Name: Wielkoskalowa skaningowa transmisyjna mikroskopia elektronowa (nanotomia) mózgu zdrowego i uszkodzonego danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Poznaj metodę nanotomii do badania struktur mózgu zdrowego i uszkodzonego danio pręgowanego przy użyciu skaningowej mikroskopii elektronowej. Technika ta umożliwia analizę zmian neurodegeneracyjnych z rozdzielczością nanometryczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Większość prac została wykonana w Centrum Mikroskopii i Obrazowania UMCG (UMIC), które jest sponsorowane przez NWO 175-010-2009-023 i ZonMW 91111006; STW "Dolina mikroskopowa 12718" do B.N.G.G.. Praca ta była sponsorowana przez grant ZonMW VENI, grant Marie Curie na integrację zawodową (ratowanie umierających neuronów) oraz stypendium Alzheimer Nederland dla T.J.v.H.

Wszystkie eksperymenty na larwach danio pręgowanego zostały zatwierdzone przez Komitet Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu w Groningen zgodnie z wytycznymi krajowymi i unijnymi.
1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Utrwalanie i osadzanie
	<ol>
		<li>Utrwalenie
		<ol>
			<li>Znieczulić larwy ryb w wodzie danio pręgowanego (0,003%) dodane do E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, 10 mM HEPES, pH 7,6) i przetestować głębokość znieczulenia, delikatnie szturchając końcówką pipety o pojemności 200 μl pod mikroskopem preparacyjnym, aż ruch przestanie być wykrywany (ryc. 1A).</li>
			<li>Podczas przetwarzania próbek pod kątem korelacyjnego EM po uzyskaniu danych obrazowania in vivo za pomocą obrazowania konfokalnego lub 2 fotonów w 1,8% agarozie, jak opisano,5,15 utrwal larwy w agarozie za pomocą 4% PFA w PBS zawierającym Triton-X-100 (0,05%).</li>
			<li>Wytnij larwy z agarozy i przetwórz na dużą skalę EM5.</li>
			<li>Utrwal larwy w świeżym 4% paraformaldehydzie w PBS zawierającym Triton-X-100 (0,05%) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w plastikowych probówkach. 
			Uwaga: Komórki wyhodowane w hodowli (in vitro) mogą być bezpośrednio utrwalone w aldehydzie glutarowym, jak opisano w następnym kroku (1.1.1.5).</li>
			<li>Usunąć roztwór i dodać 100 μl 0,5% PFA, 2% aldehydu glutarowego (GA) i 0,1 M kakodylanu sodu (pH 7,4). Przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C. Próbki należy dwukrotnie płukać w 0,1 M kakodylanu sodu.</li>
			<li>Wytnij głowy larw rostralnie do tyłomózgowia, aby ułatwić penetrację osmu. Używaj cienkich strzykawek/kleszczyków.</li>
			<li>Larwy postfiksu w 1% tetratlenku osmu (OsO4)/1,5% żelazocyjanku potasu (K4[Fe(CN)6]) w 0,1 M kakodylanu sodu na lodzie przez 2 godziny i płukać 3 x 5 min w podwójnie destylowanymH2O.</li>
			<li>Odwodnić w etanolu przez 20 minut inkubacji w rosnących stężeniach etanolu (50%, 70%, 3 razy 100%).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Osadzanie
		<ol>
			<li>Przygotuj żywicę epoksydową zgodnie ze standardowymi recepturami stosowanymi w EM labs. 
			Uwaga: Żywicy epoksydowej używamy w następujący sposób: zmieszać 19,8 g eteru glicydowego 100, 9,6 g bezwodnika kwasu 2-dodecenylobursztynowego i 11,4 g bezwodnika metylonadynowego za pomocą mieszadła magnetycznego. Dodać 0,5 g DMP-30 (tris-(dimetyloaminometylo)fenol) i ponownie wymieszać.</li>
			<li>Wysiadywać larwy przez noc w 50% żywicy epoksydowej w etanolu (v/v) podczas obracania (RT).</li>
			<li>Zastąp rozcieńczoną żywicę epoksydową czystą żywicą. Inkubować przez 30 minut, ponownie dodać świeżą żywicę i inkubować przez kolejne 30 minut. Ponownie odświeżyć żywicę, a następnie inkubować przez 3 godziny w temperaturze pokojowej, następnie przez 15 minut w temperaturze 58 °C i przez kolejną 1 godzinę w temperaturze pokojowej pod niskim ciśnieniem (200 mbar).</li>
			<li>Ustaw głowice w dostępnych na rynku silikonowych płaskich formach do zatapiania pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą igły lub wykałaczki z przodem skierowanym w stronę formy lub w razie potrzeby (Rysunek 1B).</li>
			<li>Polimeryzować żywicę epoksydową przez noc w temperaturze 58 °C. Jeśli żywica epoksydowa jest nadal zbyt miękka, odczekaj kolejny dzień na polimeryzację i stwardnienie w temperaturze 58 °C. Zbadaj sztywność, wywierając nacisk za pomocą kleszczy. Jeśli to łatwo pozostawia wgłębienie, odczekaj kolejny dzień na polimeryzację i stwardnienie w temperaturze 58 °C. Gdy próbka jest w pełni stwardniała, przystąp do przycinania i krojenia.</li>
			<li>Odetnij nadmiar żywicy z króćca za pomocą żyletek (Rysunek 1B).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podział na sekcje, kontrasty i montaż
	<ol>
		<li>Cięcia
		<ol>
			<li>Przeciąć blok żywicy epoksydowej za pomocą ultramikrotomu.</li>
			<li>Użyj noża do szkła lub diamentowego noża do histonoża, aby wyciąć półcienkie odcinki (500 nm) w celu barwienia błękitem toluidynowym/zasadową fuksyną (ryc. 1D), aby wykryć właściwe położenie.</li>
			<li>Przenieś półcienkie odcinki na szkiełkach mikroskopowych, podnosząc je szklaną pipetą Pasteura, której końcówka została zamknięta przez stopienie w płomieniu. Suszyć na gorącej płycie, aż nie pozostanie woda. Barwieć przez 10 sekund 1% błękitem toluidynowym w wodzie na gorącej płycie i po spłukaniu wodą barwić przez 10 sekund 0,05% fuksyny zasadowej w 1% tetraboranie sodu. Zbadaj za pomocą normalnego mikroskopu świetlnego przy 10X do 40X.</li>
			<li>Po osiągnięciu właściwego miejsca/orientacji w mózgu, kontynuuj cięcie bloku żywicy epoksydowej nożem diamentowym, aby wyciąć ultracienkie odcinki (~ 70 nm; Rysunek 1E)</li>
			<li>Używaj łatwych do zidentyfikowania struktur anatomicznych w mózgu i wokół niego, w tym wgłębień węchowych, oczu, granic istoty szarej i białej, aby zidentyfikować obszar zainteresowania podczas ultracienkiego przekroju i dostosować kąt cięcia, gdy próbka jest przechylona.</li>
			<li>Zamontuj sekcję na miedzianych siatkach L2 x 1 z pojedynczym gniazdem (Rysunek 1F), aby umożliwić akwizycję bez przerywania przez pręty siatki. Użyj siatek powlekanych Formvar do podparcia sekcji.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Kontrastujące
		<ol>
