Name: Specyficzne dla sekwencji i selektywne rozpoznawanie dwuniciowych RNA na jednoniciowych RNA za pomocą chemicznie modyfikowanych peptydowych kwasów nukleinowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Poznaj metody rozpoznawania dwuniciowych RNA przez chemicznie modyfikowane peptydowe kwasy nukleinowe. Protokoły obejmują syntezę, elektroforezę i spektrofotometrię fluorescencyjną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Ministerstwo Edukacji Singapuru (MOE) Tier 1 (RGT3/13 i RG42/15 do G.C.) oraz MOE Tier 2 (MOE2013-T2-2-024 i MOE2015-T2-1-028 do G.C.).

Złożono wniosek patentowy (PAT/179/14/15/PCT) oparty na opisanej tu pracy.

Oligomery PNA wiążące dupleksowo (np. 10-mery) są cząsteczkami średniej wielkości, a zatem mogą wykazywać przesunięcie ruchliwości elektroforetycznej po związaniu się z RNA o porównywalnym lub nieco większym rozmiarze (np. 50-merowym lub mniejszym). Jeśli RNA jest znacznie większe niż PNA, miareczkowanie PNA do RNA może nie działać z powodu ograniczonej zmiany ruchliwości żelu. W ten sposób duży RNA może zostać obcięty w przypadku niedenaturujących testów PAGE. Miareczkowanie dużego RNA do znakowanego fluoroforem PNA pozwala na monitorowanie tworzenia się tripleksu przez niedenaturujący żel agarozowy z próbką załadowaną w środku żelu40.
W eksperymencie miareczkowania za pomocą niedenaturującego PAGE ze stałym całkowitym stężeniem RNA, zwykle używamy nieznakowanego stężenia RNA 1 μM do efektywnego barwienia po barwieniu wolnego RNA i prążków triplex bromkiem etydyny. Stężenie RNA tak niskie, jak 0,2 μM może być również wystarczające w zależności od konstruktu RNA31. Stężenie nieznakowanego RNA (0,2 μM) określa, że wartości Kd, które można dokładnie zmierzyć, powinny wynosić około 0,2 μM lub więcej. W celu zwiększenia skuteczności barwienia można zastosować inne barwniki barwiące. Alternatywnie, nasze niepublikowane dane sugerują, że RNA znakowane barwnikiem Cy3 mogą być używane w eksperymentach PAGE bez denaturacji w celu pomiaru zdarzeń ścisłego wiązania.
Ze względu na fakt, że 2-aminopuryna jest tylko umiarkowanie fluorescencyjna, miareczkowanie fluorescencji 2-aminopuryny jest również ograniczone do pomiaru wiązania przy wartościach Kd bliskich lub wyższych niż 0,2 μM31. RNA lub PNA można znakować stosunkowo jasnym barwnikiem w celu ilościowego określenia stosunkowo ścisłego wiązania w roztworze poprzez miareczkowanie fluorescencyjne, jeśli wiązanie powoduje zmiany w sygnałach fluorescencyjnych 53,54,55.
Strategia celowania w struktury RNA przez PNA wiążące dsRNA została przetestowana dla ograniczonej liczby RNA. Jest prawdopodobne, że właściwości wiązania mogą się różnić w przypadku dsRNA o różnych sekwencjach i składach par zasad. Zawsze można wybrać bogate w puryny pasmo dupleksu do projektowania TFPNA. Bardzo ważne jest zrozumienie, w jaki sposób kolejne trójki Q·C-G mogą wpływać na stabilność trójki. Zdecydowanie potrzebne są bardziej obszerne badania zależne od sekwencji, aby zrozumieć zależne od sekwencji właściwości wiązania TFPNA.
Powinowactwo wiązania TFPNA można dodatkowo zwiększyć poprzez zwiększenie długości i/lub dalszą modyfikację zasad i szkieletów56,57 TFPNA. Jednak ciągły obszar dupleksu może często nie składać się z więcej niż 10 kolejnych par zasad bez zakłóceń spowodowanych przez struktury inne niż Watson-Crick. Można sprzężać TFPNA z małymi cząsteczkami w celu rozpoznania struktur innych niż Watson-Crick sąsiadujących z regionami dsRNA. Zasadniczo oczekuje się, że koniugat TFPNA-mała cząsteczka będzie miał zwiększone powinowactwo wiązania i specyficzność w porównaniu z samym TFPNA lub małą cząsteczką. Jednak właściwości chemiczne i fizyczne łącznika dla koniugacji 58,59,60,61,62,63,64 muszą zostać zoptymalizowane.
Fakt, że TFPNA mogą selektywnie wiązać się z dsRNA przez ssRNA i dsDNA, sugeruje, że możliwe jest opracowanie TFPNA jako bardzo użytecznych sond chemicznych i potencjalnych ligandów terapeutycznych poprzez regulację dynamiki strukturalnej RNA i interakcji z białkami i metabolitami. Wychwyt komórkowy TFPNA może być ułatwiony poprzez koniugację z ugrupowaniami penetrującymi komórkę, takimi jak małe cząsteczki, peptydy i nanocząstki, lub kompleksowanie ze strukturami supramolekularnymi, takimi jak liposomy 5,6,12,17,25,31,41,65,66 . Dalsza funkcjonalizacja TFPNA za pomocą znaczników bioobrazowania, takich jak fluorofory i radioizotopy, może ułatwić wykrywanie, obrazowanie i celowanie w funkcjonalne struktury RNA w organizmach żywych.

