Name: Sekwencyjna immunofluorescencja i immunohistochemia na kriowyciętych zarodkach danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Poznaj sekwencyjną immunofluorescencję i immunohistochemię na kriowyciętych zarodkach Danio rerio. Ta metoda umożliwia precyzyjną kolokalizację w populacjach komórkowych i poprawia morfologię tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant NIH 5K01OD021419-02 oraz NC State University College of Veterinary Medicine.

1. Przygotowanie zarodków
<ol>
	<li>Utrwalić 48 godzin po zapłodnieniu (hpf) chimeryczne zarodki danio pręgowanego wygenerowane przez przeszczep blastuli do blastuli między zarodkami AB danio pręgowanego typu dzikiego w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez noc z kołysaniem w temperaturze 4 °C. Wykonaj dwa 5-minutowe płukania z kołysaniem w temperaturze pokojowej przy użyciu 500 μL 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem zawierającej 0,1% niejonowego środka powierzchniowo czynnego (1x PBSt; patrz Tabela Materiałów) 
	nuta: Paraformaldehyd jest toksyczny i rakotwórczy i musi być odpowiednio utylizowany zgodnie z przepisami instytucjonalnymi. Praca z paraformaldehydem powinna być wykonywana w kapturze chemicznym i zawsze należy używać odpowiednich środków ochrony osobistej (rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne).</li>
	<li>Odwodnić zarodki, przemłukując je sekwencyjnie 500 μl 30%, 50% i 70% metanolu (MeOH) rozcieńczonego 1x PBSt przez 10 minut każdy w temperaturze pokojowej z kołysaniem. Inkubować zarodki w 500 μl 100% MeOH w temperaturze -20 °C przez co najmniej 14 godzin 
	nuta: Metanol jest toksyczny i musi być odpowiednio utylizowany zgodnie z przepisami instytucjonalnymi. Praca z metanolem powinna być wykonywana w kapturze chemicznym i zawsze należy używać odpowiednich środków ochrony osobistej (rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne).</li>
	<li>Nawodnij zarodki, myjąc sekwencyjnie 500 μl 70%, 50% i 30% MeOH rozcieńczonych 1x PBSt przez 10 minut każdy w temperaturze pokojowej z kołysaniem. Wykonaj dwa 5-minutowe prania z 500 μL 1x PBSt w temperaturze pokojowej z bujaniem.</li>
	<li>Usunąć 1x PBSt i inkubować w 500 μl 30% sacharozy rozcieńczonej dejonizowaną wodą o temperaturze pokojowej z kołysaniem, aż zarodki opadną na dno probówki (około 1 godzina). Zastąp sacharozę 500 μl 15% żelatyny rybnej/25% sacharozy (15/25; patrz Tabela Materiałów) i inkubuj w temperaturze pokojowej z kołysaniem przez noc.</li>
	<li>Zastąp około połowy objętości 15/25 pożywką o optymalnej temperaturze cięcia (pożywką OCT) i inkubuj w temperaturze pokojowej z kołysaniem, aż zarodki opadną na dno probówki (około 1 godzina).</li>
	<li>Zastąp około połowy objętości pożywką OCT i inkubuj w temperaturze pokojowej z kołysaniem przez 1 godzinę. Powtórz ten krok jeden raz.</li>
	<li>Podczas etapów inkubacji z pożywką 15/25 i OCT należy odwrócić lub przesunąć probówkę w razie potrzeby, aby połączyć te odczynniki.</li>
</ol>
2. Osadzanie zarodków i przygotowanie kriosekcji
<ol>
	<li>Przenieś zarodki do plastikowej formy (patrz tabela materiałów) za pomocą kleszczy, minimalizując transfer mieszaniny 15/25-OCT. Napełnij formę mniej więcej do połowy pożywką OCT i delikatnie wymieszaj zarodki w pożywce OCT.</li>
	<li>Przygotuj oznakowane plastikowe foremki i przenieś pożądane zarodki (zwykle 1-3 zarodki) do pustych, oznakowanych plastikowych foremek, minimalizując przenoszenie pożywki OCT. Gdy pożądane zarodki znajdą się w plastikowej formie, delikatnie napełnij pożywką OCT do górnej części formy.</li>
	<li>Użyj kleszczy lub igieł 25 G, aby ułożyć zarodki w pożądanej orientacji, używając lekkiego mikroskopu stereoskopowego do wizualizacji (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A,B).</li>
	<li>Przygotowane foremki zamrozić na suchym lodzie w izolowanym pojemniku z metalową platformą. Delikatnie umieść wiaderko na lód lub chłodziarkę do pianki na metalowej platformie, aby utworzyć zimną komorę (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C,D)</li>
	<li>Przygotować kriosekcje o grubości 10\12 μm za pomocą kriostatu ustawionego na -20 °C.
	<ol>
		<li>Ustaw jeden blok na raz i użyj pożywki OCT, aby zamrozić blok na dysku/uchwycie z dolną częścią bloku skierowaną w stronę ostrza (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A). Upewnij się, że blok jest całkowicie przymrożony do dysku (podłoże OCT zmieni kolor na biały) przed rozpoczęciem cięcia (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B).</li>
		<li>Umieść kriosekcje na naładowanych szkiełkach (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2C, D) i wysusz szkiełka na powietrzu przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Immunofluorescencja dla pH3
<ol>
	<li>Wykonaj trzy 5-minutowe płukania szkiełek w 1x PBS w odpowiednim pojemniku, takim jak słoik Coplin. Jeśli chusteczki nie są dobrze przylegające do szkiełka, należy przeprowadzić płukanie, kładąc szkiełka na płaskiej powierzchni i delikatnie pipetując 500 μl 1x PBS na powierzchnię. Wylej 1x PBS między praniami, delikatnie przechylając szkiełka.</li>
	<li>Obrysuj sekcje pisakiem barierowym lub ołówkiem woskowym, aby utrzymać płyn na szkiełkach (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
	<li>Ułożyć szkiełka na płaskiej powierzchni w wilgotnej komorze i odpipetować 200 μl buforu blokowego na sekcję na szkiełka. Inkubować w buforze blokowym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować rozcieńczenie przeciwciała pierwotnego (przeciwciało anty-pH królika, 1:200; patrz Tabela Materiałów) w buforze blokowym i dobrze wymieszać przez pipetowanie. Delikatnie przechylić szkiełka, aby spuścić bufor blokowy, wrócić do wilgotnej komory i odpipetować 200 μl roztworu przeciwciał pierwotnych na sekcję na szkiełka. W przypadku kontroli tylko wtórnej należy odpipetować 200 μl bufora blokowego na odpowiednie sekcje.</li>
	<li>Inkubować szkiełka w temperaturze 4 °C przez noc w wilgotnej komorze wypełnionej wodą dejonizowaną. Uszczelnij krawędzie wilgotnej komory, aby zatrzymać wilgoć.</li>
	<li>Wykonaj trzy 5-minutowe płukania szkiełek w 1x PBS w odpowiednim pojemniku, takim jak słoik Coplin. Podczas etapów płukania należy przygotować rozcieńczenie przeciwciał drugorzędowych (koniugat przeciwciała przeciw fluorescencyjnemu fluorescencyjnemu przeciwciału drugorzędowemu przeciwko królikowi, 1:2 000; patrz Tabela Materiałów) w buforze blokowym i dobrze wymieszać przez pipetowanie.</li>
	<li>Położyć szkiełka na płaskiej powierzchni w wilgotnej komorze i odpipetować 200 μl roztworu przeciwciał wtórnych na sekcję na szkiełka. Inkubować szkiełka w wtórnym roztworze przeciwciał w temperaturze pokojowej, osłonięty przed światłem, przez 30 minut.</li>
	<li>Wykonaj trzy 5-minutowe płukania szkiełek w 1x PBS w odpowiednim pojemniku, takim jak słoik z Coplinu, osłonięty przed światłem. Podczas etapów mycia przygotuj roztwór do barwienia jądrowego (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Umieść szkiełka na płaskiej powierzchni i odpipetuj 200\u2012500 μl (w zależności od wielkości próbki) roztworu do barwienia jądrowego na każdą sekcję. Inkubować szkiełka w roztworze do barwienia jądrowego przez 10 minut, w osłonie przed światłem.</li>
