Specyficzne dla sekwencji i selektywne rozpoznawanie dwuniciowych RNA na jednoniciowych RNA za pomocą chemicznie modyfikowanych peptydowych kwasów nukleinowych

Ogólnym celem tego artykułu o metodach jest przedstawienie szczegółowych protokołów wykorzystywanych przez nasze laboratorium do badania molekularnego rozpoznawania dwuniciowych RNA przez chemicznie modyfikowane peptydowe kwasy nukleinowe. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii chemicznej RNA, takie jak wykrywanie i celowanie w struktury RNA. Główną zaletą tej techniki jest to, że zasady projektowania można zastosować do celowania w dowolne struktury dupleksowe RNA.

Procedurę zademonstruje Desiree Toh, pracownik naukowy z mojego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj cztery mikrolitry 35% roztworu glicerolu do wcześniej przygotowanych próbek RNA PNA i delikatnie wymieszaj. Za pomocą mikropipety i końcówek do napełniania żelem ostrożnie przelej 20 mikrolitrów każdej próbki do wcześniej przygotowanego żelu poliakrylamidowego, uważając, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków powietrza.

Uruchom żel przy stałym napięciu 250 woltów przez pięć godzin. Po pięciu godzinach wyłącz zasilanie i wyjmij szklaną płytkę ze stojaka na żel. Następnie usuń żelową taśmę uszczelniającą i zdemontuj szklaną płytkę.

Delikatnie usuń żel ze szklanej płytki i umieść go w pojemniku wypełnionym 350 mililitrami wody dejonizowanej. Ostrożnie dodaj 35 mikrolitrów bromku etydyny do pojemnika i umieść go na wytrząsarce platformowej na niskich obrotach na 30 minut. Po wyrzuceniu roztworu bromku etydyny spłukać żel 1,5 do dwóch litrów wody destylowanej.

Następnie zeskanuj żel za pomocą imagera z zielonym laserem o długości 532 nanometrów i filtrem emisyjnym ustawionym na 610 nanometrów. Określ ilościowo intensywność opaski żelowej za pomocą bezpłatnego oprogramowania. Przenieś odpowiednią ilość dwuniciowego RNA znakowanego 2-aminopuryną do czystej probówki o pojemności 1,5 mililitra.

Następnie zagęścić roztwory RNA za pomocą koncentratora próżniowego. Następnie należy przenieść odpowiednie objętości docelowego PNA dla różnych stężeń z wcześniej przygotowanego głównego materiału do oddzielnych probówek o pojemności 1,5 mililitra. Zagęścić roztwory PNA za pomocą koncentratora próżniowego.

Dodać 975 mikrolitrów buforu inkubacyjnego do probówki zawierającej wysuszone RNA i dokładnie wymieszać, aby upewnić się, że całe RNA zostało rozpuszczone. Po krótkim odwirowaniu roztworu RNA poddać go wyżarzaniu, umieszczając probówkę w podgrzanym bloku grzewczym na 10 minut. Po zakończeniu wyłącz blok grzewczy i pozwól próbce ostygnąć do temperatury pokojowej.

Dodaj 75 mikrolitrów RNA do każdej z probówek zawierających wysuszone PNA i dokładnie wymieszaj. Po pozostawieniu próbek w temperaturze pokojowej na co najmniej godzinę, należy je inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Teraz przenieś odpowiednie ilości jednoniciowego RNA znakowanego 2-aminopuryną do oddzielnych probówek o pojemności 1,5 mililitra.

Przenieść odpowiednie objętości docelowego PNA dla różnych stężeń z głównego materiału do odpowiednich probówek zawierających jednoniciowy RNA. Po wysuszeniu próbek dodać 75 mikrolitrów buforu inkubacyjnego do każdej z probówek i dokładnie wymieszać. Poddaj każdą próbkę wyżarzaniu, umieszczając każdą rurkę we wstępnie podgrzanym bloku grzewczym na 10 minut.

Po pozostawieniu próbek do ostygnięcia do temperatury pokojowej, inkubuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnie przenieś 70 mikrolitrów każdej próbki do kuwety o powierzchni jednego centymetra kwadratowego. Umieść kuwetę w spektrofotometrze fluorescencyjnym i zmierz emisję w zakresie długości fal od 330 do 550 nanometrów.

Po zakończeniu pomiaru wyjmij bufor z kuwety. Wypłucz kuwetę wodą destylowaną i osusz gazowym azotem. Po powtórzeniu pomiaru dla wszystkich próbek, należy wykreślić intensywność fluorescencji w stosunku do długości fali.

Przenieś odpowiednie ilości jednoniciowego RNA do oddzielnych probówek o pojemności 1,5 mililitra. Następnie przenieś odpowiednie objętości docelowego PNA z głównego stada do odpowiednich probówek zawierających jednoniciowy RNA. Po wysuszeniu próbek dodać 130 mikrolitrów buforu inkubacyjnego do każdej z probówek i dokładnie wymieszać.

Poddaj każdą próbkę wyżarzaniu, umieszczając każdą rurkę we wstępnie podgrzanym bloku grzewczym na 10 minut. Po pozostawieniu próbek do ostygnięcia do temperatury pokojowej, inkubuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Teraz przenieś 130 mikrolitrów każdej próbki do kuwety z ośmioma mikrokomórkami, z której jedna zawiera bufor inkubacyjny.

Za pomocą spektrofotometru UV-Vis zmierz absorbancję każdej próbki przy 260 nanometrach. Mierz przy wzroście temperatury od 15 do 95 stopni Celsjusza, a następnie spadającej temperaturze od 95 do 15 stopni Celsjusza w tempie 0,5 stopnia Celsjusza na minutę. Oligomery PNA otrzymano po dwóch oczyszczaniach metodą HPLC w odwrotnej fazie.

Tożsamość PNA można potwierdzić za pomocą analizy MALDI/TOF. Niedenaturujące dane PAGE sugerują, że zmodyfikowany Q i L PNA może rozpoznać tylko dwuniciowy region RNA z parą C-G. To specyficzne i wzmocnione rozpoznawanie odbywa się poprzez potrójną formację opartą na T-A-U-L-G-C i Q-C-G PNA RNA.

Badanie miareczkowania fluorescencji 2-aminopurynowej wykazało, że PNA zmodyfikowany Q i L wiąże się z celowanym dwuniciowym RNA, ale nie z jednoniciowym RNA. PNA zawierające reszty Q nie wykazują przejść termicznych, co sugeruje brak wiązania z jednoniciowym RNA z powodu zderzenia sterycznego w parze Q-G Watsona-Cricka. W porównaniu z niezmodyfikowanymi PNA P1, PNA P4 i P5 zawierające reszty L wykazują niższą temperaturę topnienia dla odpowiadających im dupleksów RNA PNA ze względu na zderzenie steryczne w parze L-G podobnej do Watsona-Cricka.

Dane dotyczące topnienia termicznego wykrytej przez absorbancję UV są zgodne z danymi miareczkowania fluorescencji 2-aminopuryny, które również pokazują, że PNA zawierające reszty Q i L nie wiąże się silnie z jednoniciowym RNA. Włączenie bazy Q jest bardziej destabilizujące niż zasady L, ponieważ zasada Q ma bardziej znaczące zderzenie steryczne w tworzeniu pary Q-G podobnej do Watsona-Cricka. Po opanowaniu różne eksperymenty można przeprowadzić w ciągu tygodnia, jeśli zostaną wykonane prawidłowo.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak sondowanie i celowanie w struktury RNA w komórkach, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy możemy wykryć struktury RNA i regulować funkcje RNA za pomocą dwuniciowych wiążących RNA PNA. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią i chorobami RNA do zbadania ukierunkowanego rozwoju terapeutycznego struktury RNA.