			<li>Barwieć ultracienkie skrawki na siatkach przez 2 minuty w 2% octanie uranylu w metanolu, a następnie cytrynianem ołowiu Reynoldsa przez kolejne 2 minuty 16.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Akwizycja obrazu
<ol>
	<li>Duża skala STEM 
	Uwaga: Używamy skanowania EM z zewnętrznym generatorem skanowania, który jest w stanie uzyskać wiele dużych pól widzenia w wysokiej rozdzielczości3,5,7,17 przy użyciu wykrywania STEM. Zazwyczaj jeden obraz wygenerowany w ten sposób odpowiada polom widzenia ~ 100 obrazów z transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM), co znacznie zmniejsza ilość ściegów.
	<ol>
		<li>Montaż próbki w mikroskopie
		<ol>
			<li>Umieścić siatkę z sekcją w uchwycie na próbkę z wieloma siatkami i przenieść do komory SEM.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ustawienie detektora STEM
		<ol>
			<li>Umieść siatkę z próbką pod belką i przesuń ją w górę tak, aby znajdowała się ok. 5 mm od bieguna soczewki. Uzyskaj obraz przy napięciu 20 kV za pomocą detektora w obiektywie.</li>
			<li>Skoncentruj się na krawędzi siatki i dostosuj odległość roboczą do 4,0 mm.</li>
			<li>Przesuń uchwyt próbki do bezpiecznej pozycji i włóż detektor STEM.</li>
			<li>Wyśrodkuj otwór detektora STEM w polu obrazu, obracając regulacyjne podczas obrazowania z maksymalną prędkością za pomocą detektora w obiektywie.</li>
			<li>Ostrożnie przynieś uchwyt na próbkę, który będzie pasował między słupek obiektywu a detektor.</li>
			<li>Uzyskaj obraz za pomocą detektora w obiektywie, aby upewnić się, że znajdujesz się w obszarze przekroju.</li>
			<li>Przełącz się na wykrywanie STEM (średnie wzmocnienie i wszystkie ćwiartki ustawione na "minus") i uzyskaj obraz oraz wybierz obszar do skanowania.</li>
			<li>Podnieś napięcie przyspieszenia do 21 kV i poczekaj na ustabilizowanie się wiązki (ponownie stabilny obraz), a następnie przejdź do 29 kV w krokach co 2 kV.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Pozyskiwanie obrazów
		<ol>
			<li>Wstępnie naświetlić próbkę (aby zapobiec zmianom jasności spowodowanym przez wiązkę elektromagnetyczną), pomniejszając tak, aby cały obszar do skanowania pasował do okna obrazu.</li>
			<li>Zmień aperturę na 120 μm (aby zachować odpowiedni zakres dynamiki, wzmocnienia detektora muszą być zmniejszone o jeden stopień).</li>
			<li>Rozmycie powoduje, że obraz jest rozmyty.</li>
			<li>Spraw, aby skanowany obszar był jak najciaśniejszy, korzystając z opcji skanowania zredukowanego obszaru.</li>
			<li>Ustaw szybkość skanowania tak, aby klatka była skanowana w czasie ok. 1 - 2 sek. 
			Uwaga: W zależności od rozmiaru i tkanki trwa to zwykle od 1/2 godziny (pole widzenia 100 x 100 μm) do 3 godzin (1 000 x 500 μm).</li>
			<li>Powiększ co najmniej 100x i zeskanuj mały obszar przez 10 sek. 
			Uwaga: Jeśli obszar ten nie zmienia jasności w porównaniu z otoczeniem, wystarczające jest wstępne naświetlanie.</li>
			<li>Przywróć aperturę 30 μm (i wzmocnienie STEM na średnim)</li>
			<li>Skoncentruj się na próbce.</li>
			<li>Wyrównaj przysłonę za pomocą woblera (przy powiększeniu ~ 40 000X).</li>
			<li>Podczas ustawiania ostrości wybierz najjaśniejszy obszar/funkcję, ustaw prędkość skanowania tak, aby szczegóły były widoczne.</li>
			<li>W mikroskopie oprogramowanie dostosuj jasność i kontrast, uważnie obserwując histogram, aby utrzymać wszystkie piksele w zakresie dynamicznym. Zrób to samo dla najciemniejszego obszaru/obiektów.</li>
			<li>Wróć do jasnego obszaru i sprawdź ponownie. Bądź po bezpiecznej stronie, aby po obu stronach histogramu było trochę miejsca.</li>
			<li>Pomniejsz obraz, aby cały obszar do skanowania zmieścił się w oknie obrazowania, a następnie uruchom program akwizycji dużego obszaru.</li>
			<li>Użyj opcji kreatora, aby skonfigurować mozaikę, wybierając obszar z ekranu. Użyj rozmiaru piksela 2 - 5 nm w zależności od tego, jakie szczegóły są niezbędne. Użyj czasu przebywania 3 μs dla STEM.</li>
			<li>Wybierz opcję "autofokus na poprzednim kafelku", użyj oprogramowania do akwizycji na dużą skalę autofokus z domyślnymi ustawieniami firmy, zaznacz pole "sprawdź ustawienie przed wykonaniem" i określ, gdzie zapisać dane.</li>
			<li>Naciśnij "optymalizuj", aby sprawdzić ustawienia mikroskopu. 
			Uwaga: Teraz zostanie pokazany potrzebny czas. Może to trwać do 72 godzin w przypadku obszarów o wymiarach 1 x 0,5 mm.</li>
			<li>W oknie "maksymalna rozdzielczość kafelków" wpisz 20 000, aby poszczególne kafelki nie były większe niż 20k x 20k, zapobiegając efektom krawędzi. Naciśnij "wykonaj".</li>
			<li>Gdy zostaniesz poproszony o sprawdzenie ostrości i jasności/kontrastu (B/C), wyłącz zewnętrzny generator skanowania i ostrożnie dostosuj ostrość i astygmatyzm w oprogramowaniu mikroskopu. Nie zmieniaj B/C. 
			Uwaga: Stół montażowy można przesuwać i zmieniać powiększenie, ale powiększenie musi być ustawione z powrotem na żądany rozmiar piksela.</li>
			<li>Ponownie włącz zewnętrzny generator skanowania i naciśnij "kontynuuj".</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza danych
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Otwórz przeglądarkę plików EM na dużą skalę i otwórz plik "informacje o mozaice". Spowoduje to otwarcie wszystkich kafelkowych plików tif. Najlepiej jest to zrobić na innej stacji roboczej, aby nie utrudniać nowych przejęć.</li>
	<li>Wybierz opcję "automatyczne ścieganie całej mozaiki" (parametry trybu nakładania się na pół, próg ściegu 0,90, automatyczna redukcja szumów. W przypadku, gdy kryteria łączenia nie mogą być spełnione, powiększ i ręcznie umieść płytkę w odpowiednim miejscu, a następnie kliknij "kontynuuj tak, jak jest").</li>
	<li>Eksportuj jako plik html lub jako pojedynczy plik TIF. 
	Należy pamiętać, że w przypadku eksportu TIF może być konieczne skalowanie w dół. Uwzględnij ostateczny rozmiar piksela w nazwie pliku, aby umożliwić późniejsze pomiary.</li>
	<li>Wykonaj adnotacje w pliku TIF, otwierając go w programie do edycji obrazów. Równolegle otwórz plik html z możliwością powiększania w przeglądarce internetowej, aby uzyskać optymalną obserwację rozdzielczości.</li>
</ol>