	<li>Odcedź roztwór do barwienia jądrowego i zamontuj szkiełka za pomocą nietwardniejących fluorescencyjnych mediów montażowych i szklanego szkiełka nakrywkowego. Szkiełka należy utrzymywać w ciemności w temperaturze 4 °C do momentu wykonania obrazowania. 
	nuta: Najlepsze wyniki uzyskuje się, gdy slajdy są obrazowane tego samego dnia lub następnego dnia.</li>
	<li>Po IF, wizualizuj i zobrazuj preparaty za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego i kamery cyfrowej przy użyciu filtrów emisyjnych 555 nm (czerwony) i 645 nm (dalekiej czerwieni) przy 100-krotnym powiększeniu (10-krotne powiększenie gałki ocznej i 10-krotne powiększenie obiektywu). Utrzymuj stałą moc lasera podczas całego obrazowania.</li>
	<li>Po zobrazowaniu umieścić szkiełka w oddzielnych pojemnikach po 1x PBS i przechowywać na płasko w temperaturze 4 °C przez noc, aby przygotować się do usunięcia szkiełka nakrywkowego. Umieszczając szkiełka w 1x PBS, delikatnie porusz szkiełkami, aby pomóc w wyjęciu szkiełka nakrywkowego. 
	nuta: Nie dociskaj szkiełka nakrywkowego ani nie próbuj usuwać szkiełka nakrywkowego ręcznie, ponieważ może to pogorszyć jakość sekcji. Szkiełka nakrywkowe należy usuwać poziomo przy minimalnym wymuszonym ruchu.</li>
</ol>
4. Immunohistochemia znakowanego dekstranu
<ol>
	<li>Po usunięciu szkiełek nakrywkowych delikatnie przenieś szkiełka do nowego 1x PBS w odpowiednim pojemniku, takim jak słoik Coplin. Usuń 1x PBS i wykonaj trzy 5-minutowe inkubacje szkiełek w 1x soli fizjologicznej buforowanej Tris z 0,1% niejonowego środka powierzchniowo czynnego (1x TBSt) w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować 250 ml 3% nadtlenku wodoru (H2O2) rozcieńczonego w wodzie dejonizowanej w pojemniku o odpowiedniej wielkości. Inkubować szkiełka w 3% roztworze H2O2 w temperaturze pokojowej przez 15 min. 
	nuta: Nadtlenek wodoru jest i musi być odpowiednio zutylizowany zgodnie z przepisami instytucjonalnymi. Należy zawsze używać odpowiedniego wyposażenia ochrony osobistej (rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne).</li>
	<li>Szybko spłucz szkiełka wodą dejonizowaną. Wykonaj trzy 5-minutowe płukanie szkiełek w 1x TBSt. Ostrożnie osusz obszar wokół odcinków tkanek i umieść szkiełka płasko w wilgotnej komorze. Obrysuj skrawki tkanki pisakiem barierowym lub ołówkiem woskowym, aby w razie potrzeby utrzymać płyn na skrawkach.</li>
	<li>Na każdą sekcję nanieść kroplami gotowy do użycia 2,5% roztwór blokujący surowicę dostarczony z wtórnym zestawem do znakowania przeciwciał (patrz Tabela Materiałów). Szkiełka należy inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
	<li>Przygotować przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w rozcieńczalniku przeciwciał (dekstran króliczy znakowany antyznakiem, 1:7,500; patrz Tabela Materiałów) i wymieszać przez delikatne pipetowanie. Delikatnie przechyl szkiełka, aby odsączyć bufor blokowy, osusz obszar wokół sekcji i umieść szkiełka płasko w wilgotnej komorze.</li>
	<li>Nie myć przed zastosowaniem roztworu przeciwciała pierwotnego. Pobrać pipetę 200 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego na sekcję na szkiełka i inkubować przez noc w wilgotnej komorze w temperaturze 4 °C. W przypadku kontroli tylko wtórnej należy pobrać pipetę z 200 μl rozcieńczalnika przeciwciał na odpowiednie sekcje.</li>
	<li>Delikatnie przechyl szkiełka, aby odsączyć roztwór przeciwciała pierwotnego i umieść w 1x TBSt w odpowiednim pojemniku, takim jak słoik Coplin. Wykonaj dwa 5-minutowe mycie szkiełek w 1x TBSt. Osusz obszar wokół sekcji i umieść płasko w wilgotnej komorze.</li>
	<li>Nałóż kroplami na każdą sekcję gotowy do użycia odczynnik blokujący redukujący tło (patrz Tabela materiałów). Szkiełka należy inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
	<li>Delikatnie przechyl szkiełka, aby odsączyć bufor blokowy, ostrożnie osusz obszar wokół sekcji i umieść szkiełka płasko w wilgotnej komorze. Nie myć przed nałożeniem roztworu przeciwciał drugorzędowych.</li>
	<li>Kroplami nanieść gotowy do użycia roztwór przeciwciała wtórnego (przeciwciało drugorzędowe polimeru anty-peroksydazy króliczka-chrzanu (HRP); patrz tabela materiałów) do każdej sekcji i inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Delikatnie przechyl szkiełka, aby odsączyć wtórny roztwór przeciwciał i umieść w 1x TBSt w odpowiednim pojemniku, takim jak słoik Coplin. Wykonaj dwa 5-minutowe mycie szkiełek w 1x TBSt.</li>
	<li>Podłoże chromogenne HRP należy przygotować bezpośrednio przed użyciem zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela Materiałów).</li>
	<li>Osusz obszar wokół sekcji, umieść szkiełka na płaskiej powierzchni i nałóż 200 μl podłoża chromogenicznego HRP na każdą sekcję. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 3 minuty, uruchamiając timer, gdy substrat zostanie nałożony na pierwsze szkiełko (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4).</li>
	<li>Odcedź roztwór substratu i krótko spłucz szkiełka w słoiku Coplin zawierającym 1x PBS. Umieść szkiełka w wodzie dejonizowanej w odpowiednim pojemniku, takim jak słoik Coplin i wykonaj dwa 5-minutowe mycia w wodzie dejonizowanej z delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Przeciwbarwić szkiełka, umieszczając je w roztworze barwiącym hematoksyliną na maksymalnie 30 s. 
	nuta: Hematoksylina jest toksyczna i musi być utylizowana zgodnie z przepisami instytucjonalnymi. Należy zawsze używać odpowiedniego wyposażenia ochrony osobistej (rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne).</li>
	<li>Umieść szkiełka w wodzie dejonizowanej w odpowiednim pojemniku, takim jak słoik Coplin i wykonaj trzy 5-minutowe mycia w wodzie dejonizowanej. Przenieś szkiełka do pojemnika zawierającego wodę z kranu Scotta (patrz Tabela Materiałów) i inkubuj przez 1 minutę.</li>
	<li>Umieść szkiełka w wodzie dejonizowanej w odpowiednim pojemniku, takim jak słoik Coplin i wykonaj trzy 5-minutowe mycia w wodzie dejonizowanej.</li>
	<li>Odwodnić szkiełka za pomocą szeregu gatunków etanolu (EtOH) (rozcieńczonych w wodzie dejonizowanej) i ksylenu w kapturze chemicznym. Wykonaj jedną 2-minutową inkubację w 70% EtOH, dwie 1-minutową inkubację w 95% EtOH, dwie 1-minutową inkubację w 100% EtOH i trzy 1-minutową inkubację w ksylenie. Zdjąć szkiełka z ksylenu i umieścić szkiełko nakrywkowe, gdy jest mokre z podłożem montażowym na bazie toluenu w kapturze chemicznym. 
	nuta: Ksylen i toluen są toksyczne i łatwopalne i muszą być odpowiednio utylizowane zgodnie z przepisami instytucjonalnymi. Praca z ksylenem i toluenem powinna być wykonywana w kapturze chemicznym i zawsze należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej (rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne).</li>
	<li>Podążając za IHC, wizualizuj i obrazuj preparaty za pomocą mikroskopu światła złożonego i kamery cyfrowej przy 100-krotnym powiększeniu (10-krotne powiększenie oczne i 10-krotne powiększenie obiektywu). (<silna klasa="xfig">Rysunek 5).</li>
</ol>

<ol><li>Whole-mount IHC protocol for zebrafish embryos [Internet]. GeneTex. , Irvine. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.genetex.com/uploaddata/Protocol/Document/IHC-WM.pdf">http://www.genetex.com/uploaddata/Protocol/Document/IHC-WM.pdf</a> (2013).</li>
<li>Inoue, D., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+for+all--a+highly+efficient+and+versatile+method+for+fluorescent+immunostaining+in+fish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos.</a> PLoS One. 6 (5), (2011).</li>
<li>Kogata, N., Howard, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-mount+immunofluorescence+protocol+for+three-dimensional+imaging+of+the+embryonic+mammary+primordium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">A whole-mount immunofluorescence protocol for three-dimensional imaging of the embryonic mammary primordium.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 18 (2), 227-231 (2013).</li>
<li>Santos, D., Monteiro, S., Luzio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+Whole-Mount+Immunohistochemistry+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29+Embryos+and+Larvae+Protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">General Whole-Mount Immunohistochemistry of Zebrafish (Danio rerio) Embryos and Larvae Protocol.</a> Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).</li>
<li>Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Sexton, J. M., Hickstein, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+KRASG12V+in+Zebrafish+Gills+Induces+Hyperplasia+and+CXCL8-Associated+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Expression of KRASG12V in Zebrafish Gills Induces Hyperplasia and CXCL8-Associated Inflammation.</a> Zebrafish. 12 (3), 221-229 (2015).</li>
<li>Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+transparent+zebrafish%3A+a+refined+method+to+improve+detection+of+gene+expression+during+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Biotechnology+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development.</a> Marine Biotechnology (NY). 3 (6), 522-527 (2001).</li>
<li>Macdonald, R. Zebrafish Immunohistochemistry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMacdonald%2C+R+%22Molecular+Methods+in+Developmental+Biology%22">Molecular Methods in Developmental Biology</a>. Guille, M. , 127th ed, Humana Press. New York. 77-88 (1999).</li>
<li>Santos, C., Pinto, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+Assessment+as+a+Tool+for+Investigating+Developmental+Toxicity+in+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical Assessment as a Tool for Investigating Developmental Toxicity in Zebrafish (Danio rerio).</a> Methods in Molecular Biology. 1797, 461-476 (2018).</li>
<li>Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Azuma, M., Sood, R., Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((brca2+in+zebrafish+ovarian+development%2C+spermatogenesis%2C+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">brca2 in zebrafish ovarian development, spermatogenesis, and tumorigenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (45), 19350-19355 (2010).</li>
<li>Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Golden, C. D., Hickstein, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA2+and+TP53+collaborate+in+tumorigenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">BRCA2 and TP53 collaborate in tumorigenesis in zebrafish.</a> PLoS One. 9 (1), (2014).</li>
<li>van der Loos, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Immunoenzyme+Staining%3A+Methods+and+Visualizations+for+the+Observation+With+Spectral+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Multiple Immunoenzyme Staining: Methods and Visualizations for the Observation With Spectral Imaging.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 313-328 (2008).</li>
<li>van der Loos, C. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avan+der+Loos%2C+CM+%22Immunoenzyme+Multiple+Staining+Methods%22">Immunoenzyme Multiple Staining Methods</a>. , Bios Scientific Publishers. New York. (1999).</li>
<li>OCT Embedding For Cryostat Sectioning Of Embryos or Larvae [Internet]. The Zebrafish Book, 5th edition. , University of Oregon Press. Available from:
 <a target="_blank" href="https://wiki.zfin.org/display/prot/OCT+Embedding+For+Cryostat+Sectioning+Of+Embryos+Or+Larvae">https://wiki.zfin.org/display/prot/OCT+Embedding+For+Cryostat+Sectioning+Of+Embryos+Or+Larvae</a> (2007).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Cells+and+Tissues+for+Fluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Methods+in+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Preparation of Cells and Tissues for Fluorescence Microscopy.</a> Basic Methods in Microscopy. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. Spector and Goldman, editors (2006).</li>
<li>Torres, E. The Lack of Commercial Antibodies for Model Organisms (and How You Can Deal with It) [Internet]. BenchSci Blog. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it">https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it</a> (2018).</li>
<li>Carmany-Rampey, A., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+mosaic+analysis+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Modern mosaic analysis in the zebrafish.</a> Methods. 39, 228-238 (2006).</li>
<li>Da’as, S. I., Balci, T. B., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell+development+and+function+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mast cell development and function in the zebrafish.</a> Methods in Molecular Biology. 1220, 29-57 (2015).</li>
<li>Quan, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+distribution+and+in+vitro+activities+of+the+urotensin+II-related+peptides+URP1+and+URP2+in+zebrafish%3A+evidence+for+their+colocalization+in+spinal+cerebrospinal+fluid-contacting+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative distribution and in vitro activities of the urotensin II-related peptides URP1 and URP2 in zebrafish: evidence for their colocalization in spinal cerebrospinal fluid-contacting neurons.</a> PLoS One. 10 (3), (2015).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th ed, University of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Sullivan-Brown, J., Bisher, M. E., Burdine, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embedding%2C+serial+sectioning+and+staining+of+zebrafish+embryos+using+JB-4+resin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Embedding, serial sectioning and staining of zebrafish embryos using JB-4 resin.</a> Nature Protocols. 6 (1), 46-55 (2011).</li>
<li>JB-4 Embedding Kit. [Internet]. Polysciences, Inc. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/plastic-embedding-media-kits/jb-4-sup-r-sup-embedding-kits-reagents/jb-4supsup-embedding-kit/">http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/plastic-embedding-media-kits/jb-4-sup-r-sup-embedding-kits-reagents/jb-4supsup-embedding-kit/</a> (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zaprezentowaliśmy nowatorską metodę łączonej immunofluorescencji i immunohistochemii, która stanowi ważny krok naprzód w przeprowadzaniu eksperymentów kolokalizacyjnych na kriosekcyjnych zarodkach danio pręgowanego. Istnieje krytyczny brak istniejących protokołów kolokalizacji, które są zoptymalizowane do stosowania z małymi zarodkami i materiałem poddanym kriosekcji17,18, które są powszechnie stosowane w badaniach molekularnych14. Istniejące protokoły kolokalizacji koncentrują się głównie na jednoczesnej wizualizacji dwóch fluoroforów17,18. Chociaż protokoły te mogą działać dobrze, ich przydatność jest ograniczona przez dostępność przeciwciał, które (i) mogą być stosowane u danio pręgowanego i (ii) są zgodne z IF.
Uważamy, że zastosowanie kriosekcji w przypadku zarodków danio pręgowanego zapewnia znaczącą przewagę pod względem zachowanej morfologii tkanek. Z uwagi na to, że IHC jest częściej wykonywany na skrawkach parafiny niż na kriosekcjach 7,8, uzasadnione jest dalsze badanie metod IHC opartych na kriosekcji w celu wykrywania ekspresji białek. Zastosowanie całego wierzchowania IF jest powszechną metodą wizualizacji poziomów ekspresji w zarodkach danio pręgowanego i jest częściej opisywane w literaturze niż IF przy użyciu kriosekcji 1,2,3,4,19. Jednak protokoły całego montażu mają ograniczenia, w tym brak dokładnej lokalizacji białek ulegających ekspresji w głębokich tkankach i możliwość ekspresji na poziomie powierzchniowym do zaciemnienia ekspresji białek w głębszych tkankach. Konsekwentnie obserwowaliśmy doskonałe utrzymanie morfologii komórkowej po krioprezerwacji, sekcjach i sekwencyjnych IF i IHC. W przypadku zastosowań, które wymagają precyzyjnej lokalizacji ekspresji białka na poziomie pojedynczej komórki, procedury oparte na sekcjach mają znaczną przewagę, jak opisaliśmy w tym protokole. Osadzanie żywicy stanowi alternatywną opcję wykonywania testów IF lub IHC na wycinkach zarodków danio pręgowanego we wczesnym stadiumrozwoju 20. Skrawki żywicy zapewniają lepsze zachowanie morfologii tkanek w porównaniu z kriosekcjami i można przygotować stosunkowo cieńsze skrawki tkanki. Jednak producenci na ogół nie zalecają stosowania skrawków żywicy do testów immunologicznych, ponieważ niektórych składników żywic nie można usunąć z odcinków i mogą one maskować miejsca wiązania przeciwciał21.
Chociaż cały protokół jest niezbędny do dokładnej i skutecznej analizy wzorców ekspresji, kilka konkretnych kroków ma kluczowe znaczenie dla sukcesu eksperymentu. Pierwszym krytycznym krokiem jest postępowanie z zarodkami podczas osadzania w OCT 13,14. Orientacja każdego zarodka w tej samej płaszczyźnie poprzecznej, tak aby sekcje były wycinane z mniej więcej tego samego obszaru dla wszystkich zarodków, może być trudne. Odkryliśmy, że używanie igieł o małej średnicy do wykonywania małych, celowych ruchów przez lepką pożywkę OCT w celu orientacji zarodka jest lepsze niż używanie kleszczy, które są zbyt duże i wypierają zbyt dużo pożywki OCT. Drugi krytyczny etap ma miejsce podczas cięcia zamrożonych bloków, ponieważ uzyskanie wysokiej jakości skrawków zawierających pożądaną tkankę (tkanki) może być trudne bez odpowiedniego przeszkolenia i doświadczenia. Dlatego zalecamy korzystanie z próbek testowych do czasu opanowania techniki. Trzecim krytycznym krokiem jest usunięcie szkiełka nakrywkowego, które może zakłócić lub usunąć próbki tkanek. Odkryliśmy, że połączenie delikatnego mieszania w celu poluzowania szkiełka nakrywkowego i powolnego wyjmowania szkiełka z pojemnika PBS jest najskuteczniejszym podejściem do usuwania szkiełek nakrywkowych. Najlepsza jest delikatna i pewna ręka; Naukowcy mogą uznać, że konieczne jest trochę prób i błędów, aby nauczyć się, jak skutecznie usuwać szkiełka nakrywkowe.
Dodatkowe ważne kroki w protokole obejmują optymalizację przeciwciał (przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe zarówno dla testów IF, jak i IHC) oraz ekspozycję szkiełek na substrat chromogenny i przeciwbarwienie. Niezbędne są dokładne badania dotyczące swoistości przeciwciał pierwszorzędowych i stężenia docelowego; ogólnie rzecz biorąc, najlepiej jest zebrać wystarczającą ilość próbek nieszlachetnych do co najmniej dwóch oddzielnych eksperymentów dla IF i IHC, które zostaną przeprowadzone w celu optymalizacji stężeń przeciwciał pierwszorzędowych przed rozpoczęciem kombinacji IF/IHC. Włączenie znanej kontroli dodatniej i ujemnej dla każdego przeciwciała pierwszorzędowego jest niezbędne w każdym doświadczeniu, aby zapewnić, że zarówno testy IF, jak i IHC działają prawidłowo. Konieczne może być również dostosowanie stężenia przeciwciał wtórnych. Konieczna jest optymalizacja ekspozycji skrawków tkanek na substrat chromogenny i przeciwbarwienie dla testu IHC, ponieważ wytyczne producenta często opisują szeroki zakres możliwych czasów ekspozycji. Nie wszystkie chromogeny mogą być kompatybilne z barwnikami przeciwstawnymi i endogenną pigmentacją tkanek, co wymaga starannego planowania w odniesieniu do doboru chromogenów.
Istnieje wiele potencjalnych modyfikacji, które można zastosować do opisanego protokołu, a my z powodzeniem przeprowadziliśmy ten protokół z innymi kombinacjami przeciwciał, które nie mogły być jednocześnie stosowane do IF. Jak wspomniano powyżej, substancje chromogenne mają wyraźną kompatybilność z określonymi przeciwbarwieniami. Odkryliśmy, że te komponenty można łatwo modyfikować w protokole. Dodatkowo parametry inkubacji przeciwciał są dość elastyczne i mogą być zwiększane lub zmniejszane w zależności od pożądanej intensywności barwienia. Proces osadzania można również modyfikować. Chociaż skupiliśmy się na przekrojach poprzecznych, zarodki można łatwo ustawić w dowolnym kierunku, aby dotrzeć do konkretnych tkanek będących przedmiotem zainteresowania. Wreszcie, w tym protokole istnieje wiele możliwych punktów pauzy. Odwodnione zarodki mogą być przechowywane w 100% MeOH w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy; zamrożone bloki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez okres do trzech miesięcy; a przygotowane preparaty można przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do dziewięciu miesięcy w pudełku na szkiełka.
Ze względu na względną złożoność tego połączonego protokołu IF/IHC istnieje wiele możliwych źródeł zmienności lub błędów, które mogą wymagać rozwiązania problemu, począwszy od jakości tkanki, przez doświadczenie badaczy, aż po obsługę próbek. Większość krytycznych kroków opisanych powyżej jest uważana za krytyczną, ponieważ albo wymagają optymalizacji na poziomie indywidualnego użytkownika, albo wymagają szczególnej zręczności, umiejętności i doświadczenia. Odkryliśmy jednak, że niespecyficzne barwienie tła i niska intensywność sygnału są najważniejszymi problemami wymagającymi optymalizacji. Podobnie jak w przypadku każdego protokołu IF lub IHC, rozwiązanie tych problemów może być czasochłonne i pracochłonne, a ta metoda może być spotęgowana, ponieważ te dwie techniki są połączone. Z tego powodu zdecydowanie zalecamy osobną optymalizację IF i IHC przed przystąpieniem do połączonego protokołu.
Chociaż przewidujemy, że ta metoda będzie przydatna w szerokim zakresie eksperymentów, istnieją potencjalne ograniczenia. Pomyślne przeprowadzenie tej procedury zależy od utrzymania nienaruszonych próbek tkanek poprzez dwa sekwencyjne eksperymenty, które obejmują wiele etapów mycia. Z tego powodu wszelkie problemy, które pojawiają się podczas cięcia lub obchodzenia się z tkankami, w tym użycie starszych preparatów, które mogły pogorszyć jakość, znacznie ograniczą zdolność badaczy do skutecznego wykonania tego protokołu. Chociaż szkiełka podstawowe mogą być potencjalnie przechowywane w temperaturze -80 °C przez okres do dziewięciu miesięcy, przyleganie tkanek do szkiełek zmniejsza się z czasem, a największy sukces odnieśliśmy w przypadku szkiełek, które są używane w ciągu miesiąca od przygotowania lub najlepiej następnego dnia. Drugim ograniczeniem jest niewielka powierzchnia zarodków danio pręgowanego. Chociaż odkryliśmy, że ten eksperyment jest przydatny w wizualizacji białek, które są stosunkowo obficie eksprymowane we wczesnych stadiach zarodków, białka, które są wyrażane niekonsekwentnie lub na niskich poziomach, mogą być bardzo trudne do uchwycenia w sekcji. Wreszcie, ponieważ protokół wykorzystuje kriosekcje 10\u201212 μm, najlepiej nadaje się do oceny ekspresji białek w większych strukturach, takich jak jądra, a nie w mniejszych składnikach subkomórkowych.
Podsumowując, nasz połączony protokół IF/IHC będzie korzystny dla szerokiej gamy badań na zarodkach danio pręgowanego we wczesnym stadium rozwoju i stanowi ważną innowację w precyzyjnej analizie ekspresji białek w takich próbkach. Nasza metoda, pokazana z powodzeniem na rycinie 5, pozwoli naukowcom zachować delikatną morfologię zarodków danio pręgowanego we wczesnym stadium w kriosekcjach, jednocześnie pracując z nieco ograniczonym zakresem obecnie dostępnych przeciwciał pierwotnych, które są zatwierdzone do stosowania w IF lub IHC u tego gatunku. Protokół ten będzie prawdopodobnie przydatny w badaniach na innych gatunkach ryb i (np. Medaka i Xenopus spp.), które są utrudnione przez podobne ograniczenia dostępności przeciwciał i może mieć zastosowanie również w tradycyjnych modelach ssaków.

