Modelowanie zakażenia rozwijającego się ludzkiego mózgu wirusem Zika in vitro przy użyciu organoidów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych

Ogólnym celem tej procedury jest modelowanie zakażenia wirusem zika w rozwijającym się ludzkim mózgu przy użyciu organoidów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii, takie jak, które komórki są zdolne do zakażenia i które białka są zaangażowane w szlak infekcji. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że naśladuje wczesną infekcję u ludzi, może być wykorzystywana w testach o wysokiej przepustowości i może być łączona z technikami genetyki fokucyjnej, takimi jak CRISPR.

Ta metoda może dostarczyć informacji na temat mechanizmu infekcji wirusem zika. Może być również stosowany w innych systemach, takich jak badania przesiewowe leków i pseudotypowanie wirusów. Stosując regularne metody konserwacji komórek macierzystych, doprowadź hodowle do zbieżności od 50% do 70%.

Sprawdź kultury za pomocą mikroskopii jasnego pola przy powiększeniu od 10 do 20 razy i upewnij się, że kolonia ma zdrową morfologię bez wykrywalnego różnicowania. Doprowadź pożywkę do konserwacji komórek macierzystych wolnych od ksenotypów do 37 stopni Celsjusza w gorącej kąpieli wodnej i rozmrozić dwa mililitry enzymatycznego odczynnika odrywającego i 50 mikrolitrów fiolki inhibitora skał podstawowych w temperaturze pokojowej. Następnie przygotuj 96-dołkową płytkę z dnem U o bardzo niskim nasadce, wielokanałową pipetę p200 i 25-mililitrowy zbiornik na odczynnik.

Następnie podnieś 45 mililitrów pożywki do 50-mililitrowej stożkowej probówki. Dodaj 45 mikrolitrów inhibitora skalnego i dokładnie wymieszaj inhibitor, triterując mieszaninę, a następnie od dwóch do czterech w wersjach. Odessać próżniowo dwie studzienki sześciodołkowej płytki zawierającej komórki macierzyste i szybko dodać jeden mililitr odczynnika oddzielającego bez enzymów do każdej studzienki, a następnie inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery minuty.

Następnie odessać próżniowo poddane działaniu studzienek i dodać jeden mililitr odczynnika enzymatycznego do oddzielania do każdej studzienki. Po pięciu minutach inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza wyjąć płytkę z inkubatora. Delikatnie postukaj w płytkę, aby rozbić zagregowane komórki.

Następnie sprawdź komórki pod mikroskopem. Jeśli duże skupiska komórek są nadal widoczne, inkubuj płytkę przez dodatkowe dwie minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Powtarzaj ten krok, aż klastry przestaną być widoczne gołym okiem.

Gdy komórki zostaną prawidłowo zdysocjowane, dodaj jeden mililitr pożywki podtrzymującej komórki macierzyste wolne od ksenotypu do każdej studzienki, aby dezaktywować enzymy dysocjacyjne. Przeciągnij zawiesinę komórek do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów i weź małą porcję do zliczania komórek. Podczas wirowania policz komórki i określ objętość reprodukcji zawiesiny potrzebną do osiągnięcia 60 000 komórek na mililitr zawiesiny.

Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w ilości 60 000 komórek na mililitr w pożywce zawierającej inhibitor skały. Za pomocą pipety o pojemności pięciu mililitrów delikatnie wymieszaj komórki od pięciu do 10 razy, aby zapewnić jednolitą zawiesinę komórek. Natychmiast dodaj zawiesinę komórek do zbiornika na odczynnik i użyj wielokanałowej pipety p200, aby przenieść 150 mikrolitrów do każdej studzienki z bardzo niskim nasadką na dolnej 96-dołkowej płytce.

Następnie odwirować płytkę o sile 150 x G przez jedną minutę, a następnie umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Nie naruszaj płytki przez 48 godzin. Począwszy od drugiego dnia, przygotuj 17 mililitrów pożywki zawierającej 17 mikrolitrów podstawowego inhibitora skały w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów.

Podgrzej mieszaninę do 37 stopni Celsjusza w gorącej kąpieli wodnej. Wyjmij płytkę organoidową z inkubatora i za pomocą wielokanałowej pipety p200 powoli nabierz 75 mikrolitrów pożywki z krawędzi studzienek w pierwszym rzędzie. Następnie szybko wyrzuć go z powrotem do studni, aby usunąć luźne komórki i organoidy.

Powtórz ten proces dyspersji dla każdego rzędu. Odczekaj 15 sekund, aby upewnić się, że organoidy opadły na dno każdej studzienki, a następnie powoli i ostrożnie odessać 75 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki za pomocą wielokanałowej pipety p200 i dozować ją do zbiornika na odpady. Następnie przenieś pożywkę zawierającą inhibitor skały do zbiornika odczynnika, dozuj 150 mikrolitrów pożywki do każdej studni organoidowej, a następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Podgrzej 17 mililitrów świeżej pożywki hodowlanej do 37 stopni Celsjusza, tym razem bez inhibitora skał. Używając wielokanałowej pipety p200 ustawionej na 100 mikrolitrów, powtórz pokazany wcześniej proces dyspersji i odczekaj 15 sekund, aby upewnić się, że organoidy opadły na dno swoich studzienek. Następnie ostrożnie odessać 125 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki i zastąpić 150 mikrolitrami podgrzanej pożywki.

Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przygotuj pożywkę zgodnie z przepisem pokazanym tutaj, a następnie sterylnie przefiltruj zmieszany roztwór w filtrze o pojemności 500 mililitrów. Od czwartego dnia do momentu zakażenia komórek około 24 dnia należy przeprowadzać regularną konserwację co drugi dzień za pomocą pożywki do indukcji neuronów.

Po przefiltrowaniu podgrzej 17 mililitrów pożywki do indukcji neuronów do 37 stopni Celsjusza, a resztę przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą wielokanałowej pipety p200, ustawionej na 100 mikrolitrów, rozprowadź wszystkie dołki płytki organoidowej, jak pokazano wcześniej. Odczekaj 15 sekund, aby upewnić się, że organoidy opadły na dno swoich studni.

Ostrożnie odessać 125 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki i zastąpić ją 125 mikrolitrami świeżej pożywki do indukcji neuronalnej. Powtarzaj ten wyczyn indukcji neralnej co drugi dzień, aż organoidy będą gotowe na zakażenie wirusem zika. Przynieś 1x zbilansowany roztwór soli Earle'a, 1x PBS i pożywkę do indukcji neuronów do 37 stopni Celsjusza w gorącej kąpieli wodnej.

Następnie rozcieńczyć wirusa zika o znanym stężeniu w 1x roztworze Earle'a do docelowej wielokrotności infekcji, która zwykle wynosi od 0,1 do 10. Za pomocą pipety p200 ostrożnie usuń całe podłoże z każdej studni organoidowej. Następnie szybko umyj organoidy 200 mikrolitrami podgrzanego 1x PBS.

Podczas wyjmowania pożywki z każdej studzienki bardzo ważne jest, aby nie dotykać organoidu ani nie zasysać go do pipety. Może to spowodować nieodwracalne uszkodzenie organoidu. W takim przypadku najlepiej wyrzucić organoid.

Następnie ostrożnie usuń cały pozostały płyn z każdej studni organoidowej za pomocą jednokanałowej pipety p200. Następnie szybko dodaj 50 mikrolitrów 1x roztworu Earle'a do udawanej infekcji lub roztworu wirusa Zika do każdej studzienki. Upewnij się, że każdy organoid jest całkowicie zanurzony po zakończeniu, umieść płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwie godziny.

Po zakończeniu ekspozycji na wirusa umyj każdą studzienkę organoidów 200 mikrolitrami PBS. Pozwól organoidom osiąść przez 15 sekund, a następnie wyjmij PBS za pomocą jednokanałowej pipety p200. Na koniec dodaj 200 mikrolitrów świeżej pożywki do indukcji neuronów do każdej studzienki i umieść płytkę z powrotem w inkubatorze.

Barwienie za pomocą DAPI, fosfo-wimentyny, TBR2 i MAP2 można połączyć, aby pokazać struktury korowe tworzące się w organoidach. Struktury te obejmują strefę komorową, strefę podkomorową, strefę pośrednią i płytkę korową w każdej rozecie. Hodowla organoidów do 108 dnia pozwala obserwować późniejsze etapy rozwoju.

Chociaż warstwy korowe nie są tak widoczne w tego typu organoidach, naturalne przejście do glejogenezy zachodzi podobnie jak in vivo. Trzy dni po zakażeniu wirusem zika widoczna staje się różnica w wielkości organoidu. Skala tej różnicy zależy od mnogości infekcji wirusowych, które są stosowane do organoidów.

Ta różnica w wielkości organoidów będzie się zwiększać w ciągu następnego tygodnia, aż do momentu, gdy zainfekowane organoidy zaczną się rozpadać. Po trzech dniach nastąpi również wzrost ilości szczątków komórkowych w zainfekowanych studniach w porównaniu ze studniami pozorowanymi. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby przestrzegać bezpiecznych praktyk laboratoryjnych, ponieważ używane są żywe materiały zakaźne.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak immunohistochemia lub RNAC, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące biologii zaangażowanej w zakażenie wirusem zika związanym z rozwojem neuronalnym.