Badania podstawowe w medycynie osocza - podejście przepustowe od płynów do komórek

Ogólnym celem tych wielodołkowych testów sekwencyjnych jest lepsze zrozumienie wpływu zimnej plazmy fizycznej na utleniacze, na reakcje biologiczne in vitro, przy użyciu spektroskopii emisji optycznych, analizy cieczy i testów aktywności komórkowej, mikroskopii i cytometrii przepływowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie medycyny osocza, zwłaszcza w odniesieniu do gatunków dyrektywnych pochodzących z osocza, istotnych dla indukcji immunogennej śmierci komórek nowotworowych. Główną zaletą tej techniki jest jej półautomatyczne podejście.

Wykorzystuje 96-dołkowe płytki, aby zwiększyć szybkość i wydajność badań. Implikacje tej techniki rozciągają się na przyszłe terapie osoczem, takie jak dermatologia czy onkologia. A także dlatego, że dostarczają one środków do identyfikacji gatunków dyrektywnych pochodzących z osocza, które są istotne dla reakcji biologicznych.

Procedurę zademonstruje Felix Niessner, technik z naszego laboratorium. W celu monitorowania gatunków plazmy, należy umieścić strumień plazmy atmosferycznej przed spektrofotometrem emisji optycznych, prostopadle do osi pióropusza i użyć dedykowanego oprogramowania do zarejestrowania fotoemisji i długości fali każdego stanu gazu, przy dwóch standardowych litrach na minutę strumienia gazu zasilającego. W przypadku analizy supertlenków poddanych działaniu osocza należy opracować końcowy protokół dla tabeli XYZ, z odpowiednimi czasami obróbki i pozycjami studzienek.

Następnie dodać 100 mikrolitrów świeżo przygotowanej mieszanki wzorcowej do studzienek przezroczystej, płaskodennej płytki 96-dołkowej w trzech kroplach i użyć czytnika mikropłytek, aby zmierzyć absorbancję przy 550 nanometrach. Aby przeanalizować wpływ leczenia osoczem na odpowiedzi metaboliczne komórek, w okapie z przepływem laminarnym wysiewa się jeden razy 10 do czterech interesujących komórek w 100 mikrolitrach w pełni uzupełnionej pożywki do hodowli komórkowej na dołku na płaskodennej płytce 96-dołkowej i inkubować przez noc. Po całonocnej hodowli w inkubatorze do hodowli komórkowych należy użyć stołu XYZ, aby potraktować studzienki samym osoczem lub gazem, zgodnie z analizą eksperymentalną, i zwrócić komórki do inkubatora na kolejne 20 godzin.

Pod koniec drugiej inkubacji dodać 25 mikrolitrów świeżej pożywki do hodowli komórkowych, uzupełnionej 500 mikromolowymi rezazurynami do komórek, a także do trzech studzienek kontrolnych tła zawierających tylko resazurynę. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze na trzygodzinną inkubację. Następnie zmierz fluorescencję w czytniku mikropłytek.

W celu obrazowania komórek poddanych działaniu plazmy, po odczycie fluorescencji, należy zastąpić supernatanty 100 mikrolitrami świeżej pożywki do hodowli komórkowych, uzupełnionej jednym mikrogramem na mililitr jodku propidyny. Umieść płytkę na zmotoryzowanym stoliku mikroskopu i wybierz obiektyw 20x, aby zobrazować komórki. Następnie użyj odpowiedniego oprogramowania do ilościowej analizy obrazu, aby określić całkowitą powierzchnię cytozolową na cyfrowych obrazach z kontrastem fazowym we wszystkich polach widzenia obrazowanych w każdym dołku.

Do analizy cytometrycznej przepływowej komórek poddanych działaniu osocza, po zobrazowaniu, przemyć komórki w każdej studzience dwa razy 200 mikrolitrami PBS, uzupełnionymi wapniem i magnezem na przemycie, a następnie znakować 15 anagramami na mililitr przeciwciała monoklonalnego anty-mysiej kalretykuliny w 50 mikrolitrach PBS plus wapń i magnez na studzienkę. Po 15 minutach w inkubatorze do hodowli komórkowych umyj komórki dwukrotnie 200 mikrolitrami kompletnej pożywki do hodowli komórkowych i dodaj 100 mikrolitrów roztworu do odrywania komórek do każdej studzienki przez 20 minut, w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy komórki się odłączą, załaduj płytkę na cytometr przepływowy i uzyskaj co najmniej 1000 zdarzeń w populacji rozproszenia do przodu i boku, zwykle związanych z żywotnymi komórkami.

Następnie użyj odpowiedniego oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej, aby określić badaną populację i określić średnią intensywność fluorescencji ekspresji kalretykuliny. Spektroskopia emisji optycznych może być wykorzystana do śledzenia wyraźnych pików związanych z reaktywnymi składnikami plazmy w różnych warunkach gazu zasilającego. W przypadku plazmowej obróbki cieczy najpierw określa się parowanie spowodowane przez argon gazowy i plazmę argonową, przy czym warunki dają różne wyniki parowania, ponieważ plazma wywiera również wpływ na temperaturę.

Podobnie jak w przypadku wyników spektroskopii emisji optycznych dla rodników hydroksylowych, osadzanie się nadtlenku wodoru znacznie zmniejsza się wraz z domieszką tlenu lub azotu, ale wzrasta wraz z nawilżanym gazem zasilającym. Co więcej, dodanie azotu do gazu zasilającego prowadzi do znacznie wyższych stężeń azotanów w porównaniu z cieczami poddanymi obróbce plazmą argonową. Większość ponadtlenków jest wytwarzana w warunkach suchego argonu gazowego, z domieszkami tlenu i/lub azotu, które znacznie wygaszają wytwarzanie supertlenków, z wyjątkiem obecności wilgotnej plazmy tlenowej argonu.

Intensywność fluorescencji resazuryny i komórek poddanych działaniu osocza jest podobna do obserwowanych wizualnie zmian fizycznych w supernatantach kultur komórkowych, co potwierdza cytotoksyczne efekty długotrwałego leczenia osoczem. Zmniejszenie całkowitej powierzchni komórek obserwuje się również w studzienkach na próbki do obróbki osoczem, szczególnie w warunkach wilgotnego gazu zasilającego, z ogólną regulacją w górę barwienia kalretykuliny na komórkach czerniaka mireńskiego, w odpowiedzi na krótszą ekspozycję na leczenie osoczem. Jeśli zostaną wykonane prawidłowo, testy komórkowe mytoplex i odczyt można wykonać w ciągu zaledwie kilku godzin.

Po tej procedurze można również zastosować inne metody, takie jak kohodowla z komórkami odpornościowymi lub analiza supernatantów do hodowli komórkowych. Pomaga to odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące uwalniania zapór, cyto klientów lub białek redux, a także rozpoznawania immunologicznego komórek czerniaka leczonych osoczem. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę do dalszych badań nad cyklami czerniaka, na przykład z wykorzystaniem sferoid guza 3D.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać podstawowe badania w medycynie plazmowej, od fazy gazowej plazmy, przez reaktywne cząsteczki i ciecze, po reakcje biologiczne w komórkach czerniaka.