Danio pręgowany to niezwykle wytrzymały organizm modelowy, który jest obecnie wykorzystywany w wielu różnych dyscyplinach w badaniach biomedycznych. W szczególności szybki rozwój zewnętrzny i przezierność zarodków danio pręgowanego stanowią doskonałe narzędzie do badań in vivo. W niniejszym artykule opisano metodę sekwencyjnych analiz immunofluorescencyjnych (IF) i immunohistochemicznych (IHC) zarodków danio pręgowanego poddanych kriosekcji. Ta nowatorska procedura wykorzystuje sekwencyjne nakładanie dwóch przeciwciał na jednym szkiełku, umożliwiając dokładną identyfikację kolokalizowanych białek na poziomie komórkowym przy jednoczesnej ochronie skrawków tkanki. Protokół ten jest szczególnie przydatny w badaniach na modelu danio pręgowanego, ponieważ stosunkowo niewielka liczba przeciwciał została zwalidowana do stosowania w zastosowaniach IF i/lub IHC u danio pręgowanego w porównaniu z modelami myszymi.
Obserwacja interakcji międzykomórkowych jest kluczowym elementem wielu badań i może dostarczyć kluczowych informacji na temat mechanizmów molekularnych działających na poziomie komórkowym, które leżą u podstaw fenotypów na poziomie organizmu. Ponadto ekspresja białek może dostarczyć informacji o funkcji komórki, zwłaszcza podczas badania ekspresji wielu białek jednocześnie w komórce (kolokalizacja). Chociaż całościowe IHC i IF są powszechnie stosowanymi technikami analizy ekspresji białek w zarodkach danio pręgowanego1,2,3,4,5, procedury całego montażu mogą być problematyczne dla uzyskania precyzyjnych danych kolokalizacji. Z naszego doświadczenia wynika, że rozróżnienie warstw tkanki i wizualizacja ekspresji białek na poziomie pojedynczej komórki w próbkach z całego montażu może być trudne. Programy do obrazowania mogą na ogół nie być w stanie odróżnić barwienia powierzchni od głębszego barwienia. Ekspresje białek niena poziomie powierzchni mogą być przesłonięte przez jaśniej wyrażoną ekspresję na poziomie powierzchni, co prowadzi do niedokładności w kwantyfikacji. Dodatkowo, większość tradycyjnych metod usuwania danio pręgowanego jest dość toksyczna6 i dlatego jest mniej pożądana w użyciu.
Techniki oparte na przeciwciałach, takie jak IF i IHC, są często używane do wykrywania ekspresji białek w podzielonym materiale, upraszczając identyfikację odrębnych populacji komórek, które wyrażają określone białko w złożonych tkankach. IHC jest powszechnie stosowany do kolokalizacji, najczęściej przy użyciu dwóch różnych przeciwciał skoniugowanych w różnych gatunkach gospodarzy i wizualizowanych za pomocą różnych kolorowych chromogenów4,7,8,9,10. Jednak używanie wielu chromogenów może prowadzić do niespecyficznego barwienia tła lub niezgodności kolorów11,12.
Opracowaliśmy nowy protokół wykrywania wielu białek za pomocą sekwencyjnych IF i IHC na kriosekcji zarodków danio pręgowanego we wczesnym stadium. Kriosekcja jest szczególnie odpowiednia dla delikatnych tkanek, takich jak zarodki danio pręgowanego, a kriosekcje są lepsze niż skrawki zatopione w parafinie w testach opartych na fluorescencji13,14. Zdecydowaliśmy się zoptymalizować połączone IF i IHC zamiast dwukolorowego IF lub IHC, aby obejść problem niezgodności przeciwciał dla jednego typu testu. Problemy te są szczególnie istotne w przypadku badań z udziałem danio pręgowanego ze względu na ograniczoną liczbę dostępnych na rynku przeciwciał, które są zatwierdzone do stosowania u danio pręgowanego. W rzeczywistości badanie przeprowadzone na czterech dużych firmach wykazało, że komercyjnie dostępnych przeciwciał do stosowania u myszy było około 112 000 w porównaniu z około 5 300 do stosowania u danio pręgowanego15. Ostatecznie zdecydowaliśmy się opracować protokół, który można wykonać na pojedynczej kriosekcji, co jest niezbędne podczas pracy z małymi lub ograniczonymi próbkami tkanek, takimi jak te uzyskiwane z zarodków danio pręgowanego.
Ten protokół został zaprojektowany do oceny zachowania proliferacyjnego komórek dawcy w 48 godzinach po zapłodnieniu chimerycznych zarodków danio pręgowanego, które zostały wygenerowane przez przeszczep blastuli do blastuli, jak opisali Carmany-Rampey i Moens16. Zarodki dawcy wstrzykiwano w stadium jednokomórkowym za pomocą znakowanego fluorescencyjnie koniugatu dekstranu przed przeszczepieniem komórek dawcy do zarodków biorcy. Zastosowaliśmy immunofluorescencję dla fosforylowanego histonu H3 Ser 10 (pH3) w celu wykrycia proliferujących komórek, a następnie immunohistochemię dla znakowanego dekstranu w celu wykrycia komórek dawcy w chimerycznych zarodkach danio pręgowanego. Sekwencyjne wykrywanie pH3 i znakowanego dekstranu w ramach jednej kriosekcji umożliwiło nam identyfikację i ilościowe określenie poszczególnych komórek, które wykazywały ekspresję obu markerów.
Ten sekwencyjny protokół IF/IHC dla kriosekcyjnego danio pręgowanego będzie użytecznym narzędziem dla badaczy danio pręgowanego, którzy pragną protokołu kolokalizacji dla ekspresji białek. Problemy, które ten protokół miał rozwiązać, takie jak małe próbki tkanek i ograniczona dostępność przeciwciał, nie są unikalne dla modelu danio pręgowanego. Metoda ta może być zatem przydatna dla każdego badacza pragnącego przeprowadzić sekwencyjne IF/IHC.
OŚWIADCZENIE ETYCZNE:
Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee, North Carolina State University, Raleigh, North Carolina, USA.