<ol><li>Faas, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+nanoscopy%3A+generation+of+ultra-large+high+resolution+electron+microscopy+maps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Virtual nanoscopy: generation of ultra-large high resolution electron microscopy maps.</a> J Cell Biol. 198, 457-469 (2012).</li>
<li>Kuipers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLIPPER%2C+a+combinatorial+probe+for+correlated+live+imaging+and+electron+microscopy%2C+allows+identification+and+quantitative+analysis+of+various+cells+and+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">FLIPPER, a combinatorial probe for correlated live imaging and electron microscopy, allows identification and quantitative analysis of various cells and organelles.</a> Cell Tissue Res. 360, 61-70 (2015).</li>
<li>Kuwajima, M., Mendenhall, J. M., Lindsey, L. F., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+transmission-mode+scanning+electron+microscopy+%28tSEM%29+for+large+volume+analysis+at+nanoscale+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated transmission-mode scanning electron microscopy (tSEM) for large volume analysis at nanoscale resolution.</a> PLoS One. 8, e59573(2013).</li>
<li>Ravelli, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Destruction+of+tissue%2C+cells+and+organelles+in+type+1+diabetic+rats+presented+at+macromolecular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Destruction of tissue, cells and organelles in type 1 diabetic rats presented at macromolecular resolution.</a> Sci Rep. 3, 1804(2013).</li>
<li>van Ham, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+correlated+microscopy+reveals+differential+macrophage+and+microglial+dynamics+during+resolution+of+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Intravital correlated microscopy reveals differential macrophage and microglial dynamics during resolution of neuroinflammation.</a> Dis Model Mech. 7, 857-869 (2014).</li>
<li>Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+EM+of+non-heavy+metal+stained+biosamples%3A+Large-field+of+view%2C+high+contrast+and+highly+efficient+immunolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling.</a> Exp Cell Res. 15477, 202-207 (2015).</li>
<li>Sokol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Scale+Electron+Microscopy+Maps+of+Patient+Skin+and+Mucosa+Provide+Insight+into+Pathogenesis+of+Blistering+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Large-Scale Electron Microscopy Maps of Patient Skin and Mucosa Provide Insight into Pathogenesis of Blistering Diseases.</a> J Invest Dermatol. 135, 1763-1770 (2015).</li>
<li>de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+light+and+electron+microscopy%3A+Ultrastructure+lights+up%21+Nat+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Correlated light and electron microscopy: Ultrastructure lights up! Nat Methods.</a> Nat Methods. 12, 503-513 (2015).</li>
<li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nat Methods. 12, 51-54 (2015).</li>
<li>Helmstaedter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connectomic+reconstruction+of+the+inner+plexiform+layer+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina.</a> Nature. 500, 168-174 (2013).</li>
<li>Oosterhof, N., Boddeke, E., van Ham, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+dynamics+in+the+CNS%3A+Learning+from+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Immune cell dynamics in the CNS: Learning from the zebrafish.</a> Glia. 63, 719-735 (2015).</li>
<li>van Ham, T. J., Kokel, D., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cells+are+cleared+by+directional+migration+and+elmo1-+dependent+macrophage+engulfment%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cells are cleared by directional migration and elmo1- dependent macrophage engulfment.</a> Curr Biol. 22, 830-836 (2012).</li>
<li>Davison, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transactivation+from+Gal4-VP16+transgenic+insertions+for+tissue-specific+cell+labeling+and+ablation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Transactivation from Gal4-VP16 transgenic insertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish.</a> Dev Biol. 304, 811-824 (2007).</li>
<li>Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+Gal4+genetics+for+permanent+gene+expression+mapping+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 13365-13370 (2009).</li>
<li>van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+apoptotic+cells+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Live imaging of apoptotic cells in zebrafish.</a> FASEB J. 24, 4336-4342 (2010).</li>
<li>Reynolds, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+lead+citrate+at+high+pH+as+an+electron-opaque+stain+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy.</a> J Cell Biol. 17, 208-212 (1963).</li>
<li>Kuwajima, M., Mendenhall, J. M., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-volume+reconstruction+of+brain+tissue+from+high-resolution+serial+section+images+acquired+by+SEM-based+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Large-volume reconstruction of brain tissue from high-resolution serial section images acquired by SEM-based scanning transmission electron microscopy.</a> Methods Mol Biol. 950, 253-273 (2013).</li>
<li>Stensaas, L. J., Reichert, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Round+and+amoeboid+microglial+cells+in+the+neonatal+rabbit+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Z+Zellforsch+Mikrosk+Anat%22%5BJournal%5D)">Round and amoeboid microglial cells in the neonatal rabbit brain.</a> Z Zellforsch Mikrosk Anat. 119, 147-163 (1971).</li>
<li>Mori, S., Leblond, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+microglia+in+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Identification of microglia in light and electron microscopy.</a> J Comp Neurol. 135, 57-80 (1969).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

