Kwantyfikacja informacji kodowanych przez poziomy ekspresji genów podczas modulacji długości życia w warunkach szerokiego zakresu ograniczeń dietetycznych u C. elegans
August 16th, 2017
Tutaj prezentujemy ramy do powiązania szeroko pojętych ograniczeń dietetycznych z ekspresją genów i długością życia. Opisujemy protokoły dotyczące szeroko zakrojonych ograniczeń dietetycznych i ilościowego obrazowania ekspresji genów w ramach tego paradygmatu. Następnie przedstawiamy analizy obliczeniowe, aby ujawnić podstawowe cechy przetwarzania informacji w obwodach genetycznych zaangażowanych w wykrywanie żywności.
Ogólnym celem tych ram jest identyfikacja genów zaangażowanych w szeroki zakres ograniczeń dietetycznych, ilościowe określenie informacji środowiskowych zakodowanych przez ich poziomy ekspresji oraz zrozumienie podstawowej strategii kodowania, która łączy środowisko z długością życia. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii starzenia się, takie jak to, które geny przekazują informacje ze środowiska, aby modulować długość życia. Chociaż ramy te mogą zapewnić wgląd w system sensoryczny C Elegan, mogą być również stosowane bardziej ogólnie do każdego systemu biologicznego, którego elementy współpracują ze sobą, w celu przetwarzania informacji o środowisku.
Główną zaletą tej techniki jest to, że określa ona ilościowo informacje środowiskowe zakodowane przez grupy neuronów i określa strategię kodowania stosowaną przez neuroselquites do przekazywania tych informacji do dalszych celów. Po wyhodowaniu OP50 na płytkach MGM zgodnie z protokołem tekstowym, należy przygotować 500 mililitrów pożywki LB w każdej z dwulitrowych kolb Erlenmeyera i sterylizować je w autoklawie. Zaszczep każdą kolbę pojedynczą kolonią OP50 i hoduj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obr./min przez około 14 godzin.
Następnie uzupełnij kultury 50 mikrogramami na mililitr streptomycyny. Następnie potrząsaj kolbami przez dodatkowe 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie umieść kolby na lodzie na 15 minut. Przenieś 450 mililitrów każdej kultury do oddzielnych 500-mililitrowych sterylnych butelek wirówek, zachowaj pozostałą kulturę na lodzie, ponieważ zostanie ona wykorzystana do określenia stężenia bakterii.
Wiruj butelki w temperaturze 4500 x G i czterech stopniach Celsjusza przez 25 minut, a następnie wyrzuć supernatant i przechowuj butelki na lodzie. Za pomocą 900 mikrolitrów sterylnego LB rozcieńczyć 100 mikrolitrów resztek kultury z każdej kolby. Użyj jednego mililitra sterylnego LB, aby wyzerować spektrofotometr, a następnie oznacz OD600 w 10-krotnym rozcieńczeniu każdej kultury.
Jeśli na przykład OD600 10-krotnego rozcieńczenia kultury nocnej wynosi 0,28, to kultura miała rzeczywisty OD600 równy 2,8. Z tego przykładu, aby uzyskać działający roztwór podstawowy 1,12 x 10 do 10. komórek OP50 na mililitr, co równa się OD600 wynoszącemu 56, ponownie zawiesić osad z hodowli 450 mililitrów w jednej 20 pierwotnej objętości lub 22,5 mililitra sterylnego roztworu podstawowego S lub SB, uzupełnionego 50 mikrogramami na mililitr streptomycyny. Wszystkie kolejne stężenia stosowane w doświadczeniach w SB i paciorkowcach należy ustalić z seryjnych rozcieńczeń materiału roboczego, stosując współczynniki rozcieńczenia wymienione w niniejszej tabeli.
Po wyhodowaniu i zsynchronizowaniu szczepów reporterowych C Elegans zgodnie z protokołem tekstowym, użyj 15 mililitrów SB do seryjnego zmycia robaków z trzech płytek i zbierz płyn w sterylnej probówce o pojemności 15 mililitrów. Pozwól larwom L4 naturalnie się osadzać, a następnie odessaj wszystko, z wyjątkiem około 0,5 mililitra płynu. W dzikich szczepach reporterowych ten typ usuwa wszelkie larwy młodsze niż L4.In zmutowanym tle, ten krok pomaga w usunięciu wszelkich zatrzymanych larw, takich jak nasze, w przypadku śmierci OK3125.
Następnie użyj dziewięciu mililitrów SB, aby ponownie zawiesić robaki. Ponownie monitoruj szybkość sedymentacji larw L4, a następnie odessaj wszystko, z wyjątkiem około 0,5 mililitra supernatantu, gdy większość larw L4 zostanie pokryta granulkami przed powtórzeniem procesu. Dodać 10 mikrolitrów sterylnego podłoża podstawowego S, uzupełnionego 0,1% pluronem F127 do płynu zawierającego larwy L4.
Działa on jak środek powierzchniowo czynny i zapobiega przywieraniu larw do wewnętrznej powierzchni plastikowych końcówek pipet. Używając końcówki pipety P200 o niskiej retencji, delikatnie ponownie zawiesić larwy, a następnie podawać 150 mikrolitrów na trzech 10-centymetrowych płytkach RNAi, które są wysiewane 5 x 225 mikrolitrami jaj pięciu bakterii RNAi. Upewnij się, że robaki są równomiernie rozmieszczone na wszystkich pięciu trawnikach bakteryjnych.
Gdy płyn wchłonie się do agaru, usuń wszelkie larwy inne niż L4 z płytek, które nie zostały wyeliminowane przez procedurę mycia, ręcznie je zrywając. Następnie przechowuj płytki w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Aby zainicjować DR o szerokim zakresie, należy usunąć wszystkie młode larwy, które uniknęły wcześniejszego etapu ręcznego usuwania, pozostawiając na płytkach tylko jednodniowe dorosłe osobniki.
Dla każdego szczepu użyj 15 mililitrów sterylnego paciorkowca SB, aby umyć jednodniowych dorosłych z trzech płytek, do 15-mililitrowej probówki. Pozwól robakom naturalnie się osadzić, a następnie odessaj wszystko oprócz 0,5 mililitra supernatantu. Ponownie zawiesić robaki za pomocą 9,5 mililitra paciorkowca SB i powtórzyć etapy sedymentacji i mycia.
Po ostatecznym przepłukaniu i zaaspiracji wszystkich oprócz 0,5 mililitra supernatantu, dodaj 10 mikrolitrów SB Plu i użyj końcówki pipety P200, aby delikatnie ponownie zawiesić larwy. Porcję 100 mikrolitrów larw na płytkę NSC, wysianą 5 x 225 mikrolitrami bakterii, w stężeniu 2 x 10 do dziewiątych komórek na mililitr. Rozprowadź 100 mikrolitrów równomiernie na wszystkich pięciu trawnikach bakteryjnych.
Pod mikroskopem oszacuj liczbę zwierząt obecnych na talerzu, dążąc do uzyskania od 100 do 150 robaków na płytkę. Określić objętość cieczy potrzebną do osiągnięcia gęstości ślimaków w tym zakresie, a następnie podzielić ją na dwie dodatkowe płytki. Dostosuj liczbę robaków na pierwszej płycie, aby również mieściła się w tym zakresie.
A następnie przechowuj płytki w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnego dnia zbierz dwudniowe dorosłe osobniki i rozłóż robaki na nowe płytki NSC obsiane chęcią eksperymentalnego zagęszczenia pokarmu. Gdy płyn zostanie wchłonięty przez agar, przesuń płytki do żądanej temperatury eksperymentalnej na 24 godziny.
Następnego dnia zbierz trzydniowe dorosłe osobniki i rozłóż je na świeżych talerzach NSC, obsianych tym samym eksperymentalnym stężeniem pokarmu. Gdy płyn zostanie wchłonięty przez agar, przywróć płytki do temperatury eksperymentalnej na 48 godzin. Na koniec użyj urządzenia mikroprzepływowego, aby zobrazować zwierzęta przed zebraniem i ilościowym określeniem danych zgodnie z protokołem tekstowym.
Jak pokazano tutaj, średnia długość życia dzikiego szczepu n2 wykazuje złożoną odpowiedź na DR w szerokim zakresie. Wielkość tej odpowiedzi jest osłabiona w całkowicie zmutowanym genie daf-7, co sugeruje, że gen ten wpływa na zdolność robaka do prawidłowego reagowania na zmiany w obfitości pokarmu. Średnie poziomy ekspresji reportera transkrypcyjnego dla genu daf-7 i tła typu dzikiego wykazują również złożoną niemonotoniczną odpowiedź na szeroki zakres DR.In daf-7 (tło genetyczne, ekspresja tego reportera transkrypcyjnego jest wysoce osłabiona i wykazuje niewielką reakcję na zmiany poziomu pokarmu. Rysunek ten ilustruje oszacowanie wspólnego rozkładu ekspresji TPH1 w neuronach ADF i ekspresji daf-7 w neuronach ASI dla danego poziomu pokarmu.
Te wykresy słupkowe przedstawiają informacje o żywności zakodowane, kombinatorycznie lub indywidualnie, przez neurony ADF, ASI i NSM, w oparciu o poziomy ekspresji genów TPH1 i daf-7. Nadmiarowość i synergiczne cechy kodowania, wynikają z porównania informacji kombinatorycznej i indywidualnej kodowanej przez neurony, reprezentowanej przez różnicę wysokości ułożonych słupków po prawej stronie i informacji zakodowanej przez pełny obwód. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że replikacja teorii informacji w celu ilościowego określenia strategii kodowania wymaga dokładnego oszacowania rozkładu ekspresji genów.
Z tego powodu wielkość próby jest kluczowym czynnikiem dla ogólnego stosowania tych ram. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać szeroki zakres eksperymentów z ograniczeniami dietetycznymi, aby zidentyfikować i scharakteryzować nowe geny, które łączą obfitość żywności z długością życia.
Przegląd
Niniejsza praca przedstawia ramy łączące szerokozasięgową restrykcję dietetyczną z ekspresją genów i długością życia. Opisuje protokoły restrykcji dietetycznej i ilościowego obrazowania ekspresji genów, wraz z analizami obliczeniowymi mającymi na celu zrozumienie obwodów genetycznych zaangażowanych w wykrywanie pokarmu.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neurobiologia starzenia się
- Analiza ekspresji genów
- Przetwarzanie informacji środowiskowych
Tło
- Zrozumienie związku między dietą a długością życia jest kluczowe w badaniach nad starzeniem się.
- Identyfikacja genów, które modulują długość życia w oparciu o sygnały środowiskowe, może dostarczyć wglądów w mechanizmy starzenia się.
- Model *C. elegans* jest skuteczny w badaniu systemów sensorycznych i obwodów genetycznych.
- Ilościowe określanie informacji środowiskowych zakodowanych przez ekspresję genów jest niezbędne do tego badania.
Cel badania
- Identyfikacja genów zaangażowanych w szerokozasięgową restrykcję dietetyczną.
- Ilościowe określenie informacji środowiskowych zakodowanych przez poziomy ekspresji genów.
- Zrozumienie strategii kodowania łączących czynniki środowiskowe z długością życia.
Wykorzystane metody
- Protokoły hodowli bakterii OP50 i *C. elegans*.
- Techniki ilościowego obrazowania do analizy ekspresji genów.
- Szeregi rozcieńczeń i metody sedymentacji do synchronizacji nicieni.
- Układy eksperymentalne do restrykcji dietetycznej i oceny długości życia.
Główne wyniki
- Identyfikacja kluczowych genów, które przekazują informacje środowiskowe związane z długością życia.
- Dane ilościowe dotyczące poziomów ekspresji genów w warunkach restrykcji dietetycznej.
- Wgląd we strategie kodowania obwodów neuronalnych w *C. elegans*.
- Demonstracja zastosowalności ramy do szerszych systemów biologicznych.
Wnioski
- Rama skutecznie łączy restrykcję dietetyczną z ekspresją genów i długością życia.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia starzenia się i interakcji środowiskowych.
- To podejście można dostosować do badania innych systemów biologicznych niż *C. elegans*.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This framework enables biopharma R&D to quantify how gene expression encodes environmental information relevant to lifespan modulation, supporting target validation in aging pathways. By linking sensory input to phenotypic output through information theory, it provides a mechanistic de-risking approach for identifying genes that modulate longevity under dietary restriction. The method supports predictive confidence in early discovery by revealing how genetic circuits process food availability signals to influence lifespan.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Identifies genes that convey environmental information to modulate lifespan, enabling therapeutic hypothesis interrogation in aging pathways.
- Operational Value: Uses quantitative imaging and genetic analysis to establish expression-food level relationships for target prioritization.
- Scientific Value: Reveals how genes like daf-7 process food abundance signals, supporting functional validation of neural circuit targets in longevity regulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Establishes standardized worm synchronization and imaging protocols for reproducible quantification of gene expression under dietary restriction.
- Operational Value: Provides serial dilution and sedimentation methods to generate calibrated bacterial food concentrations for scalable assay conditions.
- Scientific Value: Enables measurement of transcriptional reporters (e.g., TPH1, daf-7) in specific neurons to quantify food-encoded information in neural circuits.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links gene expression dynamics to lifespan outcomes, supporting biomarker alignment between environmental sensing and aging phenotypes.
- Operational Value: Uses microfluidic imaging and lifespan tracking to connect molecular readouts to phenotypic continuity across discovery and preclinical stages.
- Scientific Value: Uncovers coding strategies (redundant/synergistic) in neural circuits, informing mechanism-based risk assessment for target advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery by linking environmental input (food level) to molecular readouts (gene expression) and phenotypic output (lifespan), supporting progression from target identification to mechanistic validation in aging research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of how specific genes regulate lifespan in response to dietary restriction through quantitative expression-food level correlations.
- Screening: Enables assay readiness via synchronized L4 larvae preparation and controlled bacterial food concentrations for consistent gene expression measurement.
- Analytics: Quantifies information encoded by gene expression using joint distribution estimation and information theory to compare conditions and circuit contributions.
- Translational Research: Connects neural circuit activity to lifespan modulation, supporting biomarker continuity from environmental sensing to aging phenotypes.
- Enterprise Reuse: Framework is adaptable to any biological system where components process environmental information, enabling platform reuse across target validation efforts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by quantifying how much environmental information is encoded by gene expression levels.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized worm handling, bacterial culture, and imaging protocols across experimental conditions.
- Strategic Value: Reduces mechanistic ambiguity in aging targets by revealing whether genes act individually or combinatorially in neural circuits to modulate lifespan.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying genes with high information-encoding capacity for dietary restriction response.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans handling, quantitative fluorescence imaging, and genetic strain management.
- Depends on controlled bacterial culture (OP50), serial dilution infrastructure, and microfluidic imaging systems for data collection.
- Necessitates cross-team standardization of worm synchronization, food concentration preparation, and lifespan assay timing.
- Adaptation across model systems requires validation of homologous neural circuits and environmental sensing mechanisms.
- Sample size is critical for accurate information theory application, as reliable gene expression distribution estimation depends on sufficient biological replicates.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:54
Preparation of Bacterial Cultures and Dilution for Experiments
3:05
Treatment of Reporter Strains with egg-5 RNAi
4:55
Initiation of Broad-range DR
7:19
Results: Information in C. elegans Quantified During Lifespan Modulation Through Broad-range Dietary Restriction
8:44
Conclusion
