Specyficzne dla sekwencji i selektywne rozpoznawanie dwuniciowych RNA na jednoniciowych RNA za pomocą chemicznie modyfikowanych peptydowych kwasów nukleinowych

Ogólnym celem niniejszego artykułu metodycznego jest przedstawienie szczegółowych protokołów wykorzystywanych w naszym laboratorium do badania molekularnego rozpoznawania dwuniciowych RNA przez chemicznie modyfikowane kwasowe peptydy nukleinowe. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie chemicznej biologii RNA, takie jak detekcja i celowanie w struktury RNA. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że zasady projektowania mogą mieć zastosowanie do celowania w dowolne struktury dupleksów RNA.

Procedurę zademonstruje Desiree Toh, pracownik badawczy z mojego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, należy dodać 4 µL 35% roztworu glicerolu do wcześniej przygotowanych próbek RNA PNA i delikatnie wymieszać. Używając mikropipety i końcówek do nakładania próbek na żel, ostrożnie nanieś 20 µL każdej próbki na wcześniej przygotowany żel poliakrylamidowy, upewniając się, że nie wprowadzono pęcherzyków powietrza.

Prowadź elektroforezę żelu przy stałym napięciu 250 V przez pięć godzin. Po pięciu godzinach wyłącz zasilacz i wyjmij płytkę szklaną ze statywu do żelu. Następnie usuń taśmę uszczelniającą żel i rozmontuj płytkę szklaną.

Ostrożnie wyjmij żel z szklanej płytki i umieść go w naczyniu wypełnionym 350 mililitrami wody dejonizowanej. Do naczynia ostrożnie dodaj 35 mikrolitrów bromku etydium i umieść je na wytrząsarku platformowym przy niskiej prędkości przez 30 minut. Po zutylizowaniu roztworu bromku etydium przepłucz żel od 1,5 do dwóch litrów wody destylowanej.

Następnie należy przeskanować żel za pomocą obrazownika z zielonym laserem o długości fali 532 nanometrów i filtrem emisji ustawionym na 610 nanometrów. Intensywność prążków na żelu należy zmierzyć ilościowo przy użyciu darmowego oprogramowania. Odpowiednią ilość dwuniciowego RNA znakowanego 2-aminopuryną należy przenieść do czystej probówki o pojemności 1,5 mililitra.

Następnie zagęść roztwory RNA za pomocą koncentratora próżniowego. Potem przenieś odpowiednie objętości docelowego PNA dla różnych stężeń z wcześniej przygotowanego roztworu zapasu do oddzielnych probówek o pojemności 1,5 mililitra. Zagęść roztwory PNA za pomocą koncentratora próżniowego.

Do probówki zawierającej wysuszone RNA dodać 975 µL buforu inkubacyjnego i dokładnie wymieszać, aby upewnić się, że całe RNA zostało rozpuszczone. Po krótkim odwirowaniu roztworu RNA przeprowadzić proces hybrydyzacji, umieszczając probówkę w wstępnie podgrzanym bloku grzejnym na 10 minut. Po zakończeniu wyłączyć blok grzejny i pozwolić próbce ostygnąć do temperatury pokojowej.

Do każdej z probówek zawierających wysuszone PNA należy dodać 75 µL RNA i dokładnie wymieszać. Po pozostawieniu próbek w temperaturze pokojowej przez co najmniej jedną godzinę, należy inkubować je w temperaturze 4 °C przez noc. Następnie należy przenieść odpowiednie ilości znakowanego 2-aminopuryną jednoniciowego RNA do osobnych probówek o pojemności 1,5 ml.

Przenieś odpowiednie objętości docelowego PNA dla różnych stężeń z zapasu głównego do poszczególnych probówek zawierających jednoniciowe RNA. Po wysuszeniu próbek dodaj 75 µL buforu inkubacyjnego do każdej z probówek i dokładnie wymieszaj. Poddaj każdą próbkę procesowi hybrydyzacji, umieszczając każdą probówkę w podgrzanym bloku grzejnym na 10 minut.

Po ostygnięciu próbek do temperatury pokojowej, inkubować je w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnie przenieść 70 µL każdej próbki do kuwety o szerokości jednego centymetra. Umieścić kuwetę w spektrofotometrze fluorescencyjnym i zmierzyć emisję w zakresie długości fal od 330 do 550 nanometrów.

Po zakończeniu pomiaru należy usunąć bufor z kuwety. Opłukać kuwetę wodą destylowaną i osuszyć strumieniem azotu. Po powtórzeniu pomiaru dla wszystkich próbek należy wykreślić zależność natężenia fluorescencji od długości fali.

Przenieś odpowiednie ilości jednoniciowego RNA do oddzielnych probówek o pojemności 1,5 mililitra. Następnie przenieś odpowiednie objętości docelowego PNA z głównego zapasu do odpowiednich probówek zawierających jednoniciowy RNA. Po wysuszeniu próbek dodaj 130 µL buforu inkubacyjnego do każdej z probówek i dokładnie wymieszaj.

Poddaj każdą próbkę procesowi wyżarzania, umieszczając każdą probówkę w wstępnie podgrzanym bloku grzewczym na 10 minut. Po ochłodzeniu próbek do temperatury pokojowej inkubuj je w temperaturze czterech stopni Celsius overnight. Następnie przenieś 130 µl każdej próbki do kuwety ośmiomikrokomórkowej, w której jedna komórka zawiera bufor inkubacyjny.

Za pomocą spektrofotometru UV-Vis zmierz absorbancję każdej próbki przy długości fali 260 nanometrów. Pomiaru należy dokonać przy zwiększaniu temperatury od 15 do 95 stopni Celsjusza, a następnie przy zmniejszaniu temperatury od 95 do 15 stopni Celsjusza, przy szybkości narastania 0,5 stopnia Celsjusza na minutę. Oligomery PNA uzyskano po dwóch etapach oczyszczania metodą odwróconej fazy HPLC.

Tożsamość PNA można potwierdzić za pomocą analizy MALDI/TOF. Dane z nieodtwarzającej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE) sugerują, że zmodyfikowane PNA typu Q i L mogą rozpoznawać region dwuniciowego RNA wyłącznie w obecności pary C-G. To specyficzne i wzmocnione rozpoznawanie zachodzi poprzez tworzenie trójek dwóch zasad PNA-RNA w sekwencjach T-A-U-L-G-C oraz Q-C-G.

Badanie miareczkowania fluorescencyjnego 2-aminopuryną wykazało, że PNA zmodyfikowany Q i L wiąże się z docelowym dwuniciowym RNA, ale nie z jednoniciowym RNA. PNA zawierające reszty Q nie wykazują przejść topnienia termicznego, co sugeruje brak wiązania z jednoniciowym RNA ze względu na zawadę steryczną w parze Q-G przypominającej parę Watsona-Cricka. W porównaniu z niemodyfikowanym PNA P1, PNA P4 i P5 zawierające reszty L wykazują niższą temperaturę topnienia dla odpowiadających im dupleksów RNA-PNA ze względu na zawadę steryczną w parze L-G przypominającej parę Watsona-Cricka.

Dane dotyczące topnienia termicznego wyznaczone na podstawie absorbancji UV są zgodne z danymi z miareczkowania fluorescencyjnego 2-aminopuryny, które również wykazują, że PNA zawierający reszty Q i L nie wiąże się silnie z jednoniciowym RNA. Wprowadzenie zasady Q jest bardziej destabilizujące niż zasady L, ponieważ zasada Q wywołuje bardziej znaczący konflikt steryczny podczas tworzenia pary Q-G typu Watsona-Cricka. Po opanowaniu metody, poszczególne eksperymenty można przeprowadzić w ciągu tygodnia, pod warunkiem prawidłowej realizacji.

Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak sondowanie i celowanie w struktury RNA w komórkach, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład, czy jesteśmy w stanie wykrywać struktury RNA i regulować funkcje RNA, wykorzystując dwuniciowe PNA wiążące RNA. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie biologii RNA i chorób do eksploracji rozwoju terapii celowanych w struktury RNA.