EM umożliwia analizę kontekstu komórkowego z obrazowaniem makrocząsteczek w wysokiej rozdzielczości w kontekście biologicznym. Zazwyczaj jednak ogranicza to pole widzenia. Technologia 3D EM na większą skalę jest szczególnie przydatna do mapowania połączeń neuronalnych poprzez tworzenie trójwymiarowych rekonstrukcji w nanoskali, co wymaga złożonego przetwarzania danych10. W przeciwieństwie do tego, EM 2D na dużą skalę wymaga tylko jednego przekroju i zszywania danych obrazowych, a ocena danych jest możliwa przez każdego, kto ma dostęp do przeglądarki internetowej. My i inni wcześniej używaliśmy EM na dużą skalę do analizy tkanek i całych zwierząt. Podobnie jak w przypadku większości podejść, szwy oparte na TEM i SEM mają swoje zalety. Zastosowano tu transmisję skaningową EM (STEM), która pozwala na generowanie dużego pola widzenia w wysokiej rozdzielczości. Zazwyczaj jeden obraz STEM odpowiada polom widzenia około 100 obrazów TEM, co znacznie zmniejsza ilość szwów podczas obrazowania dużych pól widzenia w wysokiej rozdzielczości. Jeśli potrzebna jest wyższa rozdzielczość, TEM może być korzystny. STEM ma tę przewagę nad TEM, że próbki niekontrastowe mogą być używane z dobrym kontrastem ultrastrukturalnym6 .
Dodatkowo, opisana tutaj metoda może być łatwo dostosowana do użytku z detekcją elektronów wstecznie rozproszonych (BSD) na sekcjach zamontowanych na płytkach krzemionkowych, rozszerzając zastosowanie na wiele systemów mikroskopowych. Pliki EM tkanek z możliwością powiększania w formacie HTML są bardzo przydatne do kwantyfikacji, udostępniania danych, które mogły nie zostać przeanalizowane do pełnej zawartości, łączenia danych LM i EM (CLEM)8, do celów prezentacji w badaniach naukowych, do analizy danych pacjentów oraz do edukacji. Alternatywnie, w wielkoskalowych EM w SEM, ale nie w TEM, można zastosować płytki krzemionkowe, co ma dwie główne zalety: Można zastosować BSD, które jest bardziej ogólnie dostępne w skaningowych mikroskopach elektronowych niż detekcja STEM. Po drugie, montaż dużych odcinków (> 1 mm2 obszary zainteresowania) jest prosty. Montaż na pojedynczych rusztach szczelinowych jest pracochłonny i trudny technicznie. Szczegółowe porównanie między TEM, SEM i STEM jest szczegółowo opisane w innym miejscu6. Wadą obrazowania BSD jest to, że w porównaniu z STEM obrazy mają zwiększony szum. Można to częściowo zrekompensować poprzez wydłużenie czasu przebywania pikseli, co skutkuje znacznie dłuższym czasem akwizycji.
Chociaż do przygotowania próbki potrzebna jest stosunkowo standardowa obróbka EM (utrwalanie, osadzanie i cięcie)5-7 , cięcie dużych ultracienkich odcinków całkowicie pozbawionych artefaktów jest technicznie trudne. Sekcje są bardzo delikatne, łatwo się łamią, składają lub ulegają zniszczeniu podczas obrazowania, co zwykle zajmuje wiele godzin na zestaw danych. Jednak ze względu na udostępnianie w internecie nieprzetworzonych, bezstronnych danych, powinno stać się możliwe łatwiejsze porównywanie ich z danymi publikowanymi i wykorzystywanie opublikowanych zbiorów danych w otwartej domenie jako elementów kontrolnych. Obecnie w użyciu jest niewiele urządzeń EM zdolnych do analizy na dużą skalę, a zatem dostęp do tej techniki jest nieco ograniczony, chociaż większość ośrodków obrazowania z zadowoleniem przyjmuje wspólne wysiłki.
W przypadku dużych odcinków tkanka musi być odpowiednio utrwalona w całej próbce. Dlatego stosuje się mieszaninę szybkiego, ale umiarkowanego utrwalacza PFA w połączeniu z powolnym, ale silnym utrwalaczem GA. Cięcie i zbieranie dużych odcinków bez artefaktów jest trudne. Praca z waflami w połączeniu z BSD jest łatwiejsza w porównaniu do zbierania sekcji na siatkach z pojedynczymi otworami. Barwienie po metalach ciężkich jest bardziej krytyczne w porównaniu z klasycznym EM. Ponieważ cała sekcja jest zobrazowana, każdy artefakt będzie widoczny. Użytkownicy TEM zazwyczaj mają trudności z przejściem na SEM ze względu na różnicę w działaniu mikroskopu.
Kwantyfikacja i udostępnianie danych - Kwantyfikacja cech subkomórkowych jest trudna w przypadku pojedynczych obrazów EM. Możliwość powiększania i pomniejszania obrazów wielkoskalowych umożliwia łatwą identyfikację interesujących komórek, po której można przeprowadzić pomiary w skali nano wewnątrz komórek. Te zestawy danych wskazują, że określone typy komórek można szybko zidentyfikować i określić ilościowo w sposób bezstronny w tych dużych odcinkach tkanki, w oparciu o cechy wykrywalne w różnych skalach. Na przykład mikroglej można zidentyfikować na podstawie jego morfologii i gęstej cytoplazmy. Następnie, po powiększeniu poszczególnych komórek, subkomórkowe i molekularne cechy tych komórek w nanoskali można zmierzyć w ramach tego samego zestawu danych, jak wcześniej pokazaliśmy dla szerokości ER w dużym zestawie danych hodowli tkankowej EM2. Dodatkową zaletą nanotomii jest to, że hosting dużych zbiorów danych online pozwoli innym na sprawdzenie danych, być może pod kątem innych cech, i wyciągnięcie wniosków na podstawie nowej hipotezy.
CLEM - Oprócz ułatwienia ilościowego EM, EM na dużą skalę ułatwia skorelowanie etykietowania pod mikroskopem świetlnym z poziomem EM8. W niniejszym przykładzie pokazano obecność mikrogleju fagocytarnego w modelu ablacji danio pręgowanego. Głównym pytaniem w neurobiologii jest to, jakie są indywidualne funkcje i wkład mikrogleju i potencjalnych innych źródeł komórek fagocytarnych i odpornościowych. Wczesne badania EM wykazały charakterystyczne subkomórkowe cechy mikrogleju w chorobie18. Niestety, trudno jest selektywnie oznaczać mikroglej, zwłaszcza w warunkach patologicznych, ponieważ wykazują one duże nakładanie się na siebie innych komórek odpornościowych pod względem ekspresji, morfologii i funkcji genów. Dlatego nie jest jasne, czy i kiedy mikroglej na poziomie ultrastrukturalnym różni się od komórek odpornościowych z innych źródeł, w tym makrofagów naciekających pochodzących z monocytów. Zrozumienie, czy istnieją różnice ultrastrukturalne między tymi komórkami, będzie punktem wyjścia do analizy różnic funkcjonalnych. Połączenie selektywnych markerów transgenicznych lub ekspresyjnych i CLEM umożliwia wykrycie cech ultrastrukturalnych selektywnych dla określonych populacji.
Diagnoza, prezentacja i edukacja - Dzięki wizualizacji od nanoskali do mikroskali w ramach jednego zestawu danych, dane EM są znacznie ułatwione dla szerokiego grona odbiorców. Wraz ze zwiększonymi możliwościami i narzędziami do korelacyjnego i wielkoskalowego EM przewidujemy odrodzenie EM w badaniach podstawowych i medycznych. Nasza metoda przedstawiona tutaj jest stosowana do modelu uszkodzenia mózgu danio pręgowanego5, ale została zastosowana na tkance ludzkiej7, mózgu szczura3, w modelu szczura na cukrzycę4 i w hodowli komórkowej2, a także może być stosowana w połączeniu z podejściem opartym na TEM1 , co pokazuje wszechstronność tej metody. Operator mikroskopu nie rejestruje już wysoce wyselekcjonowanych, a tym samym tendencyjnych obrazów, ale wszystkie liczne cechy ultrastrukturalne są rejestrowane i dostępne do analizy na całym świecie.