RNA stają się ważnymi biomarkerami i celami terapeutycznymi, ze względu na ostatnie postępy w odkryciach roli RNA w regulacji i katalizie różnych procesów biologicznych1,2,3. Tradycyjnie, nici antysensowne były używane do wiązania się z ssRNA poprzez tworzenie dupleksu Watsona-Cricka3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Ostatnio kwasy nukleinowe peptydowe tworzące triplex (TFPNA) zostały zaprojektowane tak, aby wiązały się z dsRNA poprzez wiązania wodorowe Hoogsteena (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1) 3,28,29. Regiony dsRNA są obecne w większości tradycyjnych RNA ukierunkowanych na antysens, w tym pre-mRNA i mRNA, pre- lub pri-miRNAs3 i wielu innych niekodujących RNA1,26,27. Celowanie w dsRNA poprzez tworzenie potrójnej helisy za pomocą TFPNA może być korzystne ze względu na jego specyfikę strukturalną i ma ogromny potencjał do wykorzystania w przywracaniu normalnych funkcji RNA, które są rozregulowane na przykład w chorobach.
Ostatnio opublikowana praca Rozners et al., oraz us3,28,29,30,31,32,33,34,35,36, 37,38,39,40,41, poinformował o wysiłkach zmierzających do poprawy selektywnego wiązania zmodyfikowanych TFPNA z dsRNA o zwiększonym powinowactwie. Opracowaliśmy metody syntezy racjonalnie zaprojektowanych monomerów PNA (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2), w tym monomeru tio-pseudoizocytozyny (L) 30 i modyfikowanego guanidyną monomeru 5-metylo cytozyny (Q)31. Dzięki różnym metodom charakterystyki biochemicznej i biofizycznej wykazaliśmy, że stosunkowo krótkie PNA (6-10 reszt) zawierające reszty L i Q wykazują lepsze rozpoznawanie par zasad Watsona-Cricka G-C i C-G odpowiednio w dsRNA. Ponadto, w porównaniu z niezmodyfikowanymi PNA, PNA zawierające reszty L i Q wykazują bardziej selektywne wiązanie w kierunku dsRNA w stosunku do ssRNA i dsDNA. Funkcjonalność guanidyny42 w bazie Q umożliwia PNA wejście do komórek HeLa31.
W naszym laboratorium syntetyzujemy PNA za pomocą manualnej chemii Boc (Boc lub t-Boc oznacza tert-butyloksykarbony (zobacz Rysunek 2) metoda syntezy peptydów w fazie stałej<klasa sup="xref">4. Synteza monomeru PNA z Boc jako grupą chroniącą aminy jest wygodna, ponieważ grupa Boc jest sterycznie mniej masywna w porównaniu z grupą chroniącą aminy fluorenylometylokoksykarbonylowe (Fmoc), co może być korzystne podczas sprzęgania monomeru PNA na stałym podłożu. Grupa Boc jest kwasolubna i może być łatwo usunięta na stałym podłożu przez 20-50% kwas trifluorooctowy (TFA) w dichlorometanie (DCM) podczas syntezy PNA. Do syntezy oligomerów PNA można zastosować zautomatyzowany syntezator peptydów; jednak do automatycznego syntezatora peptydów potrzebny jest 3-5-krotny nadmiar monomeru PNA. Ręczna synteza wymaga znacznie mniejszej ilości monomeru PNA (2-3-krotny nadmiar), a każde sprzężenie jest łatwo monitorowane przez Kaiser test43. Co więcej, wiele automatycznych syntezatorów nie jest kompatybilnych z syntezą strategii Boc ze względu na użycie TFA na etapie usuwania Boc.
Oligomery PNA mogą być oczyszczone za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (RP-HPLC), a następnie charakterystyki masy cząsteczkowej za pomocą MALDI-TOF (<silna klasa="xfig">Rysunki 3 i 4)30,31. Używamy niedenaturującego PAGE do monitorowania powstawania triplexów, ze względu na fakt, że wolne dupleksowe konstrukty RNA i tripleksy związane z PNA często wykazują różne wskaźniki migracji (Rysunek 5)30,31. Znakowanie nie jest potrzebne, jeśli można uzyskać skuteczne barwienie końcowe zarówno dla potrójnych pasm dupleksu RNA, jak i PNA·RNA2. Do eksperymentów PAGE bez denaturacji potrzebna jest stosunkowo niewielka ilość próbki. Jednak ładujące (inkubacyjne) i bieżące (pH 8,3) mogą nie być takie same, co powoduje, że pomiary są ograniczone do stabilnych kinetycznie tripleksów, ponieważ stosunkowo wysokie pH 8,3 może znacznie zdestabilizować tripleks.
2-aminopuryna jest izomerem adeniny (6-aminopuryny); intensywność fluorescencji 2-aminopuryny (z pikiem emisji około 370 nm) jest wrażliwa na lokalne zmiany środowiska strukturalnego i jest odpowiednia do monitorowania tworzenia się triplex z resztą 2-aminopuryny włączoną w pobliżu miejsca wiązania PNA (Rysunek 6)31. W przeciwieństwie do wielu innych barwników, które wykazują emisję fluorescencji w zakresie widzialnym, RNA znakowane 2-aminopuryną można wystawić na działanie światła pokojowego bez wybielania fotograficznego. W przeciwieństwie do eksperymentu PAGE, w którym często potrzebny jest bufor o pH 8,3, miareczkowanie fluorescencyjne oparte na 2-aminopurynie pozwala na pomiar wiązania w jednym roztworze przy określonym pH, a tym samym może pozwolić na pomiar i wykrycie stosunkowo słabego i kinetycznie niestabilnego wiązania w stanie równowagi.
Eksperymenty termicznego topnienia z wykrytą absorbancją-UV pozwalają na pomiar stabilności termicznej dupleksów (Rysunek 7)31 i triplexes30,32,44,45. W zależności od długości i składu sekwencji, topnienie tripleksów może, ale nie musi, wykazywać wyraźne przejście. Parametry termodynamiczne można uzyskać, jeżeli krzywe ogrzewania i chłodzenia nakładają się na siebie. Dokładne parametry termodynamiczne można uzyskać za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej (ITC)32; jednak do celów ITC na ogół wymagane są stosunkowo duże ilości próbek.

<table><tbody><tr><td>Sita molekularne, 4A, granulki o średnicy 1-2 mm&nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>87956</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek 4-metylobenzhydryloaminy (MBHA&Yuml; HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>532444</td><td></td></tr><tr><td>N,N-diizopropyloetyloamina (DIPEA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11801</td><td></td></tr><tr><td>(Benzotriazol-1-yl-oksy)tripyrrolidinofosphonium hexafluorophosphate (PyBOP)</td><td>Alfa Aesar</td><td>B25251</td><td></td></tr><tr><td>Anhyryd octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320102</td><td></td></tr><tr><td>Kaiser Test Kit&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60017</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy (TFA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06374</td><td></td></tr><tr><td>Niemodyfikowane monomery PNA</td><td>ASM Research Chemicals GmbH</td><td>5004007, 5004008, 5004009, 5004010</td><td></td></tr><tr><td>Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8389 / 47624</td><td></td></tr><tr><td>Tioanizol</td><td>Alfa</td><td>Aesar A14846</td><td></td></tr><tr><td>1,2-Ethanedithiol</td><td>Alfa Aesar</td><td>L12865</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorometanosulfonowy</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10173</td><td></td></tr><tr><td>LiChrosper&reg; 100 RP-18 z końcówką (5 &mikro; m) LiChroCART&reg; 250-4</td><td>Milipore</td><td>150838</td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotydy RNA firmy Merck&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Dostosowane&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kwas &alfa;-cyjano-4-hydroksycynamonowy (CHCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39468</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J15694</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8887</td><td></td></tr><tr><td>N.N'-metylenobisakryloamid</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>146072</tr><tr><td>Nadsiarczan amonu (APS)</td><td>Bio-rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)</td><td>Bio-rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>10X Bufor tris-boranu-EDTA (TBE), pH 8,3</td><td>1. baza</td><td>BUF-3010-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol&nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>H5433</td><td></td></tr><tr><td>Bromek etydyny (10 mg/ml)</td><td>Bio-rad&nbsp;</td><td>161-0433</td><td></td></tr><tr><td>Ogniwo o wysokiej precyzji (Quartz Suprasil, 200-2500 nm)</td><td>Hellma Analytics&nbsp;</td><td>105.250-QS</td><td></td></tr></tbody></table>

specyficzne dla sekwencji i selektywne rozpoznawanie dwuniciowych rna na jednoniciowych rna za pomocą chemicznie modyfikowanych peptydowych kwasów nukleinowych

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

RNA stają się ważnymi biomarkerami i celami terapeutycznymi. W związku z tym istnieje ogromny potencjał w opracowywaniu sond chemicznych i ligandów terapeutycznych do rozpoznawania sekwencji i struktury RNA. Niedawno opracowano chemicznie modyfikowane oligomery peptydowych kwasów nukleinowych (PNA), które mogą rozpoznawać dupleksy RNA w sposób specyficzny dla sekwencji. PNA są stabilne chemicznie z neutralnym szkieletem podobnym do peptydu. PNA mogą być stosunkowo łatwo syntetyzowane za pomocą ręcznej metody syntezy peptydów w fazie stałej Boc-chemistry. PNA są oczyszczane za pomocą HPLC z odwróconą fazą, a następnie charakteryzowane są za pomocą desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą czasu przelotu (MALDI-TOF). Technika elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE) bez denaturacji ułatwia obrazowanie powstawania tripleksów, ponieważ starannie zaprojektowane konstrukty dupleksowe wolnego RNA i tripleksy związane z PNA często wykazują różne szybkości migracji. Niedenaturujący PAGE z bromkiem etydyny po barwieniu jest często łatwą i pouczającą techniką charakteryzowania powinowactwa wiązania i specyficzności oligomerów PNA. Zazwyczaj wiele spinek do włosów RNA lub dupleksów z mutacjami pojedynczej pary zasad można wykorzystać do scharakteryzowania właściwości wiązania PNA, takich jak powinowactwo wiązania i swoistość. 2-aminopuryna jest izomerem adeniny (6-aminopuryny); intensywność fluorescencji 2-aminopuryny jest wrażliwa na lokalne zmiany środowiska strukturalnego i nadaje się do monitorowania tworzenia tripleksów z resztą 2-aminopuryny włączoną w pobliżu miejsca wiązania PNA. Miareczkowanie fluorescencyjne 2-aminopuryny można również wykorzystać do potwierdzenia selektywności wiązania zmodyfikowanych PNA w stosunku do ukierunkowanych dwuniciowych RNA (dsRNA) w stosunku do jednoniciowych RNA (ssRNA). Eksperymenty z topnieniem termicznym z detekcją absorpcji promieniowania UV pozwalają na pomiar stabilności termicznej dupleksów PNA-RNA i tripleksów PNA·RNA2. W tym miejscu opisano syntezę i oczyszczanie oligomerów PNA zawierających zmodyfikowane reszty oraz opisano biochemiczne i biofizyczne metody charakterystyki rozpoznawania dupleksów RNA przez zmodyfikowane PNA.

HPLC w trybie odwróconej fazy umożliwia oczyszczanie oligomerów PNA. Czyste oligomery PNA można uzyskać po dwóch rundach oczyszczania metodą HPLC (Rysunek 3). Tożsamość PNA można potwierdzić za pomocą analizy MALDI-TOF (Rysunek 4).
Niedenaturująca elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (PAGE) jest prostą i informacyjną techniką służącą do charakteryzacji powinowactwa i specyficzności wiązania oligomerów PNA. Zazwyczaj stosujemy wiele spinek RNA lub dupleksów z mutacjami pojedynczych par zasad w celu scharakteryzowania właściwości wiązania (Rycina 5). Dane z niedenaturującej elektroforezy PAGE przedstawione na Rycini 5 wyraźnie sugerują, że PNA modyfikowane Q i L mogą rozpoznawać region dsRNA z parą C-G (Rycina 5B, panel dolny), ale nie ten bez pary C-G (Rycina 5B, panel górny). To specyficzne i wzmocnione rozpoznawanie odbywa się poprzez tworzenie trójek zasad PNA·RNA2 T·A-U, L·G-C oraz Q·C-G (Rycina 1A, C, D). Do wykazania poprawionych właściwości wiązania zmodyfikowanego PNA można również użyć różnych PNA z pojedynczymi lub wielokrotnymi mutacjami. Wykazaliśmy, że dodanie 2 mM Mg2+ do buforu inkubacyjnego nie wpływa znacząco na wiązanie31.
Wykazaliśmy za pomocą miareczkowania fluorescencyjnego 2-aminopuryną, że PNA zmodyfikowany Q i L wiąże się z docelowym regionem dsRNA (Rysunek 6A, 6C, 6D), ale nie z ssRNA (Rysunek 6B, 6E, 6F). PNA P3 wiąże się z dsRNA znakowanym 2-aminopuryną z wartością Kd wynoszącą 0.8 ± 0.1 µM. Intensywność fluorescencji przy 370 nm dla ssRNA znakowanego 2-aminopuryną pozostaje względnie stała przy zmiennym stężeniu P3, co wskazuje na brak wiązania PNA P3 z ssRNA.
PNA zawierające reszty Q (P2 i P3) nie wykazują przejść topnienia termicznego (Rysunek 7), co sugeruje brak wiązania z ssRNA. Jest to spowodowane zawadą steryczną występującą w parze Q-G o charakterze Watsona-Cricka. W porównaniu z niezmodyfikowanym PNA P1, PNA P4 i P5 zawierające zmodyfikowane reszty L, ale nie zawierające reszt Q, wykazują obniżone temperatury topnienia dla odpowiadających im dupleksów RNA-PNA ze względu na zawadę steryczną występującą w parze L-G o charakterze Watsona-Cricka. Dane topnienia termicznego wykryte za pomocą absorbancji UV są zgodne z danymi miareczkowania fluorescencyjnego 2-aminopuryną, które również pokazują, że PNA zawierające reszty Q i L nie wiążą się znacząco z ssRNA (Rysunek 6B, 6E, 6F). Wprowadzenie zasady Q jest bardziej destabilizujące niż zasady L, ponieważ zasada Q wywołuje bardziej znaczącą zawadę steryczną podczas tworzenia pary Q-G o charakterze Watsona-Cricka (Rysunek 1F) w porównaniu do pary L-G o charakterze Watsona-Cricka (Rysunek 1E).
<img alt="Schemat parowania zasad RNA-DNA; pary Hoogsteena a Watsona-Cricka; analiza struktury chemicznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Struktury chemiczne stabilnych trypletów zasad oraz niestabilnych struktur par zasad. (A-D) Triplety zasad PNA·RNA2 w dużym rowku dla T·A-U (A), C+·G-C (B), L·G-C (C) oraz Q·C-G (D). (E, F) Niestabilne pary zasad PNA-RNA typu Watsona-Cricka dla L-G (E) i Q-G (F). Litera R reprezentuje szkielet cukrowo-fosforanowy RNA. Wiązania wodorowe zaznaczono czarnymi liniami przerywanymi. Rysunek został powielony z referencji31. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat struktur chemicznych wariantów Boc-PNA, ilustrujący syntezę kwasów nukleinowych typu peptydowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Struktury chemiczne monomerów PNA. Przedstawiono cztery monomery PNA (T, C, L oraz Q). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat syntezy peptydu z wynikami chromatografii produktu surowego i ponownego oczyszczania, analiza czasu retencji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Struktura chemiczna oligomeru PNA i oczyszczanie za pomocą RP-HPLC. (A) Struktura chemiczna sekwencji PNA P3. (B, C) Dane RP-HPLC dla surowego PNA P3 (B) oraz ponownie oczyszczonego PNA P3 (C). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wynik spektrometrii mas; wykres m/z w funkcji intensywności; analiza związku P3; masa obliczona i obserwowana." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Widmo MALDI-TOF oczyszczonego PNA P3. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Interakcje spinek RNA; schemat, elektroforeza w żelu, krzywa wiązania; analiza tworzenia tripleksu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Sekwencje spinek RNA i PNA oraz charakterystyka wiązania metodą niedenaturującej elektroforezy PAGE. (A) Spinki RNA (rHP1 i rHP2), PNA P3 oraz tripleks PNA·RNA2 utworzony pomiędzy PNA P3 a rHP2. (B) Wyniki niedenaturującej elektroforezy PAGE (12%) dla wiązania rHP1 i rHP2 z PNA P3. Bufor inkubacyjny zawiera 200 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7.5. Naniesione spinki RNA (rHP1 i rHP2) znajdują się w stężeniu 1 µM w objętości 20 µL. Stężenia PNA w ścieżkach od lewej do prawej to 0, 0.2, 0.4, 1, 1.6, 2, 4, 10, 16, 20, 28 i 50 µM. PNA P3 nie wiąże się z rHP1 (panel górny), ale wiąże się z rHP2 (panel dolny). (C) Wyznaczenie Kd dla wiązania P3 z rHP2. Frakcję tworzenia tripleksu (Y) przedstawiono w funkcji stężenia PNA. Rycina została opracowana na podstawie publikacji31. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Stabilność tripleksu i dupleksu DNA-RNA; widma fluorescencji; krzywe powinowactwa wiązania; dane spektroskopowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Badanie miareczkowania fluorescencyjnego wiązania PNA P3 z RNA znakowanym 2-aminopuryną. Pozostałość 2-aminopuryny jest oznaczona jako '2' w sekwencji RNA. Bufor inkubacyjny to 200 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7.5. (A) Tripleks PNA·RNA2 utworzony pomiędzy P3 a dsRNA znakowanym 2-aminopuryną (dsRNA2-2AP). (B) Hipotetyczny dupleks PNA-RNA utworzony pomiędzy P3 a ssRNA znakowanym 2-aminopuryną (ssRNA2-2AP). (C, E) Widma emisji fluorescencji odpowiednio dla dupleksu RNA (1 µM) i ssRNA (1 µM) znakowanych 2-aminopuryną, przy zmiżnym stężeniu P3 w pH 7.5. Pik w okolicy 475 nm wynika ze słabej emisji fluorescencyjnej zasady L w PNA. (D, F) Wyznaczenie Kd na podstawie wykresów intensywności fluorescencji 2-aminopuryny (przy 370 nm) odpowiednio dla dupleksu RNA i ssRNA w funkcji stężenia PNA P3. Rycina została opracowana na podstawie referencji31. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Stabilność dupleksu RNA; krzywe topnienia; wykres; oddziaływanie ssRNA1, P1-P5; analiza denaturacji termicznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Wyniki topnienia termicznego dla dupleksów RNA-PNA. Bufor inkubacyjny to 200 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 20 mM NaH2PO4, pH 7.5. Wszystkie próbki zawierają 5 µM jednoniciowego RNA (ssRNA1) oraz PNA w 130 µL. (A) Jednoniciowe RNA (ssRNA1), PNA (P1, P2, P3, P4 i P5) oraz hipotetyczny dupleks PNA-RNA utworzony między PNA P3 a ssRNA1 w orientacji równoległej. Steryczna zawada jest zaznaczona dla par Q-G i L-G przypominających pary Watsona-Cricka. (B) Krzywe topnienia dla różnych PNA wiążących się z ssRNA1. Temperatury topnienia są podane dla krzywych z przejściami topnienia. Rycina została zaadaptowana z referencji31.

Raportujemy protokoły syntezy i oczyszczania oligomerów peptydowych kwasów nukleinowych (PNA) zawierających zmodyfikowane pozostałości. Opisano biochemiczne i biofizyczne metody charakterystyki rozpoznawania dupleksów RNA przez zmodyfikowane PNA.

Specyficzne dla sekwencji i selektywne rozpoznawanie dwuniciowych RNA na jednoniciowych RNA za pomocą chemicznie modyfikowanych peptydowych kwasów nukleinowych

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Ogólnym celem niniejszego artykułu metodycznego jest przedstawienie szczegółowych protokołów wykorzystywanych w naszym laboratorium do badania molekularnego rozpoznawania dwuniciowych RNA przez chemicznie modyfikowane kwasowe peptydy nukleinowe. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie chemicznej biologii RNA, takie jak detekcja i celowanie w struktury RNA. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że zasady projektowania mogą mieć zastosowanie do celowania w dowolne struktury dupleksów RNA.Procedurę zademonstruje Desiree Toh, pracownik badawczy z mojego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, należy dodać 4 µL 35% roztworu glicerolu do wcześniej przygotowanych próbek RNA PNA i delikatnie wymieszać. Używając mikropipety i końcówek do nakładania próbek na żel, ostrożnie nanieś 20 µL każdej próbki na wcześniej przygotowany żel poliakrylamidowy, upewniając się, że nie wprowadzono pęcherzyków powietrza.Prowadź elektroforezę żelu przy stałym napięciu 250 V przez pięć godzin. Po pięciu godzinach wyłącz zasilacz i wyjmij płytkę szklaną ze statywu do żelu. Następnie usuń taśmę uszczelniającą żel i rozmontuj płytkę szklaną.Ostrożnie wyjmij żel z szklanej płytki i umieść go w naczyniu wypełnionym 350 mililitrami wody dejonizowanej. Do naczynia ostrożnie dodaj 35 mikrolitrów bromku etydium i umieść je na wytrząsarku platformowym przy niskiej prędkości przez 30 minut. Po zutylizowaniu roztworu bromku etydium przepłucz żel od 1,5 do dwóch litrów wody destylowanej.Następnie należy przeskanować żel za pomocą obrazownika z zielonym laserem o długości fali 532 nanometrów i filtrem emisji ustawionym na 610 nanometrów. Intensywność prążków na żelu należy zmierzyć ilościowo przy użyciu darmowego oprogramowania. Odpowiednią ilość dwuniciowego RNA znakowanego 2-aminopuryną należy przenieść do czystej probówki o pojemności 1,5 mililitra.Następnie zagęść roztwory RNA za pomocą koncentratora próżniowego. Potem przenieś odpowiednie objętości docelowego PNA dla różnych stężeń z wcześniej przygotowanego roztworu zapasu do oddzielnych probówek o pojemności 1,5 mililitra. Zagęść roztwory PNA za pomocą koncentratora próżniowego.Do probówki zawierającej wysuszone RNA dodać 975 µL buforu inkubacyjnego i dokładnie wymieszać, aby upewnić się, że całe RNA zostało rozpuszczone. Po krótkim odwirowaniu roztworu RNA przeprowadzić proces hybrydyzacji, umieszczając probówkę w wstępnie podgrzanym bloku grzejnym na 10 minut. Po zakończeniu wyłączyć blok grzejny i pozwolić próbce ostygnąć do temperatury pokojowej.Do każdej z probówek zawierających wysuszone PNA należy dodać 75 µL RNA i dokładnie wymieszać. Po pozostawieniu próbek w temperaturze pokojowej przez co najmniej jedną godzinę, należy inkubować je w temperaturze 4 °C przez noc. Następnie należy przenieść odpowiednie ilości znakowanego 2-aminopuryną jednoniciowego RNA do osobnych probówek o pojemności 1,5 ml.Przenieś odpowiednie objętości docelowego PNA dla różnych stężeń z zapasu głównego do poszczególnych probówek zawierających jednoniciowe RNA. Po wysuszeniu próbek dodaj 75 µL buforu inkubacyjnego do każdej z probówek i dokładnie wymieszaj. Poddaj każdą próbkę procesowi hybrydyzacji, umieszczając każdą probówkę w podgrzanym bloku grzejnym na 10 minut.Po ostygnięciu próbek do temperatury pokojowej, inkubować je w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnie przenieść 70 µL każdej próbki do kuwety o