Wielkoskalowa skaningowa transmisyjna mikroskopia elektronowa (nanotomia) mózgu zdrowego i uszkodzonego danio pręgowanego
25 maja 2016
Wielkoskalowa mikroskopia elektronowa 2D (EM), czyli nanotomia, to ogólnotkankowe zastosowanie nanoskalowej rozdzielczości EM. W tym miejscu opisujemy uniwersalną metodę nanotomii stosowaną do badania mózgu larw danio pręgowanego w zdrowiu i po nieinwazyjnym uszkodzeniu mózgu.
Ogólnym celem tej wielkoskalowej mikroskopii elektronowej lub eksperymentu nanotomijnego jest zdefiniowanie zmian od poziomu makromolekularnego do poziomu tkankowego, w dzisiejszym przypadku, w degenerującym się mózgu danio pręgowanego. Nanotomia może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w naukach przyrodniczych. Na przykład w neurodegeneracji i badaniach nad cukrzycą typu 1.
Główną zaletą nanotomii jest to, że pozyskiwane są bezstronne informacje, począwszy od makrocząsteczek, organelli, komórek, a skończywszy na tkankach. Pozwala to na ilościowe określanie ilości i udostępnianie danych w otwartym dostępie za pośrednictwem nanotomy.org. Chociaż nanotomia dostarcza informacji na temat utrzymania odporności i mikrogleju w neurodegeneracyjnym mózgu danio pręgowanego, jest również stosowana do innych modeli chorób, w tym hodowli komórkowych, myszy, a nawet tkanek ludzkich.
Ogólnie rzecz biorąc, naukowcy nowicjusze w tej technice mają trudności, ponieważ ilość danych jest przytłaczająca. Może to być tysiąc razy więcej niż uzyskane przy użyciu tradycyjnego EM. Po utrwaleniu larw danio pręgowanego zgodnie z protokołem tekstowym, przytnij głowy larw rostralnie do tyłomózgowia, aby ułatwić penetrację osmu. Umieść larwy w 1% tetratlenku osmu, 1,5% żelazocyjanku potasu, w 0,1-molowym kakodylanie sodu i inkubuj na lodzie przez dwie godziny.
Następnie użyj podwójnie destylowanej wody, aby przepłukać zarodki trzy razy przez pięć minut za każdym razem. Przed zatopieniem próbki należy odwodnić w serii etanolu. Aby osadzić zarodki, po inkubacji w rozcieńczonej żywicy epoksydowej przez noc zgodnie z protokołem tekstowym, usuń rozcieńczoną żywicę i użyj czystej żywicy do jej zastąpienia.
Inkubować przez 30 minut, następnie wymień żywicę po raz drugi i inkubuj przez kolejne 30 minut. Po odświeżeniu żywicy po raz trzeci inkubować w temperaturze pokojowej przez trzy godziny. Następnie inkubować w temperaturze 58 stopni Celsjusza przez 15 minut.
Na koniec inkubować pod niskim ciśnieniem w temperaturze pokojowej przez godzinę. Następnie, pod mikroskopem preparacyjnym, użyj igły lub wykałaczki, aby zorientować głowice w dostępnych na rynku silikonowych płaskich formach do zatapiania. Następnie polimeryzuj żywicę epoksydową w temperaturze 58 stopni Celsjusza przez noc.
Gdy próbka jest w pełni stwardniała, użyj żyletek, aby odciąć nadmiar żywicy z kikuta. Aby wykryć właściwe położenie, użyj noża do szkła lub diamentowego noża do histomu na ultramikrotomie, aby wyciąć półcienkie skrawki larw dla błękitu toluidynowego/fuksyny zasadowej. Przenieś półcienkie sekcje na szkiełka mikroskopowe, podnosząc je szklaną pipetą Pasteura, której końcówka została zamknięta przez stopienie jej w płomieniu.
Suszyć na gorącej płycie, aż nie pozostanie woda. Następnie umieść próbki w 1% błękitu toluidynowego w wodzie i inkubuj skrawki na gorącej płycie przez 10 sekund, aby je zabarwić. Następnie, po użyciu wody do przepłukania skrawków, użyj 05% zasadowej fuksyny w 1% tetraboranie sodu, aby zabarwić próbki przez dodatkowe 10 sekund.
Za pomocą normalnego mikroskopu świetlnego o powiększeniu od 10 do 40 razy zbadaj próbki. Po osiągnięciu właściwego miejsca lub orientacji należy użyć łatwych do zidentyfikowania struktur anatomicznych, w tym wgłębień węchowych, oczu lub granic istoty szarej i białej, aby zidentyfikować obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania podczas ultracienkiego cięcia i dostosować kąt cięcia, gdy próbka jest przechylona. Kontynuuj cięcie bloku żywicy epoksydowej nożem diamentowym, aby wyciąć ultracienkie odcinki 70 nanometrów.
Zamontuj każdą sekcję w jednym gnieździe L2 na 1 z miedzianej siatki z kodem kreskowym, aby umożliwić akwizycję bez przerywania przez pręty siatki. Milimetr kwadratowy może wydawać się mały. Po prostu zmieści się w otworze.
W ten sposób zapobiegamy blokowaniu naszej próbki przez paski siatki. Uświadom sobie, że każdy artefakt wprowadzony w naszej próbce zostanie zarejestrowany w porównaniu z tradycyjnym EM. Porównaj próbki z metalami ciężkimi zgodnie z protokołem tekstowym i przechowuj w pudełku z siatką. Aby zamontować próbkę w skaningowym mikroskopie elektronowym lub SEM, umieść siatkę ze skrzynki rozdzielczej z sekcją w uchwycie na próbki z wieloma siatkami i przenieś ją do komory SEM.
Po ustawieniu detektora zgodnie z protokołem tekstowym, należy wstępnie napromienić próbkę, pomniejszając tak, aby cały obszar do skanowania zmieścił się w oknie obrazu. Po zmianie przysłony na 120 mikrometrów i rozmyciu obrazu użyj opcji skanowania zredukowanego obszaru, aby zeskanowany obszar był jak najmniejszy. Następnie ustaw liczbę klatek na sekundę, aby zeskanować klatkę w około jedną do dwóch sekund.
Następnie powiększ co najmniej 100X i skanuj mały obszar przez 10 sekund. Jeśli jasność w obszarze nadal się zmienia, kontynuuj naświetlanie przed naświetlaniem. Gdy obszar ten nie zmienia jasności w porównaniu z otoczeniem, wystarczające jest wstępne naświetlanie.
Podczas ustawiania ostrości wybierz najjaśniejszy obszar lub obiekt i ustaw szybkość skanowania tak, aby szczegóły były widoczne. W oprogramowaniu mikroskopu dostosuj jasność i kontrast, uważnie obserwując histogram, aby wszystkie piksele pozostały w zakresie dynamicznym. Zrób to samo dla najciemniejszych obszarów i obiektów.
Wróć do jasnego obszaru i sprawdź ponownie, czy po obu stronach histogramu jest trochę miejsca. W przypadku kroków od czwartego szóstego do czwartego ósmego regulacja jasności i kontrastu musi być wykonana bardzo ostrożnie, aby cały obszar mieścił się w zakresie dynamicznym. Pomniejsz tak, aby cały obszar do skanowania zmieścił się w oknie wyobraźni i uruchom program akwizycji dużego obszaru.
Następnie użyj opcji kreatora, aby skonfigurować mozaikę, wybierając obszar z ekranu. Użyj rozmiaru piksela od dwóch do pięciu nanometrów, w zależności od tego, jakie szczegóły są niezbędne, i ustaw czas przebywania wynoszący trzy mikrosekundy dla skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej lub STEM. Naciśnij optymalizuj, aby sprawdzić ustawienia mikroskopu, a zostanie wyświetlony potrzebny czas.
Następnie ponownie włącz zewnętrzny generator skanowania i naciśnij kontynuuj. Aby przeanalizować dane STEM, otwórz przeglądarkę plików EM na dużą skalę i otwórz plik o nazwie mosaic info, który otworzy kafelkowe pliki tif. Wybierz opcję Automatycznie zszyj całą mozaikę i wybierz następujące parametry: tryb nakładania równa się połowie, próg zszywania równa się 0,90, a redukcja szumów równa się automatyczna.
Jeśli kryteria łączenia nie mogą być spełnione, powiększ i ręcznie umieść kafelek w odpowiednim miejscu, a następnie kliknij przycisk Kontynuuj tak, jak jest.Wyeksportuj dane jako plik HTML lub jako pojedynczy tif. Dołącz ostateczny rozmiar piksela i nazwę pliku, aby umożliwić późniejsze pomiary, a następnie przeanalizuj dane zgodnie z protokołem tekstowym. Jak pokazano tutaj, nanotomia kontrolnych odcinków mózgu ujawnia typowe cechy ultrastrukturalne tkanki nerwowej przodomózgowia rostralnego, w tym wiązki włókien węchowych, jądra neuronalne i podprzedziały neuronalne, w tym synapsy.
Tutaj struktury subkomórkowe obejmują różne morfologie jądrowe i ogniska w różnych typach komórek i organelli, w tym aparat Golgiego, retikulum endoplazmatyczne, mitochondria, pęcherzyki synaptyczne i gęstości postsynaptyczne. Nieoczekiwanie jądra komórek wyściełających komorę są bardzo gęste elektronowo w porównaniu z innymi komórkami rozproszonymi bardziej bocznie w mózgu. W mikrogleju jądra wykazują również ciemne ogniska, prawdopodobnie heterochromatynę, których nie ma w innych komórkach mózgu.
To zdjęcie wykonane przez EM na dużą skalę przedstawiające przekrój koronalny u larwy danio pręgowanego poddawanej ablacji neuronalnej ujawnia mikroglej fagocytarny. Cechy charakterystyczne dla mikrogleju w komórkach ssaków stwierdzono również w tych komórkach, w tym wyraźny aparat Golgiego i liczne inkluzje, takie jak lizosomy. Po opanowaniu akwizycji można ją przeprowadzić w ciągu jednego dnia, podczas gdy tradycyjny EM będzie Cię kosztował co najmniej tydzień.
Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby operator mikroskopu odgrywał kluczową rolę w uzyskiwaniu wysokiej jakości obrazów. To nie jest tylko technika naciskania przycisku. Teraz zastosowaliśmy nanotomię nie tylko do modelu zwyrodnienia neuronów u danio pręgowanego, ale także do znakowania immunologicznego komórek oraz do badania tkanek much, tkanek ludzkich i innych.
Ta technika toruje drogę każdemu badaczowi w każdej dziedzinie. Mogą oni ponownie zapoznać się ze zbiorami danych online na nanotomy.org. Następnie mogą badać domniemane zmiany, od skali nanometrowej do milimetrowej i wszystkie badane modele.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zastosować nanotomię do swojego pytania badawczego i systemu komórkowego lub tkankowego, który badasz. Nie zapominaj, że tylko profesjonalista powinien przygotować próbkę ze względu na toksyczne odczynniki i względy etyczne, ale każdy może wypróbować nanotomię na stronie internetowej. org w domu.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia uniwersalną metodę wielkoskalowej dwuwymiarowej mikroskopii elektronowej, czyli nanotomii, zastosowaną w badaniu mózgu larwy danio przebrzoskanego. Technika ta jest wykorzystywana do analizy stanu zdrowia mózgu oraz skutków nieinwazyjnych urazów mózgu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Mikroskopia elektronowa
- Neurodegeneracja
Wstęp
- Nanotomia zapewnia rozdzielczość nanometryczną dla analizy w skali całych tkanek.
- Umożliwia ona obiektywne pozyskiwanie danych, od makrocząsteczek po tkanki.
- Metoda ta ma zastosowanie w różnych modelach chorób, w tym w tkankach ludzi oraz rybek zebrafish.
- Wyzwania obejmują zarządzanie ogromną ilością generowanych danych.
Cel badania
- Zdefiniowanie zmian w mózgu ryby danio-ostrolepis na poziomie makromolekularnym i tkankowym.
- Poszukiwanie nowych informacji na temat neurodegeneracji i utrzymania odporności.
- Umożliwienie otwartego udostępniania danych za pośrednictwem nanotomy.org.
Zastosowane metody
- Fiksacja i odwodnienie larw danio przebrózmianego.
- Zatapianie w żywicy epoksydowej i krojenie przy użyciu ultramikrotomu.
- Barwienie błękitem toluidynowym i fuksyną zasadową w celu wizualizacji.
- Skaningowa mikroskopia elektronowa w celu uzyskania szczegółowych obrazów.
Główne wyniki
- Skuteczne uzyskanie obrazów struktur mózgu danio-pręgowanego o wysokiej rozdzielczości.
- Identyfikacja cech anatomicznych istotnych dla neurodegeneracji.
- Wykazanie możliwości zastosowania tej metody w przypadku różnych próbek biologicznych.
Wnioski
- Nanotomia jest potężnym narzędziem do badania struktury i funkcji mózgu.
- Technika ta zwiększa zrozumienie procesów neurodegeneracyjnych.
- Stanowi ona podstawę dla przyszłych badań w dziedzinie neuronauki.
Często Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Elektronowa mikroskopia wielkoskalowa (nanotomia) umożliwia bezstronną, obejmującą całe tkanki kwantyfikację zmian subkomórkowych i molekularnych w modelach chorób neurodegeneracyjnych, wspierając walidację celów terapeutycznych poprzez bezpośrednią wizualizację cech patologicznych w różnych typach komórek. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w fazie wczesnego odkrywania leków, dostarczając danych z korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM), które łączą obserwacje fenotypowe z mechanizmami ultrastrukturalnymi. Możliwość zastosowania tej metody u rybek zebrafish, w tkankach ludzkich oraz w modelach chorobowych sprawia, że stanowi ona translacyjne narzędzie do ograniczania ryzyka, dostarczając wglądu w mechanizmy podczas odkrywania leków ukierunkowanych na ośrodkowy układ nerwowy (CNS).
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację zmian od poziomu makromolekularnego po poziom tkankowy w modelach neurodegeneracji.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celów terapeutycznych dzięki obiektywnej detekcji aktywacji mikrogleju, stresu neuronalnego oraz patologii podkomórkowej.
- Wartość strategiczna: Ułatwia zwiększenie pewności prognostycznej i selekcję projektów w portfolio poprzez kwantyfikację ultrastrukturalnych biomarkerów progresji choroby.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów analizy poprzez generowanie zestandaryzowanych, powtarzalnych zbiorów danych EM.
- Wartość operacyjna: Odpowiada na potrzeby standaryzacji testów i uzyskiwania ilościowych wyników dzięki obrazowaniu opartemu na kafelkach oraz zautomatyzowanym protokołom zszywania obrazów.
- Wartość strategiczna: Zwiększa gotowość do przesiewania i możliwość ponownego wykorzystania platformy poprzez umożliwienie udostępniania danych w otwartym dostępie za pośrednictwem nanotomy.org w celu analizy międzyfunkcyjnej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Omówiono znaczenie dla patogenezy choroby oraz dopasowanie biomarkerów translacyjnych poprzez korelację cech obrazowania EM z danymi z mikroskopii świetlnej w modelach uszkodzeń.
- Wartość operacyjna: Opisano ciągłość procesu od etapu odkryć po walidację przedkliniczną poprzez rejestrację fagocytujących mikroglejów i zmian w organellach podczas degeneracji w czasie rzeczywistym.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje o postępie badań w oparciu o analizę ryzyka poprzez ujawnienie specyficznych dla typu komórek reakcji na ablację neuronów, w tym przesunięć heterochromatyny w jądrach komórkowych komór obszaru komórkowego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Nanotomia włącza się w proces odkrywania leków – od testowania hipotez we wczesnej fazie odkryć, po identyfikację wiodących związków i walidację przedkliniczną – dostarczając ilościowych danych strukturalnych w wielu skalach, które pozwalają ocenić stopień związania z celem oraz mechanizm działania.
- Biologia odkrywcza: Wyjaśnia, w jaki sposób metoda ta wspiera testowanie hipotez, wyjaśnianie szlaków sygnałowych i ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez bezstronne obrazowanie kompleksów makromolekularnych, organelli i fenotypów komórkowych w procesach neurodegeneracji.
- Przesiewanie: Opisuje gotowość testów, powtarzalność i wyniki ilościowe uzyskane dzięki standaryzowanemu sekcjonowaniu, barwieniu i akwizycji STEM z określonym rozmiarem piksela i czasem przebywania wiązki.
- Analityka: Wskazuje na pomiary, odczyty i wyniki statystyczne, takie jak kwantyfikacja cech ultrastrukturalnych w neuronach, mikrogleju i przedziałach subkomórkowych, co umożliwia porównanie różnych warunków.
- Badania translacyjne: Łączy metodę z ciągłością przedkliniczną lub dopasowaniem biomarkerów, umożliwiając korelację CLEM obszarów obrazowanych fluorescencyjnie z późniejszą nanotomią w celu mapowania nanoanatomicznego.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia metodę jako wielokrotnie wykorzystywalną funkcjonalność, a nie technikę jednorazową, którą można zastosować w przypadku ryb zebrafish, tkanek ludzkich, modeli muszek owocówek i hodowli komórkowych do podłużnego wydobywania danych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna, walidacja celu, redukcja dwuznaczności mechanistycznej dzięki bezpośredniej wizualizacji zmian związanych z neurodegeneracją.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność dzięki sekcjonowaniu opartemu na siatce, kontrolowanym parametrom STEM oraz zautomatyzowanemu łączeniu mozaik.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa i zredukowane ryzyko biologiczne na późnych etapach dzięki identyfikacji wczesnych ultrastrukturalnych biomarkerów patologii.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko oraz decyzje dotyczące rozwoju w oparciu o mierzalne, obejmujące całą tkankę zmiany podkomórkowe w modelach chorób.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana wiedza naukowa w zakresie przygotowania próbek do mikroskopii elektronowej, ultramikrotomii oraz obsługi STEM, aby uniknąć artefaktów i zapewnić wysoką jakość danych.
- Potrzeby w zakresie instrumentarium i infrastruktury analitycznej, w tym skaningowego EM z zewnętrznym generatorem skanowania, diamentowego noża histologicznego oraz wielkoskalowego przeglądarki plików EM do eksportu do formatów HTML lub TIFF.
- Wymogi standaryzacji międzyzespołowej w zakresie fiksacji, barwienia, kąta cięcia oraz regulacji jasności i kontrastu, aby zachować zakres dynamiczny we wszystkich zestawach danych.
- Rozważania dotyczące adaptacji w różnych systemach modelowych, takie jak dostosowanie orientacji głowy larwy, montaż na siatce oraz protokoły barwienia dla próbek z rybek zebrafish, tkanek ludzkich lub much.
- Praktyczne ograniczenia wynikające z materiału źródłowego, w tym problemy z zarządzaniem danymi ze względu na zestawy danych o skali terabajtowej oraz konieczność posiadania doświadczenia operatora w zakresie naświetlania wstępnego i regulacji histogramu.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:10
Larvae Fixation and Embedding
2:38
Sectioning, Contrasting, and Mounting
4:28
Mounting the Sample in the Scanning Electron Microscope and Acquiring Images
6:40
Data Analysis
7:33
Results: Large Scale Scanning Transmission Electron Microscopy of Zebrafish Brain
8:48
Conclusion
