Name: Rozpuszczalność związków hydrofobowych w roztworze wodnym z wykorzystaniem kombinacji samoorganizującego się peptydu i aminokwasu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 8 s
Description: Poznaj metodę rozpuszczania związków hydrofobowych w wodzie przy użyciu samoorganizujących się peptydów i aminokwasów. To podejście eliminuje toksyczne rozpuszczalniki wspomagające, umożliwiając bezpieczniejsze zastosowanie terapeutyków w medycynie klinicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem, granty operacyjne MOP-42546 i MOP-119514.

1. Przygotowanie roztworów aminokwasów
<ol>
	<li>Przygotować i oznaczyć dwie stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 ml dla każdego aminokwasu (po jednej dla "niskich" i "wysokich" stężeń).</li>
	<li>Przygotować dużą kolbę o pojemności 2 litrów zawierającą oczyszczoną wodę (18,2 MΩ·cm w temperaturze 25 °C).</li>
	<li>Oblicz ilość każdego aminokwasu (w gramach), aby osiągnąć pożądane stężenia, i zważ odpowiednią ilość aminokwasu do odpowiednich probówek wirówkowych o pojemności 50 ml za pomocą szpatułki. 
	UWAGA: W przypadku "wysokiego" stężenia dwóch ujemnie naładowanych aminokwasów zamiast wody stosuje się PBS. Nie mogliśmy zwiększyć ich stężenia ze względu na niską rozpuszczalność w wodzie, a stosowanie PBS zamiast wody pomaga utrzymać niskie pH. Ponadto obliczenia stężenia uzyskano przy użyciu końcowej objętości 40 ml dla każdego roztworu aminokwasów. Wszystkie stężenia aminokwasów przedstawiono w tabeli 3. Pamiętaj, aby przepłukać szpatułkę między aminokwasami, aby uniknąć zanieczyszczenia. Zalecamy spłukanie wodą, a następnie przetarcie 70% etanolem.</li>
	<li>Dodać 40 ml oczyszczonej wody (lub PBS) do każdej probówki o pojemności 50 ml za pomocą pipety serologicznej. Zakryj probówki i wiruj lub energicznie wstrząsaj aż do rozpuszczenia. Sonikacja w kąpieli wodnej (temperatura pokojowa, 130 W, 40 kHz) może być również stosowana w celu wspomagania procesu rozpuszczalności. 
	UWAGA: Następujące roztwory aminokwasów są wrażliwe na światło i powinny być pokryte folią aluminiową: tryptofan, fenyloalanina i tyrozyna (które składają się z aromatycznych struktur przypominających pierścienie) oraz cysteina (reaktywna grupa -SH).</li>
</ol>
2. Przygotowanie rozwiązań SAP-AA
<ol>
	<li>Przygotować 20 ml fiolek scyntylacyjnych dla samoorganizujących się peptydów. Dla danego peptydu samoorganizującego się należy przygotować jedną fiolkę na przygotowany roztwór aminokwasu (każda kombinacja zostanie umieszczona w osobnej fiolce).</li>
	<li>Używając wagi analitycznej o wysokiej wydajności (o dokładności odczytu do 0,1 mg lub mniejszej), odważyć około 1 ± 0,2 mg peptydu na dnie każdej fiolki. Nakrętkę po zważeniu i zapisać dokładną masę peptydu na nasadce.</li>
	<li>Odmierzyć pipetą odpowiednią objętość roztworu aminokwasu (przygotowanego w sekcji 1) do każdej fiolki zawierającej peptyd, w celu osiągnięcia pożądanego stężenia peptydu samoorganizującego się (0,1 mg/ml dla długich peptydów o długości 16 aminokwasów lub 0,2 mg/ml dla krótszych peptydów o długości 8 aminokwasów).</li>
	<li>Sonikować przez 10 minut w łaźni wodnej (130 W, 40 kHz) w temperaturze pokojowej, upewniając się, że roztwory w fiolkach są całkowicie zanurzone w łaźni wodnej.</li>
</ol>
3. Przygotowanie roztworów podstawowych Lek-DMSO lub Lek-Etanol
<ol>
	<li>Połącz 1 mg leku (w tym przypadku kurkuminy) ze 100% DMSO i kolejny 1 mg ze 100% etanolem, aby utworzyć dwa roztwory podstawowe. 
	UWAGA: Dodaliśmy 200 μl DMSO i 400 μl etanolu, aby uzyskać zapasy DMSO-kurkuminy i etanolu-kurkuminy, które wynosiły odpowiednio 5 mg / ml i 2,5 mg / ml, ze względu na różną rozpuszczalność w każdym rozpuszczalniku; Należy jednak pamiętać, że stężenie bulionu należy dostosować w zależności od interesującego nas leku hydrofobowego. Czynniki takie jak rozpuszczalność leku i efektywne stężenie biologiczne są ważne dla określenia tej wartości. Należy również pamiętać, że zapas zostanie rozcieńczony 100-krotnie i 50-krotnie odpowiednio w preparatach DMSO i etanolu w połączeniu z roztworami SAP-AA (patrz sekcja 4). Preferowane może być przygotowanie większej ilości bulionu w zależności od liczby wymaganych preparatów – w tym przypadku należy użyć więcej niż 1 mg leku. Zapas można przechowywać w temperaturze -20 °C; Rozmrozić na lodzie i wirować przed użyciem.</li>
	<li>Wiruj fiolki przez 15 s, aby całkowicie rozpuścić lek.</li>
</ol>
4. Przygotowanie preparatów leczniczych
<ol>
	<li>Przygotuj przezroczyste probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml dla każdego preparatu. Pamiętaj, aby oznaczyć probówki przeznaczonym peptydem samoorganizującym się, aminokwasem (i stężeniem) oraz współrozpuszczalnikiem.</li>
	<li>Dodaj 10 μl bulionu Drug-DMSO lub 20 μl bulionu Drug-Ethanol do odpowiednich probówek do mikrowirówek.</li>
	<li>Dodać 990 μl roztworów kwasu SAP-AA do odpowiednich oznakowanych probówek mikrowirówek zawierających Drug-DMSO i 980 μL do tych zawierających Drug-Ethanol. W ten sposób uzyskuje się 1 ml preparatów leczniczych z 1% DMSO lub 2% etanolu. 
	UWAGA: Końcowe stężenie wszystkich preparatów kurkuminy wynosiło 0,5 mg/ml zgodnie z protokołem. Ponownie, będzie się to różnić w przypadku stosowania innych związków hydrofobowych i/lub zaczynania od innego stężenia podstawowego (patrz krok 3.1)</li>
	<li>Wirować energicznie przez 30 s i pozostawić preparaty na 30 minut.</li>
</ol>
5. Badanie rozpuszczalności
<ol>
	<li>Po okresie odpoczynku ponownie energicznie wiruj przez 30 s.</li>
	<li>Odwirować preparaty przy 14,220 g przez 1 min.</li>
	<li>Przeanalizuj dno probówek mikrowirówkowych pod kątem wytrącania (poprzez wizualizację).</li>
</ol>

<ol><li>Holmes, T. C., de Lacalle, S., Su, X., Liu, G., Rich, A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+neurite+outgrowth+and+active+synapse+formation+on+self-assembling+peptide+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Extensive neurite outgrowth and active synapse formation on self-assembling peptide scaffolds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (12), 6728-6733 (2000).</li>
<li>Davis, M. E., Motion, J. P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+self-assembling+peptide+nanofibers+create+intramyocardial+microenvironments+for+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Injectable self-assembling peptide nanofibers create intramyocardial microenvironments for endothelial cells.</a> Circulation. 111 (4), 442-450 (2005).</li>
<li>Matson, J. B., Stupp, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+peptide+scaffolds+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Self-assembling peptide scaffolds for regenerative medicine.</a> Chem. Commun. 48 (1), 26-33 (2012).</li>
<li>Tatman, P. D., Muhonen, E. G., Wickers, S. T., Gee, A. O., Kim, E., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+peptides+for+stem+cell+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater.+Sci%22%5BJournal%5D)">Self-assembling peptides for stem cell and tissue engineering.</a> Biomater. Sci. 4 (4), 543-554 (2016).</li>
<li>Keyes-Baig, C., Duhamel, J., Fung, S. -Y., Bezaire, J., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+peptide+as+a+potential+carrier+of+hydrophobic+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Self-assembling peptide as a potential carrier of hydrophobic compounds.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7522-7532 (2004).</li>
<li>Kumar, P., Pillay, V., Modi, G., Choonara, Y. E., du Toit, L. C., Naidoo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+peptides%3A+implications+for+patenting+in+drug+delivery+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Pat.+Drug+Deliv.+Formul%22%5BJournal%5D)">Self-assembling peptides: implications for patenting in drug delivery and tissue engineering.</a> Recent Pat. Drug Deliv. Formul. 5 (1), 24-51 (2011).</li>
<li>Wang, H., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-peptide-based+molecular+hydrogels%3A+novel+gelation+strategies+and+applications+for+tissue+engineering+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Short-peptide-based molecular hydrogels: novel gelation strategies and applications for tissue engineering and drug delivery.</a> Nanoscale. 4, 5259-5267 (2012).</li>
<li>French, K. M., Somasuntharam, I., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+peptide-based+delivery+of+therapeutics+for+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Self-assembling peptide-based delivery of therapeutics for myocardial infarction.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 96, 40-53 (2016).</li>
<li>Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+assembly+of+a+self-complementary+oligopeptide+to+form+a+stable+macroscopic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (8), 3334-3338 (1993).</li>
<li>Bowerman, C. J., Nilsson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+amphipathic+%CE%B2-sheet+peptides%3A+insights+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of amphipathic β-sheet peptides: insights and applications.</a> Biopolymers. 98 (3), 169-184 (2012).</li>
<li>Amidon, G., Lennernäs, H., Shah, V., Crison, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+theoretical+basis+for+a+biopharmaceutic+drug+classification%3A+the+correlation+of+in+vitro+drug+product+dissolution+and+in+vivo+bioavailability%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">A theoretical basis for a biopharmaceutic drug classification: the correlation of in vitro drug product dissolution and in vivo bioavailability.</a> Pharm. Res. 12 (3), 413-420 (1995).</li>
<li>Shi, Y., Porter, W., Merdan, T., Li, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+intravenous+delivery+of+poorly+water-soluble+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Recent advances in intravenous delivery of poorly water-soluble compounds.</a> Expert Opin. Drug Deliv. 6 (12), 1261-1282 (2009).</li>
<li>Bawa, R., Fung, S. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+peptide-based+nanoparticles+enhance+cellular+delivery+of+the+hydrophobic+anticancer+drug+ellipticine+through+caveolae-dependent+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Self-assembling peptide-based nanoparticles enhance cellular delivery of the hydrophobic anticancer drug ellipticine through caveolae-dependent endocytosis.</a> Nanomedicine. 8 (5), 647-654 (2012).</li>
<li>Liu, J., Zhang, L., Yang, Z., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+release+of+paclitaxel+from+a+self-assembling+peptide+hydrogel+formed+in+situ+and+antitumor+study+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Nanomed%22%5BJournal%5D)">Controlled release of paclitaxel from a self-assembling peptide hydrogel formed in situ and antitumor study in vitro.</a> Int. J. Nanomed. 6, 2143-2153 (2011).</li>
<li>Wu, Y., Sadatmousavi, P., Wang, R., Lu, S., Yuan, Y., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+peptide-based+nanoparticles+enhance+anticancer+effect+of+ellipticine+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Nanomed%22%5BJournal%5D)">Self-assembling peptide-based nanoparticles enhance anticancer effect of ellipticine in vitro and in vivo.</a> Int. J. Nanomed. 7, 3221-3233 (2012).</li>
<li>Fung, S. Y., Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.200800860/abstract">Self-Assembling Peptide as a Potential Carrier for Hydrophobic Anticancer Drug Ellipticine: Complexation, Release and In Vitro Delivery.</a> Adv. Funct. Mater. 19 (1), 74-83 (2009).</li>
<li>Fung, S. -Y., Oyaizu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+nanoscale+combinations+of+self-assembling+peptides+and+amino+acids+of+the+Src+tyrosine+kinase+inhibitor+in+acute+lung+injury+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The potential of nanoscale combinations of self-assembling peptides and amino acids of the Src tyrosine kinase inhibitor in acute lung injury therapy.</a> Biomaterials. 32 (16), 4000-4008 (2011).</li>
<li>Pacheco, S., Kanou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formulation+of+hydrophobic+therapeutics+with+self-assembling+peptide+and+amino+acid%3A+A+new+platform+for+intravenous+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Formulation of hydrophobic therapeutics with self-assembling peptide and amino acid: A new platform for intravenous drug delivery.</a> J. Control. Release. 239, 211-222 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W procedurze formułowania istnieją różne krytyczne kroki i punkty, które należy wziąć pod uwagę podczas rozwiązywania problemów. Po pierwsze, ponieważ pracujemy z różnymi składnikami i stężeniami, wiele etapów wirowania w całym protokole zapewnia, że wszystkie stężenia są jednolite i prawidłowe. Niektóre z hydrofobowych roztworów aminokwasów o wysokim stężeniu mogą nadal nie zostać całkowicie rozpuszczone po wirowaniu, a w takim przypadku można je energicznie wstrząsnąć ręcznie, aby wspomóc ten proces. Podobnie, ważne je...

SAPs to klasa biomateriałów, które były intensywnie badane jako rusztowania 3D w medycynie regeneracyjnej1,2,3,4. Ostatnio jednak zostały wykorzystane jako nośniki do dostarczania środków terapeutycznych ze względu na ich unikalne właściwości biologiczne5,6,7,8. SAP w naturalny sposób łączą się w stabilne nanostruktury9, zapewniając w ten sposób sposób sposób hermetyzację i ochronę leków. SAP są amfipatyczne, składają się ze specyficznego wzorca hydrofobowych i hydrofilowych powtórzeń aminokwasów, co napędza ich samoorganizację9,10 i pozwala im służyć jako medium między środowiskami hydrofobowymi i hydrofilowymi. W związku z tym, w klinicznym dostarczaniu leków hydrofobowych – które mają wyjątkowo niską biodostępność i wchłanianie w organizmie z powodu braku rozpuszczalności w środowisku wodnym11,12 – SAP są obiecujące jako nośnik dostawczy. Co więcej, ich wzorzec sekwencji sugeruje również, że SAP mogą być racjonalnie zaprojektowane i skonstruowane tak, aby zmaksymalizować kompatybilność z dowolnym lekiem lub związkiem (tj. w oparciu o grupy funkcyjne) i dodatkowo wspomóc rozpuszczalność.
SAP zostały zastosowane jako skuteczne środki dostarczania leków w wielu warunkach in vitro i in vivo13,14,15,16. Wykazały się również dużym bezpieczeństwem i biokompatybilnością. Jednak ze względu na niską osmolarność preparatów leków SAP, nie mogą one być stosowane do wstrzykiwań dożylnych, jak w warunkach klinicznych13. Biorąc pod uwagę to ograniczenie, opracowaliśmy niedawno strategię, która łączy SAP z roztworami aminokwasów w celu zmniejszenia stosowania toksycznych współrozpuszczalników i zwiększenia osmolarności formulacji, a tym samym znaczenia klinicznego. Zdecydowaliśmy się na użycie aminokwasów, ponieważ są one budulcem SAP, są już klinicznie akceptowane, a w połączeniu z SAP zwiększają rozpuszczalność hydrofobowych leków, jednocześnie zmniejszając ilość wymaganego SAP17,18.
Zbadaliśmy kombinacje SAP-AA jako uogólnioną platformę do hydrofobowej rozpuszczalności leków i późniejszego dostarczania, tworząc wieloetapowy proces przesiewowy i stosując go do inhibitora Src, PP2, jako modelowego związku hydrofobowego. W tym procesie zbadaliśmy wpływ zmiany składników formulacji – ostatecznie testując 6 różnych SAP, wszystkie 20 aminokwasów w 2 różnych stężeniach (niskim i wysokim; niskim w oparciu o stężenia w istniejących zastosowaniach klinicznych, a wysokie stężenia były 2x, 3x lub 5x większe niż stężenie kliniczne w oparciu o maksymalną rozpuszczalność każdego aminokwasu w wodzie), i 2 różne współrozpuszczalniki – oraz wybrane kombinacje, które rozpuściły PP2 do dalszej analizy. Ten preparat leku okazał się skuteczny jako nośnik leków w hodowlach komórkowych, a także w modelach in vivo przy użyciu zarówno podawania dotchawiczego, jak i dożylnego. Podobnie, nasze prace dotyczyły wszechstronności kombinacji SAP-AA w rozpuszczaniu wielu, strukturalnie różnych związków hydrofobowych w środowisku wodnym; W szczególności leki rottlerin i curcumin18. W tym manuskrypcie przedstawiono metodę formulacji SAP-AA i analizę rozpuszczalności kurkuminy jako przykład pierwszego kroku w naszym procesie przesiewowym. Protokół ten zapewnia prosty, powtarzalny sposób badania przesiewowego w poszukiwaniu optymalnych kombinacji SAP-AA, które rozpuszczają dowolny związek hydrofobowy.