szerokości jednego centymetra. Umieścić kuwetę w spektrofotometrze fluorescencyjnym i zmierzyć emisję w zakresie długości fal od 330 do 550 nanometrów.Po zakończeniu pomiaru należy usunąć bufor z kuwety. Opłukać kuwetę wodą destylowaną i osuszyć strumieniem azotu. Po powtórzeniu pomiaru dla wszystkich próbek należy wykreślić zależność natężenia fluorescencji od długości fali.Przenieś odpowiednie ilości jednoniciowego RNA do oddzielnych probówek o pojemności 1,5 mililitra. Następnie przenieś odpowiednie objętości docelowego PNA z głównego zapasu do odpowiednich probówek zawierających jednoniciowy RNA. Po wysuszeniu próbek dodaj 130 µL buforu inkubacyjnego do każdej z probówek i dokładnie wymieszaj.Poddaj każdą próbkę procesowi wyżarzania, umieszczając każdą probówkę w wstępnie podgrzanym bloku grzewczym na 10 minut. Po ochłodzeniu próbek do temperatury pokojowej inkubuj je w temperaturze czterech stopni Celsius overnight. Następnie przenieś 130 µl każdej próbki do kuwety ośmiomikrokomórkowej, w której jedna komórka zawiera bufor inkubacyjny.Za pomocą spektrofotometru UV-Vis zmierz absorbancję każdej próbki przy długości fali 260 nanometrów. Pomiaru należy dokonać przy zwiększaniu temperatury od 15 do 95 stopni Celsjusza, a następnie przy zmniejszaniu temperatury od 95 do 15 stopni Celsjusza, przy szybkości narastania 0,5 stopnia Celsjusza na minutę. Oligomery PNA uzyskano po dwóch etapach oczyszczania metodą odwróconej fazy HPLC.Tożsamość PNA można potwierdzić za pomocą analizy MALDI/TOF. Dane z nieodtwarzającej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE) sugerują, że zmodyfikowane PNA typu Q i L mogą rozpoznawać region dwuniciowego RNA wyłącznie w obecności pary C-G. To specyficzne i wzmocnione rozpoznawanie zachodzi poprzez tworzenie trójek dwóch zasad PNA-RNA w sekwencjach T-A-U-L-G-C oraz Q-C-G.Badanie miareczkowania fluorescencyjnego 2-aminopuryną wykazało, że PNA zmodyfikowany Q i L wiąże się z docelowym dwuniciowym RNA, ale nie z jednoniciowym RNA. PNA zawierające reszty Q nie wykazują przejść topnienia termicznego, co sugeruje brak wiązania z jednoniciowym RNA ze względu na zawadę steryczną w parze Q-G przypominającej parę Watsona-Cricka. W porównaniu z niemodyfikowanym PNA P1, PNA P4 i P5 zawierające reszty L wykazują niższą temperaturę topnienia dla odpowiadających im dupleksów RNA-PNA ze względu na zawadę steryczną w parze L-G przypominającej parę Watsona-Cricka.Dane dotyczące topnienia termicznego wyznaczone na podstawie absorbancji UV są zgodne z danymi z miareczkowania fluorescencyjnego 2-aminopuryny, które również wykazują, że PNA zawierający reszty Q i L nie wiąże się silnie z jednoniciowym RNA. Wprowadzenie zasady Q jest bardziej destabilizujące niż zasady L, ponieważ zasada Q wywołuje bardziej znaczący konflikt steryczny podczas tworzenia pary Q-G typu Watsona-Cricka. Po opanowaniu metody, poszczególne eksperymenty można przeprowadzić w ciągu tygodnia, pod warunkiem prawidłowej realizacji.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak sondowanie i celowanie w struktury RNA w komórkach, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład, czy jesteśmy w stanie wykrywać struktury RNA i regulować funkcje RNA, wykorzystując dwuniciowe PNA wiążące RNA. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie biologii RNA i chorób do eksploracji rozwoju terapii celowanych w struktury RNA.

sequence-specific-selective-recognition-double-stranded-rnas-over

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Wysokoprzepustowa selektywna acylacja hydroksylowa 2' analizowana przez rozszerzenie startera (SHAPE) wykorzystuje nowatorską technologię sondowania chemicznego, odwrotną transkrypcję, elektroforezę kapilarną i oprogramowanie do przewidywania struktury drugorzędowej do określenia struktur RNA od kilkuset do kilku tysięcy nukleotydów z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu.

Przewidywanie struktury drugorzędowej RNA przy użyciu wysokoprzepustowego SHAPE

Interakcje RNA-białko leżą u podstaw wielu procesów komórkowych. W tym miejscu opisujemy metodę in vivo do izolowania specyficznego RNA i identyfikowania nowych białek, które są z nim związane. Może to rzucić nowe światło na to, w jaki sposób RNA są regulowane w komórce.

Izolacja nowych białek wiążących RNA metodą RaPID

Opisujemy protokół do identyfikacji białek wiążących RNA i mapowania ich regionów wiążących RNA w żywych komórkach za pomocą fotosieciowania za pośrednictwem UV i spektrometrii mas.

Przygotowanie próbki do identyfikacji regionów wiążących RNA w oparciu o spektrometrię mas

Ta metoda ściągania RNA pozwala na identyfikację celów RNA długiego niekodującego RNA (lncRNA). Opierając się na hybrydyzacji domowej roboty, zaprojektowanych antysensownych sond oligonukleotydowych DNA specyficznych dla tego lncRNA w odpowiednio utrwalonej tkance lub linii komórkowej, skutecznie umożliwia wychwycenie wszystkich celów RNA lncRNA.

Procedura ściągania RNA w celu identyfikacji celów RNA długiego niekodującego RNA

Dwuniciowe RNA wytwarzane podczas replikacji wirusa RNA mogą być rozpoznawane przez receptory rozpoznające wzorce, aby wywołać wrodzoną odpowiedź immunologiczną. W przypadku wirusów RNA o ujemnym znaczeniu interakcja między niskim poziomem dsRNA a PRR pozostaje niejasna. Opracowaliśmy metodę mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dsRNA i PRR arenawirusa w poszczególnych komórkach.

Obrazowanie konfokalne dwuniciowego RNA i receptorów rozpoznawania wzorców w zakażeniu wirusem RNA o ujemnym znaczeniu

Specyficzność sekwencji jest kluczowa dla regulacji genów. Białka regulatorowe, które rozpoznają określone sekwencje, są ważne dla regulacji genów. Zdefiniowanie funkcjonalnych miejsc wiązania dla takich białek jest trudnym problemem biologicznym. Iteracyjne podejście do identyfikacji miejsca wiązania białka wiążącego RNA jest opisane tutaj i ma zastosowanie do wszystkich białek wiążących RNA.

Badanie przestrzeni sekwencji w celu identyfikacji miejsc wiązania białek wiążących regulatorowe RNA

MALDI-TOF został użyty do scharakteryzowania fragmentów uzyskanych z reaktywności pomiędzy utlenionym RNA a egzorybonukleazą Xrn-1. Niniejszy protokół opisuje metodologię, która może być stosowana do innych procesów z udziałem RNA i/lub DNA.

Identyfikacja fragmentów RNA powstałych w wyniku degradacji enzymatycznej za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF

Oligonukleotydowe 5′-trifosforany są wszechobecnymi składnikami w podstawowych szlakach biologicznych i są coraz częściej wykorzystywane w zastosowaniach biotechnologicznych. W tym miejscu opisano techniki rutynowej syntezy i oczyszczania oligonukleotydowych 5′-trifosforanów, zaczynając od oligonukleotydów przygotowanych standardowymi technikami syntezy automatycznej.

Chemiczna trifosforylacja oligonukleotydów

Obecny protokół demonstruje użycie szybkiego, 3-stopniowego, opartego na aptamie testu wykładniczego amplifikacji do wykrywania celów. Przygotowanie próbki, wzmocnienie sygnału i rozwój koloru są omówione w celu wdrożenia tego systemu do rozpoznawania obecności teofiliny w porównaniu z kofeiną.

Wykrywanie celów oparte na aptamierach ułatwione przez 3-stopniową izotermiczną reakcję amplifikacji wykładniczej G-Quadruplex

Nanomaszyny oparte na DNAzyme mogą być używane do wysoce selektywnego i czułego wykrywania kwasów nukleinowych. W artykule opisano szczegółowy protokół projektowania nanomaszyn opartych na DNAzyme z rdzeniem 10-23 przy użyciu wolnego oprogramowania i ich zastosowania w wykrywaniu fragmentu wirusa Epsteina-Barr jako przykładu.

DNAzyme 10-23 - Nanomaszyny do rozpoznawania kwasów nukleinowych

Poznaj metody rozpoznawania dwuniciowych RNA przez chemicznie modyfikowane peptydowe kwasy nukleinowe. Protokoły obejmują syntezę, elektroforezę i spektrofotometrię fluorescencyjną.

Specyficzne dla sekwencji i selektywne rozpoznawanie dwuniciowych RNA na jednoniciowych RNA za pomocą chemicznie modyfikowanych peptydowych kwasów nukleinowych (Wideo) | JoVE Journal

Specyficzne dla sekwencji i selektywne rozpoznawanie dwuniciowych RNA na jednoniciowych RNA za pomocą chemicznie modyfikowanych peptydowych kwasów nukleinowych

Przeglądaj więcej filmów