Identyfikacja motywów funkcjonalnych i ich partnerów wiążących w oparciu o peptydy

Ten film przedstawia zestaw czterech eksperymentów wykorzystywanych do identyfikacji funkcjonalnych motywów białka HIV jeden NPH oraz do opracowania inhibitorów na bazie peptydów. Specyficzne krótkie peptydy pochodzące z motywów znajdujących się w białkach o pełnej długości, zarówno zachowują swoją funkcję biologiczną, jak i kompetycyjnie hamują funkcję białka o pełnej długości w celu identyfikacji motywów apoptotycznych. U HIV jedna komórka kota szarpnięcia NEF jest poddawana działaniu peptydów skanujących NEF i przeprowadza się test apoptozy tunelowej w celu identyfikacji peptydów, które indukują apoptozę.

Drugi zestaw peptydów zawierający wariacje na temat motywu wydzielania NEF. Region modyfikacji wydzielania lub SMR jest transfekowany do komórek wraz z utratą funkcji NPH GFP z powodu hamowania kompetycyjnego, na co wskazuje zmniejszone wydzielanie nph. GFP ocenia się za pomocą fluorometrii w celu identyfikacji czynników komórkowych, które oddziałują z regionem modyfikacji wydzielania lub SMR nef.

Wytrącanie wody odbywa się przy użyciu SMR NPH typu dzikiego jako przynęty. Wreszcie, aby sprawdzić, czy te interakcje wpływają na wydzielanie, przeciwciała przeciwko zidentyfikowanym partnerom wiążącym są transfekowane do komórek. Aby ocenić, czy antagonizują one wydzielanie motywu NF, uzyskane wyniki identyfikują dwa funkcjonalne motywy apoptotyczne w NEF oraz peptyd inhibitorowy, który antagonizuje funkcjonalny motyw wydzielania NEF, a także jego komórkowych partnerów wiążących niezbędnych do wydzielania.

Ogólnym celem tego zestawu czterech eksperymentów jest przyspieszenie identyfikacji motywów funkcjonalnych w białkach docelowych, a następnie wykorzystanie tych danych do opracowania inhibitorów zasad peptydowych tych motywów funkcjonalnych. Ten zestaw protokołów był przydatny dla naszej grupy, pomagając nam odpowiedzieć na kluczowe pytania związane z patogenezą HIV, takie jak zrozumienie roli wydzielania wywołanego nefami w patogenezie oraz w rozszyfrowaniu mechanizmów leżących u podstaw zdolności neff do manipulowania szlakiem transportu egzosomalnego. Dzisiaj procedury zademonstruje dr Ming Bo Huang, który jest instruktorem badawczym w moim laboratorium.

Rozpocznij tę procedurę od zestawu peptydów skanujących obszar zainteresowania dla tego eksperymentu. 20 peptydów mer z nakładaniem się 10 aminokwasów obejmujących całe białko NPH HIV uzyskano z programu odczynników AIDS. Aby zidentyfikować motywy apoptotyczne NPH, wykonaj test apoptozy przy użyciu peptydów skanujących NEF indywidualnie w następujący sposób, dodaj jeden mililitr pożywki hodowlanej zawierającej 10 nanogramów na mililitr peptydu na 35 milimetrową płytkę jerk hat, hodowle komórkowe i inkubuj kultury przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po inkubacji należy wykonać końcowy test DUTP za pośrednictwem transferazy deoksynukleotydowej, nacięcie biotyny i znakowanie lub test tunelowy w celu oceny apoptozy. Aby to zrobić, najpierw umyj komórki PBS, a następnie odessaj PBS i dodaj 4% aldehydu Paraform w PBS, inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby utrwalić komórki po utrwaleniu komórek, umyj je PBS i dodaj Triton X 100, inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby je przepuścić. Po utrwaleniu i przepuszczalności komórek dodać odczynnik tunelowy i inkubować komórki przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza po przepuszczalności.

Przepłucz komórki dwukrotnie PBS. Następnie określ procent barwionych komórek za pomocą epifluorescencji w systemie mikroskopii sterowanej komputerowo. Po transekcji komórek jca z NPH, plazmidem GFP i różnymi odmianami peptydu SMR przy użyciu zestawu odczynników do dostarczania białka rydwanu, jak opisano w dokumencie towarzyszącym, należy pobrać pożywkę w celu określenia wydajności transfekcji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Przechwytuj obrazy fluorescencyjne i w jasnym polu oraz określaj procent komórek. Następnie transfekowany w celu oceny zahamowania wydzielania NPH GFP, przenieść 100 mikrolitrów kondycjonowanej bezkomórkowo pożywki do indywidualnych dołków 96-dołkowej czarnej płytki mikromiareczkowej. Użyj fluorymetru o długości fali wzbudzenia 485 nanometrów i długości fali emisji 515 nanometrów, aby zmierzyć fluorescencję GFP w ośrodku we względnych jednostkach fluorescencji.

Po zakończeniu odczytu przenieś dane do komputera. Ustaw poziom fluorescencji GFP w pożywce kontrolnej na 100%Następnie porównaj go z poziomem fluorescencji GFP w pożywce z komórek transfekowanych różnymi peptydami SMR, aby określić zmiany w wydzielaniu NPH GFP. Identyfikacja współczynników wiążących motywy jest trudnym krokiem.

Upewnij się, że kulki są odpowiednio wymieszane podczas inkubacji i że jak najwięcej płynu jest usuwane z kulek podczas każdego etapu mycia. Hodować komórki jerk hat w pożywce RPMI 1640 zawierającej 10% FBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza w komórkach osadów kolby do hodowli tkankowej T 75 przez odwirowanie w temperaturze 1000 razy G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze PBS i przenieść go do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej.

Wiruj z prędkością 1000 razy G przez jedną minutę. Następnie ponownie zawieś granulkę w jednym mililitrze lizy Anti-Flag. Bufor za pomocą delikatnego pipetowania różnicowo mikrowirówki.

Zawiesiny w dawce 2000 razy G przez pięć minut i w dawce 13 000 razy G przez 10 minut. Aby osadzać szczątki komórkowe i DNA, należy zebrać supernatant zwany dalej lizatem. Po określeniu stężenia białka dodać jeden miligram białka lizatu i jeden mikrogram peptydu SMR typu dzikiego lub zmutowanego peptydu SMR do 20 mikrolitrów żelu o podwójnym powinowactwie Anti-Flag M.

Ten żel powinowactwa jest dalej określany jako żywica, która doprowadza mieszaninę do końcowej objętości jednego mililitra w buforze co IP. Przygotuj również kontrolę ujemną, w której lizat łączy się z żywicą pod nieobecność któregokolwiek z peptydów. Inkubować mieszaniny w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, obracając się od końca do końca.

Następnego dnia osadzaj żywicę przez mikrowirowanie w temperaturze od 5 000 do 8 000 razy G przez 30 sekund. Po odwirowaniu odczekaj od jednej do dwóch minut przed przystąpieniem do próbek, aby żywica mogła osiąść w probówce. Usunąć supernatant za pomocą wąskiej końcówki pipety lub strzykawki Hamiltona, uważając, aby nie przenieść żadnej żywicy.

Żywicę przemyć czterokrotnie za pomocą resus, zawieszając ją w 500 mikrolitrach buforu do mycia, a następnie przeprowadzić mikrowirowanie. Aby wymyć związane białka komórkowe. Dodać 15 mikrogramów nadmiaru trzech peptydów flagowych do probówki w 50 mikrolitrach buforu do przemywania i inkubować na wytrząsarce kołyskowej przez 30 minut w temperaturze pokojowej po wirówce inkubacyjnej w temperaturze 5 000 do 8 000 razy G przez 30 sekund.

Po pozostawieniu probówek na dwuminutowe osiadanie, zebrać i zachować supernatant zawierający usunięte białka. Po zagęszczeniu EIT przez wytrącanie acetonu, próbki należy zagotować w buforze do próbek laly. Następnie oddziel białka według strony SDS na 40 do 20% triss, prefabrykowany żel kryterium HCL zabarwia żel za pomocą kumasi brylantowy niebieski R dwa 50.

W celu oceny hamowania przeciwciał transfekcyjnych komórek JCA za pomocą NGFP i tubuliny Antifa lub przeciwciała zapobiegającego śmiertelności przy użyciu zestawu odczynników do dostarczania białka rydwanu, jak opisano w dokumencie towarzyszącym, należy pobrać kondycjonowaną pożywkę bezkomórkową z pobranych komórek. Przenieść 100 mikrolitrów do indywidualnych dołków 96-dołkowej czarnej płytki do mikromiareczkowania. Następnie zmierz fluorescencję GFP w ośrodku za pomocą fluorymetru o długości fali wzbudzenia 485 nanometrów i długości fali emisji 515 nanometrów we względnych jednostkach fluorescencyjnych.

Po odczytaniu tabliczki przenieś dane do komputera i ustaw poziom fluorescencji GFP w kontroli tubuliny przeciwtłuszczowej na 100%Porównaj to z poziomem fluorescencji GFP w pożywce z komórek transfekowanych przeciwciałem przeciw śmiertelności, aby określić zmiany w wydzielaniu NEF GFP w celu zmapowania motywów apoptotycznych HIV jeden NPH analiza skanowania peptydowego białek NPH została przeprowadzona zgodnie z opisem w tym filmie. Oś Y pokazuje procent komórek, które są znakowane tunelowo, a oś x oznacza stan leczenia, jak pokazano tutaj, zidentyfikowano dwa oddzielne regiony HIV jeden NEF, które indukują apoptozę. Wskazuje na to zwiększone znakowanie tunelowe komórek wystawionych na działanie peptydów nefowych.

Szczyty apoptozy są oznaczone motywem pierwszym i motywem drugim w celu oceny konkurencyjnego hamowania wydzielania nefów przez pożywkę hodowlaną peptydów typu dzikiego SMR z komórek T szarpniętych CAT z klonem NPH GFP i różnymi peptydami SMR oznaczono egzoomalne wydzielanie NPH, jak wykazano fluorescencją GFP w peptydach zawierających jeden lub więcej motywów sekwencji NPH typu dzikiego, motywy sekwencji SMR hamowały wydzielanie egzoomalnego NEF podczas gdy alanina zastępuje dowolny aminokwas w tym regionie, znacznie zmniejsza skuteczność peptydów. Sugeruje to, że peptyd SM R typu dzikiego hamuje egzoomal nph, 11-aminokwasową wersję apoptotycznego motywu neff. Jeden SM, wcześniej opisany i uzyskany z Sigma Genesis, został użyty jako kontrola negatywna i nie miał wpływu na wydzielanie egzoomalnego NEP.

To zdjęcie barwionego żelu SDS z kumasi pokazuje koimmunoprecypitację czterech białek przez peptyd SMR typu dzikiego o rozmiarach 60, 65, 75 i 250 kilodaltonów. Zmutowany peptyd SMR kontroli negatywnej nie wychwytywał tych białek, a białka te nie oddziaływały niespecyficznie z żywicą powinowactwa. Przy braku peptydu SMR typu dzikiego, wyniki te sugerują, że białka wytrącone z kraju oddziaływały specyficznie z motywami SMR peptydu typu dzikiego.

Test czytnika płytek pokazuje, że transfekcja przeciwciała anty śmiertelnego plazmidem o ekspresji neph całkowicie zniosła wydzielanie egzoomalnego NPH. Niepowiązane przeciwciało nie miało wpływu na wydzielanie egzoomalne ne. Wyniki te sugerują, że do wydzielania nefu egzoomalnego wymagana jest nienaruszona interakcja talentu NM.

Podsumowując, po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać technik opisywania do identyfikacji motywów funkcjonalnych w białkach docelowych i wykorzystania tych danych do opracowania inhibitorów zasad peptydowych tych motywów funkcjonalnych. Próbując procedury co IP, należy pamiętać o zwróceniu szczególnej uwagi podczas wykonywania płukania inkubacyjnego, upewniając się, że kulki są odpowiednio wymieszane podczas inkubacji i że jak najwięcej płynu jest usuwane z kulek podczas każdego etapu mycia. Również podczas płukania komórek i lizatu żywica zawsze pozwala na osadzenie się żywicy po odwirowaniu.

Użyj końcówek pipet z wąskimi końcami i wykonaj cztery prania, aby odpowiednio zredukować tło do akceptowalnego poziomu.