<table><tbody><tr><td>EAK16-I</td><td>CanPeptide Inc.</td><td>Niestandardowa sekwencja peptydów</td><td>: AEAKAEAKAEAKAEAK, acetylacja N-końca i amidacja C-końca, >95% czystości przez HPLC</td></tr><tr><td>EAK16-II</td><td>CanPeptide Inc.</td><td>Niestandardowa sekwencja peptydowa</td><td>: AEAEAKAKAEAEAKAK, acetylacja N-końca i amidacja C-końca, >95% czystości przez HPLC</td></tr><tr><td>EAK16-IV</td><td>CanPeptide Inc.</td><td>Niestandardowa sekwencja peptydów</td><td>: AEAEAEAEAKAKAKAK, acetylacja N-końca i amidacja C-końca, >95% czystości przez HPLC</td></tr><tr><td>EFK8-II</td><td>CanPeptide Inc.</td><td>Niestandardowa sekwencja peptydów</td><td>: FEFEFKFK, acetylacja N-końca i amidacja C-końca, >95% czystości przez HPLC</td></tr><tr><td>A6KE</td><td>CanPeptide Inc.</td><td>Niestandardowa sekwencja peptydów</td><td>: AAAAAAKE, acetylacja N-końca i amidacja C-końca, >95% czystości przez HPLC</td></tr><tr><td>P6KE</td><td>CanPeptide Inc.</td><td>Niestandardowa sekwencja peptydów</td><td>: PPPPPPPKE, acetylacja N-końca i amidacja C-końca, >95% czystości według HPLC</td></tr><tr><td>Alanina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7469-100G</td><td>L-Alanina</td></tr><tr><td>Izoleucyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7403-100G</td><td>L-Izoleucyna</td></tr><tr><td>Leucyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8912-100G</td><td>L-Leucyna</td></tr><tr><td>Metionina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5308-100G</td><td>L-Metionina</td></tr><tr><td>Prolina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5607-100G</td><td>L-Prolina</td></tr><tr><td>Walina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V0513-100G</td><td>L-Walina</td></tr><tr><td>Fenyloalanina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5482-100G</td><td>L-Fenyloalanina</td></tr><tr><td>Tryptofan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8941-100G</td><td>L-Tryptofan</td></tr><tr><td>Tyrozyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8566-100G</td><td>L-Tyrozyna</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8790-100G</td><td>L-Glycine</td></tr><tr><td>Asparagine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4159-100G</td><td>L-Asparagine</td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8540-100G</td><td>L-Glutamina</td></tr><tr><td>Serine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7219-100G</td><td>L-Serine</td></tr><tr><td>Treonina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8441-100G</td><td>L-Treonina</td></tr><tr><td>Histydyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6034-100G</td><td>L-Histydyna</td></tr><tr><td>Lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5501-100G</td><td>L-Lizyna</td></tr><tr><td>Arginina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8094-100G</td><td>L-Arginina</td></tr><tr><td>Kwas asparaginowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7219-100G</td><td>Kwas L-asparaginowy</td></tr><tr><td>Kwas glutaminowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8415-100G</td><td>Kwas</td></tr> <tr><td>L-glutaminowyCysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7352-100G</td><td>L-Cysteina</td></tr><tr><td>Dimetylosultlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540-500ML</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>277649-100ML</td><td>Bezwodna</td></tr><tr><td>kurkumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>08511-10MG</td><td>Lek hydrofobowy, kurkumina</td></tr><tr><td>Rottlerin</td><td>EMD Millipore</td><td>557370-10MG</td><td>Lek hydrofobowy, rottlerin</td></tr><tr><td>PP2</td><td>Enzo&nbsp;</td><td>BML-EI297-0001</td><td>Lek hydrofobowy,</td></tr><tr><td>fiolki scyntylacyjne</td> PP2 <td>VWR</td><td>2650-66022-081</td><td>Szkło borokrzemianowe, z nakrętką, 20 mL. Fiolki do ważenia peptydów.</td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 50 ml</td><td>VWR</td><td>352070</td><td>Polipropylen, sterylne, 50 mL. Do roztworów aminokwasów.</td></tr></tbody></table>

rozpuszczalność związków hydrofobowych w roztworze wodnym z wykorzystaniem kombinacji samoorganizującego się peptydu i aminokwasu

Solubility of Hydrophobic Compounds in Aqueous Solution Using Combinations of Self-assembling Peptide and Amino Acid

Samoorganizujące się peptydy (SAP) są obiecującymi narzędziami do dostarczania hydrofobowych środków terapeutycznych do zastosowań klinicznych; ich właściwości amfipatyczne pozwalają im rozpuszczać związki hydrofobowe w środowisku wodnym ludzkiego ciała. Jednak samoorganizujące się roztwory peptydów mają słabą kompatybilność krwi (np. niską osmolarność), co utrudnia ich kliniczne zastosowanie poprzez podawanie dożylne. Niedawno opracowaliśmy uogólnioną platformę do hydrofobowego dostarczania leków, która łączy SAP z roztworami aminokwasów (SAP-AA) w celu zwiększenia rozpuszczalności leków i osmolarności preparatu, aby spełnić wymagania dotyczące zastosowań klinicznych. Ta strategia formułowania została dokładnie przetestowana w kontekście trzech strukturalnie różnych związków hydrofobowych – PP2, rottleryny i kurkuminy – w celu wykazania jej wszechstronności. Ponadto zbadaliśmy skutki zmiany składników formulacji, analizując 6 różnych SAP, 20 naturalnie występujących aminokwasów w niskich i wysokich stężeniach oraz dwa różne współrozpuszczalniki: dimetylosulfotlenek (DMSO) i etanol. Nasza strategia okazała się skuteczna w optymalizacji składników dla danego leku hydrofobowego, a funkcję terapeutyczną sformułowanego inhibitora PP2 obserwowano zarówno in vitro, jak i in vivo. Niniejszy manuskrypt przedstawia naszą uogólnioną metodę formulacji z wykorzystaniem kombinacji SAP-AA dla związków hydrofobowych oraz analizę rozpuszczalności jako pierwszy krok w kierunku potencjalnego zastosowania tych preparatów w bardziej funkcjonalnych badaniach. Dołączamy reprezentatywne wyniki rozpuszczalności dla preparatu hydrofobowego związku, kurkuminy, i omawiamy, w jaki sposób nasza metodologia służy jako platforma dla przyszłych badań biologicznych i modeli chorób.

W celu przeprowadzenia dowodu koncepcji, dla hydrofobowego leku, kurkuminy, przygotowano formulacje z wykorzystaniem wszystkich 20 naturalnie występujących aminokwasów w niskich stężeniach, w połączeniu z tylko jednym SAP, EAK16-II. Przetestowano również formulacje z zastosowaniem DMSO oraz etanolu jako rozpuszczalników pomocniczych. W rezultacie otrzymano łącznie 40 formulacji kurkuminy, z których każda zawierała inne składniki. Należy zauważyć, że w poprzednich badaniach z użyciem inhib...

Ten protokół opisuje klinicznie stosowany sposób rozpuszczania związków hydrofobowych w środowisku wodnym przy użyciu kombinacji samoorganizujących się roztworów peptydów i aminokwasów. Nasza metoda rozwiązuje główne ograniczenie terapii hydrofobowych, w których brakuje bezpiecznych, skutecznych środków rozpuszczalności i metod dostarczania do warunków klinicznych.

Rozpuszczalność związków hydrofobowych w roztworze wodnym z wykorzystaniem kombinacji samoorganizującego się peptydu i aminokwasu

Self-assembling peptides (SAPs) are promising vehicles for the delivery of hydrophobic therapeutics for clinical applications; their amphipathic ...

Ogólnym celem tej metody jest zwiększenie rozpuszczalności związków hydrofobowych w roztworach wodnych w celu ich potencjalnego zastosowania w warunkach klinicznych. Metoda ta rozwiązuje kluczowy problem w dziedzinie medycyny, jakim jest ograniczony stopień wykorzystania związków hydrofobowych w praktyce klinicznej ze względu na ich słabą rozpuszczalność w układach wodnych, takich jak krew. Główną zaletą tej techniki jest możliwość rozpuszczania związków hydrofobowych w roztworach wodnych bez konieczności znaczącego stosowania toksycznych cosolwentów.Najpierw należy oznakować dwie stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 ml dla każdego aminokwasu. Przygotować dużą kolbę o pojemności dwóch litrów zawierającą wodę oczyszczoną. Po obliczeniu ilości każdego aminokwasu dla pożądanych stężeń, odważyć odpowiednie ilości aminokwasów do odpowiednich probówek wirówkowych za pomocą szpatułki.Za pomocą pipety serologicznej dodać 40 ml oczyszczonej wody do każdej probówki do wirowania. Po zakapslowaniu probówek wymieszać próbki w wstrząsarku typu vortex do czasu rozpuszczenia. Używając precyzyjnej wagi analitycznej, odważyć około 1 ± 0,2 mg peptydu na dno 20 ml fiolki scyntylacyjnej.Zapisz dokładną wagę peptydu na nakrętce, a następnie zakręć fiolkę. Następnie pipetuj odpowiednią objętość roztworu aminokwasów do każdej fiolki, aby uzyskać pożądane stężenie samoorganizującego się peptydu. Sonicuj próbki przez 10 minut w sonikatorze kąpielowym w temperaturze pokojowej, upewniając się, że roztwory w fiolkach są całkowicie zanurzone w kąpieli wodnej. Przygotuj dwa roztwory zapasowe leku, łącząc jeden miligram wybranego leku z odpowiednią ilością DMSO oraz kolejny jeden miligram leku z etanolem.Następnie oba roztwory należy mieszać w wirówce typu vortex przez 15 sekund, aby całkowicie rozpuścić lek. Po tym kroku należy opisać probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml dla każdej formulacji, wskazując zastosowany peptyd samoorganizujący się, aminokwas oraz kosolwent. Do odpowiednich probówek do mikrocentryfugi należy dodać 10 µl roztworu zapasu leku w DMSO lub 20 µl roztworu zapasu leku w etanolu.Następnie do probówek do mikrocentryfugi zawierających roztwór zapasowy leku w DMSO należy dodać 990 µL roztworów aminokwasów peptydów samomontujących. Do probówek do mikrocentryfugi zawierających roztwór zapasowy leku w etanolu należy dodać 980 µL roztworów aminokwasów peptydów. Wszystkie formulacje leku należy intensywnie wymieszać w wstrząsarku wortex przez 30 sekund.Następnie przykryć folią aluminiową i pozostawić preparaty na 30 minut przed przeprowadzeniem testu rozpuszczalności. Po 30 minutach energicznie mieszać preparaty w wirówce typu vortex przez 30 sekund. Następnie odwirować preparaty z prędkością 14 220 ×g przez jedną minutę.Po wirowaniu należy przeprowadzić kontrolę wizualną dna probówek do mikrocentryfugi pod kątem wystąpienia osadu. Spośród 40 formulacji przetestowanych w niniejszym badaniu, siedem skutecznie rozpuściło hydrofobowy lek, kurkuminę. Poprzez pogrupowanie formulacji według składników zidentyfikowano dwa główne trendy.Etanol wydaje się być lepszym kosolwentem do rozpuszczania kurkuminy, a dodatnio naładowane aminokwasy, lizyna i arginina, wydają się być optymalnymi składnikami do jej rozpuszczania. Interesującą obserwacją jest zmiana barwy w przypadku formulacji zawierających argininę i lizynę, co wskazuje na rozpuszczenie kurkuminy w warunkach zasadowych. Po opanowaniu metody, procedura ta może zostać wykonana w ciągu dwóch do trzech godzin przy użyciu odpowiedniego sprzętu, pod warunkiem wcześniejszego przygotowania roztworów aminokwasów.Po zastosowaniu tej procedury rozpuszczalne formulacje leków można dalej testować in vitro i in vivo, aby bezpośrednio ocenić i porównać biologiczną skuteczność lub bezpieczeństwo rozpuszczonego leku. Po opracowaniu ta metoda formulacji utorowała drogę do podawania in vivo hydrofobowego inhibitora zapasowego o nazwie PP@ w celu zapobiegania ostremu uszkodzeniu płuc. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak zastosować kombinację samomontujących się peptydów i aminokwasów w celu rozpuszczenia dowolnego hydrofobowego leku.

solubility-hydrophobic-compounds-aqueous-solution-using-combinations

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisano prostą i ogólną metodę manualnej syntezy peptoidów z wykorzystaniem podstawowego sprzętu i dostępnych komercyjnie odczynników, co umożliwia łatwą syntezę peptoidów w większości laboratoriów. Opisano syntezę, oczyszczanie i charakterystykę amfifilowego peptoidu 36-meru, a także jego samoorganizację w wysoko uporządkowane nanoarkusze.

Synteza peptoidów metodą submonomerową w fazie stałej oraz ich samoorganizacja w wysoko uporządkowane nanoarkusze

Ten artykuł opisuje tworzenie wysoce uporządkowanych struktur opartych na peptydach poprzez spontaniczny proces samoorganizacji. Metoda wykorzystuje dostępne na rynku peptydy i powszechnie stosowany sprzęt laboratoryjny. Technika ta może być stosowana do wielu różnych peptydów i może prowadzić do odkrycia nowych zespołów opartych na peptydach.

Tworzenie uporządkowanych struktur biomolekularnych przez samoorganizację krótkich peptydów

Synteza amfifilów peptydowych na bazie poliaminy (PPA) jest znaczącym wyzwaniem ze względu na obecność wielu azotów aminowych, co wymaga rozsądnego użycia grup ochronnych w celu zamaskowania tych reaktywnych funkcji. W tym artykule opisujemy łatwą metodę otrzymywania tych nowych klas cząsteczek samoorganizujących się.

Łatwy protokół syntezy samoorganizujących się amfifilów peptydowych na bazie poliaminy (PPA) i pokrewnych biomateriałów

Protokół syntezy peptydu modyfikowanego 1,2-ditiolanem i charakterystyka struktur supramolekularnych wynikających z samoorganizacji peptydu.

Synteza i charakterystyka samoorganizujących się peptydów modyfikowanych 1,2-ditiolanem

Ten protokół opisuje skuteczną metodę syntezy nanoemulsji koniugatu kwasów oleinowych i platyny(II) stabilizowanego tripeptydem lizyna-tyrozyna-fenyloalanina (KYF). Nanoemulsja powstaje w łagodnych warunkach syntetycznych poprzez samoorganizację KYF i koniugatu.

Stabilizowana tripeptydem nanoemulsja kwasu oleinowego

Przedstawiono protokół do syntezy kodowanych informacyjnie oligomerów peptoidowych oraz do sekwencyjnego samoorganizowania tych peptoidów w drabinki molekularne przy użyciu amin i aldehydów jako dynamicznych par kowalencyjnych reagentów oraz kwaśnych triflatów metali ziem rzadkich Lewisa jako odczynników wielozadaniowych.

Synteza peptydów niosących informacje i ich sekwencyjna dynamiczna samoorganizacja kowalencyjna

Przedstawiamy protokół wytwarzania hybrydowej błony lipidowej na granicy woda/powietrze poprzez domieszkowanie dwuwarstwy lipidowej cząsteczkami miedzi (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-ftalocyjaniny (CuPc). Powstała hybrydowa błona lipidowa ma strukturę warstwową lipid/CuPc/lipid. Protokół ten może być również stosowany do tworzenia innych funkcjonalnych nanomateriałów.

Samoorganizacja hybrydowych błon lipidowych domieszkowanych hydrofobowymi cząsteczkami organicznymi na granicy faz woda/powietrze

Ten artykuł zawiera protokoły projektowania i samoorganizacji nanostruktur z oligomerów kwasu nukleinowego modyfikowanych gamma peptydów w mieszaninach rozpuszczalników organicznych.

Samoorganizacja peptydowych kwasów nukleinowych modyfikowanych promieniami gamma w złożone nanostruktury w mieszaninach rozpuszczalników organicznych

Ten protokół przedstawia trzy szybkie i proste metody przygotowania, które wykorzystują warunki środowiskowe do wywołania samoorganizacji peptydów w hydrożele. Dodatkowo opisano charakterystykę hydrożeli peptydowych, wykazując, że w tych prostych warunkach mogą powstawać mechanicznie stabilne hydrożele peptydowe.

Przygotowanie stabilnych mechanicznie samoorganizujących się hydrożeli peptydowych

Oznaczanie opróżniania żołądka za pomocą nieinwazyjnego testu oddechowego [13C]-oktanowego do śledzenia gastroparezy u samic myszy NOD LtJ.

Ocena opróżniania żołądka u nieotyłych myszy z cukrzycą za pomocą testu oddechowego [13C]-oktanowego

Poznaj metodę rozpuszczania związków hydrofobowych w wodzie przy użyciu samoorganizujących się peptydów i aminokwasów. To podejście eliminuje toksyczne rozpuszczalniki wspomagające, umożliwiając bezpieczniejsze zastosowanie terapeutyków w medycynie klinicznej.

Rozpuszczalność związków hydrofobowych w roztworze wodnym z wykorzystaniem kombinacji samoorganizującego się peptydu i aminokwasu (Wideo) | JoVE Journal

Rozpuszczalność związków hydrofobowych w roztworze wodnym z wykorzystaniem kombinacji samoorganizującego się peptydu i aminokwasu

Przeglądaj więcej filmów