Ostatnie osiągnięcia techniczne poprawiły wszechstronność, stosowalność i ilościowy charakter EM, prowadząc do odrodzenia analizy ultrastrukturalnej. Postępy obejmują 3D EM, wielkoskalową 2D EM oraz ulepszone metody i odczynniki do skorelowanej mikroskopii świetlnej i mikroskopii elektronowej (CLEM) w celu porównania innych trybów analizy mikroskopowej bezpośrednio z poziomem EM8-10. Wielkoskalowa technologia 2D EM jest szczególnie przydatna do ilościowego określania lub identyfikacji (nowych) cech chorobowych patologii człowieka, badania modeli zwierzęcych pod kątem chorób i modeli kultur tkankowych. Ze względu na typowo małe pole widzenia trudno jest skorelować zmiany przy dużym powiększeniu ze skalą obejmującą całą tkankę, a także obiektywnie i ilościowo analizować cechy ultrastrukturalne.
Do analizy patologicznej tkanek ludzkich lub oceny patologii w modelach zwierzęcych, standardem są kolorowe sekcje hematooksyliny i eozyny (H&E) w tkance zatopionej w formaldehydzie (FFPE). Oprócz prostego barwienia H&E wykonuje się również znakowanie immunologiczne w celu identyfikacji nieprawidłowości patologicznych. Gdyby takie tkanki można było analizować na poziomie EM, można by zidentyfikować określone typy komórek i zmiany subkomórkowe. Bezstronny charakter EM na dużą skalę pozwala na znalezienie nieoczekiwanych i nowych cech choroby. Dzięki dużej skali można wizualizować obszary EM do milimetrów kwadratowych. My i inni wcześniej zastosowaliśmy nanotomię do wysp trzustkowychszczura 4, hodowli komórkowej2, mózgu szczura3, skóry i błony śluzowej7 oraz całych larw danio pręgowanego1,5 (www.nanotomy.org). Danio pręgowany doskonale nadaje się do obrazowania in vivo, w szczególności do wizualizacji typów komórek, które są trudno dostępne w tkankach ssaków, w tym w komórkach odpornościowych mózgu11. Tutaj szczegółowo opisano procedurę nanotomii, zastosowaną do przekrojów czołowych głów danio pręgowanego poddawanych warunkowej ablacji neuronalnej poprzez konwersję metronidazolu przez neuronalną ekspresję nitroreduktazy (www.nanotomy.org)5,12-14. Wszystkie surowe dane są prezentowane jako pliki HTML z możliwością powiększania, wizualizujące zmiany w skali molekularnej do tkankowej. Prezentacja surowych danych pozwala na bezstronną analizę zbiorów danych pod innym kątem przez ekspertów z całego świata.

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>low topnia agaroza</td><td>VWR</td><td>444152G</td><td></td></tr><tr><td>trikaina</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>aldehyd glutarowy</td><td>Polysciences</td><td>1909</td><td></td></tr><tr><td>kakodylan sodu</td><td>Sigma</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>tetratlenek osmu</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>19114</td><td></td></tr><tr><td>żelazocyjanek potasu (K4[Fe(CN)]6)</td><td>Merck</td><td>4984</td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>VWR</td><td>20821.365</td><td></td></tr><tr><td>octan uranylu&nbsp;</td><td>Merck</td><td>8473</td><td></td></tr><tr><td>tetraboran sodu</td><td>Merck</td><td>1063808</td><td></td></tr><tr><td>błękit toluidenowy</td><td>Merck</td><td>1273</td><td></td></tr><tr><td>zasadowa fuksyna</td><td>BDH</td><td>340324</td><td></td></tr><tr><td>cytrynian ołowiu</td><td>BDH</td><td>wycofane z produkcji</td><td></td></tr><tr><td>EPON</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-dodecenylsuccinicacid anhydride&nbsp;</td><td>Serva</td><td>20755</td><td></td></tr><tr><td>bezwodnik metylonadowy</td><td>Serva</td><td>29452</td><td></td></tr><tr><td>eter glicydowy 100</td><td>Serva</td><td>21045</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30&nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>553</td><td></td></tr><tr><td>standardowa płaska forma do zatapiania</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>70901</td><td></td></tr><tr><td>nóż diamentowy</td><td>Diatome Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siatki miedziane&nbsp;</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki dwustronna taśma węglowa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauka skaning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EM Zeiss Supra55</td><td>Ultramikrotom Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica EM UC7</td><td>Zewnętrzny</td> generator skanowania Leica <td></td><td></td></tr><tr><td>Atlas&nbsp;</td><td>Zasady fibicyjne</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wielkoskalowa skaningowa transmisyjna mikroskopia elektronowa (nanotomia) mózgu zdrowego i uszkodzonego danio pręgowanego

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Wielkoskalowa mikroskopia elektronowa 2D (EM), czyli nanotomia, to zastosowanie mikroskopii elektronowej o rozdzielczości nanoskalowej w całej tkance. Inni i my wcześniej zastosowaliśmy EM na dużą skalę do ludzkiej skóry wysp trzustkowych, hodowli tkankowych i całych larw danio pręgowanego1-7. W tym miejscu opisujemy uniwersalną metodę skanowania EM w skali tkankowej w celu bezstronnego wykrywania cech subkomórkowych i molekularnych. Nanotomię zastosowano do zbadania zdrowego i neurodegeneracyjnego mózgu danio pręgowanego. Nasza metoda opiera się na znormalizowanych protokołach przygotowania próbek EM: utrwalanie za pomocą aldehydu glutarowego i osmu, a następnie zatapianie w żywicy epoksydowej, ultracienkie cięcie i montaż ultracienkich przekrojów na siatkach jednootworowych, a następnie barwienie po zakończeniu uranylem i ołowiem. Wielkoskalowe obrazy mozaiki 2D EM są pozyskiwane za pomocą skanującego EM podłączonego do zewnętrznego generatora skanowania dużego obszaru za pomocą skanowania transmisyjnego EM (STEM). Obrazy EM o dużej skali mają zazwyczaj rozmiar ~ 5 - 50 G pikseli i najlepiej oglądać je za pomocą plików HTML z możliwością powiększania, które można otworzyć w dowolnej przeglądarce internetowej, podobnie jak w przypadku geograficznych map HTML online. Metoda ta może być stosowana do tkanek (ludzkich), przekrojów całych zwierząt, a także do hodowli tkankowych1-5. W tym przypadku mózgi danio pręgowanego analizowano w nieinwazyjnym modelu ablacji neuronów. W ramach jednego zestawu danych wizualizujemy zmiany tkankowe, komórkowe i subkomórkowe, które można określić ilościowo w różnych typach komórek, w tym neuronach i mikrogleju, makrofagach mózgu. Ponadto nanotomia ułatwia korelację EM z mikroskopią świetlną (CLEM)8 na tej samej tkance, ponieważ duże powierzchnie wcześniej zobrazowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej mogą być następnie poddane działaniu EM o dużym obszarze, co skutkuje nanoanatomią (nanotomią) tkanek. Podsumowując, nanotomia pozwala na bezstronne wykrywanie cech na poziomie EM w wymierny sposób obejmujący całą tkankę.

Wielkoskalowy zestaw danych EM z przekrojów wieńcowych głowy tygodniowych larw zebrafish pokazuje wiele cech tkankowych i komórkowych na pojedynczym obrazie w dużej skali (www.nanotomy.org).
Nanotomia kontrolnych przekrojów mózgu ujawnia typowe cechy ultrastrukturalne tkanki nerwowej rostralnej części przedmózgowia, w tym pęczki włókien węchowych, jądra neuronalne oraz podkompartymenty neuronalne, w tym synapsy (Ryc. 2A, www.nanotomy.org). Wśród rozróżnialnych typów komórek w głowie znajdują się chondrocyty z dużymi wakuolami w żuchwie, osmiofilna mielina komórek nerwu węchowego oraz komórki śródbłonka małego naczynia; struktury obejmują meninx (odpowiednik opon mózgowych u danio pręgowanego, błoniastą warstwę otaczającą mózg ssaków). Struktury subkomórkowe obejmują glikokaliks naskórka, zróżnicowane morfologie i ogniska jądrowe w różnych typach komórek oraz organelle, w tym aparat Golgiego, retikulum endoplazmatyczne (ER), mitochondria, pęcherzyki synaptyczne i gęstości postsynaptyczne.
Nieoczekiwanie jądra komórek wyścielających komorę są bardzo gęste elektronowo w porównaniu z innymi komórkami rozproszonymi bardziej bocznie w mózgu. Ponadto jądra komórkowe w obrębie komory wykazują ciemne ogniska, które nie występują w innych komórkach mózgu i różnią się rozmiarem oraz strukturą od heterochromatyny obecnej w jądrach fagocytującej mikroglejów (Rysunek 2). Komórki wyścielające komorę u rozwijającego się danio pręgowanego to głównie komórki gleju radialnego i progenitory neuronalne, co może odzwierciedlać inny stan chromatyny niż w komórkach bardziej zróżnicowanych. Ponieważ komórki macierzyste w tkankach są zazwyczaj dość rzadkie, nanotomia służąca do korelacji znakowania tkankowego markerami komórek macierzystych z EM w skali tkankowej mogłaby zatem zostać wykorzystana do identyfikacji cech ultrastrukturalnych komórek macierzystych.
Wielkoskalowa EM (www.nanotomy.org) przekroju czołowego larwy danio pręgowanego poddanej ablacji neuronalnej ujawnia wiele specyficznych tkanek oraz cech komórkowych i molekularnych, których nie stwierdzono u zwierząt kontrolnych. Cechy komórkowe obejmują fagocytującą mikrogleję oraz wakuole o rozmiarach komórek, prawdopodobnie reprezentujące obumierające komórki (Ryc. 2B, www.nanotomy.org). Poprzednie badania EM zidentyfikowały mikrogleję u kręgowców18,19. Charakterystyczne cechy mikroglei obejmują wydłużone jądra, skupiska łacistej chromatyny przy otoczce jądrowej, wyraźny aparat Golgiego, wolne polirybosomy, ziarnisty retikulum endoplazmatyczne (ER) z długimi, wąskimi cysternami, stosunkowo ciemną/gęstą cytoplazmę oraz liczne inkluzje, takie jak fagosomy, krople lipidowe i lizosomy. Wszystkie te cechy, przypisywane mikroglei w tkankach ssaków, stwierdzono również w tych komórkach w mózgach danio pręgowanego (Ryc. 2B, www.nanotomy.org).
<img alt="Proces mikroskopii danio pręgowanego; schemat przetwarzania obrazów; eksport TIF; konfiguracja mikroskopii elektronowej." src="/files/ftp_upload/53635/53635fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat wielkoskalowej mikroskopii elektronowej tkanek mózgu danio pręgowanego. (A) 7-dniowa larwa danio pręgowanego. (B) Główki larw danio pręgowanego zatopione obok siebie w żywicy epoksydowej. (C) Nóż szklany do wycinania skrawków półcienkich i orientacji preparatu. (D) Reprezentatywny skrawek półcienki barwiony błękitem toluidyny, przedstawiający dwie zatopione obok siebie larwy danio pręgowanego. (E) Nóż diamentowy do wycinania skrawków ultrascienkich (70 nm). (F) Zmodyfikowany obraz z (D) przedstawiający przekrój całego mózgu larwy danio pręgowanego na siatce jednodziurkowej w celu wskazania rozmieszczenia. (G) System mikroskopowy wykorzystany do wielkoskalowej EM 2D w niniejszym badaniu. (H) Schemat przetwarzania obrazów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53635/53635fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia elektronowa porównująca grupę kontrolną i ablację neuronalną przy powiększeniu 1x, 10x i 100x." src="/files/ftp_upload/53635/53635fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Wyniki nanotomii: od makrocząsteczki do tkanki. (A) Nanotomia mózgów grupy kontrolnej oraz (B) grupy poddanej działaniu (ablacja neuronalna; Rysunek 1) 7 dni po zapłodnieniu, wykazująca cechy charakterystyczne dla zdegenerowanego mózgu po ablacji neuronalnej. (B) Obejmują one fagocytarną mikrogleję, ciemne komórki w procesie śmierci komórkowej oraz gąbczasty wygląd tkanki nerwowej ((A) i (B)). Panele górne (adaptacja z5): widok przy powiększeniu 10X obszaru wskazanego w panelach środkowych. Panele środkowe: widok przy powiększeniu 10X obszaru wskazanego w panelach dolnych. (A, panel środkowy) Widok przy dużym powiększeniu neuropila pokazujący synapsę w (A, panel dolny), pęcherzyki synaptyczne (SVs) i gęstość postsynaptyczną (PD). (B, panel środkowy) Widok przy dużym powiększeniu amoeboidalnej mikroglei lub prawdopodobnie makrofaga (panel środkowy, M) wykazujący typowe cechy amoeboidalnej mikroglei (panel dolny), w tym wyraźny aparat Golgiego (G) oraz inkluzje, w tym wakuole lizosomalne (L). Paski skali: 50 µm (góra), 5 µm (środek) i 0.5 µm (dół). Rysunek został zmodyfikowany na podstawie5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53635/53635fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku</a> lub odwiedź pełne dane online (nanotomy.org).

Wielkoskalowa mikroskopia elektronowa 2D (EM), czyli nanotomia, to ogólnotkankowe zastosowanie nanoskalowej rozdzielczości EM. W tym miejscu opisujemy uniwersalną metodę nanotomii stosowaną do badania mózgu larw danio pręgowanego w zdrowiu i po nieinwazyjnym uszkodzeniu mózgu.

Wielkoskalowa skaningowa transmisyjna mikroskopia elektronowa (nanotomia) mózgu zdrowego i uszkodzonego danio pręgowanego

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously ...

Ogólnym celem tego wielkoskalowego eksperymentu z wykorzystaniem mikroskopii elektronowej lub nanotomii jest określenie zmian od poziomu makromolekularnego do poziomu tkankowego, w tym przypadku w degenerującym się mózgu danio pręgowanego. Nanotomia może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w naukach o życiu, na przykład w badaniach nad neurodegeneracją i cukrzycą typu 1.Główną zaletą nanotomii jest pozyskiwanie bezstronnych informacji, obejmujących zakres od makrocząsteczek, organelli i komórek, aż po tkanki. Umożliwia to kwantyfikację oraz udostępnianie danych w modelu otwartego dostępu za pośrednictwem strony nanotomy.org. Choć nanotomia pozwala na wgląd w mechanizmy utrzymania odporności oraz rolę mikrogleju w neurodegeneracyjnym mózgu danio pręgowanego, znajduje ona zastosowanie również w innych modelach chorób, w tym w kulturach komórkowych, tkankach mysich, a nawet ludzkich.Zazwyczaj naukowcy rozpoczynający pracę z tą techniką napotykają trudności ze względu na przytłaczającą ilość danych. Może ona być tysiąc razy większa niż w przypadku tradycyjnej EM. Po utrwaleniu larw danio pręgowanego zgodnie z protokołem tekstowym, należy odciąć głowy larw rostralnie względem tylnego mózgu, aby ułatwić penetrację osmu. Larwy należy umieścić w 1% tetrotlenku osmu i 1,5% żelazicyjanku potasu w 0,1 M k mengakodylanie sodu, a następnie inkubować na lodzie przez dwie godziny.Następnie należy użyć wody dwukrotnie destylowanej, aby wypłukać embriony trzy razy po pięć minut każdorazowo. Przed zatopieniem próbki muszą zostać odwodnione w serii stężeń etanolu. Aby zatopić embriony, po inkubacji w rozcieńczonej żywicy epoksydowej przez noc zgodnie z protokołem tekstowym, należy usunąć rozcieńczoną żywicę i zastąpić ją żywicą czystą.Inkubować przez 30 minut, następnie wymienić żywicę po raz drugi i inkubować przez kolejne 30 minut. Po trzeciej wymianie żywicy inkubować w temperaturze pokojowej przez trzy godziny. Następnie inkubować w temperaturze 58 °C przez 15 minut.Na koniec inkubować pod niskim ciśnieniem w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Następnie, korzystając z mikroskopu stereoskopowego, za pomocą igły lub wykałaczki odpowiednio ułożyć głowy w dostępnych w handlu silikonowych płaskich formach do zatapiania. Następnie polimeryzować żywicę epoksydową w temperaturze 58 °C przez noc.Gdy preparat całkowicie stwardnieje, należy użyć żyletki, aby odciąć nadmiar żywicy z trzpienia. W celu weryfikacji właściwego rozmieszczenia próbki, należy wykonać półcienkie przekroje larw przy użyciu noża szklanego lub diamentowego histrono na ultramikrotomie, a następnie poddać je barwieniu błękitem toluidynowym/fuksyną zasadową. Półcienkie przekroje należy przenieść na szkiełka przedmiotowe, pobierając je szklaną pipetą Pasteura, której końcówkę zamknięto poprzez stopienie w płomieniu.Suszyć na płycie grzejnej do całkowitego odparowania wody. Następnie umieścić próbki w 1% roztworze błękitu toluidyny w wodzie i inkubować przekroje na płycie grzejnej przez 10 s w celu ich zabarwienia. Po wypłukaniu przekrojów wodą, zastosować 0,5% fuksyny zasadowej w 1% tetraboranie sodu, aby barwić próbki przez kolejne 10 s.Próbki należy zbadać za pomocą zwykłego mikroskopu świetlnego przy powiększeniu od 10X do 40X. Po dotarciu do odpowiedniego miejsca lub orientacji, należy wykorzystać łatwo identyfikowalne struktury anatomiczne, takie jak dołki węchowe, oczy lub granice między istotą szarą a białą, aby zidentyfikować interesujący region mózgu podczas krojenia ultracienkich skrawków oraz aby dostosować kąt cięcia w przypadku przechylenia próbki. Należy kontynuować krojenie bloku żywicy epoksydowej nożem diamentowym w celu uzyskania ultracienkich skrawków o grubości 70 nanometer.Zamocuj każdy przekrój na pojedynczym slotcie paska kodowanego miedzianej siatki L2 by 1, aby umożliwić akwizycję niezakłóconą przez pręty siatki. Milimetr kwadratowy może wydawać się mały. Będzie on jednak idealnie pasował do otworu.W ten sposób zapobiegamy blokowaniu próbki przez pręty siatki. Należy mieć na uwadze, że w porównaniu z tradycyjną EM, zarejestrowany zostanie każdy artefakt wprowadzony do próbki. Próbki należy kontrastować metalami ciężkimi zgodnie z protokołem tekstowym, a następnie przechowywać w pudełku na siatki. Aby zamocować próbkę w skaningowym mikroskopie elektronowym (SEM), należy umieścić siatkę z przekrojem z pudełka transferowego w uchwycie na wiele próbek i przenieść ją do komory SEM.Po wyrównaniu detektora zgodnie z protokołem tekstowym, przeprowadź naświetlanie wstępne próbki, pomniejszając obraz tak, aby cały obszar do zeskanowania mieścił się w oknie obrazu. Po zmianie apertury na 120 micrometers i rozostrzeniu obrazu, użyj opcji skanowania ograniczonego obszaru, aby zminimalizować pole skanowania. Następnie ustaw częstotliwość klatek tak, aby skanowanie klatki trwało około jednej do dwóch sekund.Następnie powiększ obraz co najmniej 100X i skanuj niewielki obszar przez 10 sekund. Jeśli jasność w tym obszarze nadal ulega zmianie, kontynuuj naświetlanie wstępne. Naświetlanie wstępne jest wystarczające, gdy jasność tego obszaru przestaje zmieniać się w stosunku do jego otoczenia.Po ustawieniu ostrości należy wybrać najjaśniejszy obszar lub element i ustawić prędkość skanowania tak, aby szczegóły były widoczne. W oprogramowaniu mikroskopu należy dostosować jasność i kontrast, uważnie obserwując histogram, aby wszystkie piksele pozostały w zakresie dynamicznym. To samo należy zrobić dla najciemniejszych obszarów i elementów.Powróć do jasnego obszaru i sprawdź go ponownie, aby po obu stronach histogramu pozostało pewne wolne miejsce. W krokach od czwartego szóstego do czwartego ósmego regulację jasności i kontrastu należy przeprowadzić bardzo ostrożnie, tak aby cały obszar mieścił się w zakresie dynamicznym. Pomniejsz widok tak, aby cały obszar przeznaczony do skanowania mieścił się w oknie obrazowania, a następnie uruchom program akwizycji dużych obszarów.Następnie należy użyć opcji kreatora do skonfigurowania mozaiki, wybierając obszar na ekranie. Należy ustawić rozmiar piksela od dwóch do pięciu nanometrów, w zależności od wymaganej szczegółowości, oraz czas przebywania (dwell time) wynoszący trzy mikrosekundy dla skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej, czyli STEM. Po naciśnięciu przycisku optymalizacji zostanie sprawione ustawienia mikroskopu i wyświetlony zostanie wymagany czas.Następnie ponownie włącz zewnętrzny generator skanowania i naciśnij przycisk kontynuuj. Aby przeanalizować dane STEM, otwórz program do przeglądania plików EM w dużej skali i otwórz plik o nazwie mosaic info, który otworzy kafelkowe pliki tif. Wybierz opcję Auto Stitch Entire Mosaic i ustaw następujące parametry: overlap mode na half, stitching threshold na 0,90 oraz noise reduction na automatic.Jeśli kryteria łączenia nie mogą zostać spełnione, powiększ obraz i ręcznie ustaw kafel w odpowiedniej pozycji, a następnie kliknij Continue As Is. Wyeksportuj dane jako plik HTML lub pojedynczy plik tif. Dołącz końcowy rozmiar piksela oraz nazwę pliku, aby umożliwić późniejsze dokonanie pomiarów, a następnie przeanalizuj dane zgodnie z protokołem tekstowym. Jak pokazano tutaj, nanotomia przekrojów mózgu kontrolnego ujawnia typowe cechy ultrastrukturalne tkanki nerwowej rostralnej części przedmózgowia, w tym pęczki włókien węchowych, jądra neuronalne oraz podprzedziały neuronalne, w tym synapsy.W tym przypadku struktury subkomórkowe obejmują różne morfologie jąder i ogniska w różnych typach komórek oraz organelle, w tym aparat Golgiego, retikulum endoplazmatyczne, mitochondria, pęcherzyki synaptyczne i zagęszczenia postsynaptyczne. Co nieoczekiwane, jądra komórek wyścielających komorę są bardzo gęste elektronowo w porównaniu z innymi komórkami rozproszonymi bardziej bocznie w mózgu. W mikrogleju jądra wykazują również ciemne ogniska, prawdopodobnie heterochromatynę, które nie występują w innych komórkach mózgu.Ten obraz z wielkoskalowej mikroskopii elektronowej (EM) przekroju wieńcowego larwy danio pręgowanego poddanej ablacji neuronalnej ujawnia fagocytarną mikroglej. W komórkach tych stwierdzono również cechy charakterystyczne dla mikrogleju w komórkach ssaków, w tym wyraźnie zaznaczony aparat Golgiego oraz liczne inkluzje, takie jak lizosomy. Po opanowaniu metody pozyskanie obrazów może zająć jeden dzień, podczas gdy tradycyjna EM zajmie co najmniej tydzień.Podczas wykonywania tej procedury kluczową rolę w uzyskaniu wysokiej jakości obrazów odgrywa operator mikroskopu. Nie jest to technika polegająca jedynie na naciśnięciu przycisku. Obecnie nanotomię stosujemy nie tylko w modelu neurodegeneracji u danio pręgowanego, ale wykorzystujemy ją również do immunoznakowania komórek oraz badania tkanek much, tkanek ludzkich i innych.Technika ta otwiera nowe możliwości dla badaczy z dowolnej dziedziny. Mogą oni ponownie zapoznać się ze zbiorami danych online na stronie nanotomy.org, a następnie badać potencjalne zmiany w skali od nanometrów do milimetrów we wszystkich analizowanych modelach.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak zastosować nanotomię w odniesieniu do Państwa pytania badawczego oraz badanego układu komórkowego lub tkankowego. Prosimy pamiętać, że ze względu na toksyczne odczynniki oraz kwestie etyczne, przygotowanie próbek powinno być wykonywane wyłącznie przez specjalistę, jednak każdy może wypróbować stronę internetową nanotomy.org w domu.

large-scale-scanning-transmission-electron-microscopy-nanotomy

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W tym filmie demonstrujemy metodę analizy rozwijającego się mózgu kręgowca w żywych embrionach danio pręgowanego z rozdzielczością pojedynczej komórki przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Obejmuje ona sposób, w jaki wstrzykujemy substancje do embrionu danio pręgowanego w stadium jednej komórki, a następnie montujemy i obrazujemy rozwijający się mózg.

Obrazowanie na żywo embrionalnego mózgu rybki zebrafish przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Ten film opisuje technikę mikrodysekcji mózgu dorosłego danio pręgowanego. Metoda ta pomaga w uzyskaniu neuorosfer pochodzących z całego mózgu, które można dalej badać.

Sekcja mózgu danio pręgowanego: technika neurobiologii ryb

Ten film demonstruje metodę badania uszkodzeń mózgu larw danio pręgowanego za pomocą wielkoskalowej skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (STEM), techniki, która łączy elementy zarówno skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM), jak i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) w celu uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości. Przedstawiono w nim etapy związane z przygotowaniem próbek i pozyskiwaniem obrazów STEM o wysokiej rozdzielczości w celu identyfikacji uszkodzenia mózgu.

Badanie uszkodzenia mózgu u larw danio pręgowanego za pomocą wielkoskalowej skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Aby rzucić światło na komórkowe i molekularne mechanizmy neurogenezy i regeneracji dorosłego danio pręgowanego, opracowaliśmy protokół inwazyjnej chirurgii powodującej mechaniczne urazy u dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego i późniejszego monitorowania zmian w ugodzonej półkuli za pomocą immunohistochemii lub hybrydyzacji in situ.

Rana kłuta dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego: metoda badania neurogenezy i regeneracji mózgu kręgowców

Obrazowanie dynamicznego zachowania organelli i innych struktur subkomórkowych in vivo może rzucić światło na ich funkcję w warunkach fizjologicznych i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metody genetycznego znakowania dwóch organelli, centrosomów i mitochondriów oraz obrazowania ich dynamiki w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej.

Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem, które może być użyte do zbadania mechanizmów komórkowych leżących u podstaw rozwoju układu nerwowego. W tym miejscu opisujemy technikę wykorzystania poklatkowej mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dużej liczby wielokolorowych komórek znakowanych Brainbow w czasie rzeczywistym w rozwijającym się układzie nerwowym danio pręgowanego.

Wizualizacja rozwijającego się mózgu u żyjących danio pręgowanych za pomocą Brainbow i poklatkowego obrazowania konfokalnego

Tutaj prezentujemy metodę obrazowania embrionalnego mózgu danio pręgowanego in vivo, aż do stadium larwalnego i młodocianego. Ta mikroinwazyjna procedura, zaadaptowana z podejść elektrofizjologicznych, zapewnia dostęp do szczegółów komórkowych i subkomórkowych dojrzałego neuronu i może być połączona z badaniami optogenetycznymi i neurofarmakologicznymi w celu scharakteryzowania funkcji mózgu i interwencji farmakologicznej.

Obrazowanie in vivo w pełni aktywnej tkanki mózgowej u wybudzonych larw i osobników młodocianych danio pręgowanego poprzez usunięcie czaszki i skóry

Zmodyfikowaliśmy model spadku masy Marmarou dla dorosłego danio pręgowanego, aby zbadać szeroki zakres patologii po uszkodzeniu mózgu (TBI) i mechanizmy leżące u podstaw późniejszej regeneracji neuronów. Ten model TBI jest skalowalny, indukuje łagodne, umiarkowane lub ciężkie TBI i podsumowuje niejednorodność obrażeń obserwowaną u ludzi.

Skalowalny model do badania skutków obrażeń spowodowanych siłą u dorosłych danio pręgowanych

Opisano model mechanicznego uszkodzenia mózgu u dorosłego danio pręgowanego, aby zbadać mechanizmy molekularne regulujące ich wysoką zdolność regeneracyjną. Metoda wyjaśnia, jak stworzyć ranę kłutą w tektum nerwu wzrokowego wielu gatunków małych ryb w celu oceny odpowiedzi regeneracyjnych za pomocą fluorescencyjnego barwienia immunologicznego.

Model rany kłutej dorosłego nerwu wzrokowego z wykorzystaniem danio pręgowanego i medaka do analizy porównawczej zdolności regeneracyjnych

Mikroskopia trójfotonowa umożliwia obrazowanie fluorescencyjne o wysokim kontraście głęboko w żywych tkankach biologicznych, takich jak mózgi myszy i danio pręgowanego, z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną.

Mikroskopia fluorescencyjna trójfotonowa tkanek głębokich w nienaruszonym mózgu myszy i danio pręgowanego

Prezentowany tutaj jest protokół do obrazowania in vivo całego mózgu larw danio pręgowanego za pomocą trójwymiarowej mikroskopii fluorescencyjnej. Procedura eksperymentalna obejmuje przygotowanie próbki, akwizycję obrazu i wizualizację.

In vivo (in vivo) Obrazowanie całego mózgu larw danio pręgowanego za pomocą trójwymiarowej mikroskopii fluorescencyjnej

Poznaj metodę nanotomii do badania struktur mózgu zdrowego i uszkodzonego danio pręgowanego przy użyciu skaningowej mikroskopii elektronowej. Technika ta umożliwia analizę zmian neurodegeneracyjnych z rozdzielczością nanometryczną.

Wielkoskalowa skaningowa transmisyjna mikroskopia elektronowa (nanotomia) mózgu zdrowego i uszkodzonego danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów