Name: Kwantyfikacja informacji kodowanych przez poziomy ekspresji genów podczas modulacji długości życia w warunkach szerokiego zakresu ograniczeń dietetycznych u C. elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Odkryj metody obliczeniowe do kwantyfikacji informacji kodowanej przez poziomy ekspresji genów podczas modulacji długości życia u C. elegans. Technika ta pozwala zrozumieć strategię kodowania sygnałów środowiskowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy laboratoriom Bargmann i Horvitz za odczynniki. Niektóre szczepy zostały dostarczone przez CGC, które jest finansowane przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej NIH (P40 OD010440). Dziękujemy również M. Lipovsek za uwagi do manuskryptu. Badania te były wspierane przez Wellcome Trust (grant projektu 087146 do Q.C.), BBSRC (BB/H020500/1 i BB/M00757X/1 do Q.C.), Europejską Radę ds. Badań Naukowych (NeuroAge 242666 do Q.C.), AMERYKAŃSKIE National Institutes of Health (R01AG035317 i R01GM088333 do H.L.) oraz amerykańską Narodową Fundację Nauki (0954578 do H.L., 0946809 GRFP do M.Z.).

<ol><li>Gendron, C. M., Chung, B. Y., Pletcher, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sensory+system%3A+More+than+just+a+window+to+the+external+world%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">The sensory system: More than just a window to the external world.</a> Commun Integr Biol. 8 (2), 1017159(2015).</li>
<li>Calhoun, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Mechanisms+for+Evaluating+Environmental+Variability+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural Mechanisms for Evaluating Environmental Variability in Caenorhabditis elegans.</a> Neuron. 86 (2), 428-441 (2015).</li>
<li>Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+healthy+life+span--from+yeast+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extending healthy life span--from yeast to humans.</a> Science. 328 (5976), 321-326 (2010).</li>
<li>Cho, Y., Zhao, C. L., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+high-throughput+and+functional+neuroimaging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Syst+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Trends in high-throughput and functional neuroimaging in Caenorhabditis elegans.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 5, 01376(2017).</li>
<li>Ching, T. -T., Hsu, A. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+plate-based+dietary+restriction+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Solid plate-based dietary restriction in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (51), e2701(2011).</li>
<li>Greer, E. L., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+dietary+restriction+regimens+extend+lifespan+by+both+independent+and+overlapping+genetic+pathways+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Different dietary restriction regimens extend lifespan by both independent and overlapping genetic pathways in C. elegans.</a> Aging Cell. 8 (2), 113-127 (2009).</li>
<li>Mair, W., Panowski, S. H., Shaw, R. J., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+dietary+restriction+for+genetic+epistasis+analysis+and+gene+discovery+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Optimizing dietary restriction for genetic epistasis analysis and gene discovery in C. elegans.</a> PLoS ONE. 4 (2), 4535(2009).</li>
<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Caenorhabditis+elegans.+life+span+on+solid+media%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Measuring Caenorhabditis elegans. life span on solid media.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (27), e1152(2009).</li>
<li>Ching, T. -T., Paal, A. B., Mehta, A., Zhong, L., Hsu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((-Ldrr-2+encodes+an+eIF4H+that+acts+downstream+of+TOR+in+diet-restriction-induced+longevity+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">-Ldrr-2 encodes an eIF4H that acts downstream of TOR in diet-restriction-induced longevity of C. elegans.</a> Aging Cell. 9 (4), 545-557 (2010).</li>
<li>Kaeberlein, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans.+by+complete+removal+of+food%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Lifespan extension in Caenorhabditis elegans. by complete removal of food.</a> Aging Cell. 5 (6), 487-494 (2006).</li>
<li>Lee, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+deprivation+extends+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Dietary deprivation extends lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 5 (6), 515-524 (2006).</li>
<li>Entchev, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene-expression-based+neural+code+for+food+abundance+that+modulates+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">A gene-expression-based neural code for food abundance that modulates lifespan.</a> elife. 4, 06259(2015).</li>
<li>Diana, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+encoding+strategy+in+a+food-sensing+neural+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">Genetic control of encoding strategy in a food-sensing neural circuit.</a> elife. 6, (2017).</li>
<li>Shannon, C. E. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/j.1538-7305.1948.tb01338.x/abstract">A Mathematical Theory of Communication.</a> Bell System Technical Journal. 27 (3), 379-423 (1948).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook+%3A+the+online+review+of+C+elegans+biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook : the online review of C elegans biology. , 1-11 (2006).</li>
<li>Garigan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+Caenorhabditis+elegans.%3A+a+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans.: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).</li>
<li>Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+FUdR+can+cause+prolonged+longevity+in+mutant+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes.</a> Mech Ageing Dev. 131 (5), 364-365 (2010).</li>
<li>Anderson, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans.lifespan+extension+by+osmotic+stress+requires+FUdR%2C+base+excision+repair%2C+FOXO%2C+and+sirtuins%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">C. elegans.lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins.</a> Mech Ageing Dev. 154, 30-42 (2016).</li>
<li>Angeli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+synthesis+inhibitor+is+protective+against+proteotoxic+stressors+via+modulation+of+fertility+pathways+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans.</a> Aging. 5 (10), Albany NY. 759-769 (2013).</li>
<li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+5%27-fluoro-2-deoxyuridine+on+mitochondrial+biology+in+Caenorhabditis+elegans%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans).</a> Exp Gerontol. 56, 69-76 (2014).</li>
<li>van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mech Ageing Dev. 132 (10), 519-521 (2011).</li>
<li>Cheng, K. C. -C., Klancer, R., Singson, A., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+MBK-2%2FDYRK+by+CDK-1+and+the+pseudophosphatases+EGG-4+and+EGG-5+during+the+oocyte-to-embryo+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of MBK-2/DYRK by CDK-1 and the pseudophosphatases EGG-4 and EGG-5 during the oocyte-to-embryo transition.</a> Cell. 139 (3), 560-572 (2009).</li>
<li>Parry, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGG-4+and+EGG-5+Link+Events+of+the+Oocyte-to-Embryo+Transition+with+Meiotic+Progression+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">EGG-4 and EGG-5 Link Events of the Oocyte-to-Embryo Transition with Meiotic Progression in C. elegans.</a> Curr Biol. 19 (20), 1752-1757 (2009).</li>
<li>Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+on-chip+rapid+microscopy%2C+phenotyping+and+sorting+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans.</a> Nat Methods. 5 (7), 637-643 (2008).</li>
<li>Crane, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+screening+of+C.+elegans.identifies+genes+implicated+in+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Autonomous screening of C. elegans.identifies genes implicated in synaptogenesis.</a> Nat Methods. 9 (10), 977-980 (2012).</li>
<li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288 (5463), 113-116 (2000).</li>
<li>Zhan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Processing+of+Imaging+Data+through+Multi-tiered+Classification+of+Biological+Structures+Illustrated+Using+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated Processing of Imaging Data through Multi-tiered Classification of Biological Structures Illustrated Using Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Comput Biol. 11 (4), 1004194(2015).</li>
<li>Duong, T. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/5143010_ks_Kernel_Density_Estimation_and_Kernel_Discriminant_Analysis_for_Multivariate_Data_in_R">Kernel density estimation and kernel discriminant analysis for multivariate data in R.</a> Journal of Statistical Software. 21 (7), URL http://www.jstatsoft.org/v21/i07 21(2007).</li>
<li>R Development Core Team. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22R%3A+A+language+and+environment+for+statistical+computing%22">R: A language and environment for statistical computing</a>. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-project.org (2008).</li>
<li>Cover, T. M., Thomas, J. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCover%2C+TM+%22Elements+of+information+theory%22">Elements of information theory</a>. , Wiley. (2006).</li>
<li>Tkacik, G., Walczak, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Information+transmission+in+genetic+regulatory+networks%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Condens+Matter%22%5BJournal%5D)">Information transmission in genetic regulatory networks: a review.</a> J Phys Condens Matter. 23 (15), 153102(2011).</li>
<li>Arimoto, S. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/1054753/">An Algorithm for Computing the Capacity of Arbitrary Discrete Memoryless Channels.</a> IEEE Transactions on Information Theory. 18 (1), 14-20 (1972).</li>
<li>Cheong, R., Rhee, A., Wang, C. J., Nemenman, I., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Information+transduction+capacity+of+noisy+biochemical+signaling+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Information transduction capacity of noisy biochemical signaling networks.</a> Science. 334 (6054), 354-358 (2011).</li>
<li>Schneidman, E., Bialek, W., Berry, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy%2C+redundancy%2C+and+independence+in+population+codes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synergy, redundancy, and independence in population codes.</a> J Neurosci. 23 (37), 11539-11553 (2003).</li>
<li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+caloric+restriction+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 95 (22), 13091-13096 (1998).</li>
<li>Golegaonkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rifampicin+reduces+advanced+glycation+end+products+and+activates+DAF-16+to+increase+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Rifampicin reduces advanced glycation end products and activates DAF-16 to increase lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 14 (3), 463-473 (2015).</li>
<li>Houtkooper, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitonuclear+protein+imbalance+as+a+conserved+longevity+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism.</a> Nature. 497 (7450), 451-457 (2013).</li>
<li>Ye, X., Linton, J. M., Schork, N. J., Buck, L. B., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pharmacological+network+for+lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">A pharmacological network for lifespan extension in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 13 (2), 206-215 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiamy nową metodę ograniczania diety, która obejmuje znacznie szerszy zakres stężeń żywności niż wcześniej opublikowane protokoły. Metoda ta łączy dwa wcześniej odrębne zjawiska obserwowane w literaturze DR C. elegans , deprywację bakteryjną i klasyczne ograniczenia dietetyczne, co pozwala na badanie obu efektów dietetycznych w ramach jednego protokołu. Korzystając z nowego paradygmatu DR o szerokim zakresie, przedstawiamy ogólne ramy badania ekspresji genów w pojedynczej komórce w odpowiedzi na określony sygnał środowiskowy i określania, w jaki sposób ta komórka koduje informacje. Nasza struktura składa się z dwóch protokołów eksperymentalnych, które ilustrują, jak wykonywać odpowiednio długość życia i obrazowanie ilościowe w ramach szerokiego zakresu DR. Dane z tych protokołów eksperymentalnych można następnie badać za pomocą analiz obliczeniowych dostarczonych w tych ramach w celu ilościowego określenia informacji zakodowanych przez zmiany w poziomach ekspresji genów lub długości życia w różnych warunkach żywnościowych.
Eksperymenty dotyczące długości życia z wykorzystaniem paradygmatu DR o szerokim zakresie obejmują sześć różnych poziomów żywności (Tabela 1). Wymaga to bardziej pracochłonnego podejścia niż badanie długowieczności przy mniejszej liczbie poziomów pożywienia, takich jak deprywacja dietetyczna10,11 lub wykorzystanie tła genetycznego eat-2 35. Jednak badanie długości życia w jednym warunku może ograniczyć interpretacje roli genu w DR. Na przykład niedawno wykazaliśmy, że mutanty daf-7 mają dwukierunkowe osłabienie odpowiedzi na stężenie pokarmu w porównaniu ze zwierzętami typu dzikiego12 (Figura 1A). W przypadku braku pożywienia mutanty daf-7 wykazują skrócenie długości życia w porównaniu ze zwierzętami typu dzikiego. Gdybyśmy wzięli pod uwagę tylko deprywację żywieniową, zinterpretowalibyśmy, że gen daf-7 jest niezbędny tylko do wydłużenia życia, podczas gdy w rzeczywistości rola daf-7 jest bardziej złożona. Dlatego kluczowym wynikiem tej części protokołu jest ustalenie, czy gen będący przedmiotem zainteresowania jest zaangażowany w modulowanie ogólnej odpowiedzi długości życia na zmiany w obfitości pożywienia.
Jedną z głównych zalet tego protokołu w porównaniu z innymi metodami jest to, że wykorzystuje on nowatorską metodę do eliminacji produkcji potomstwa u zwierząt poddawanych analizie długości życia. W większości badań stosuje się lek FuDR w celu zahamowania proliferacji linii zarodkowej u dorosłych, czyniąc ich bezpłodnymi. Jednak ostatnie badania wykazały, że leczenie FuDR może mieć wpływ na długość życia w zależności od stanu i genu 17,18,19,20,21, co stawia pod znakiem zapytania jego ogólne zastosowanie. W tym protokole eliminacja produkcji potomstwa osiąga się poprzez 24-godzinne traktowanie zwierząt RNAi ukierunkowanym na gen jaja-5, który hamuje tworzenie się chitynowej skorupki jajowej zapłodnionych oocytów C. elegans, powodując ich śmierć22,23. Zaletą tej metody jest to, że działa bardzo późno, a więc nie ingeruje w linię zarodkową, która jest głównym regulatorem długowieczności C. elegans.
Jednym z potencjalnych zastrzeżeń związanych z szeroko zakrojonym protokołem DR jest jego zależność od stosowania antybiotyków w celu kontrolowania namnażania się bakterii w celu zapewnienia ścisłej kontroli stężenia bakterii. Wiadomo, że namnażanie się bakterii w jelitach robaka jest główną przyczyną śmierci C. elegans16. Tak więc stosowanie antybiotyków bakteriostatycznych, takich jak karbenicylina, w agarze NGM zapobiega namnażaniu się bakterii i wydłuża życie robaków w porównaniu z kontrolami bez antybiotyków16. Wykazano, że niektóre rodzaje antybiotyków, takie jak ryfampicyna36 i członkowie rodziny tetracyklin 37,38, wydłużają życie C. elegans niezależnie od ich wpływu na proliferację bakterii. Jednak w literaturze nie ma dowodów na to, że zarówno karbenicylina, jak i streptomycyna mogą zwiększać długowieczność niezależnie od ich wpływu na namnażanie się bakterii.
Długość życia może być postrzegana jako wynik złożonych obliczeń, w których informacje środowiskowe, kierowane przez ekspresję genów w sieciach neuronalnych, są przekazywane do fizjologii. Nasz protokół zapewnia metodologię pozwalającą zrozumieć, w jaki sposób określone geny wpływają na ten przepływ informacji o środowisku. Aby odpowiedzieć na to pytanie, potrzebujemy niezawodnego przetwarzania obrazu, aby określić rozkład odpowiedzi ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki. Możliwość oszacowania nie tylko średniej odpowiedzi ekspresji genów na zmiany w obfitości żywności, ale także pełnego rozkładu statystycznego w dużych populacjach stanowi ważny wymóg dla możliwości zastosowania naszej metody. Ten dokładny opis reakcji ekspresji genów na obfitość pożywienia pozwala na zastosowanie teorii informacji do ilościowego określenia informacji kodowanych przez określone neurony, a także strategii kodowania stosowanej przez obwód neuronalny.
Obrazowanie i aspekty obliczeniowe metod opisanych w niniejszym protokole mają zastosowanie do szerszego zestawu kontekstów biologicznych. W naszej pracy skupiliśmy się na małej sieci neuronowej zaangażowanej w wykrywanie żywności, jednak analizy cech przetwarzania informacji nie ograniczają się do konkretnego typu komórki lub określonych sygnałów środowiskowych. W przyszłości metodologie te mogą zostać potencjalnie rozszerzone na większą różnorodność zmiennych wejściowych, wpływając na wszelkie wyniki fizjologiczne. Podejścia te przyczynią się do lepszego zrozumienia, w jaki sposób sieci regulacyjne genów kodują, przetwarzają i przesyłają informacje.

Wszystkie organizmy muszą być w stanie wyczuwać i reagować na zmiany w środowisku, aby zapewnić sobie przetrwanie. U zwierząt układ nerwowy jest głównym detektorem i przetwornikiem informacji o środowisku i koordynuje fizjologiczną reakcję na wszelkie zmiany, które mogą mieć wpływ na przetrwanie organizmu1. Obfitość pożywienia to wskazówka środowiskowa, która jest dobrze zbadana w wielu kontekstach, która nie tylko reguluje zachowania związane z jedzeniem, takie jak żerowanie2, ale także wpływa na długowieczność zwierzęcia. Modulacja długości życia przez zmiany w obfitości pożywienia jest zjawiskiem znanym jako ograniczenie dietetyczne (DR) i ma szerokie ewolucyjne zachowanie3.
Nicień Caenorhabditis elegans to potężny system modelowy do rozwiązywania fundamentalnych problemów biologicznych. Opracowano wiele technik, które pozwalają na manipulowanie genomem robaka, takich jak RNAi i techniki edycji genów in vivo. Niewielki rozmiar fizyczny robaka i jego przezroczystość optyczna umożliwiają również obrazowanie in vivo zarówno transkrypcyjnych, jak i translacyjnych reporterów fluorescencyjnych oraz użyteczność technologii o wysokiej przepustowości, takich jak mikrofluidyka4. Razem narzędzia te można wykorzystać do zbadania, w jaki sposób obwody neuronalne kierują zachowaniem zwierząt.
C. elegans jest bakteriożercą i opublikowano kilka metod, które pozwalają na precyzyjną kontrolę obfitości pożywienia poprzez manipulowanie stężeniem bakterii5,6,7,8. W społeczności badawczej C. elegans DR był badany w dwóch różnych kontekstach. Pierwszy z nich można nazwać "klasycznym DR", ponieważ odzwierciedla zmiany obserwowane w odpowiedzi na zmniejszający się poziom pożywienia w innych organizmach. W tym kontekście, zmniejszająca się obfitość żywności z poziomu ad libitum skutkuje wydłużeniem długości życia, aż do osiągnięcia optimum, po tym momencie długowieczność maleje wraz z dalszym zmniejszaniem ilości żywności6,7,9. Drugim kontekstem, w którym DR badano u C. elegans, jest deprywacja żywieniowa, w której długowieczność robaków zwiększa się poprzez całkowite usunięcie wszelkich bakteryjnych źródeł pożywienia10,11. W Entchev et al. (2015)12 wykazaliśmy, że złożoność DR wynikająca z tych dwóch różnych paradygmatów może być badana jednocześnie w kontekście, który nazywamy "DR o szerokim zakresie". Korzystając z opisanego poniżej protokołu, zidentyfikowaliśmy nową klasę genów zaangażowanych w DR, które dwukierunkowo modulują reakcję długości życia na obfitość pożywienia i są zaangażowane w obwody neuronalne, które wykrywają food12 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).
Reakcja zwierzęcia na zmiany w środowisku integruje sekwencję procesów biologicznych, które łączą system sensoryczny ze złożonymi interakcjami regulacyjnymi, przekazując informacje środowiskowe do fizjologii. Chociaż mechanistyczne szczegóły takiego "przepływu informacji" są często nieznane, narzędzia genetyczne mogą być wykorzystane do uzyskania wglądu w to, jak te złożone obliczenia są zorganizowane między różnymi komponentami biologicznymi. W naszej ostatniej pracy wykazaliśmy, że daf-7 i tph-1 są zaangażowane w przekazywanie informacji środowiskowych o obfitości żywności przez obwód neuronowy wykrywający żywność, który moduluje długość życia u C. elegans12,13. Stosując matematyczne ramy teorii informacji14, byliśmy w stanie określić ilościowo ilość informacji środowiskowych, w kategoriach bitów, które są reprezentowane przez zmiany ekspresji genów w daf-7 i tph-1 w określonych neuronach na różnych poziomach pożywienia. Na tej podstawie byliśmy w stanie odkryć strategię kodowania stosowaną przez ten obwód neuronowy i sposób, w jaki jest on genetycznie kontrolowany (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).
W poniższym protokole opisujemy kroki wymagane do zrozumienia, jakie są efekty działania interesujących genów wyrażanych w określonych neuronach i jak uczestniczą one w przepływie informacji o jedzeniu od środowiska do długości życia. Ogólnie rzecz biorąc, nasza struktura jest podzielona na dwa protokoły eksperymentalne i obliczeniowy przepływ pracy. Jeśli chodzi o aspekty eksperymentalne, kluczowe znaczenie ma posiadanie mutantów genów będących przedmiotem zainteresowania, które można badać w ramach szerokiego zakresu DR. Wierne reportery transkrypcyjne są również niezbędne do ilościowego określenia poziomu ekspresji genów na różnych poziomach żywności. Aby móc przeprowadzić analizę obliczeniową omówioną w naszej metodzie, zestaw danych musi mieć wystarczający rozmiar, aby zapewnić miarodajne oszacowania rozkładów wyrażeń. Mimo że udostępniamy szablonowe kody źródłowe do analiz, użytkownik musi być zaznajomiony z językiem teorii informacji, który jest szeroko stosowany w naszych ramach obliczeniowych. Kody źródłowe są napisane w językach R i C++. Dlatego wymagany jest również pewien poziom biegłości w programowaniu, aby zastosować je w sensowny sposób.

<table><tbody><tr><td>Karbenicylina Sól disodowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1389-5G</td><td>Antybiotyk</td></tr><tr><td>Streptomycyna Sól siarczanowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501-50G</td><td>Antybiotyk</td></tr><tr><td>&nbsp; Izopropyl &beta;-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758-10G</td><td>Induktor do płytek RNAi</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71380-1KG-M</td><td>Stosowany w bazie S i agarze NGM</td></tr><tr><td>di-Wodorofosforan potasu (K2HPO 4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05104.1000</td><td>Stosowany w bazie S i agarze NGM</td></tr><tr><td>Di-wodorofosforan potasu (KH2PO4 )</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791-1KG</td> Stosowany w siarczanie magnezu <td>S basal i NGM agar</td></tr><tr><td>(MgSO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643-1KG</td><td>Stosowany w agarze</td></tr> <tr><td>NGMChlorek wapnia (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670-500G</td><td>Stosowany w agarze NGM</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71687-500G</td><td>Używany do wybielania</td></tr><tr><td>Pluronic-F127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443-1KG</td><td>Stosowany w obrazowaniu</td></tr><tr><td>Podchloryn sodu (NaClO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05614.2500</td><td>Służy do wybielania</td></tr><tr><td>LB Bulion</td><td>Invitrogen</td><td>12780052</td><td>Służy do hodowli bakterii</td></tr><tr><td>Adavanced TC 6 cm Płytki do kultur tkankowych</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628960</td><td>Płytki do</td></tr><tr><td>hodowli tkankowych CellStar 10cm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td>Płytki do obrazowania</td></tr><tr><td>Końcówki P200 o niskiej retencji</td><td>Brandt</td><td>732832</td><td>Wskazówki dotyczące obchodzenia się z robakami w płynie</td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD</td><td>214510</td><td>Agar do płytek NGM, RNAi i NSC</td></tr><tr><td>Bactoo-pepton</td><td>BD</td><td>211820</td><td>Pepton do płytek NGM, RNAi i NSC</td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja informacji kodowanych przez poziomy ekspresji genów podczas modulacji długości życia w warunkach szerokiego zakresu ograniczeń dietetycznych u c. elegans

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Systemy sensoryczne pozwalają zwierzętom wykrywać, przetwarzać i reagować na swoje otoczenie. Obfitość pożywienia jest wskazówką środowiskową, która ma głęboki wpływ na fizjologię i zachowanie zwierząt. Niedawno wykazaliśmy, że modulacja długowieczności nicieni Caenorhabditis elegans przez obfitość pożywienia jest bardziej złożona niż wcześniej sądzono. Reakcja długości życia na zmiany poziomu pożywienia jest determinowana przez określone geny, które działają poprzez kontrolowanie przetwarzania informacji w obwodzie neuronalnym. Nasze ramy łączą w sobie analizę genetyczną, wysokoprzepustowe obrazowanie ilościowe i teorię informacji. Tutaj opisujemy, w jaki sposób techniki te można wykorzystać do scharakteryzowania dowolnego genu, który ma fizjologiczne znaczenie dla szerokiego zakresu ograniczeń dietetycznych. W szczególności ten przepływ pracy ma na celu ujawnienie, w jaki sposób interesujący nas gen reguluje długość życia w warunkach szeroko zakrojonych ograniczeń dietetycznych; następnie ustalenie, w jaki sposób ekspresja genu zmienia się w zależności od poziomu pokarmu; i wreszcie, aby zapewnić bezstronną kwantyfikację ilości informacji przekazywanych przez ekspresję genów na temat obfitości pożywienia w środowisku. Kiedy kilka genów jest badanych jednocześnie w kontekście obwodu neuronalnego, ten przepływ pracy może odkryć strategię kodowania stosowaną przez obwód.

Przeprowadzając eksperymenty nad długością życia mutantów badanych genów równolegle ze szczepem dzikiego typu N2, można ustalić, czy geny te odgrywają rolę w odpowiedzi pokarmowej na szerokozakresową DR. Odpowiedź typu dzikiego powinna być porównywalna z tą przedstawioną na Rysunku 1A. Jakakolwiek modulacja tej odpowiedzi przez mutanty, objawiająca się niejednolitym efektem w różnych warunkach pokarmowych, wskazuje, że geny te wpływają na zdolność nicienia do prawidłowej odpowiedzi na zmiany w dostępności pokarmu, co uzasadnia dalsze badanie odpowiedzi ekspresyjnych tych genów na szerokozakresową DR. Jeśli jednak odpowiedź mutantów w zakresie długości życia nie różni się znacząco od typu dzikiego, oznacza to, że geny te nie biorą udziału w przekazywaniu efektów szerokozakresowej DR, przynajmniej na poziomie średniej długości życia. Jeśli mutacje powodują jednolity przesunięcie całej odpowiedzi długości życia, geny te wywierają niezależny od pokarmu wpływ na długowieczność. Nie wyklucza to możliwości, że ekspresja badanych genów jest zależna od pokarmu, w takim przypadku informacje niesione przez te geny nie są przekazywane na długość życia.
Kolejnym etapem protokołu jest określenie, w jaki sposób zmieniają się poziomy ekspresji genów zainteresowania pod wpływem szerokiego zakresu DR. Na Rysunku 1B ilustrujemy to na przykładzie poziomów ekspresji reportera transkrypcyjnego daf-7, który wykazuje odpowiedź na zmiany poziomu pożywienia w neuronach sensorycznych ASI. U mutanta daf-7(-) odpowiedź ekspresyjna reportera transkrypcyjnego jest zmieniona. Jeśli geny zainteresowania są rzeczywiście reaktywne na pożywienie na poziomie długości życia, można oczekiwać, że ich ekspresja również będzie zmieniać się wraz z dostępnością pokarmu. Odpowiednio, reporter transkrypcyjny w tle mutantowym powinien wykazywać zmieniony profil ekspresji w odpowiedzi na szeroki zakres DR. Jest jednak możliwe, że reporter transkrypcyjny genu zainteresowania w tle typu dzikiego nie wykazuje żadnych zmian w ekspresji zależnych od pożywienia. W takiej sytuacji może to wskazywać na efekt regulacji potranskrypcyjnej, który wykracza poza zakres niniejszego protokołu.
W pracy Diana et al. (2017)13 wyekstrahowaliśmy wartości ekspresji daf-7 w neuronach ASI oraz tph-1 w ADF i NSM. Na Rycini 2A przedstawiamy oszacowanie rozkładu ekspresji w ASI i ADF dla określonego poziomu dostępności pożywienia. Posiadanie wielu odczytów z obrazów pojedynczych nicieni pozwala nam analizować nie tylko ilość informacji kodowanych niezależnie przez każdy neuron, ale także informacje kombinatoryczne całego obwodu neuronalnego (Rycina 2B-2C). Połączenie tych dwóch miar teorii informacji pozwala nam scharakteryzować system pod kątem strategii kodowania stosowanej przez neurony w celu przekazywania informacji o pożywieniu. Ilość redundancji w obwodzie można uzyskać, sumując wzajemną informację dla każdego neuronu i odejmując od niej wspólną informację wzajemną (pojemność kanału) otrzymaną po uwzględnieniu kombinatorycznych odczytów obwodu. Dodatnia wartość takiej różnicy wskazuje na redundantny charakter strategii kodowania, ponieważ skumulowana informacja między częściami jest większa niż rzeczywista informacja zakodowana przez cały obwód. I odwrotnie, wartość ujemna odzwierciedla strategię synergistyczną, ponieważ faktycznie zakodowana informacja jest większa niż suma jej komponentów (Rycina 2B). Informację i redundancję można porównywać pomiędzy różnymi genotypami, aby zbadać możliwe wyższe role regulacji genów; na przykład w pracy Diana et al. (2017)13 efekt mutacji daf-7 zmienia strategię kodowania z redundantnej na synergistyczną (Rycina 2C-2D).
<img alt="Wykres długości życia i ekspresji ASI w zależności od poziomu dostępności pokarmu; porównanie typu dzikiego i mutantów daf-7." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56292/56292fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1Reakcja długości życia i ekspresji genów w warunkach szerokiego zakresu ograniczenia kalorycznego (DR). (A) Średnia długość życia szczepu typu dzikiego N2 (linia czarna) wykazuje złożoną odpowiedź na szerokozakresową DR. Amplituda tej odpowiedzi jest osłabiona u mutanta null genu daf-7 gen (czerwona linia). Słupki błędów przedstawiają błąd standardowy średniej, dane zbiorcze z Entchev i wsp. (2015)12. (B) średnie poziomy ekspresji reportera transkrypcyjnego dla daf-7 gen w tle typu dzikiego (czarna linia) wykazuje również złożoną, niemonotoniczną odpowiedź na szerokozakresową ograniczoną dietę (DR). W daf-7(-) tło genetyczne ekspresja tego reportera transkrypcyjnego jest silnie osłabiona i wykazuje niewielką odpowiedź na zmiany poziomu pożywienia. Słupki błędów reprezentują standardowy błąd średniej, dane z pojedynczej próby w Entchev i in. (2015)12. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56292/56292fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza integracji informacji multimodalnych, wykresy uwypuklające redundancję i synergię w danych neuronalnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56292/56292fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2: Metodologia obliczeniowa. (A) Ilustracja dwuwymiarowej estymacji gęstości tph-1 ekspresja w ADF i daf-7 ekspresja w ASI uzyskana z pakietu R „ks” przy użyciu siatki o wymiarach 30 x 30. (B) Wizualizacja informacji zakodowanej przez wspólną ekspresję tph-1 i daf-7 (łącznie) oraz indywidualnie (suma części) dla neuronów ADF, ASI i NSM. Redundancyjne i synergiczne cechy kodowania są reprezentowane przez różnicę między wysokością skumulowanych słupków po prawej stronie a informacją zakodowaną przez cały obwód. (C) Porównanie informacji o żywności kodowanych przez zwierzęta typu dzikiego oraz daf-7(-) mutanty. (D) Obserwowany u mutantów spadek informacji wzajemnej towarzyszy przejściu w stronę kodowania synergicznego. Panele B-D zostały opracowane na podstawie danych Diany i inni (2017)13. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56292/56292fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stężenie bakterii (komórek/ml)</td>
			<td>Gęstość optyczna (60 nm)</td>
			<td>Współczynnik rozcieńczenia (z poprzedniego etapu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,12E+10</td>
			<td>56.000</td>
			<td>0.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,0E+09</td>
			<td>10.000</td>
			<td>5.60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6,32E+08</td>
			<td>3.160</td>
			<td>3.16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6,32E+07</td>
			<td>0.316</td>
			<td>10.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,0E+07</td>
			<td>0.100</td>
			<td>3.16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0 (S podstawowe)</td>
			<td>0.000</td>
			<td>Brak danych</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Poziomy zasilania i czynniki rozcieńczenia stosowane w szerokozakresowym DR.Stężenia bakterii (komórek/mL) zastosowane w protokole szerokozakresowego DR, wraz z odpowiadającymi im pomiarami OD60 oraz czynnikiem rozcieńczenia wymaganym do uzyskania każdego stężenia z poprzedniego.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="7">Doświadczalna temperatura długości życia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dzień</td>
			<td>12.5°C</td>
			<td>15°C</td>
			<td>17.5°C</td>
			<td>20°C</td>
			<td>22.5°C</td>
			<td>25°C</td>
			<td>27.5°C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-12</td>
			<td colspan="7">Przenieś wszystkie szczepy na świeże płytki NGM i utrzymuj w temperaturze 20°C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-11</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-10</td>
			<td colspan="7">Przygotować pokolenie P0 szczepów daf-7(-) i utrzymywać w temperaturze 20°C (1 L4 na płytkę, 5 płytek)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-9</td>
			<td colspan="7">Przygotować generację P0 szczepów typu dzikiego i utrzymywać w 20°C (1 L4 na płytkę, 5 płytek)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-5</td>
			<td colspan="7">Przygotowanie pokolenia F1 szczepów daf-7(-) i ich utrzymywanie w 20°C (1 L4 na płytkę, 90 płytek)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-4</td>
			<td colspan="7">Przygotować pokolenie F1 szczepów typu dzikiego i utrzymywać w 20°C (1 L4 na płytkę, 30 płytek)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td colspan="7">Wyselekcjonuj larwy L4 z pokolenia F2 w celu &gt;płytki RNAi egg-5 i przechowywać w 20°C (15 L4 na płytkę, 24 płytki)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td colspan="7">Przenieść jednodniowe osobniki dorosłe na płytki z NSC zasiane w zagęszczeniu 2,0E+9 komórek/ml poziomu pożywki i utrzymywać w 20°C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td colspan="7">Przenieś 2-dniowe osobniki dorosłe na płytki NSC wysiane z pożywkami dla grup eksperymentalnych i do odpowiedniej temperatury eksperymentalnej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>Transfer</td>
			<td>Transfer</td>
			<td>Transfer</td>
			<td>Transfer</td>
			<td>Transfer</td>
			<td>Transfer</td>
			<td>Transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>Transfer</td>
			<td>Transfer</td>
			<td>Transfer</td>
			<td>Transfer</td>
			<td>Przeniesienie</td>
			<td>Transfer</td>
			<td>Transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>Transfer</td>
			<td>Transfer</td>
			<td>Transfer</td>
			<td>Transfer</td>
			<td>Transfer</td>
			<td>Transfer</td>
			<td>Transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>Transfer</td>
			<td>Transfer</td>
			<td>Transfer</td>
			<td>Transfer</td>
			<td>Transfer</td>
			<td>Transfer</td>
			<td>Transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>Transfer</td>
			<td>Transfer</td>
			<td>Transfer</td>
			<td>Transfer</td>
			<td>Transfer</td>
			<td>Transfer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14</td>
			<td>Transfer</td>
			<td>Transfer</td>
			<td>Transfer</td>
			<td>Transfer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18</td>
			<td>Transfer</td>
			<td>Transfer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22</td>
			<td>Transfer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Harmonogram badania długości życia przeprowadzonego w różnych temperaturach.Schematyczny opis kroków niezbędnych do przygotowania szerokozakresowych eksperymentów dotyczących długości życia w warunkach ograniczenia kalorycznego (DR) w różnych temperaturach, na przykładzie szczepów daf-7(-) oraz typu dzikiego. Liczba przeniesień na świeże szalki dla każdego poziomu pożywienia w eksperymencie zmniejsza się wraz ze wzrostem temperatury. Wynika to z faktu, że zwierzęta w wyższych temperaturach starzeją się szybciej i są zatem bardziej podatne na uszkodzenia fizyczne podczas każdego przeniesienia.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dni</td>
			<td>Potok obrazowania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-14</td>
			<td>Szczepy reporterowe Chunk w tle daf(-). Przechowywać w 20 °C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-13</td>
			<td>Szczepy raportujące Chunk w tle typu dzikiego. Przechowywać w 20 °C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-12</td>
			<td>Przygotuj pokolenie P0 szczepów reporterowych daf-7(-). Wykorzystaj 3 larwy w stadium L4 na każdą 10-centymetrową płytkę NGM. Użyj 2 płytek i utrzymuj w temperaturze 20 °C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-10</td>
			<td>Przygotuj pokolenie P0 szczepów reporterowych typu dzikiego. Na każdą płytkę NGM o średnicy 10 cm nanieś 3 larwy w stadium L4. Wykorzystaj 2 płytki i utrzymuj w 20 °C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-8</td>
			<td>Przygotowanie pokolenia F1 szczepów reporterowych daf-7(-). Należy wykorzystać 3 larwy w stadium L4 na każdą płytkę NGM o średnicy 10 cm. Należy użyć 12 płytek i inkubować w temperaturze 20 °C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-6</td>
			<td>Przygotuj pokolenie F1 szczepów reporterowych typu dzikiego. Wykorzystaj po 3 larwy w stadium L4 na każdą płytkę NGM o średnicy 10 cm. Użyj 4 płytek i utrzymuj w temperaturze 20 °C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-3</td>
			<td>Oczyszczaj od bielizny szczepy reporterowe daf-7(-) w godzinach popołudniowych (ok. godz. 17:0), przenoś jaja na 3 płytki NGM o średnicy 10 cm i utrzymuj w 20 °C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-2</td>
			<td>Wybielić szczepy reporterowe typu dzikiego rano (ok. godz. 10:0), złożyć jaja na 3 płytkach NGM o średnicy 10 cm i przechowywać w 20 °C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>Przenieś L4 na płyty z pożywką RNAi dla egg-5 o rozmiarze 10 cm. Użyj 3 płyt na szczep i utrzymuj w 20 °C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>Przemyć 1-dobowe osobniki dorosłe na płytki z NSC zasiane w zagęszczeniu 2,0E+9 komórek/ml. Należy użyć 3 płytek na szczep i przechowywać w 20 °C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>Wymyć 2-dniowe dorosłe osobniki i przenieść je na płytki NSC z zasianymi eksperymentalnymi poziomami pokarmu. Należy użyć 3 płytek na szczep i zmienić temperaturę na eksperymentalną.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>Przenieść na świeże płytki z NSC. Użyć 3 płytek na szczep i inkubować w temperaturze eksperymentalnej.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>Przenieść na świeże płytki NSC. Użyć 3 płytek na szczep i inkubować w temperaturze eksperymentalnej.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>Zebrać zwierzęta z płytek i przygotować je do obrazowania.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Harmonogram potoku obrazowania. Schematyczny zarys kroków niezbędnych do przygotowania eksperymentów obrazowania DR w szerokim zakresie z wykorzystaniem szczepów fluorescencyjnych reporterów transkrypcyjnych w tle daf-7(-) i typu dzikiego w różnych temperaturach jako przykładach.

Tutaj prezentujemy ramy do powiązania szeroko pojętych ograniczeń dietetycznych z ekspresją genów i długością życia. Opisujemy protokoły dotyczące szeroko zakrojonych ograniczeń dietetycznych i ilościowego obrazowania ekspresji genów w ramach tego paradygmatu. Następnie przedstawiamy analizy obliczeniowe, aby ujawnić podstawowe cechy przetwarzania informacji w obwodach genetycznych zaangażowanych w wykrywanie żywności.

Kwantyfikacja informacji kodowanych przez poziomy ekspresji genów podczas modulacji długości życia w warunkach szerokiego zakresu ograniczeń dietetycznych u C. elegans

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

Ogólnym celem tych ram jest identyfikacja genów zaangażowanych w szeroki zakres ograniczeń dietetycznych, ilościowe określenie informacji środowiskowych zakodowanych przez ich poziomy ekspresji oraz zrozumienie podstawowej strategii kodowania, która łączy środowisko z długością życia. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii starzenia się, takie jak to, które geny przekazują informacje ze środowiska, aby modulować długość życia. Chociaż ramy te mogą zapewnić wgląd w system sensoryczny C Elegan, mogą być również stosowane bardziej ogólnie do każdego systemu biologicznego, którego elementy współpracują ze sobą, w celu przetwarzania informacji o środowisku.Główną zaletą tej techniki jest to, że określa ona ilościowo informacje środowiskowe zakodowane przez grupy neuronów i określa strategię kodowania stosowaną przez neuroselquites do przekazywania tych informacji do dalszych celów. Po wyhodowaniu OP50 na płytkach MGM zgodnie z protokołem tekstowym, należy przygotować 500 mililitrów pożywki LB w każdej z dwulitrowych kolb Erlenmeyera i sterylizować je w autoklawie. Zaszczep każdą kolbę pojedynczą kolonią OP50 i hoduj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obr./min przez około 14 godzin.Następnie uzupełnij kultury 50 mikrogramami na mililitr streptomycyny. Następnie potrząsaj kolbami przez dodatkowe 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie umieść kolby na lodzie na 15 minut. Przenieś 450 mililitrów każdej kultury do oddzielnych 500-mililitrowych sterylnych butelek wirówek, zachowaj pozostałą kulturę na lodzie, ponieważ zostanie ona wykorzystana do określenia stężenia bakterii.Wiruj butelki w temperaturze 4500 x G i czterech stopniach Celsjusza przez 25 minut, a następnie wyrzuć supernatant i przechowuj butelki na lodzie. Za pomocą 900 mikrolitrów sterylnego LB rozcieńczyć 100 mikrolitrów resztek kultury z każdej kolby. Użyj jednego mililitra sterylnego LB, aby wyzerować spektrofotometr, a następnie oznacz OD600 w 10-krotnym rozcieńczeniu każdej kultury.Jeśli na przykład OD600 10-krotnego rozcieńczenia kultury nocnej wynosi 0,28, to kultura miała rzeczywisty OD600 równy 2,8. Z tego przykładu, aby uzyskać działający roztwór podstawowy 1,12 x 10 do 10. komórek OP50 na mililitr, co równa się OD600 wynoszącemu 56, ponownie zawiesić osad z hodowli 450 mililitrów w jednej 20 pierwotnej objętości lub 22,5 mililitra sterylnego roztworu podstawowego S lub SB, uzupełnionego 50 mikrogramami na mililitr streptomycyny. Wszystkie kolejne stężenia stosowane w doświadczeniach w SB i paciorkowcach należy ustalić z seryjnych rozcieńczeń materiału roboczego, stosując współczynniki rozcieńczenia wymienione w niniejszej tabeli.Po wyhodowaniu i zsynchronizowaniu szczepów reporterowych C Elegans zgodnie z protokołem tekstowym, użyj 15 mililitrów SB do seryjnego zmycia robaków z trzech płytek i zbierz płyn w sterylnej probówce o pojemności 15 mililitrów. Pozwól larwom L4 naturalnie się osadzać, a następnie odessaj wszystko, z wyjątkiem około 0,5 mililitra płynu. W dzikich szczepach reporterowych ten typ usuwa wszelkie larwy młodsze niż L4.In zmutowanym tle, ten krok pomaga w usunięciu wszelkich zatrzymanych larw, takich jak nasze, w przypadku śmierci OK3125.Następnie użyj dziewięciu mililitrów SB, aby ponownie zawiesić robaki. Ponownie monitoruj szybkość sedymentacji larw L4, a następnie odessaj wszystko, z wyjątkiem około 0,5 mililitra supernatantu, gdy większość larw L4 zostanie pokryta granulkami przed powtórzeniem procesu. Dodać 10 mikrolitrów sterylnego podłoża podstawowego S, uzupełnionego 0,1% pluronem F127 do płynu zawierającego larwy L4.Działa on jak środek powierzchniowo czynny i zapobiega przywieraniu larw do wewnętrznej powierzchni plastikowych końcówek pipet. Używając końcówki pipety P200 o niskiej retencji, delikatnie ponownie zawiesić larwy, a następnie podawać 150 mikrolitrów na trzech 10-centymetrowych płytkach RNAi, które są wysiewane 5 x 225 mikrolitrami jaj pięciu bakterii RNAi. Upewnij się, że robaki są równomiernie rozmieszczone na wszystkich pięciu trawnikach bakteryjnych.Gdy płyn wchłonie się do agaru, usuń wszelkie larwy inne niż L4 z płytek, które nie zostały wyeliminowane przez procedurę mycia, ręcznie je zrywając. Następnie przechowuj płytki w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Aby zainicjować DR o szerokim zakresie, należy usunąć wszystkie młode larwy, które uniknęły wcześniejszego etapu ręcznego usuwania, pozostawiając na płytkach tylko jednodniowe dorosłe osobniki.Dla każdego szczepu użyj 15 mililitrów sterylnego paciorkowca SB, aby umyć jednodniowych dorosłych z trzech płytek, do 15-mililitrowej probówki. Pozwól robakom naturalnie się osadzić, a następnie odessaj wszystko oprócz 0,5 mililitra supernatantu. Ponownie zawiesić robaki za pomocą 9,5 mililitra paciorkowca SB i powtórzyć etapy sedymentacji i mycia.Po ostatecznym przepłukaniu i zaaspiracji wszystkich oprócz 0,5 mililitra supernatantu, dodaj 10 mikrolitrów SB Plu i użyj końcówki pipety P200, aby delikatnie ponownie zawiesić larwy. Porcję 100 mikrolitrów larw na płytkę NSC, wysianą 5 x 225 mikrolitrami bakterii, w stężeniu 2 x 10 do dziewiątych komórek na mililitr. Rozprowadź 100 mikrolitrów równomiernie na wszystkich pięciu trawnikach bakteryjnych.Pod mikroskopem oszacuj liczbę zwierząt obecnych na talerzu, dążąc do uzyskania od 100 do 150 robaków na płytkę. Określić objętość cieczy potrzebną do osiągnięcia gęstości ślimaków w tym zakresie, a następnie podzielić ją na dwie dodatkowe płytki. Dostosuj liczbę robaków na pierwszej płycie, aby również mieściła się w tym zakresie.A następnie przechowuj płytki w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnego dnia zbierz dwudniowe dorosłe osobniki i rozłóż robaki na nowe płytki NSC obsiane chęcią eksperymentalnego zagęszczenia pokarmu. Gdy płyn zostanie wchłonięty przez agar, przesuń płytki do żądanej temperatury eksperymentalnej na 24 godziny.Następnego dnia zbierz trzydniowe dorosłe osobniki i rozłóż je na świeżych talerzach NSC, obsianych tym samym eksperymentalnym stężeniem pokarmu. Gdy płyn zostanie wchłonięty przez agar, przywróć płytki do temperatury eksperymentalnej na 48 godzin. Na koniec użyj urządzenia mikroprzepływowego, aby zobrazować zwierzęta przed zebraniem i ilościowym określeniem danych zgodnie z protokołem tekstowym.Jak pokazano tutaj, średnia długość życia dzikiego szczepu n2 wykazuje złożoną odpowiedź na DR w szerokim zakresie. Wielkość tej odpowiedzi jest osłabiona w całkowicie zmutowanym genie daf-7, co sugeruje, że gen ten wpływa na zdolność robaka do prawidłowego reagowania na zmiany w obfitości pokarmu. Średnie poziomy ekspresji reportera transkrypcyjnego dla genu daf-7 i tła typu dzikiego wykazują również złożoną niemonotoniczną odpowiedź na szeroki zakres DR.In daf-7 (tło genetyczne, ekspresja tego reportera transkrypcyjnego jest wysoce osłabiona i wykazuje niewielką reakcję na zmiany poziomu pokarmu. Rysunek ten ilustruje oszacowanie wspólnego rozkładu ekspresji TPH1 w neuronach ADF i ekspresji daf-7 w neuronach ASI dla danego poziomu pokarmu.Te wykresy słupkowe przedstawiają informacje o żywności zakodowane, kombinatorycznie lub indywidualnie, przez neurony ADF, ASI i NSM, w oparciu o poziomy ekspresji genów TPH1 i daf-7. Nadmiarowość i synergiczne cechy kodowania, wynikają z porównania informacji kombinatorycznej i indywidualnej kodowanej przez neurony, reprezentowanej przez różnicę wysokości ułożonych słupków po prawej stronie i informacji zakodowanej przez pełny obwód. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że replikacja teorii informacji w celu ilościowego określenia strategii kodowania wymaga dokładnego oszacowania rozkładu ekspresji genów.Z tego powodu wielkość próby jest kluczowym czynnikiem dla ogólnego stosowania tych ram. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać szeroki zakres eksperymentów z ograniczeniami dietetycznymi, aby zidentyfikować i scharakteryzować nowe geny, które łączą obfitość żywności z długością życia.

quantification-information-encoded-gene-expression-levels-during

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

W niniejszym artykule przedstawiamy ogólny protokół pomiaru długości życia nicieni utrzymywanych na pożywkach stałych z bakteriami zneutralizowanymi za pomocą promieniowania UV.

Pomiar długości życia Caenorhabditis elegans na podłożach stałych

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół przeprowadzania restrykcji dietetycznej na sztywnym podłożu u C. elegans z wykorzystaniem zabitych bakterii.

Ograniczenie kaloryczne na stałym podłożu u Caenorhabditis elegans

W tym artykule demonstrujemy obrazowanie na żywo poszczególnych robaków za pomocą niestandardowego urządzenia mikroprzepływowego. W urządzeniu wiele robaków jest indywidualnie zamkniętych w oddzielnych komorach, co pozwala na wielokrotny nadzór podłużny nad różnymi procesami biologicznymi.

Platforma mikroprzepływowa do obrazowania podłużnego u Caenorhabditis elegans

Tutaj opisujemy metodę Replica Set, podejście do ilościowego pomiaru długości życia/przeżycia i zdrowia C. elegans w sposób wysoce wydajny i solidny, umożliwiając w ten sposób badanie wielu schorzeń bez poświęcania jakości danych. Protokół ten szczegółowo opisuje strategię i udostępnia narzędzie programowe do analizy danych zestawu replik.

Metoda zestawu replik: wysokoprzepustowe podejście do ilościowego pomiaru długości życia Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy protokół izolacji RNA, DNA i białka z tej samej próbki, w celu zmniejszenia zmienności, poprawy odtwarzalności i ułatwienia interpretacji.

Połączone ekstrakcje nukleotydów i białek w Caenorhabditis elegans

Spadek proteostazy jest cechą charakterystyczną starzenia się, ułatwiając wystąpienie chorób neurodegeneracyjnych. Przedstawiamy protokół do ilościowego pomiaru proteostazy w dwóch różnych tkankach Caenorhabditis elegans poprzez heterologiczną ekspresję powtórzeń poliglutaminy połączonych z fluorescencyjnym reporterem. Model ten umożliwia szybką analizę genetyczną proteostazy in vivo.

Kwantyfikacja swoistego dla tkanki spadku proteostazy u Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans służy jako doskonały system modelowy z solidnymi i tanimi metodami badania zdrowia, długości życia i odporności na stres.

Badanie tanich metod pomiaru długości życia i długości zdrowia u Caenorhabditis elegans

Obecny protokół opisuje metody suplementacji lipidów w kulturach płynnych i na płytkach dla Caenorhabditis elegans, w połączeniu z badaniami podłużnymi i analizą transkrypcji genów z dużej ilości lub kilku robaków i tkanek robaków.

Suplementacja lipidów w celu długowieczności i analizy transkrypcji genów w Caenorhabditis elegans

Prezentowany tutaj jest zoptymalizowany protokół hodowli izolowanych pojedynczych nicieni na stałych podłożach w mikrofabrykowanych urządzeniach wielodołkowych. Takie podejście pozwala na monitorowanie poszczególnych zwierząt przez całe życie pod kątem różnych fenotypów związanych ze starzeniem się i zdrowiem, w tym aktywności, wielkości i kształtu ciała, geometrii ruchu i przeżycia.

Długotrwała hodowla i monitorowanie izolowanych Caenorhabditis elegans na pożywkach stałych w urządzeniach wielodołkowych

W protokole tym opisano test do ilościowego określenia szybkości karmienia Caenorhabditis elegans w oparciu o pomiar klirensu bakterii w płynnej kulturze.

Kwantyfikacja spożycia pokarmu w Caenorhabditis elegans poprzez pomiar klirensu bakteryjnego

Odkryj metody obliczeniowe do kwantyfikacji informacji kodowanej przez poziomy ekspresji genów podczas modulacji długości życia u C. elegans. Technika ta pozwala zrozumieć strategię kodowania sygnałów środowiskowych.

Kwantyfikacja informacji kodowanych przez poziomy ekspresji genów podczas modulacji długości życia w warunkach szerokiego zakresu ograniczeń dietetycznych u C. elegans (Wideo) | JoVE Journal

Kwantyfikacja informacji kodowanych przez poziomy ekspresji genów podczas modulacji długości życia w warunkach szerokiego zakresu ograniczeń dietetycznych u C. elegans

Przeglądaj więcej filmów