<table><tbody><tr><td>15/25</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>15% żelatyna rybna/25% sacharoza w/v, wykonane z dH2O</td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe Alexa 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21429</td><td>stosowane w rozcieńczeniu 1:2,000 w buforze blokowym dla przeciwciała IF</td></tr><tr><td>Diluent</td><td>Dako</td><td>S3022</td><td></td></tr><tr><td>Tło Buster Buster</td><td></td><td>NB306</td><td></td></tr><tr><td>bufor blokowy (IF)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>5% normalna surowica kozia, 0,1% Triton X-100 w 1x PBS</td></tr><tr><td>cellOprogramowanie do obrazowania Sens Oprogramowanie</td> do obrazowania <td>Olympus</td><td>cellSens</td><td>używane z mikroskopem światła złożonego</td></tr><tr><td>chimeryczne zarodki danio pręgowanego</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>AB chimery typu dzikiego analizowane przy 48 hpf&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop światła złożonego</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td>używany z aparatem cyfrowym i oprogramowaniem do obrazowania cellSens do przechwytywania obrazu po</td></tr><tr><td>konfokalnym mikroskopie fluorescencyjnym</td> IHC <td>Leica</td><td>DM 2500</td><td>używany z aparatem cyfrowym i pakietem Leica Application Suite Zaawansowane oprogramowanie do obrazowania fluorescencji po IF</td></tr><tr><td>Jednorazowe formy plastikowe, 15 mm x 15 mm x 5 mm</td><td>Ted Pella</td><td>27147-2</td><td></td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy, mikroskop świetlny</td><td>Olympus</td><td>DP27</td><td></td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy, mikroskop fluorescencyjny</td><td>Leica</td><td>TCS SPE</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Koptec</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna rybna</td><td>Sigma</td><td>G7041</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka</td><td>podstawowe Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru, 30%</td><td>Fisher</td><td>H325-100</td><td></td></tr><tr><td>ImmPRESS Zestaw do wykrywania polimerów HRP</td><td>Vector</td><td>MP-7401</td> przeciwciało <td>wtórne przeciw królikowi, polimer HRP</td></tr><tr><td>Pakiet aplikacji Leica Zaawansowane oprogramowanie do obrazowania fluorescencyjnego</td> Oprogramowanie do obrazowania <td>Leica</td><td>LAS AF 2.3.6</td><td>używane z konfokalnym mikroskopem fluorescencyjnym</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowana Hematoksylina Meyera</td><td>Thermo</td><td>72804</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>MP Biomedical</td><td>191356</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>medium Tissue-Tek/Fisher</td><td>4583/4585</td><td></td></tr><tr><td>anty-Oregon Green</td><td>przeciwciało Sondy molekularne/Life Technologies</td><td>A889</td><td>stosowane w rozcieńczeniu 1:7500 dla IHC</td></tr><tr><td>Oregon Green Dextran</td><td>Invitrogen</td><td>P7171</td><td>stosowany w stężeniu 2,5% w 0,2 M KCl</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, 4%</td> <td>Acros Organics</td><td>416780030</td><td>wyprodukowane w laboratorium w 1x PBS</td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15</td><td></td></tr><tr><td>1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>wyprodukowana w laboratorium</td><td>N/A</td><td>50 ml 10x PBS, objętość do 500 ml z dH2O</td></tr><tr><td>10x sól fizjologiczna buforowana fosforyzem</td><td>wyprodukowana w laboratorium</td><td>N/A</td><td>przy użyciu protokołu Cold Spring Harbor</td></tr><tr><td>1x PBSt</td><td>wyprodukowano w laboratorium</td><td>N/A</td><td>50 ml 10x PBS, 1 mL 10% Tween 20, objętość do 500 ml z dH2O</td></tr><tr><td>fosforylowane przeciwciało histonowe H3</td> Santa <td>Cruz</td><td>sc-8656-R</td><td>stosowane w rozcieńczeniu 1:500 do IF</td></tr><tr><td>Scott's Tap Water</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>26070-06</td><td>z powodzeniem stosowały inne marki oprócz EMS</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Amresco</td><td>335</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher</td><td>BP337</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO3</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td>stosowany w stosunku 1:1,000 w 1x PBS do IF</td></tr><tr><td>1x sól fizjologiczna buforowana Tris</td><td>wyprodukowana w laboratorium</td><td>N/A</td><td>50 mL 10x TBS, do 500 mL objętości z dH2O</td></tr><tr><td>10x sól fizjologiczna buforowana Tris</td><td>wyprodukowana w laboratorium</td><td>N/A</td><td>85 g NaCl, 61 g Tris base, do 1 L objętości z dH2O</td></tr><tr><td>1x TBSt</td><td>wyprodukowany w laboratorium</td><td>N/ A</td><td>50 ml 10x TBS, 1 mL 10% Tween 20, objętość do 500 ml z dH2O</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>327371000</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector</td><td>H-1000</td><td>nieutwardzalny nośnik montażowy</td></tr><tr><td>Vector NovaRed Podłoże</td><td></td><td>Vector SK-4800</td><td>HRP</td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Fisher</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

