Wielkoskalowa skaningowa transmisyjna mikroskopia elektronowa (nanotomia) mózgu zdrowego i uszkodzonego danio pręgowanego

Ogólnym celem tej wielkoskalowej mikroskopii elektronowej lub eksperymentu nanotomijnego jest zdefiniowanie zmian od poziomu makromolekularnego do poziomu tkankowego, w dzisiejszym przypadku, w degenerującym się mózgu danio pręgowanego. Nanotomia może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w naukach przyrodniczych. Na przykład w neurodegeneracji i badaniach nad cukrzycą typu 1.

Główną zaletą nanotomii jest to, że pozyskiwane są bezstronne informacje, począwszy od makrocząsteczek, organelli, komórek, a skończywszy na tkankach. Pozwala to na ilościowe określanie ilości i udostępnianie danych w otwartym dostępie za pośrednictwem nanotomy.org. Chociaż nanotomia dostarcza informacji na temat utrzymania odporności i mikrogleju w neurodegeneracyjnym mózgu danio pręgowanego, jest również stosowana do innych modeli chorób, w tym hodowli komórkowych, myszy, a nawet tkanek ludzkich.

Ogólnie rzecz biorąc, naukowcy nowicjusze w tej technice mają trudności, ponieważ ilość danych jest przytłaczająca. Może to być tysiąc razy więcej niż uzyskane przy użyciu tradycyjnego EM. Po utrwaleniu larw danio pręgowanego zgodnie z protokołem tekstowym, przytnij głowy larw rostralnie do tyłomózgowia, aby ułatwić penetrację osmu. Umieść larwy w 1% tetratlenku osmu, 1,5% żelazocyjanku potasu, w 0,1-molowym kakodylanie sodu i inkubuj na lodzie przez dwie godziny.

Następnie użyj podwójnie destylowanej wody, aby przepłukać zarodki trzy razy przez pięć minut za każdym razem. Przed zatopieniem próbki należy odwodnić w serii etanolu. Aby osadzić zarodki, po inkubacji w rozcieńczonej żywicy epoksydowej przez noc zgodnie z protokołem tekstowym, usuń rozcieńczoną żywicę i użyj czystej żywicy do jej zastąpienia.

Inkubować przez 30 minut, następnie wymień żywicę po raz drugi i inkubuj przez kolejne 30 minut. Po odświeżeniu żywicy po raz trzeci inkubować w temperaturze pokojowej przez trzy godziny. Następnie inkubować w temperaturze 58 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Na koniec inkubować pod niskim ciśnieniem w temperaturze pokojowej przez godzinę. Następnie, pod mikroskopem preparacyjnym, użyj igły lub wykałaczki, aby zorientować głowice w dostępnych na rynku silikonowych płaskich formach do zatapiania. Następnie polimeryzuj żywicę epoksydową w temperaturze 58 stopni Celsjusza przez noc.

Gdy próbka jest w pełni stwardniała, użyj żyletek, aby odciąć nadmiar żywicy z kikuta. Aby wykryć właściwe położenie, użyj noża do szkła lub diamentowego noża do histomu na ultramikrotomie, aby wyciąć półcienkie skrawki larw dla błękitu toluidynowego/fuksyny zasadowej. Przenieś półcienkie sekcje na szkiełka mikroskopowe, podnosząc je szklaną pipetą Pasteura, której końcówka została zamknięta przez stopienie jej w płomieniu.

Suszyć na gorącej płycie, aż nie pozostanie woda. Następnie umieść próbki w 1% błękitu toluidynowego w wodzie i inkubuj skrawki na gorącej płycie przez 10 sekund, aby je zabarwić. Następnie, po użyciu wody do przepłukania skrawków, użyj 05% zasadowej fuksyny w 1% tetraboranie sodu, aby zabarwić próbki przez dodatkowe 10 sekund.

Za pomocą normalnego mikroskopu świetlnego o powiększeniu od 10 do 40 razy zbadaj próbki. Po osiągnięciu właściwego miejsca lub orientacji należy użyć łatwych do zidentyfikowania struktur anatomicznych, w tym wgłębień węchowych, oczu lub granic istoty szarej i białej, aby zidentyfikować obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania podczas ultracienkiego cięcia i dostosować kąt cięcia, gdy próbka jest przechylona. Kontynuuj cięcie bloku żywicy epoksydowej nożem diamentowym, aby wyciąć ultracienkie odcinki 70 nanometrów.

Zamontuj każdą sekcję w jednym gnieździe L2 na 1 z miedzianej siatki z kodem kreskowym, aby umożliwić akwizycję bez przerywania przez pręty siatki. Milimetr kwadratowy może wydawać się mały. Po prostu zmieści się w otworze.

W ten sposób zapobiegamy blokowaniu naszej próbki przez paski siatki. Uświadom sobie, że każdy artefakt wprowadzony w naszej próbce zostanie zarejestrowany w porównaniu z tradycyjnym EM. Porównaj próbki z metalami ciężkimi zgodnie z protokołem tekstowym i przechowuj w pudełku z siatką. Aby zamontować próbkę w skaningowym mikroskopie elektronowym lub SEM, umieść siatkę ze skrzynki rozdzielczej z sekcją w uchwycie na próbki z wieloma siatkami i przenieś ją do komory SEM.

Po ustawieniu detektora zgodnie z protokołem tekstowym, należy wstępnie napromienić próbkę, pomniejszając tak, aby cały obszar do skanowania zmieścił się w oknie obrazu. Po zmianie przysłony na 120 mikrometrów i rozmyciu obrazu użyj opcji skanowania zredukowanego obszaru, aby zeskanowany obszar był jak najmniejszy. Następnie ustaw liczbę klatek na sekundę, aby zeskanować klatkę w około jedną do dwóch sekund.

Następnie powiększ co najmniej 100X i skanuj mały obszar przez 10 sekund. Jeśli jasność w obszarze nadal się zmienia, kontynuuj naświetlanie przed naświetlaniem. Gdy obszar ten nie zmienia jasności w porównaniu z otoczeniem, wystarczające jest wstępne naświetlanie.

Podczas ustawiania ostrości wybierz najjaśniejszy obszar lub obiekt i ustaw szybkość skanowania tak, aby szczegóły były widoczne. W oprogramowaniu mikroskopu dostosuj jasność i kontrast, uważnie obserwując histogram, aby wszystkie piksele pozostały w zakresie dynamicznym. Zrób to samo dla najciemniejszych obszarów i obiektów.

Wróć do jasnego obszaru i sprawdź ponownie, czy po obu stronach histogramu jest trochę miejsca. W przypadku kroków od czwartego szóstego do czwartego ósmego regulacja jasności i kontrastu musi być wykonana bardzo ostrożnie, aby cały obszar mieścił się w zakresie dynamicznym. Pomniejsz tak, aby cały obszar do skanowania zmieścił się w oknie wyobraźni i uruchom program akwizycji dużego obszaru.

Następnie użyj opcji kreatora, aby skonfigurować mozaikę, wybierając obszar z ekranu. Użyj rozmiaru piksela od dwóch do pięciu nanometrów, w zależności od tego, jakie szczegóły są niezbędne, i ustaw czas przebywania wynoszący trzy mikrosekundy dla skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej lub STEM. Naciśnij optymalizuj, aby sprawdzić ustawienia mikroskopu, a zostanie wyświetlony potrzebny czas.

Następnie ponownie włącz zewnętrzny generator skanowania i naciśnij kontynuuj. Aby przeanalizować dane STEM, otwórz przeglądarkę plików EM na dużą skalę i otwórz plik o nazwie mosaic info, który otworzy kafelkowe pliki tif. Wybierz opcję Automatycznie zszyj całą mozaikę i wybierz następujące parametry: tryb nakładania równa się połowie, próg zszywania równa się 0,90, a redukcja szumów równa się automatyczna.

Jeśli kryteria łączenia nie mogą być spełnione, powiększ i ręcznie umieść kafelek w odpowiednim miejscu, a następnie kliknij przycisk Kontynuuj tak, jak jest.Wyeksportuj dane jako plik HTML lub jako pojedynczy tif. Dołącz ostateczny rozmiar piksela i nazwę pliku, aby umożliwić późniejsze pomiary, a następnie przeanalizuj dane zgodnie z protokołem tekstowym. Jak pokazano tutaj, nanotomia kontrolnych odcinków mózgu ujawnia typowe cechy ultrastrukturalne tkanki nerwowej przodomózgowia rostralnego, w tym wiązki włókien węchowych, jądra neuronalne i podprzedziały neuronalne, w tym synapsy.

Tutaj struktury subkomórkowe obejmują różne morfologie jądrowe i ogniska w różnych typach komórek i organelli, w tym aparat Golgiego, retikulum endoplazmatyczne, mitochondria, pęcherzyki synaptyczne i gęstości postsynaptyczne. Nieoczekiwanie jądra komórek wyściełających komorę są bardzo gęste elektronowo w porównaniu z innymi komórkami rozproszonymi bardziej bocznie w mózgu. W mikrogleju jądra wykazują również ciemne ogniska, prawdopodobnie heterochromatynę, których nie ma w innych komórkach mózgu.

To zdjęcie wykonane przez EM na dużą skalę przedstawiające przekrój koronalny u larwy danio pręgowanego poddawanej ablacji neuronalnej ujawnia mikroglej fagocytarny. Cechy charakterystyczne dla mikrogleju w komórkach ssaków stwierdzono również w tych komórkach, w tym wyraźny aparat Golgiego i liczne inkluzje, takie jak lizosomy. Po opanowaniu akwizycji można ją przeprowadzić w ciągu jednego dnia, podczas gdy tradycyjny EM będzie Cię kosztował co najmniej tydzień.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby operator mikroskopu odgrywał kluczową rolę w uzyskiwaniu wysokiej jakości obrazów. To nie jest tylko technika naciskania przycisku. Teraz zastosowaliśmy nanotomię nie tylko do modelu zwyrodnienia neuronów u danio pręgowanego, ale także do znakowania immunologicznego komórek oraz do badania tkanek much, tkanek ludzkich i innych.

Ta technika toruje drogę każdemu badaczowi w każdej dziedzinie. Mogą oni ponownie zapoznać się ze zbiorami danych online na nanotomy.org. Następnie mogą badać domniemane zmiany, od skali nanometrowej do milimetrowej i wszystkie badane modele.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zastosować nanotomię do swojego pytania badawczego i systemu komórkowego lub tkankowego, który badasz. Nie zapominaj, że tylko profesjonalista powinien przygotować próbkę ze względu na toksyczne odczynniki i względy etyczne, ale każdy może wypróbować nanotomię na stronie internetowej. org w domu.