Korelacyjna superrozdzielczość i mikroskopia elektronowa w celu ustalenia lokalizacji białek w siatkówce danio pręgowanego

Ten protokół opisuje niezbędne kroki do uzyskania wyników lokalizacji białek subkomórkowych na siatkówce danio pręgowanego poprzez korelację obrazów z superrozdzielczej mikroskopii świetlnej i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Ogólnym celem tej metody mikroskopowej jest precyzyjna lokalizacja ekspresji białek w odniesieniu do różnych organelli subkomórkowych w siatkówce larw danio pręgowanego poprzez korelację obrazów z superrozdzielczości i skaningowej mikroskopii elektronowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące rozwoju siatkówki i szlaków komórkowych, takich jak badanie błędnej lokalizacji białek w mutantach. Główną zaletą tej techniki jest to, że łączy ona superrozdzielczość ze skaningową mikroskopią elektronową w celu uzyskania bardzo dokładnych danych dotyczących lokalizacji białek w kontekście strukturalnym próbki.

Zbiór przekrojów Tokuyasu na waflach silikonowych znacznie ułatwia obsługę, a zastosowanie platynowego cieniowania dla kontrastu zapewnia dobrą topografię próbki. Tak więc ta metoda może zapewnić wgląd w badania siatkówki larw danio pręgowanego. Jedną z jego głównych zalet jest to, że może być również stosowany w wielu innych systemach biologicznych, takich jak identyfikacja ekspresji białek w tkance myszy.

Po wypreparowaniu oczu z utrwalonych larw danio pręgowanego zgodnie z protokołem tekstowym, podgrzej 15 mililitrów 12% żelatyny lokalnej marki spożywczej w PBS w temperaturze 40 stopni Celsjusza. Następnie odessać PBS z rurek oczu i dodać roztwór żelatyny. Delikatnie postukaj w probówkę, aby upewnić się, że żelatyna infiltruje próbkę, i inkubuj ją przez 10 do 30 minut w temperaturze 40 stopni Celsjusza w termobloku z delikatnym potrząsaniem lub w łaźni wodnej.

W łaźni wodnej o temperaturze 40 stopni Celsjusza napełnij płaskie formy do zatapiania silikonu lub polietylenu o wymiarach 12 na pięć na trzy milimetry ciepłą żelatyną. Następnie za pomocą pipety dodaj dwoje oczek na formę, a pod lornetką użyj igły do preparowania, aby je odpowiednio wyrównać. Po pozostawieniu żelatyny do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez minutę, umieść ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 20 minut, aby stwardniała.

Pod lornetką użyj żyletki, aby ponownie przyciąć blok żelatyny, aby pasował do jednego oka na blok. Przenieść zatopione w żelatynie oczy do 2,3 molowej sacharozy w PBS na lodzie. Próbki należy inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Następnie wymień próbki na świeży 2,3-molowy roztwór sacharozy. I przechowuj tkankę w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub minus 20 stopni Celsjusza do przechowywania do kilku miesięcy. Ponownie przytnij blok żelatyny do prawie wielkości oka przed przeniesieniem go do krioszpilki.

Następnie zamroź blok w ciekłym azocie i przenieś go do krio-ultramikrotomu. Za pomocą diamentowego noża w krio-ultramikrotomie wytnij odcinki o grubości 110 nanometrów w temperaturze minus 120 stopni Celsjusza. Wybierz sekcje z przewodową pętlą zawierającą kroplę 2% metylocelulozy i 2,3 molowego roztworu sacharozy.

Następnie przenieś skrawki na wafel silikonowy o wymiarach siedem na siedem milimetrów. Aby umyć wafle, odpipetuj cztery krople i połóż wafle do góry nogami na kroplach. Inkubuj wafle na kroplach w temperaturze zero stopni Celsjusza przez 20 minut.

Następnie umyj wafle dwa razy w PBS w temperaturze pokojowej przez dwie minuty każdy. Próbki inkubować trzykrotnie w 0,15% glicynie w PBS przez jedną minutę każda. Następnie użyj PBS, aby umyć próbki trzy razy przez jedną minutę na pranie.

Wstępnie inkubować tkankę z PBG przez pięć minut. Następnie dodaj do sekcji królik anty-Tom20 w PBG. I inkubować wafle w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

W przypadku PBG chusteczkę należy umyć sześć razy po jednej minucie na jedno pranie. Następnie należy wstępnie inkubować próbki z PBG w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Zastąp PBG dwuwartościowymi fragmentami Fab Alexa 647 przeciwko królikom w PBG i inkubuj przez 30 minut.

Umyć próbki w PBG sześć razy przez jedną minutę na jedno mycie. Następnie użyj PBS, aby umyć wafle trzy razy przez dwie minuty. Dodaj DAPI i PBS do wafli i inkubuj przez 10 sekund.

Następnie użyj PBS, aby przemyć próbki dwa razy przez dwie minuty każda. Umieścić wafel na kropelce roztworu 80% glicerolu i buforu obrazującego do jednego zawierającego system oczyszczania tlenu i krótko go inkubować. Przenieś wafle, tkanką do dołu, na świeżą kroplę mieszaniny 80% glicerolu i buforu do obrazowania jeden do jednego na szalce Petriego ze szklanym dnem.

Użyj pipety ze wszystkich stron, aby usunąć większość płynu znajdującego się pod waflem. Następnie użyj silikonowych pasków, aby przymocować wafel do dna szalki Petriego. Umieść zamontowane sekcje na odwróconym mikroskopie z obiektywem zanurzeniowym z olejkiem o dużej aperturze numerycznej.

Przed obrazowaniem należy pozwolić, aby próbka zrównoważyła się z temperaturą mikroskopu, aby zminimalizować lub zmniejszyć dryft poprzeczny i osiowy. Wyśrodkuj obszar zainteresowania i uzyskaj obrazy referencyjne epifluorescencji o szerokim polu. Zmień na tryb pracy w super rozdzielczości.

Dostosuj czas naświetlania aparatu na 15 milisekund i ustaw wzmocnienie mnożenia elektronów na maksimum 300. Następnie oświetl próbkę w trybie epifluorescencji laserem o długości 642 nanometrów przy maksymalnej mocy lasera. Gdy tylko pojedyncze mrugnięcia molekuły zostaną dobrze oddzielone w każdej klatce, tak aby prawdopodobieństwo nakładania się poszczególnych sygnałów było niewielkie, zmniejsz moc lasera do prawie 1/3.

Nagraj surowy obraz w epifluorescencji, uzyskując co najmniej 30 000 klatek. Na podstawie danych pierwotnych, w obszarze Narzędzia, analiza serii t używa progu wykrywania 30 fotonów. Kliknij przycisk Oceń, aby wygenerować listę zdarzeń lokalizacyjnych.

W obszarze Narzędzia w panelu Przetwarzanie listy zdarzeń kliknij przycisk Utwórz obraz, aby zobrazować obraz o wysokiej rozdzielczości za pomocą dopasowania gaussowskiego, stosując rozmiar piksela renderowania wynoszący cztery nanometry. Usuń silikonowe paski i dodaj kroplę PBS blisko krawędzi wafla, aby podnieść go z szalki Petriego. Po użyciu PBS do dwukrotnego umycia wafla przez dwie minuty, użyj 0,1% aldehydu glutarowego w PBS, aby utrwalić go po utrwaleniu przez pięć minut.

Następnie ponownie umyć próbkę dwa razy przez dwie minuty na każde przemycie w PBS. Inkubować wafel w jednej kropli 2% metylocelulozy w wodzie na lodzie dwa razy przez pięć minut na inkubację. Następnie włóż wafel do probówki wirówkowej i odwiruj przy 14, 100 razy g przez 90 sekund.

Po wirowaniu użyj przewodzącego cementu węglowego, aby zamontować wafel na aluminiowym króćcu SEM. Za pomocą urządzenia do odparowywania wiązką elektronów dodaj warstwę od dwóch do 10 nanometrów węgla platyny na próbkę poprzez obrotowe cieniowanie z następującymi ustawieniami. Wycinki obrazu za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego o napięciu 1,5 kilowolta, odległości roboczej dwóch milimetrów oraz za pomocą detektora elektronów wtórnych w soczewce.

Użyj Fidżi, aby otworzyć obrazy z mikroskopii świetlnej i elektronowej, klikając Plik, Otwórz. Dostosuj rozmiar płótna, klikając Obraz, Dostosuj, Rozmiar płótna. Następnie umieść oba obrazy w stosie, klikając Obraz, Stosy, Obrazy do stosu.

Na Fidżi otwórz nowy interfejs ścieżki EM2, klikając Plik, Nowy, Ścieżka EM2 nowa. Zaimportuj stos z obydwoma obrazami, klikając prawym przyciskiem myszy czarne okno i wybierając Importuj stos. Ręcznie wyrównaj obraz mikroskopii świetlnej z obrazem mikroskopii elektronowej ze znakami orientacyjnymi, klikając obraz prawym przyciskiem myszy i wybierając opcję Wyrównaj, Ręcznie wyrównaj warstwę ze znakami orientacyjnymi.

Wybierz narzędzie Zaznaczanie, aby dodać punkty orientacyjne. Użyj kształtu jąder jako odniesienia, aby zaznaczyć te same krawędzie na obu obrazach i dodać kilka punktów. Zastosuj wyrównanie do modelu afinicznego, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając polecenie Zastosuj przekształcenie, Model afiniczny.

Na koniec zmień przezroczystość warstwy, aby ocenić jakość wyrównania. Panel ten pokazuje obraz szerokokątny o małym powiększeniu przekroju siatkówki danio pręgowanego po pięciu dniach od zapłodnienia. Ten sam obszar jest tutaj pokazany za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej.

Te obrazy w większym powiększeniu pokazują Tom20 zabarwiony na czerwono z klastrami w mitochondriach. Ekspresja Tom20 jest pokazana tutaj jako wykryta przez mikroskopię GSDIM. Na tym zdjęciu ta sama sekcja łączy korelacyjną superrozdzielczość i skaningową mikroskopię elektronową.

Zabarwienie Tom20 pojawia się w klastrze mitochondrialnym na zewnętrznych błonach mitochondriów. Sygnał fluorescencyjny DAPI w jądrach odpowiada topografii obrazu SEM. Ten obraz SEM zapewnia kontekst dla barwienia Tom20 na obrazie GSDIM.

Grzebienice mitochondrialne są wyraźnie widoczne, a barwienie Tom20 jest zlokalizowane na zewnętrznych błonach mitochondriów. Błony zewnętrznego segmentu fotoreceptorów są wyraźnie rozdzielone. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o tym, aby jak najlepiej zoptymalizować parametry etykietowania i obrazowania.

Tylko optymalnie oznakowane próbki nadają się do uzyskania superrozdzielczości. Próbki nie mogą nigdy wyschnąć w żadnym momencie procedury etykietowania. Procedura ta może zostać rozszerzona o podwójne znakowanie immunofluorescencyjne, a tym samym umożliwić lokalizację dwóch różnych białek w określonej strukturze.

W przypadku bardziej złożonych próbek zaleca się stosowanie markerów fiducial w celu uzyskania precyzyjnego wyrównania obrazów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać badania korelacyjne w celu lokalizacji białek w odniesieniu do różnych organelli komórki w złożonej próbce tkanki z precyzją superrozdzielczości.