sekwencyjna immunofluorescencja i immunohistochemia na kriowyciętych zarodkach danio pręgowanego

Sequential Immunofluorescence and Immunohistochemistry on Cryosectioned Zebrafish Embryos

Badanie interakcji międzykomórkowych często wymaga dyskretnego etykietowania określonych populacji komórek i precyzyjnej lokalizacji białek. Zarodek danio pręgowanego jest doskonałym narzędziem do badania takich interakcji z modelem in vivo. Testy immunohistochemiczne i immunofluorescencyjne są często stosowane w zarodkach danio pręgowanego w celu oceny ekspresji białek. Jednak uzyskanie dokładnego mapowania kolokalizowanych białek w przestrzeni trójwymiarowej może być trudne. Ponadto niektóre badania mogą wymagać użycia dwóch przeciwciał, które nie są zgodne z tą samą techniką (np. przeciwciało 1 nadaje się tylko do immunohistochemii, a przeciwciało 2 nadaje się tylko do immunofluorescencji). Celem metody opisanej w niniejszym dokumencie jest przeprowadzenie sekwencyjnej immunofluorescencji i/lub immunohistochemii na poszczególnych kriosekcjach pochodzących z zarodków danio pręgowanego we wczesnym stadium rozwoju. Tutaj opisujemy zastosowanie sekwencyjnych rund immunofluorescencji, obrazowania, immunohistochemii, obrazowania dla pojedynczej kriosekcji w celu uzyskania precyzyjnej identyfikacji ekspresji białka na poziomie pojedynczej komórki. Metodologia ta jest odpowiednia dla każdego badania na zarodkach danio pręgowanego we wczesnym stadium, które wymaga dokładnej identyfikacji wielu celów białkowych w poszczególnych komórkach.

Opracowaliśmy ten protokół w celu identyfikacji i analizy ekspresji białek w poszczególnych komórkach dawcy w chimerycznych embrionach zebrafish 48 h po zapłodnieniu, które zostały wytworzone poprzez transplantację blastuli do blastuli pomiędzy embrionami zebrafish szczepu AB typu dzikiego. Pomyślna analiza ekspresji białek na poziomie pojedynczej komórki wymagała przygotowania krioprzecięć z odpowiednio zorientowanymi embrionami (Rycina 1 i Rycina 2) oraz starannego, sekwencyjnego zastosowania technik IF i IHC na tych krioprzecięciach (Rycina 3 i Rycina 4). Zastosowanie specyficznych przeciwciał do jednoczesnego wykrywania komórek proliferujących (anty-pH3, Rycina 5A,B) oraz komórek dawcy (anty-znakowany dekstran, Rycina 5D) może służyć do identyfikacji i kwantyfikacji aktywnie proliferujących komórek dawcy (Rycina 5E). Niezbędne jest uzyskanie wysokiej jakości obrazów zarówno po IF (Rycina 2A,B), jak i IHC (Rycina 2D), aby dokładnie zidentyfikować poszczególne komórki. Do nałożenia obrazów na siebie (Rycina 5E>) należy użyć programu do analizy obrazu. W zależności od zastosowanego programu do analizy obrazu możliwe może być przeprowadzenie automatycznego przeliczenia znakowanych komórek, jeśli wymagana jest kwantyfikacja.
<img alt="Proces mrożenia w blokach z próbkami tkanek w oznakowanych formach, przedstawiony w układzie naukowym; metoda." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59344/59344fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1: Przygotowanie mrożonych bloków OCT. (A) Widok mikroskopowy (50x) embrionów w OCT w formie kriogenicznej przygotowanej do zamrażania. Czerwona strzałka wskazuje położenie głowy embrionu danio przebrzuchłego względem dolnej powierzchni formy; czarna strzałka wskazuje ogon skierowany w górę, w stronę użytkownika. (B) Plastikowe formy z zarodkami i OCT umieszczone na schłodzonej platformie metalowej. (C) Piankowy kubełek z lodem umieszczony nad plastikowymi formami w celu utworzenia komory mrożącej. (D) Gdy blok zostanie całkowicie zamrożony, OCT zmienia kolor z przezroczystego na biały. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59344/59344fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces mikrotomii w krioztacie, przygotowanie próbek, cięcie na mikrotomie do analizy tkanek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59344/59344fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Kriosekcjonowanie zamrożonych bloków OCT. (A), nałożenie świeżego OCT na dysk kriostatu i umieszczenie zamrożonego bloku na OCT, w pozycji obróconej 180° z orientacji zamrażania bloku. (B) Widok z boku bloku zamrożonego do tarczy sekcyjnej. (C) Widok bloku do sekcjonowania z płytką rolującą w odpowiedniej pozycji. (D) Pobieranie skrawków z metalowej platformy kriotomu za pomocą naładowanego szkiełka. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59344/59344fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Test dyfuzyjny na podłożu agarowym na szkiełku przedmiotowym; badanie wrażliwości na antybiotyki; eksperyment mikrobiologiczny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59344/59344fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3: Widok przygotowanych skrawków po umieszczeniu ich na szkiełku. Strzałka wskazuje barierę hydrofobową, a linia przerywana wyznacza strefę zawierającą przekroje wewnątrz obrysu bariery. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59344/59344fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Konfiguracja laboratoryjna z pipetą, komorą suszącą oraz stoperem; koncentracja badawcza na metodzie przygotowania próbek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59344/59344fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4: Przygotowanie do aplikacji substratu chromogennego podczas IHC. Preparat umieszcza się na płaskiej powierzchni pokrytej folią spożywczą, aby umożliwić równomierne naniesienie substratu chromogennego i zapobiec rozlaniu materiałów niebezpiecznych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59344/59344fig4large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Schemat barwienia histologicznego z opisanymi sekcjami, podkreślający lokalizację białek i strukturę tkanki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59344/59344fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rysunek 5: Reprezentatywne znakowanie IF i IHC krioprzekrojów chimerycznych zarodków danio przebrwonionego w 48. godzinie rozwoju (hpf), otrzymanych w wyniku transplantacji z blastuli do blastuli pomiędzy zarodkami danio przebrwonionego typu dzikiego AB. (A) IF w celu wykrycia ekspresji fosforylowanej histony H3 w obrębie Ser 10 (anty-pH3, 1:20) w chimerycznym zarodku zebrafish w 48. hpf. Kolor czerwony = komórki pH3-dodatnie; kolor niebieski = jądra komórkowe. Żółte strzałki wskazują przykłady komórek dodatnich. (BOdjęcie niebieskiego barwnika jądrowego w obrazie cyfrowym (oprogramowanie ImageJ) poprawia wizualizację komórek pH3-dodatnich w celu ich ilościowego oznaczenia oraz nałożenia obrazów.C) Kontrola negatywna (wyłącznie przeciwciało wtórne) dla analizy IF w krioprzekroju chimerycznego zarodka ryby danio w 48 hpf. Pasek skali reprezentuje 50 µm (dotyczy wszystkich paneli). (D) IHC w celu wykrycia znakowanego dekstranu (anty-znakowany dekstran, 1:7 50) w chimerycznym zarodku danio pręgowanego o wieku 48 hpf, otrzymanym w wyniku przeszczepu z blastuli do blastuli pomiędzy zarodkami danio pręgowanego typu dzikiego AB. Zarodki dawcy zostały wstrzyknięte fluorescencyjnym koniugatem dekstranu w stadium jednego komórki przed wykonaniem przeszczepu z blastuli do blastuli. Kolor czerwony oznacza komórki znakowane koniugatem dekstranu; kolor niebieski oznacza jądra komórkowe. Żółte strzałki wskazują przykłady komórek dodatnich. (E) Nałożenie panelu B (IF dla pH3) i panelu C (IHC dla znakowanego dekstranu), wykazujące kolokalizację ekspresji pH3 i znakowania dekstranem w pojedynczych komórkach. Żółte strzałki wskazują przykłady komórek podwójnie dodatnich. (F) Kontrola negatywna (wyłącznie przeciwciało wtórne) dla analizy IHC w mrożonych sekcjach embrionu chimerycznego rybki zebrafish w 48 hpf. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59344/59344fig5large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół demonstruje sekwencyjną immunofluorescencję i immunohistochemię na kriosekcjach z wczesnych stadiów zarodków danio pręgowanego, umożliwiając precyzyjne analizy kolokalizacji w określonych populacjach komórek.

Sekwencyjna immunofluorescencja i immunohistochemia na kriowyciętych zarodkach danio pręgowanego

Investigation of intercellular interactions often requires discrete labeling of specific cell populations and precise protein localization. The zebrafish ...

Protokół ten demonstruje nowatorską procedurę sekwencyjnej immunofluorescencji i immunohistochemii kriosekcji z pęcherzyków danio pręgowanego we wczesnym stadium, co umożliwia precyzyjne analizy kolokalizacji w określonych populacjach komórek. Główną zaletą tego protokołu jest jego elastyczność. Łączy w sobie techniki immunofluorescencji i immunohistochemii przy użyciu pojedynczej kriosekcji, aby zmaksymalizować morfologię tkanki, kolokalizację ekspresji i zgodność przeciwciał.Protokół ten można zastosować do innych modeli ryb lub ziemnowodnych, ponieważ badacze ci często borykają się z podobnymi komplikacjami związanymi z dostępnością przeciwciał i często przeprowadzają podobne rodzaje eksperymentów. Praca z kriosekcjami zarodków we wczesnym stadium może być trudna, ponieważ są one małe, a kriosekcja może być wyzwaniem, ale zaawansowane przygotowanie i praktyka pomogą złagodzić wszelkie trudności związane z tą metodą. W naszym protokole jest wiele kroków, które wymagają szczególnego obchodzenia się i ostrożności i mogą być trudne do opanowania bez zobaczenia, jak ktoś demonstruje techniki.Na początek przenieś poprzednie, utrwalone i przygotowane czterdzieści osiem godzin po zapłodnieniu chimeryczne zarodki danio pręgowanego z probówki z mieszaniną 15 25 OCT do plastikowej formy za pomocą kleszczy, minimalizując jakikolwiek transfer mieszanki. Wypełnij formę mniej więcej do połowy pożywką OCT i delikatnie wymieszaj w niej zarodki. Przygotuj oznakowane plastikowe formy i przenieś pożądane zarodki do pustych, oznakowanych plastikowych form, minimalizując przenoszenie pożywki OCT.Następnie delikatnie napełnij pożywką OCT do górnej części foremek z zarodkami. Pracując pod lekkim mikroskopem stereoskopowym do wizualizacji, użyj igieł, aby ułożyć zarodki w pożądanej orientacji. Następnie przygotowane foremki umieść w izolowanym pojemniku z metalową platformą i zamroź je na suchym lodzie.Delikatnie umieść wiaderko z lodem na metalowej platformie, aby utworzyć zimną komorę i zamrażaj przez około 30 minut. Używając kriostatu ustawionego na minus 20 stopni Celsjusza, pokrój osadzone zarodki w kriosekcjach o grubości od 10 do 12 mikrometrów, okresowo sprawdzając głębokość przekroju pod mikroskopem w celu monitorowania lokalizacji i tkanki. Umieść sekcje na naładowanych szkiełkach i wysusz je na powietrzu w temperaturze pokojowej przez noc.Umyj szkiełka trzy razy przez pięć minut w 1X PBS w odpowiednim pojemniku. Połóż szkiełka na płaskiej powierzchni w wilgotnej komorze. Użyj pisaka barierowego, aby obrysować sekcje, aby utrzymać płyn na szkiełkach.Odpipetować 200 mikrolitrów buforu blokowego na sekcję i inkubować w buforze blokowym przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Przygotować pierwszorzędowe rozcieńczenie przeciwciał i bufor blokowy, a następnie dobrze wymieszać przez pipetowanie. Delikatnie przechylić szkiełka, aby spuścić bufor blokowy i wrócić do wilgotnej komory.Odpipetować 200 mikrolitrów roztworu przeciwciała pierwszorzędowego na sekcję na szkiełka i 200 mikrolitrów buforu blokowego na odpowiednie sekcje jako kontrolę. Inkubuj szkiełka w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc w wilgotnej komorze wypełnionej dejonizowaną wodą, upewniając się, że krawędzie komory są uszczelnione, aby zatrzymać wilgoć. Umyj szkiełka trzy razy przez pięć minut w 1X PBS i w odpowiednim pojemniku.Przygotować rozcieńczenie przeciwciał drugorzędowych podczas przemywania i zablokować bufor, a następnie dobrze wymieszać przez pipetowanie. Po ułożeniu szkiełek na płaskiej powierzchni w wilgotnej komorze dodać 200 mikrolitrów wtórnego roztworu przeciwciał na sekcję. Inkubować szkiełka w wtórnym roztworze przeciwciał w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut.Umyj szkiełka trzy razy przez pięć minut w 1X PBS w odpowiednim pojemniku. Po umieszczeniu szkiełek na płaskiej powierzchni dodać roztwór do barwienia jądrowego na każdą sekcję i inkubować pod przykryciem przez 10 minut. Po spuszczeniu roztworu do barwienia jądrowego zamontuj szkiełka za pomocą nietwardniejących fluorescencyjnych mediów montażowych i szklanego szkiełka nakrywkowego.Upewnij się, że trzymasz je w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu obrazowania. Umieść szkiełka w pojedynczych pojemnikach z 1X PBS i przechowuj płasko w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, delikatnie mieszając, aby poluzować szkiełka nakrywkowe na tyle, aby odpadły po zmieszaniu. Upewnij się, że nie naciskasz szkiełka nakrywkowego ani nie próbujesz go usunąć ręcznie, ale poczekaj, aż odpadną przy minimalnym wymuszonym ruchu.Po usunięciu szkiełek nakrywkowych delikatnie przenieś szkiełka do pojemnika ze świeżym 1X PBS. Usuń 1X PBS i inkubuj szkiełka w 1X tris-buforowanej soli fizjologicznej z 0,1% niejonowego środka powierzchniowo czynnego trzy razy przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Inkubować szkiełka w 3% roztworze nadtlenku wodoru w temperaturze pokojowej przez 15 minut.Następnie połóż szkiełko płasko i dodaj bufor blokowy kroplami do powierzchni. Delikatnie przechyl szkiełka, aby opróżnić bufor blokowy. Osusz obszar wokół sekcji i umieść szkiełka płasko w wilgotnej komorze.Dodać 200 mikrolitrów roztworu przeciwciała pierwszorzędowego na sekcję na szkiełka i inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Delikatnie przechyl szkiełka, aby odsączyć roztwór przeciwciał pierwotnych i umyj dwa razy przez pięć minut w 1X TBST. Następnie nałóż gotowy do użycia odczynnik blokujący tło kroplami do każdej sekcji i inkubuj w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 20 minut.Delikatnie przechyl szkiełka, aby opróżnić bufor blokowy. Ostrożnie osusz obszar wokół sekcji i umieść szkiełka płasko w wilgotnej komorze. Kroplami nanieść gotowy do użycia roztwór przeciwciał drugorzędowych na każdą sekcję i inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Delikatnie przechyl szkiełka, aby odsączyć wtórny roztwór przeciwciał i umyj dwa razy przez pięć minut w 1X TBST. Po wysuszeniu obszaru wokół sekcji umieść szkiełka na płaskiej powierzchni i dodaj 200 mikrolitrów podłoża chromogenicznego HRP do każdej sekcji. Uruchom stoper, gdy podłoże zostanie nałożone na pierwsze szkiełko i inkubuj w temperaturze pokojowej przez trzy minuty.Odcedź roztwór podłoża. Szkiełka należy krótko przepłukać w odpowiednim pojemniku z 1X PBS i umyć je dwukrotnie w wodzie dejonizowanej przez pięć minut, delikatnie mieszając. Przeciwbarwić preparaty, umieszczając je w roztworze barwiącym hematoksyliną na maksymalnie 30 sekund i umyć trzy razy po pięć minut w wodzie dejonizowanej.Inkubować szkiełka w pojemniku zawierającym wodę z kranu Scotta przez jedną minutę, a następnie ponownie myć trzy razy przez pięć minut w wodzie dejonizowanej. Odwodnić szkiełka za pomocą szeregu gatunków etanolu rozcieńczonych w wodzie dejonizowanej i ksylenie w okapie chemicznym. Po wyjęciu szkiełek z ksylenu należy natychmiast dodać podłoże montażowe na bazie toluenu i umieścić szkiełko nakrywkowe.Aby zapewnić powodzenie podczas ślizgania się nakrywki, ważne jest, aby pracować z jednej strony szkiełka na drugą, jednocześnie powoli opuszczając szkiełko nakrywkowe, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków, które zasłaniałyby tkankę. Na koniec wizualizuj i zobrazuj slajdy za pomocą mikroskopu światła złożonego i kamery cyfrowej przy 100-krotnym powiększeniu. Specyficzne przeciwciała stosowane tutaj do jednoczesnego wykrywania komórek proliferujących i komórek dawcy identyfikowały i określały ilościowo komórki dawcy, które aktywnie się proliferują.Zarówno po immunofluorescencji, jak i immunohistochemii niezbędne jest generowanie wysokiej jakości obrazów w celu dokładnej identyfikacji poszczególnych komórek. Do wykonania nakładki obrazu użyto programu do analizy obrazu. Podczas wykonywania tej procedury najważniejsze jest, aby odpowiednio zabarwić i przeciwdziałać przebarwieniom podczas immunohistochemii.Po tej procedurze można zastosować dodatkowe metody jako modyfikacje oryginalnego protokołu, takie jak użycie różnych kombinacji przeciwciał, typów tkanek lub gatunków. Obrazy mogą być również analizowane na różne sposoby w celu uzyskania odpowiednich danych. Technika ta pozwoliła nam spojrzeć na kolokalizację i wiele środowisk genetycznych jako sposób badania interakcji między komórkami i mogła być stosowana podobnie do innych technik wymagających szczegółowej analizy kolokalizacji.Wiele odczynników w immunohistochemii jest niebezpiecznych i należy je odpowiednio traktować. Prace z etanolem, ksylenem i sztywnym montażem należy wykonywać w masce. Odpady DAB należy utylizować jako odpady niebezpieczne, a pranie po DAB należy wybielić.

sequential-immunofluorescence-immunohistochemistry-on-cryosectioned

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Hybrydyzacja in situ w preparatach całych jest jedną z najszerzej stosowanych technik w biologii rozwoju. Przedstawiamy tutaj protokół podwójnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości, służący do analizy precyzyjnego wzorca ekspresji pojedynczego genu oraz określania nakładania się domen ekspresji dwóch genów. Włączyliśmy barwienie jąder jodkiem propidyny w celu uwydatnienia organizacji tkanki.

Wysokorozdzielcza podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w całych embrionach ryby danio-ostrobłysku

Opisano szybką metodę immunobarwienia embrionalnego serca danio pręgowanego. W porównaniu z metodą immunobarwienia całych preparatów, metoda ta znacznie zwiększa penetrację przeciwciał, co pozwala na uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości, ujawniających struktury komórkowe i podkomórkowe w sercu przy znacznie krótszym czasie przetwarzania.

Immunobarwienie wypreparowanego serca embrionalnego ryby danio

Opisany tutaj jest protokół półautomatycznego obrazowania specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego.

Półautomatyczne obrazowanie specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego

Zarodek danio pręgowanego jest doskonałym modelem do badań nad biologią rozwojową. Podczas embriogenezy danio pręgowany rozwija się z masą żółtka, co stanowi trójwymiarowe wyzwanie dla obserwacji i analizy próbek. Protokół ten opisuje, w jaki sposób tworzyć dwuwymiarowe preparaty do montażu płaskiego całych próbek zarodków danio pręgowanego barwionych metodą montażu in situ (WISH).

Przygotowanie do obserwacji i analizy próbek zarodków danio pręgowanego wybarwionych metodą hybrydyzacji in situ metodą całego wierzchowca

Obrazowanie dynamicznego zachowania organelli i innych struktur subkomórkowych in vivo może rzucić światło na ich funkcję w warunkach fizjologicznych i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metody genetycznego znakowania dwóch organelli, centrosomów i mitochondriów oraz obrazowania ich dynamiki w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej.

Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego

Opisano techniki immunobarwienia fosfo-epitopów w całych zarodkach danio pręgowanego, a następnie przeprowadzania dwukolorowej fluorescencyjnej lokalizacji konfokalnej w strukturach komórkowych tak małych jak pierwotne rzęski. Techniki utrwalania i obrazowania mogą określać lokalizację i kinetykę pojawiania się lub aktywacji określonych białek.

Immunobarwiące fosfo-epitopy w narządach rzęskowych całych zarodków danio pręgowanego

Metody immunoznakowania do analizy różnych populacji mikrotubul w rozwijającym się mózgu danio pręgowanego są tutaj opisane, które mają szerokie zastosowanie do innych tkanek. Pierwszy protokół przedstawia zoptymalizowaną metodę znakowania immunologicznego stabilnych i dynamicznych mikrotubul. Drugi protokół zapewnia metodę obrazowania i ilościowego oznaczania powstających mikrotubul.

Zastosowanie znakowania immunologicznego do analizy stabilnych, dynamicznych i powstających mikrotubul w zarodku danio pręgowanego

Rozwój rzęsek jest niezbędny do prawidłowego organogenezy. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę oznaczania i wizualizacji komórek rzęskowych danio pręgowanego.

Wizualizacja wielorzęskowych komórek u danio pręgowanego za pomocą połączonego protokołu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i immunofluorescencji całej góry

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania białek za pośrednictwem przeciwciał fluorescencyjnych w całych preparatach zarodków i larw danio pręgowanego.

Immunohistochemia całego wierzchowca w zarodkach i larwach danio pręgowanego

Ten protokół opisuje, jak uzyskać obrazy poprzez połączenie hybrydyzacji in situ i immunohistochemii odcinków embrionalnych danio pręgowanego. Przed kriosekcją przeprowadzono hybrydyzację in situ, a następnie barwienie przeciwciałami. Przydatne jest wykrycie wzorców ekspresji dwóch genów u danio pręgowanego, jeśli występuje niedobór przeciwciał.

In Situ Hybrydyzacja połączona z immunohistochemią w kriosekcji zarodków danio pręgowanego

Optogenetyczne manipulowanie szlakami sygnałowymi może być potężną strategią do zbadania, w jaki sposób sygnalizacja jest dekodowana w rozwoju, regeneracji, homeostazie i chorobie. Protokół ten zawiera praktyczne wskazówki dotyczące stosowania aktywatorów sygnalizacyjnych białka węzłowego i morfogennego kości (BMP) opartych na dziedzinie wykrywania światła i tlenu we wczesnym zarodku danio pręgowanego.

Aktywacja sygnalizacji optogenetycznej w zarodkach danio pręgowanego

Poznaj sekwencyjną immunofluorescencję i immunohistochemię na kriowyciętych zarodkach Danio rerio. Ta metoda umożliwia precyzyjną kolokalizację w populacjach komórkowych i poprawia morfologię tkanek.

Sekwencyjna immunofluorescencja i immunohistochemia na kriowyciętych zarodkach danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów