokalizacja ekspresji białek w odniesieniu do różnych organelli subkomórkowych w siatkówce larwy danio pręgowanego poprzez korelację obrazów z mikroskopii superrozdzielczej i skaningowej mikroskopii elektronowej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu rozwoju siatkówki i szlaków komórkowych, takie jak badanie błędnej lokalizacji białek u mutantów. Główną zaletą tej techniki jest połączenie superrozdzielczości ze skaningową mikroskopią elektronową w celu uzyskania wysoce dokładnych danych dotyczących lokalizacji białek w kontekście strukturalnym próbki.Zbieranie przekrojów metodą Tokuyasu na waflach silikonowych znacznie ułatwia manipulację próbkami, a zastosowanie cieniowania platyną w celu zwiększenia kontrastu zapewnia dobrą topografię preparatu. Dzięki temu metoda ta może dostarczyć cennych informacji w badaniach siatkówki larw zebrafish. Jedną z jej głównych zalet jest możliwość zastosowania w wielu innych systemach biologicznych, takich jak identyfikacja ekspresji białek w tkankach mysich.Po wypreparowaniu oczu z utrwalonych larw danio pręgowanego zgodnie z protokołem tekstowym, podgrzać 15 ml 12% żelatyny lokalnej marki spożywczej w PBS do 40 °C. Następnie odessać PBS z probówek z oczami i dodać roztwór żelatyny. Delikatnie opukać probówkę, aby upewnić się, że żelatyna przeniknęła do próbki, a następnie inkubować przez 10 do 30 minut w 40 °C w termobloku z delikatnym mieszaniem lub w łaźni wodnej.W kąpieli wodnej o temperaturze 40°C należy wypełnić ciepłą żelatyną płaskie formy do zatapiania z silikonu lub polietylenu o wymiarach 12 × 5 × 3 mm. Następnie, używając pipety, należy umieścić po dwa oczy w każdej formie i przy pomocy igły sekcyjnej pod mikroskopem stereoskopowym odpowiednio je ustawić. Po pozostawieniu żelatyny do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez jedną minutę, należy umieścić ją w temperaturze 4°C na 20 minut w celu utwardzenia.Pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą żyletki ponownie przytnąć blok żelatynowy tak, aby w każdym bloku znajdowało się jedno oko. Przenieść oczy zatopione w żelatynie do 2,3 M sacharozy w PBS na lodzie. Inkubować próbki w temperaturze 4 °C przez noc.Następnie przenieś próbki do świeżego 2,3 M roztworu sacharozy. Przechowuj tkankę w temperaturze 4°C lub -20°C w przypadku przechowywania do kilku miesięcy. Przytnij ponownie blok żelatynowy do rozmiaru niemal równego wielkości oka przed przeniesieniem go na cryo-pin.Następnie zamrozić blok w ciekłym azocie i przenieść go do krioultramikrotomu. Za pomocą noża diamentowego w krioultramikrotomie wykonać przekroje o grubości 110 nanometr w temperaturze -120 °C. Przekroje zebrać za pomocą drucianej pętli z kroplą 2% roztworu metylocelulozy i 2,3 M sacharozy.Następnie przenieś przekroje na krzemową płytkę o wymiarach 7x7 mm. Aby wypłukać płytki, nanieś pipetą cztery krople i połóż płytki odwrócone stronąi do dołu na kroplach. Inkubuj płytki na kroplach w temperaturze 0 °C przez 20 minut.Następnie dwa razy przemyj wafery w PBS w temperaturze pokojowej przez dwie minuty każdego razu. Inkubuj próbki trzykrotnie w 0,15% glicyny w PBS przez jedną minutę każdego razu. Następnie trzykrotnie przemyj próbki w PBS przez jedną minutę podczas każdego płukania.Preinkubować tkankę w PBG przez pięć minut. Następnie do przekrojów dodać przeciwciało królicze anty-Tom20 w PBG. Inkubować preparaty w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Za pomocą PBG przemyj tkankę sześciokrotnie, przez jedną minutę podczas każdego płukania. Następnie przeprowadź preinkubację próbek z PBG w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Zastąp PBG dwuwartościowymi fragmentami Fab przeciwko królikowi Alexa 647 w PBG i inkubuj przez 30 minut.Przemyj próbki w PBG sześć razy, przez jedną minutę na każde płukanie. Następnie przemyj płytki trzy razy w PBS przez dwie minuty. Dodaj DAPI i PBS na płytki i inkubuj przez 10 sekund.Następnie należy dwukrotnie przemyć próbki za pomocą PBS, każdorazowo przez dwie minuty. Wafer należy umieścić w kropli roztworu 80% glicerolu i buforu obrazującego zawierającego system usuwania tlenu w stosunku jeden do jednego i krótko inkubować. Następnie należy przenieść wafery stroną tkankową do dołu na świeżą kroplę mieszaniny 80% glicerolu i buforu obrazującego w stosunku jeden do jednego w szalce Petriego z szklanym dnem.Używając pipety, odessać większość cieczy spod wafla z każdej strony. Następnie za pomocą silikonowych pasków przymocować wafeł do dna szalki Petriego. Umieścić zamocowane sekcje na mikroskopie odwróconym wyposażonym w obiektyw imersyjny z wysoką aperturą numeryczną.Przed obrazowaniem należy pozwolić próbce na wyrównanie temperatury z temperaturą mikroskopu, aby zminimalizować lub ograniczyć dryft boczny i osiowy. Należy wycentrować obszar zainteresowania i pozyskać referencyjne obrazy epifluorescencyjne w szerokim polu. Następnie należy przełączyć urządzenie w tryb pracy superrozdzielczej.Ustaw czas naświetlania kamery na 15 milliseconds, a wzmocnienie mnożnikowe elektronów na maksymalną wartość 300. Następnie oświetl próbkę w trybie epifluorescencji za pomocą lasera o długości fali 642 nanometer przy maksymalnej mocy lasera. Gdy tylko błyski pojedynczych cząsteczek będą wyraźnie oddzielone w każdej klatce, tak aby prawdopodobieństwo nakładania się poszczególnych sygnałów było niskie, zmniejsz moc lasera do niemal 1/3.Nagraj obraz surowy w epifluorescencji, rejestrując minimum 30 000 klatek. Z surowych danych, w menu Tools, w sekcji t-Series Analysis, ustaw próg detekcji na 30 fotonów. Kliknij Evaluate, aby wygenerować listę zdarzeń lokalizacji.W sekcji Tools, w panelu Eventlist Processing kliknij Create Image, aby zwizualizować obraz super-rozdzielczy za pomocą dopasowania Gaussa, stosując rozmiar renderowanego piksela wynoszący cztery nanometry. Usuń paski silikonowe i dodaj kroplę PBS blisko krawędzi wafla, aby podnieść go z szalki Petriego. Po dwukrotnym przemyciu wafla roztworem PBS przez dwie minuty przy każdym myciu, zastosuj 0,1% glutaraldehydu w PBS w celu post-fiksacji przez pięć minut.Następnie ponownie przemyj próbkę dwa razy w PBS, przez dwie minuty podczas każdego mycia. Inkubuj wafelek w jednej kropli 2% metylocelulozy w wodzie na lodzie dwa razy przez pięć minut podczas każdej inkubacji. Następnie umieść wafelek w probówce do wirowania i wiruj przy 14 100 ×g przez 90 sekund.Po wirowaniu należy użyć przewodzącego cementu węglowego, aby zamocować płytkę na aluminiowym stubie do SEM. Za pomocą urządzenia do naparowania wiązką elektronów należy nanieść na próbkę warstwę platyny z węglem o grubości od 2 do 10 nanometrów metodą cieniowania rotacyjnego przy następujących ustawieniach. Przekroje należy obrazować za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego przy napięciu 1,5 kilowolta, odległości roboczej 2 milimetry i z wykorzystaniem detektora elektronów wtórnych w obiektywie (in lens).Użyj programu Fiji, aby otworzyć obrazy z mikroskopii świetlnej i elektronowej, klikając Plik, Otwórz. Dostosuj rozmiar obszaru roboczego, klikając Obraz, Dopasuj, Rozmiar obszaru roboczego. Następnie połącz oba obrazy w stos, klikając Obraz, Stosy, Obrazy do stosu.W programie Fiji otwórz nowy interfejs track EM2, klikając Plik, Nowy, Track EM2 nowy. Zaimportuj stos z obydwoma obrazami, klikając prawym przyciskiem myszy w czarnym oknie i wybierając Importuj stos. Dopasuj obraz z mikroskopii świetlnej do obrazu z mikroskopii elektronowej ręcznie za pomocą punktów orientacyjnych, klikając prawym przyciskiem myszy na obrazie i wybierając Dopasuj, Dopasuj warstwę ręcznie za pomocą punktów orientacyjnych.Wybierz narzędzie Select, aby dodać punkty charakterystyczne. Wykorzystaj kształt jąder komórkowych jako punkt odniesienia, aby zaznaczyć te same krawędzie na obu obrazach i dodać kilka punktów. Wykonaj wyrównanie za pomocą modelu afinicznego, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając Apply transform, Affine Model.Na koniec zmień przezroczystość warstw, aby ocenić jakość dopasowania. Na tym panelu przedstawiono obraz szerokopolowy przy niskim powiększeniu przekroju siatkówki zebrafish w piątej dobie po zapłodnieniu. Ten sam obszar pokazano tutaj za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej.Te obrazy przy większym powiększeniu pokazują barwienie Tom20 na czerwono z klastrami w mitochondriach. Ekspresja Tom20 jest tutaj przedstawiona jako wykryta za pomocą mikroskopii GSDIM. Na tym obrazie ten sam przekrój łączy korelacyjną superrozdzielczość oraz skaningową mikroskopię elektronową.Barwienie Tom20 występuje w obrębie klastra mitochondrialnego na zewnętrznych błonach mitochondriów. Sygnał fluorescencyjny DAPI w jądrach odpowiada topografii obrazu SEM. Ten obraz SEM zapewnia kontekst dla barwienia Tom20 na obrazie GSDIM.Grzebienie mitochondrialne są wyraźnie widoczne, a barwienie Tom20 jest zlokalizowane w zewnętrznych błonach mitochondriów. Błony segmentu zewnętrznego fotoreceptorów są wyraźnie rozdzielone. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby w jak najlepszym stopniu zoptymalizować parametry znakowania i obrazowania.Do superrozdzielczości nadają się wyłącznie próbki optymalnie znakowane. Próbki nie mogą wyschnąć na żadnym etapie procedury znakowania. Procedurę tę można rozszerzyć na immunofluorescencję z podwójnym znakowaniem, co pozwala na lokalizację dwóch różnych białek w obrębie określonej struktury.W przypadku bardziej złożonych próbek zaleca się stosowanie markerów fiducjalnych w celu uzyskania precyzyjnego dopasowania obrazów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania badań korelacyjnych w celu lokalizacji białek w odniesieniu do różnych organelli komórkowych w złożonej próbce tkankowej z precyzją super-rozdzielczości.

correlative-super-resolution-electron-microscopy-to-resolve-protein

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy artykuł opisuje metodę mikrodyssekcji siatkówek zebrafish (danio pręgowanego) z dołączonym lub usuniętym nabłonkiem barwnikowym siatkówki, z embrionów od jednego do trzech dni po zapłodnieniu.

Mikrodysekcja tkanek embrionalnego oka rybki zebrafish

W tym filmie przedstawiono techniki wielokolorowego konfokalnego obrazowania time-lapse oraz celowanej ablacji komórek. Obrazowanie time-lapse jest wykorzystywane do monitorowania zachowania wielu wybranych typów komórek in vivo. Celowana ablacja komórek ułatwia badanie funkcji obwodów neuronalnych oraz paradygmatów regeneracji neuronów specyficznych dla danej grupy komórek.

Wielokolorowe obrazowanie poklatkowe transgenicznych rybek zebrafish: wizualizacja komórek macierzystych siatkówki aktywowanych przez ukierunkowaną ablację komórek neuronalnych

Opisano metodę warunkowego wyciszania ekspresji białka docelowego w siatkówce dorosłego danio-zebry, która polega na dokonywaniu iniekcji domięśniowych morfolino antysensownych oraz ich elektroporacji do siatkówki. W wyniku tego procesu ekspresja białka jest wyciszona przez kilka dni, co umożliwia zbadanie roli tego białka w regenerującej się lub nienaruszonej siatkówce.

In vivo elektroporacja morfolin do siatkówki dorosłego danio pręgowanego

Wprowadzamy skuteczną metodę wstecznego oznaczania komórek zwojowych siatkówki (RGC) u dorosłych ryb pręgowanych.

Wsteczne znakowanie komórek zwojowych siatkówki u dorosłych danio pręgowanego za pomocą barwników fluorescencyjnych

Obrazowanie dynamicznego zachowania organelli i innych struktur subkomórkowych in vivo może rzucić światło na ich funkcję w warunkach fizjologicznych i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metody genetycznego znakowania dwóch organelli, centrosomów i mitochondriów oraz obrazowania ich dynamiki w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej.

Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego

Wielkoskalowa mikroskopia elektronowa 2D (EM), czyli nanotomia, to ogólnotkankowe zastosowanie nanoskalowej rozdzielczości EM. W tym miejscu opisujemy uniwersalną metodę nanotomii stosowaną do badania mózgu larw danio pręgowanego w zdrowiu i po nieinwazyjnym uszkodzeniu mózgu.

Wielkoskalowa skaningowa transmisyjna mikroskopia elektronowa (nanotomia) mózgu zdrowego i uszkodzonego danio pręgowanego

Mikroskopia fluorescencyjna z lekkim arkuszem jest doskonałym narzędziem do obrazowania rozwoju embrionalnego. Pozwala na nagrywanie długich filmów poklatkowych żywych zarodków w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Demonstrujemy jego zastosowanie do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego w szerokich skalach czasoprzestrzennych i przedstawiamy potok do fuzji i dekonwolucji zestawów danych multiview.

Wykorzystanie mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego

Ten protokół demonstruje sekwencyjną immunofluorescencję i immunohistochemię na kriosekcjach z wczesnych stadiów zarodków danio pręgowanego, umożliwiając precyzyjne analizy kolokalizacji w określonych populacjach komórek.

Sekwencyjna immunofluorescencja i immunohistochemia na kriowyciętych zarodkach danio pręgowanego

Te protokoły zostały opracowane w celu analizy morfologii soczewki korowej, integralności strukturalnej szwów soczewki danio pręgowanego w soczewkach stałych i żywych oraz do pomiaru położenia jądra soczewki danio pręgowanego wzdłuż osi przednio-tylnej.

Ocena lokalizacji jądra soczewki danio pręgowanego i integralności szwów

Ten protokół opisuje podejście do etykietowania in toto i wielowymiarowego obrazowania wczesnego rozwoju oczu danio pręgowanego. Opisujemy znakowanie, osadzanie i obrazowanie czterowymiarowe (4D) za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej oraz rozważania dotyczące optymalizacji pozyskiwania zestawów danych do analizy mechanizmów morfogenezy panewki wzrokowej.

4-wymiarowe obrazowanie morfogenezy kubka wzrokowego danio pręgowanego

Ten protokół opisuje szczegółowe etapy wstępnego wdrażania mikroskopii immunoelektronowej, skupiając się na badaniu obwodów synaptycznych i lokalizacji białek w siatkówce.

Badanie obwodów siatkówki i lokalizacji molekularnej poprzez wstępne osadzenie mikroskopii immunoelektronowej

Poznaj metodę korelacyjnej superrozdzielczości i mikroskopii elektronowej do lokalizacji białek w siatkówce Danio rerio. Technika ta umożliwia precyzyjne badanie rozwoju siatkówki i funkcji komórkowych.

Korelacyjna superrozdzielczość i mikroskopia elektronowa w celu ustalenia lokalizacji białek w siatkówce danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów