Sekwencyjna immunofluorescencja i immunohistochemia na kriowyciętych zarodkach danio pręgowanego

Protokół ten demonstruje nowatorską procedurę sekwencyjnej immunofluorescencji i immunohistochemii kriosekcji z pęcherzyków danio pręgowanego we wczesnym stadium, co umożliwia precyzyjne analizy kolokalizacji w określonych populacjach komórek. Główną zaletą tego protokołu jest jego elastyczność. Łączy w sobie techniki immunofluorescencji i immunohistochemii przy użyciu pojedynczej kriosekcji, aby zmaksymalizować morfologię tkanki, kolokalizację ekspresji i zgodność przeciwciał.

Protokół ten można zastosować do innych modeli ryb lub ziemnowodnych, ponieważ badacze ci często borykają się z podobnymi komplikacjami związanymi z dostępnością przeciwciał i często przeprowadzają podobne rodzaje eksperymentów. Praca z kriosekcjami zarodków we wczesnym stadium może być trudna, ponieważ są one małe, a kriosekcja może być wyzwaniem, ale zaawansowane przygotowanie i praktyka pomogą złagodzić wszelkie trudności związane z tą metodą. W naszym protokole jest wiele kroków, które wymagają szczególnego obchodzenia się i ostrożności i mogą być trudne do opanowania bez zobaczenia, jak ktoś demonstruje techniki.

Na początek przenieś poprzednie, utrwalone i przygotowane czterdzieści osiem godzin po zapłodnieniu chimeryczne zarodki danio pręgowanego z probówki z mieszaniną 15 25 OCT do plastikowej formy za pomocą kleszczy, minimalizując jakikolwiek transfer mieszanki. Wypełnij formę mniej więcej do połowy pożywką OCT i delikatnie wymieszaj w niej zarodki. Przygotuj oznakowane plastikowe formy i przenieś pożądane zarodki do pustych, oznakowanych plastikowych form, minimalizując przenoszenie pożywki OCT.

Następnie delikatnie napełnij pożywką OCT do górnej części foremek z zarodkami. Pracując pod lekkim mikroskopem stereoskopowym do wizualizacji, użyj igieł, aby ułożyć zarodki w pożądanej orientacji. Następnie przygotowane foremki umieść w izolowanym pojemniku z metalową platformą i zamroź je na suchym lodzie.

Delikatnie umieść wiaderko z lodem na metalowej platformie, aby utworzyć zimną komorę i zamrażaj przez około 30 minut. Używając kriostatu ustawionego na minus 20 stopni Celsjusza, pokrój osadzone zarodki w kriosekcjach o grubości od 10 do 12 mikrometrów, okresowo sprawdzając głębokość przekroju pod mikroskopem w celu monitorowania lokalizacji i tkanki. Umieść sekcje na naładowanych szkiełkach i wysusz je na powietrzu w temperaturze pokojowej przez noc.

Umyj szkiełka trzy razy przez pięć minut w 1X PBS w odpowiednim pojemniku. Połóż szkiełka na płaskiej powierzchni w wilgotnej komorze. Użyj pisaka barierowego, aby obrysować sekcje, aby utrzymać płyn na szkiełkach.

Odpipetować 200 mikrolitrów buforu blokowego na sekcję i inkubować w buforze blokowym przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Przygotować pierwszorzędowe rozcieńczenie przeciwciał i bufor blokowy, a następnie dobrze wymieszać przez pipetowanie. Delikatnie przechylić szkiełka, aby spuścić bufor blokowy i wrócić do wilgotnej komory.

Odpipetować 200 mikrolitrów roztworu przeciwciała pierwszorzędowego na sekcję na szkiełka i 200 mikrolitrów buforu blokowego na odpowiednie sekcje jako kontrolę. Inkubuj szkiełka w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc w wilgotnej komorze wypełnionej dejonizowaną wodą, upewniając się, że krawędzie komory są uszczelnione, aby zatrzymać wilgoć. Umyj szkiełka trzy razy przez pięć minut w 1X PBS i w odpowiednim pojemniku.

Przygotować rozcieńczenie przeciwciał drugorzędowych podczas przemywania i zablokować bufor, a następnie dobrze wymieszać przez pipetowanie. Po ułożeniu szkiełek na płaskiej powierzchni w wilgotnej komorze dodać 200 mikrolitrów wtórnego roztworu przeciwciał na sekcję. Inkubować szkiełka w wtórnym roztworze przeciwciał w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut.

Umyj szkiełka trzy razy przez pięć minut w 1X PBS w odpowiednim pojemniku. Po umieszczeniu szkiełek na płaskiej powierzchni dodać roztwór do barwienia jądrowego na każdą sekcję i inkubować pod przykryciem przez 10 minut. Po spuszczeniu roztworu do barwienia jądrowego zamontuj szkiełka za pomocą nietwardniejących fluorescencyjnych mediów montażowych i szklanego szkiełka nakrywkowego.

Upewnij się, że trzymasz je w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu obrazowania. Umieść szkiełka w pojedynczych pojemnikach z 1X PBS i przechowuj płasko w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, delikatnie mieszając, aby poluzować szkiełka nakrywkowe na tyle, aby odpadły po zmieszaniu. Upewnij się, że nie naciskasz szkiełka nakrywkowego ani nie próbujesz go usunąć ręcznie, ale poczekaj, aż odpadną przy minimalnym wymuszonym ruchu.

Po usunięciu szkiełek nakrywkowych delikatnie przenieś szkiełka do pojemnika ze świeżym 1X PBS. Usuń 1X PBS i inkubuj szkiełka w 1X tris-buforowanej soli fizjologicznej z 0,1% niejonowego środka powierzchniowo czynnego trzy razy przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Inkubować szkiełka w 3% roztworze nadtlenku wodoru w temperaturze pokojowej przez 15 minut.

Następnie połóż szkiełko płasko i dodaj bufor blokowy kroplami do powierzchni. Delikatnie przechyl szkiełka, aby opróżnić bufor blokowy. Osusz obszar wokół sekcji i umieść szkiełka płasko w wilgotnej komorze.

Dodać 200 mikrolitrów roztworu przeciwciała pierwszorzędowego na sekcję na szkiełka i inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Delikatnie przechyl szkiełka, aby odsączyć roztwór przeciwciał pierwotnych i umyj dwa razy przez pięć minut w 1X TBST. Następnie nałóż gotowy do użycia odczynnik blokujący tło kroplami do każdej sekcji i inkubuj w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 20 minut.

Delikatnie przechyl szkiełka, aby opróżnić bufor blokowy. Ostrożnie osusz obszar wokół sekcji i umieść szkiełka płasko w wilgotnej komorze. Kroplami nanieść gotowy do użycia roztwór przeciwciał drugorzędowych na każdą sekcję i inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Delikatnie przechyl szkiełka, aby odsączyć wtórny roztwór przeciwciał i umyj dwa razy przez pięć minut w 1X TBST. Po wysuszeniu obszaru wokół sekcji umieść szkiełka na płaskiej powierzchni i dodaj 200 mikrolitrów podłoża chromogenicznego HRP do każdej sekcji. Uruchom stoper, gdy podłoże zostanie nałożone na pierwsze szkiełko i inkubuj w temperaturze pokojowej przez trzy minuty.

Odcedź roztwór podłoża. Szkiełka należy krótko przepłukać w odpowiednim pojemniku z 1X PBS i umyć je dwukrotnie w wodzie dejonizowanej przez pięć minut, delikatnie mieszając. Przeciwbarwić preparaty, umieszczając je w roztworze barwiącym hematoksyliną na maksymalnie 30 sekund i umyć trzy razy po pięć minut w wodzie dejonizowanej.

Inkubować szkiełka w pojemniku zawierającym wodę z kranu Scotta przez jedną minutę, a następnie ponownie myć trzy razy przez pięć minut w wodzie dejonizowanej. Odwodnić szkiełka za pomocą szeregu gatunków etanolu rozcieńczonych w wodzie dejonizowanej i ksylenie w okapie chemicznym. Po wyjęciu szkiełek z ksylenu należy natychmiast dodać podłoże montażowe na bazie toluenu i umieścić szkiełko nakrywkowe.

Aby zapewnić powodzenie podczas ślizgania się nakrywki, ważne jest, aby pracować z jednej strony szkiełka na drugą, jednocześnie powoli opuszczając szkiełko nakrywkowe, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków, które zasłaniałyby tkankę. Na koniec wizualizuj i zobrazuj slajdy za pomocą mikroskopu światła złożonego i kamery cyfrowej przy 100-krotnym powiększeniu. Specyficzne przeciwciała stosowane tutaj do jednoczesnego wykrywania komórek proliferujących i komórek dawcy identyfikowały i określały ilościowo komórki dawcy, które aktywnie się proliferują.

Zarówno po immunofluorescencji, jak i immunohistochemii niezbędne jest generowanie wysokiej jakości obrazów w celu dokładnej identyfikacji poszczególnych komórek. Do wykonania nakładki obrazu użyto programu do analizy obrazu. Podczas wykonywania tej procedury najważniejsze jest, aby odpowiednio zabarwić i przeciwdziałać przebarwieniom podczas immunohistochemii.

Po tej procedurze można zastosować dodatkowe metody jako modyfikacje oryginalnego protokołu, takie jak użycie różnych kombinacji przeciwciał, typów tkanek lub gatunków. Obrazy mogą być również analizowane na różne sposoby w celu uzyskania odpowiednich danych. Technika ta pozwoliła nam spojrzeć na kolokalizację i wiele środowisk genetycznych jako sposób badania interakcji między komórkami i mogła być stosowana podobnie do innych technik wymagających szczegółowej analizy kolokalizacji.

Wiele odczynników w immunohistochemii jest niebezpiecznych i należy je odpowiednio traktować. Prace z etanolem, ksylenem i sztywnym montażem należy wykonywać w masce. Odpady DAB należy utylizować jako odpady niebezpieczne, a pranie po DAB należy wybielić.