Name: Modelowanie zakażenia rozwijającego się ludzkiego mózgu wirusem Zika in vitro przy użyciu organoidów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Poznaj modelowanie zakażenia wirusem Zika w rozwijającym się ludzkim mózgu przy użyciu organoidów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych. Ta metoda umożliwia badanie mechanizmów infekcji i potencjalnych terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Priscilli L. Yang i Dominique J. Burri z Harvard Medical School za pomoc w początkowym rozmnażaniu i kwantyfikacji ZIKV. Chcielibyśmy również podziękować Nathanielowi D. Kirkpatrickowi za wsparcie w zakresie obrazowania. K.E. był wspierany przez Stanley Center for Psychiatric Research i Harvard Stem Cell Institute.

1. Tworzenie organoidów mózgowych z hodowli 2D iPSC / hESC (Dzień 0)
Uwaga: Ten protokół zakłada, że utrzymanie komórek macierzystych (SC) odbywa się w pożywce SCMM z substratem witronektyny lub Geltrexu. W przypadku stosowania alternatywnej, wysokobiałkowej pożywki do hodowli komórek macierzystych, zaleca się przejście kultur SC do SCMM przez co najmniej dwa pasaże przed rozpoczęciem tworzenia organoidów. Protokół nie został przetestowany z metodami hodowli SC opartymi na karmicielu.
<ol>
	<li>Korzystając z regularnych metod konserwacji SC25,26, doprowadź kultury do 50%-70% konfluencji. Zwykle jest to 3-4 dni po pasażowaniu, choć może to być zależne od metody hodowli i linii komórkowej. 
	nuta: Do wyprodukowania pełnej 96-dołkowej płytki organoidów potrzebne są około 2 dołki z płytki 6-dołkowej.</li>
	<li>Sprawdzaj kultury za pomocą mikroskopii jasnego pola przy powiększeniu 10X-20X, aby zapewnić zdrową morfologię kolonii, bez wykrywalnego różnicowania.</li>
	<li>Doprowadzić SCMM do temperatury 37 °C w gorącej łaźni wodnej i rozmrozić do temperatury pokojowej fiolkę o pojemności 50 μl z 50 mM Y-27632 (inhibitorem skały) i 2 ml enzymatycznego odczynnika oddzielającego.</li>
	<li>Przygotuj 96-dołkową płytkę z dnem U z ultra niskim nasadką (ULA), wielokanałową pipetę P200 i zbiornik na odczynnik o pojemności 25 ml.</li>
	<li>Podajcie 45 ml SCMM w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i dodajcie 45 μl 50 mM Y-27632. Dokładnie wymieszać przez rozcieranie.</li>
	<li>Odessać próżniowo dwie studzienki zawierające SC i szybko dodać 1 ml bezenzymatycznego odczynnika oddzielającego do każdej studzienki za pomocą pipety P1000. Inkubować płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 4 minuty.</li>
	<li>Odessać próżniowo studzienki poddane działaniu substancji i dodać 1 ml odczynnika enzymatycznego do oddzielania do każdej studzienki za pomocą pipety P1000.
	<ol>
		<li>Inkubować płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez dodatkowe 5 minut.</li>
		<li>Usuń płytkę i zbadaj leczone studzienki. Delikatnie postukaj w płytkę, aby rozbić zagregowane komórki. Jeżeli duże skupiska komórek są nadal widoczne, inkubować płytkę przez dodatkowe 2 minuty w temperaturze 37 °C. Powtarzać ten krok do momentu, gdy skupiska przestaną być widoczne gołym okiem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy komórki zostaną prawidłowo zdysocjowane, dodaj 1 ml SCMM do każdej studzienki, aby dezaktywować enzymy dysocjacyjne. Zebrać 4 ml zawiesiny komórek w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i pobrać małą porcję do zliczenia komórek.
	<ol>
		<li>Wszelkie pozostałe, nieoczyszczone studzienki z płytki konserwacyjnej należy umieścić z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podczas liczenia odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 300 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Określ całkowitą liczbę komórek i oblicz ilość roztworu SCMM + Y-27632, która będzie potrzebna do uzyskania zawiesiny 60 000 komórek/ml.</li>
	<li>Ostrożnie odessać próżniowo supernatant i dodać obliczoną objętość roztworu SCMM + Y-27632. Wymieszaj 5-10 razy za pomocą pipety o pojemności 5 ml, zapewniając jednolitą zawiesinę komórek.</li>
	<li>Natychmiast przenieś zawiesinę komórek do zbiornika odczynnika i odpipetuj 150 μl do każdej studzienki 96-dołkowej płytki ULA U-bottom za pomocą wielokanałowej pipety P200. W ten sposób powstaje 96 pojedynczych organoidów, z których każdy początkowo składa się z 9 000 komórek.</li>
	<li>Odwirować płytkę o sile 150 x g przez 1 min.</li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C i nie naruszać płytki przez 48 godzin.</li>
</ol>
2. Utrzymanie organoidów mózgowych (Dzień 2)
<ol>
	<li>Przygotuj 17 ml SCMM z 17 μl 50 mM Y-27643 w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Podgrzać roztwór SCMM + Y-27632 do temperatury 37 °C w gorącej łaźni wodnej.</li>
	<li>Wyjąć płytkę organoidową z inkubatora i za pomocą wielokanałowej pipety P200 o pojemności 75 μl powoli pobrać pożywkę z krawędzi studzienki w pierwszym rzędzie. Po pobraniu pożywki szybko wyrzuć pożywkę z powrotem do studzienki, aby podnieść luźne komórki i organoidy. Powtórz tę czynność dla każdego wiersza. 
	nuta: Ta technika, zwana dalej "dyspersją", podnosi szczątki komórkowe i organoid do zawieszenia. Organoid szybko opada na dno studni, podczas gdy mniejsze zanieczyszczenia pozostają w zawieszeniu, co pozwala na ich usunięcie poprzez wymianę podłoża. Pomaga to zapobiec spoczywaniu organoidu w szczątkach komórkowych podczas hodowli.
	<ol>
		<li>Po rozproszeniu wszystkich studzienek odczekaj 15 sekund, aby upewnić się, że organoidy opadły na dno każdej studzienki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powoli i ostrożnie odessać 75 μl pożywki z każdej studzienki za pomocą wielokanałowej pipety P200 i dozować do zbiornika na odpady. 
	nuta: Większość użytkowników od czasu do czasu odsysa organoid podczas regularnych karmień. Może się to zdarzyć w około 1% przypadków. Proszę odpowiednio zaplanować, aby upewnić się, że wystarczająca liczba organoidów przetrwa do eksperymentalnych punktów czasowych.</li>
	<li>Przenieś roztwór SCMM + Y-27632 do zbiornika odczynnika i dozuj 150 μl do każdej studzienki organoidowej za pomocą wielokanałowej pipety P200.</li>
	<li>Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
3. Utrzymanie organoidów mózgowych (Dzień 3)
<ol>
	<li>Podgrzej 17 ml SCMM do temperatury 37 °C, tym razem bez Y-27643.</li>
	<li>Za pomocą wielokanałowej pipety P200 ustawionej na 100 μl rozproszyć wszystkie dołki płytki organoidowej (patrz krok 2.2). Odczekaj 15 sekund, aby upewnić się, że organoidy opadły na dno swoich studni.</li>
	<li>Przygotować zbiornik na odpady i przenieść podgrzany SCMM do zbiornika źródłowego.</li>
	<li>Ostrożnie odessać 125 μl pożywki z każdej studzienki i zastąpić 150 μl świeżego SCMM za pomocą wielokanałowej pipety P200.</li>
	<li>Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
4. Utrzymanie organoidów mózgowych (Dzień 4+)
Uwaga: Przeprowadzaj tę regularną konserwację co drugi dzień, aż do infekcji.
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem karmienia w 4 dniu należy przygotować pożywkę do indukcji neuronalnej (NI).
	<ol>
		<li>Rozmrozić 250 μl podwielokrotności 2 mg/ml heparyny wraz z jedną fiolką o pojemności 5 ml z suplementem 100X N-2. Dodaj 250 μl heparyny, 5 ml 100X N-2 i 5 ml 100X MEM-NEAA do 500 ml DMEM/F12+GlutaMAX. Sterylny przefiltrować zmieszany roztwór w filtrze o pojemności 500 ml. 
		nuta: Utrzymuj NI w temperaturze 4 °C, gdy nie jest używany; NI utrzymuje się do dwóch tygodni przed przygotowaniem świeżej pożywki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podgrzać 17 ml pożywki NI do 37 °C.</li>
	<li>Za pomocą wielokanałowej pipety P200 ustawionej na 100 μl rozproszyć wszystkie dołki płytki organoidowej (patrz krok 2.2). Odczekaj 15 sekund, aby upewnić się, że organoidy opadły na dno swoich studni.</li>
	<li>Przygotować zbiornik na odpady i przenieść podgrzany NI do zbiornika źródłowego.</li>
	<li>Ostrożnie odessać 125 μl pożywki z każdej studzienki i zastąpić 125 μl świeżego NI za pomocą wielokanałowej pipety P200.</li>
	<li>Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
5. Zakażenie organoidami wirusem ZIKV (~Dzień 24)
UWAGA: Po około 3 tygodniach różnicowania, w organoidzie pojawią się duże struktury neuroepitelialne i rozety, które będą bardzo podatne na infekcję ZIKV.
<ol>
	<li>Doprowadź Earle's 1X Balanced Salt Solution (EBSS), 1X PBS i NI do temperatury 37 °C w gorącej kąpieli wodnej.</li>
	<li>Rozcieńczyć ZIKV o znanym stężeniu w 1X EBSS do docelowej wielokrotności infekcji (MOI). 
	nuta: Zaleca się miareczkowanie różnych MOI w celu uzyskania odpowiedzi na dawkę wirusa. Może się to różnić w zależności od szczepu wirusa; dla ATCC VR-1838 i ATCC VR-1843 typowe wartości MOI mieszczą się w zakresie od 0,1 do 10).</li>
	<li>Ostrożnie usuń całe podłoże z organoidu za pomocą jednokanałowej pipety P200. Szybko dodaj 200 μl 1X PBS do każdej studzienki za pomocą wielokanałowej pipety P200, aby umyć organoidy.</li>
	<li>Ostrożnie usuń całe podłoże z organoidu za pomocą jednokanałowej pipety P200. Szybko dodaj 50 μl roztworu 1X tylko EBSS (pozorowana infekcja) lub wirusa ZIKV do studni i upewnij się, że organoid jest całkowicie zanurzony. Powtórzyć te czynności dla każdego organoidu, który ma być zakażony na potrzeby badania.</li>
	<li>Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 2 godziny 
	nuta: Inkubacja pozorowanych zakażonych organoidów przez ten czas nie powinna znacząco wpłynąć na ich wzrost w porównaniu z organoidami niezakłóconymi.</li>
	<li>Około 30 minut przed zakończeniem inkubacji wirusa przelać 25 ml NI do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i doprowadzić do temperatury 37 °C w gorącej łaźni wodnej.</li>
	<li>Po zakończeniu ekspozycji na wirusa przemyj organoidy 200 μl 1X PBS dla każdej studzienki, pozwól organoidom osiąść przez 15 s, a następnie usuń 1X PBS za pomocą jednokanałowej pipety P200.</li>
	<li>Dodaj 200 μl świeżego NI do każdej studzienki i umieść z powrotem w inkubatorze.
	<ol>
		<li>Opcjonalnie: Dla punktu czasowego dnia 0 organoidy mogą być obrazowane godzinę po zakażeniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontynuuj hodowlę, zastępując 125 μl NI co drugi dzień metodą dyspersji (patrz krok 4). Pamiętaj, aby odpowiednio zutylizować zużyte media i końcówki, ponieważ zawierają one zakaźne cząsteczki ZIKV.</li>
</ol>

<ol><li>Jurado, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+productively+infects+primary+human+placenta-specific+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Zika virus productively infects primary human placenta-specific macrophages.</a> JCI Insight. 1, 1-6 (2016).</li>
<li>Quicke, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Infects+Human+Placental+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Infects Human Placental Macrophages.</a> Cell Host Microbe. 20, 83-90 (2016).</li>
<li>Brasil, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa1602412#t=article">Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report.</a> New Engl J Med. 375, 2321-2334 (2016).</li>
<li>Mlakar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Associated+with+Microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22New+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Associated with Microcephaly.</a> New Engl J Med. 374, 951-958 (2016).</li>
<li>Rubin, E. J., Greene, M. F., Baden, L. R. <a target="_blank" href="http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMe1601862#t=article">Zika Virus and Microcephaly.</a> New Engl J Med. 374, 984-985 (2016).</li>
<li>Soares de Oliveira-Szejnfeld, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+Brain+Abnormalities+and+Zika+Virus%3A+What+the+Radiologist+Can+Expect+to+See+Prenatally+and+Postnatally%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Congenital Brain Abnormalities and Zika Virus: What the Radiologist Can Expect to See Prenatally and Postnatally.</a> Radiology. , 161584(2016).</li>
<li>Hamel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+Zika+Virus+Infection+in+Human+Skin+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells.</a> J Virol. 89, 8880-8896 (2015).</li>
<li>Tang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Infects+Human+Cortical+Neural+Progenitors+and+Attenuates+Their+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth.</a> Cell Stem Cell. 18, 587-590 (2016).</li>
<li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+small-molecule+inhibitors+of+Zika+virus+infection+and+induced+neural+cell+death+via+a+drug+repurposing+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of small-molecule inhibitors of Zika virus infection and induced neural cell death via a drug repurposing screen.</a> Nat Med. 22, 1101-1107 (2016).</li>
<li>Morrison, T. E., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+of+Zika+Virus+Infection%2C+Pathogenesis%2C+and+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity.</a> Journal of virology. , 00009-00017 (2017).</li>
<li>Lazear, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mouse+Model+of+Zika+Virus+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">A Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis.</a> Cell Host Microbe. 19, 720-730 (2016).</li>
<li>Manangeeswaran, M., Ireland, D. D. C., Verthelyi, D., Tonelli, L., Wang, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+%28PRVABC59%29+Infection+Is+Associated+with+T+cell+Infiltration+and+Neurodegeneration+in+CNS+of+Immunocompetent+Neonatal+C57Bl%2F6+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Zika (PRVABC59) Infection Is Associated with T cell Infiltration and Neurodegeneration in CNS of Immunocompetent Neonatal C57Bl/6 Mice.</a> PLOS Pathog. 12, 1006004(2016).</li>
<li>Miner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Infection+in+Mice+Causes+Panuveitis+with+Shedding+of+Virus+in+Tears%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Infection in Mice Causes Panuveitis with Shedding of Virus in Tears.</a> Cell reports. 16, 3208-3218 (2016).</li>
<li>Dudley, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rhesus+macaque+model+of+Asian-lineage+Zika+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A rhesus macaque model of Asian-lineage Zika virus infection.</a> Nat Commun. 7, 12204(2016).</li>
<li>Li, X. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+2016+Clinical+Isolate+of+Zika+Virus+in+Non-human+Primates%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Characterization of a 2016 Clinical Isolate of Zika Virus in Non-human Primates.</a> EBioMedicine. 12, 170-177 (2016).</li>
<li>Osuna, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+viral+dynamics+and+shedding+in+rhesus+and+cynomolgus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Zika viral dynamics and shedding in rhesus and cynomolgus macaques.</a> Nat Med. 22, 1448-1455 (2016).</li>
<li>Cugola, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Brazilian+Zika+virus+strain+causes+birth+defects+in+experimental+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models.</a> Nature. , (2016).</li>
<li>Garcez, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+impairs+growth+in+human+neurospheres+and+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids.</a> Science. 352, 816-818 (2016).</li>
<li>Wells, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Ablation+of+AXL+Does+Not+Protect+Human+Neural+Progenitor+Cells+and+Cerebral+Organoids+from+Zika+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic Ablation of AXL Does Not Protect Human Neural Progenitor Cells and Cerebral Organoids from Zika Virus Infection.</a> Cell Stem Cell. 19, 703-708 (2016).</li>
<li>Dang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Depletes+Neural+Progenitors+in+Human+Cerebral+Organoids+through+Activation+of+the+Innate+Immune+Receptor+TLR3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Depletes Neural Progenitors in Human Cerebral Organoids through Activation of the Innate Immune Receptor TLR3.</a> Cell Stem Cell. 19, 258-265 (2016).</li>
<li>Gabriel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Zika+Virus+Isolates+Induce+Premature+Differentiation+of+Neural+Progenitors+in+Human+Brain+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids.</a> Cell Stem Cell. 20, 397-406 (2017).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-Region-Specific+Organoids+Using+Mini-bioreactors+for+Modeling+ZIKV+Exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure.</a> Cell. 165, 1238-1254 (2016).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Organized+Formation+of+Polarized+Cortical+Tissues+from+ESCs+and+Its+Active+Manipulation+by+Extrinsic+Signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-Organized Formation of Polarized Cortical Tissues from ESCs and Its Active Manipulation by Extrinsic Signals.</a> Cell Stem Cell. 3, 519-532 (2008).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501, 373-379 (2012).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nat Methods. 8, 424-429 (2011).</li>
<li>Beers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+and+colony+expansion+of+human+pluripotent+stem+cells+by+enzyme-free+dissociation+in+chemically+defined+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions.</a> Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).</li>
<li>Contreras, D., Arumugaswami, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Infectious+Cell+Culture+System+and+the+In+Vitro.+Prophylactic+Effect+of+Interferons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro. Prophylactic Effect of Interferons.</a> J Vis Exp. , e10-e13 (2016).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Istnieje kilka zastrzeżeń, które należy wziąć pod uwagę przy wykorzystywaniu ludzkich organoidów mózgowych do badania infekcji ZIKV. Jedną z ważnych kwestii jest to, że tworzenie i struktura organoidów jest w dużym stopniu zależna od linii komórek macierzystych, z której powstają. Zachowaj ostrożność podczas porównywania linii komórkowych, w tym linii inżynierii izogenicznej; Najlepiej jest wyciągać wnioski na podstawie wielu subklonów, a najlepiej wielu linii komórek macierzystych. Dodatkowo, ze względu na tę różnicę w liniach komórkowych, zaleca się eksperymenty pilotażowe w celu zapewnienia, że w organoidach zachodzi prawidłowe różnicowanie. Podczas gdy struktury neuronabłonkowe są widoczne pod mikroskopią jasnego pola, sugeruje się również przeprowadzenie eksperymentów qRT-PCR lub kriosekcji w celu znalezienia markerów różnicowania neuronalnego, takich jak PAX6 lub fosfo-wimentyna.
Należy również przewidzieć znaczną zmienność między organoidami w obrębie tej samej linii komórkowej. Ze względu na niewzorcowy charakter protokołu, liczba i wielkość struktur neuroepitelialnych może się różnić między poszczególnymi organoidami. Zazwyczaj można spodziewać się co najmniej dwóch dużych (>200 μm średnicy na D24) rozet nerwowych na organoid. Z tego powodu badania podłużne, takie jak obserwacja zmiany wielkości organoidów po zakażeniu, są szczególnie pouczające. Mogą również wystąpić różnice między partiami, a najbardziej prawdopodobną przyczyną tego jest niedokładne liczenie komórek lub wysiew. Zaleca się przeprowadzenie wielokrotnego liczenia i upewnienie się, że zawiesina komórek jest dobrze wymieszana przed wysiewem na 96-dołkowe płytki ULA U-bottom. 
Podczas hodowli organoidów na 96-dołkowych płytkach ULA U-bottom, zaplanuj zaobserwowanie znacznych efektów parowania wokół krawędzi płytek. Idealnie jest wypełnić te studnie PBS i pracować tylko z 60 studzienkami środkowymi. Ze względu na parowanie organoidy w studzienkach zewnętrznych będą narażone na inne warunki niż te w środku, co prawdopodobnie wpłynie na ich wzrost i różnicowanie. Proszę wziąć to pod uwagę przy planowaniu liczby organoidów, które będą potrzebne do eksperymentów. Dodatkowo organoidy zaczną zarastać format 96-dołkowy po około 30 dniach, co będzie widoczne z powodu przebarwienia pożywki hodowlanej. Jeśli planujesz przenieść organoidy po upływie 30 dni, zaleca się przeniesienie organoidów na płytkę ULA 24-dołkową. Aby przeprowadzić transfer, użyj nożyczek, aby przeciąć końcówkę P1000 tak, aby otwór był znacznie większy niż same organoidy, i przenieś organoidy przez pipetowanie.
Ludzkie organoidy mózgowe mają ogromny potencjał w pogłębianiu wiedzy na temat rozwoju neurologicznego i chorób. Zachęca się badaczy do modyfikowania protokołu w razie potrzeby. Na przykład, można zaimplementować czynniki wzorcowe, aby poprawić efektywność różnicowania w kierunku określonych typów komórek, co pozwoli im zbadać wpływ wirusa na określone regiony anatomiczne. Neurorozwojowe skutki ZIKV są nadal słabo poznane, ale to nowe podejście zapewni naukowcom dostępny, szybki i wysokoprzepustowy sposób badania mechanizmów infekcji.

Wirus Zika (ZIKV) szybko rozprzestrzenił się w Mikronezji, Polinezji Francuskiej i obu Amerykach, a ostatnio wykazano, że przekracza barierę łożyskową1,2 w celu zainfekowania rozwijającego się mózgu płodu, prowadząc do chorób neurorozwojowych, takich jak małogłowie3,4,5,6 . Długoterminowy wpływ na życie tych pacjentów oraz obecny brak leczenia skłoniły badaczy i klinicystów do podjęcia działań mających na celu lepsze zrozumienie mechanizmów stojących za zakażeniem i replikacją wirusa ZIKV. Wcześniejsze badania dotyczyły zakażenia ZIKV systemami in vitro w różnych fizjologicznie istotnych typach komórek7,8,9, a także in vivo10 z immunokompetentnymi i z obniżoną odpornością myszy11,12,13 i naczelne inne niż ludzie14,15,16. Oprócz tych bardziej konwencjonalnych technik, kilka grup wdrożyło organoidy mózgowe pochodzące z komórek macierzystych, aby lepiej zrozumieć infekcję ZIKV rozwijającego się ludzkiego mózgu. Grupy te wykorzystały ludzkie organoidy mózgowe do potwierdzenia fenotypu mikrocefalii17,18, zbadaj receptory związane z wejściem wirusa19, zbadaj fizjologiczne reakcje na infekcję20,21, i potencjalnie przeprowadź badanie pod kątem kandydatów na leki22. Tutaj opisano technikę szybkiego wytwarzania i infekowania organoidów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych, jak pokazano wcześniej19, aby lepiej zrozumieć infekcję ZIKV rozwijającego się ludzkiego mózgu.
Ponieważ organoidy są tworzone ze standardowych kultur pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC), technika ta pozwala na uzyskanie odpowiedzi na różne pytania naukowe dotyczące infekcji wirusowej rozwijającego się mózgu. Na przykład, inżynieria CRISPR może być wykorzystana do modyfikacji tych linii PSC przed infekcją organoidów w szybszym tempie niż większość badań genetycznych in vivo19. Dodatkowo, w przeciwieństwie do standardowych dwuwymiarowych (2D) kultur różnicujących, organoidy wykazują złożoną architekturę komórkową, która ma kluczowe znaczenie dla kortykogenezy, a ostatnie badania wykazały, że architektura ta może zostać zakłócona po infekcji21. Wreszcie, stosunkowo niski koszt wytwarzania organoidów pozwala na eksperymenty i badania przesiewowe o wyższej przepustowości w porównaniu z modelami in vivo. Z drugiej strony, wykorzystanie organoidów do badania ZIKV ma pewne wady. Chociaż organoidy są znacznie bardziej istotne biologicznie niż kultury 2D, istnieją dodatkowe wyzwania związane z oceną organoidów ze względu na ich trójwymiarowy (3D) charakter. Obrazowanie i dysocjacja organoidów zwykle wymaga większej ilości sprzętu i większych inwestycji zasobów niż w przypadku standardowych kultur 2D. Ponadto organoidy nie mają składników unaczynieniowych i immunologicznych, które są obecne w modelach in vivo, dlatego badaczom zainteresowanym tymi aspektami infekcji wirusowej zaleca się poszukiwanie alternatywnego protokołu.
Istnieje wiele technik tworzenia ludzkich organoidów i neurosfer w kulturze, które zazwyczaj mieszczą się w kategoriach wzorzystych lub niewzorcowych. Metody oparte na wzorcach implementują czynniki regulujące Wnt, BMP, TGFβ i inne szlaki sygnałowe, aby popchnąć różnicowanie w kierunku określonych linii23. Metody bez wzorców, takie jak ta opisana tutaj, wykorzystują skłonność indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) i ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) do domyślnego różnicowania się w kierunku linii neuroektodermalnej24. Po około trzech tygodniach różnicowania powstałe organoidy składają się z dużych, biomimetycznych struktur neuroepiteliowych, które zawierają kilka typów komórek, które obserwuje się we wcześnie rozwijającym się mózgu.
Technika wytwarzania organoidów ze standardowych, bezżywieniowych kultur PSC i infekowania tych organoidów ZIKV jest przedstawiona w całości. Wskazówki dotyczące metod hodowli potrzebnych do PSC bez karmienia można znaleźć w poprzednich publikacjach dotyczących metod25,26. Dodatkowo, aby zastosować stałe ilości wirusa do wielu eksperymentów, ważne jest, aby obliczyć MOI z wyprzedzeniem. Odbywa się to poprzez przeprowadzenie infekcji komórek Vero, a następnie leczenie pożywką nakładkową, inkubację i barwienie immunologiczne. Opisy i metody tej techniki zostały już wcześniej opisane19,27.
Gdy kultura PSC osiągnie docelową konfluencję 50%-70%, komórki są następnie dysocjowane i agregowane w 96-dołkowe płytki o bardzo niskim przyłączeniu. Komórki są utrzymywane przez 3 dni w pożywce do konserwacji komórek macierzystych wolnych od ksenotypów (SCMM), a następnie przekształcane w pożywkę do indukcji neuronalnej przez pozostałą część hodowli. Gdy organoidy różnicują się przez 3 tygodnie, infekcja może zostać przeprowadzona. Rutynowo wykonując zdjęcia w ciągu tygodnia po zakażeniu, naukowcy będą obserwować postępującą śmierć komórki i rozerwanie działania organoidu. Naukowcy mogą również w tym czasie dysocjować organoidy, aby przeprowadzić profilowanie transkrypcyjne lub proteomiczne. Do obrazowania zaleca się metody kriosekcji i arkusza świetlnego, a naukowcy mogą spodziewać się wysokiego poziomu infekcji i replikacji wirusa, szczególnie w populacjach nerwowych komórek progenitorowych (NPC) w organoidach. Ostatecznie technika ta pozwala naukowcom szybko zbadać mechanizmy infekcji wirusowej ludzkiego mózgu przy niskich kosztach i ograniczonym sprzęcie.

<table><tbody><tr><td>Bezenzymatyczny odczynnik odpryskujący, ReLeSR</td><td>StemCell Technologies</td><td>5873</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1X) Uzupełniany glutaminianem DMEM/F12 (1X)</td><td>Gibco</td><td>10565-018</td><td>(+)2.438 g/L wodorowęglan sodu, (+)Suplement N-2 pirogronianu sodu</td></tr><tr><td>(100X)</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminokwasy endogenne (MEM-NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Earle'a (EBSS)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30029.02</td><td></td></tr><tr><td>Filtr Stericup (500 ml)</td><td>Milipore</td><td>220009-140</td><td></td></tr><tr><td>Costar Ultra-Low Attachment Plate, 96-dołkowy, okrągłodenny</td> Zbiornik na odczynnik <td>Corning</td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>o małej objętości resztkowej (25 ml)</td><td>Integra</td><td>4312</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+</td><td>Rainin</td><td>17013810</td><td></td></tr><tr><td>Duża wirówka, kompatybilna z płytką hodowlaną</td><td>Wirnik</td> wirówkowy Thermo Scientific <td>75007210</td><td></td></tr><tr><td>Culture</td> Thermal <td>Scientific</td><td>75005706</td><td></td></tr><tr><td>Vero Cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td>Do ekspansji wirusa, w razie potrzeby</td></tr><tr><td>Wirus Zika ( Szczep Uganda)</td><td>ATCC</td><td>VR-1838</td><td>Można stosować inne szczepy</td></tr><tr><td>Wirus Zika (szczep Puerto Rico)</td> <td>ATCC</td><td>VR-1843</td><td>Można stosować inne szczepy</td></tr><tr><td>fosfo-wimentyna</td><td>MBL</td><td>D076-3</td><td>mysia poliklonalna,&nbsp; 1:250 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>TBR2</td><td>Abcam</td><td>ab23345</td><td>poliklonalny królik, rozcieńczenie 1:300</td></tr><tr><td>MAP2</td><td>Novus</td><td>NB300-213</td><td>kurczak poliklonalne, rozcieńczenie 1:1500</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>CST12389S</td><td>poliklonalny królik, rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>D1-4G2 białko otoczki flawiwirusa</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB10216</td><td>mysi monoklonalny, rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>rozszczepiona kaspaza-3</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej</td><td>9661</td><td>poliklonalny królik, rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>488 anty-mysie IgG</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11001</td><td>koza poliklonalna, 1:1000</td></tr><tr><td>594 anty-królicza IgG</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11037</td><td>koza poliklonalna, 1:1000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>647 anty-kurczak IgY</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21449</td><td>koza poliklonalna, 1:1000 rozcieńczenie</td></tr></tbody></table>

modelowanie zakażenia rozwijającego się ludzkiego mózgu wirusem zika in vitro przy użyciu organoidów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Niedawne pojawienie się wirusa Zika (ZIKV) w populacjach podatnych doprowadziło do nagłego wzrostu małogłowia i innych zaburzeń neurorozwojowych u noworodków. Chociaż komary są główną drogą przenoszenia wirusa, wykazano również, że rozprzestrzenia się on poprzez kontakt seksualny i pionową transmisję z matki na płód. W tym ostatnim przypadku transmisji, ze względu na unikalny tropizm wirusowy ZIKV, uważa się, że wirus atakuje głównie nerwowe komórki progenitorowe (NPC) rozwijającego się mózgu.
Tutaj opisana jest metoda modelowania infekcji ZIKV i wynikającej z niej mikrocefalii, która występuje, gdy ludzkie organoidy mózgowe są wystawione na działanie żywego ZIKV. Organoidy wykazują wysoki poziom wirusa w populacji neuronalnych przodków i wykazują ciężką śmierć komórek i małogłowie w miarę upływu czasu. Ten trójwymiarowy model organoidu mózgowego pozwala naukowcom na przeprowadzanie eksperymentów dopasowanych do gatunku w celu obserwacji i potencjalnej interwencji w przypadku infekcji ZIKV rozwijającego się ludzkiego mózgu. Model zapewnia lepszą przydatność w porównaniu ze standardowymi metodami dwuwymiarowymi i zawiera specyficzną dla człowieka architekturę komórkową i ekspresję białek, które nie są możliwe w modelach zwierzęcych.

W dniu tworzenia organoidów hodowle SC powinny znajdować się w fazie wzrostu logarytmicznego, wykazując 50%-70% konfluencji, co przedstawiono na Rysunku 1(A-C). Hodowle powinny tworzyć zaokrąglone kolonie z wyraźnymi krawędziami, a studzienki powinny być wolne od różnicowania Rysunek 1(D-E). Jeśli dochodzi do różnicowania, zaleca się przeprowadzenie selektywnego usuwania komórek w celu oczyszczenia dotkniętych obszarów na płytkach co najmniej jeden dzień przed tworzeniem organoidów. Jeśli zróżnicowana jest znaczna część hodowli, konieczne może być przeprowadzenie dodatkowego pasażu, rozmrożenie nowej fiolki lub zmiana technik hodowli komórek macierzystych, aby zapewnić, że organoidy są tworzone z czystych hodowli komórek macierzystych.
Dysocjacja poprzez zastosowanie kombinacji odczynników do odrywania komórek bez udziału enzymów oraz odczynników enzymatycznych powinna doprowadzić do uzyskania głównie pojedynczych komórek, choć podczas liczenia nadal mogą być obserwowane małe agregaty komórek. Obecność niewielkich agregatów nie wydaje się zakłócać tworzenia organoidów, jednak może wpływać na dokładność liczenia. Zaleca się wykonanie wielokrotnych pomiarów dla każdej próbki; jeśli wyniki różnią się o ponad 20%, może być konieczne wydłużenie czasu dysocjacji w celu dalszej singularyzacji komórek.
Po wysianiu komórek i odwirowaniu ich w płytce 96-dołkowej z wypukłym dnem ULA (Rysunek 2A), będą one widoczne jako płaska, gęsta warstwa komórek na dnie każdego dołka. W ciągu kolejnych dwóch dni komórki będą powoli agregować. Zaleca się, aby nie zakłócać płytki podczas tych 48 godzin, ponieważ siły mechaniczne mogą rozbić luźno uformowany agregat. Przez pierwsze 10 dni organoid pozostanie w większości sferyczny i urośnie z ~300 µm do 600-800 µm (Rysunek 2B). Bardziej widoczne struktury zaczynają pojawiać się w organoidzie między 10. a 20. dniem (Rysunek 2C-E). Do 24. dnia badacze powinni być w stanie zaobserwować struktury przypominające rozety za pomocą mikroskopii w jasnym polu (Rysunek 2F). Podczas dalszej hodowli struktury neuroepitelialne te mogą zwiększać swoją liczbę i rozmiar w ciągu kilku dni (Rysunek 2G). Podczas dokarmiania badacz zauważy znaczne ilości debris gromadzące się na dnie każdego dołka, szczególnie podczas pierwszych 2 tygodni hodowli. Technika dyspersji opisana w kroku 2.2 usuwa większość tych debris komórkowych, aby zapobiec gromadzeniu się debris apoptotycznych podczas wielokrotnych dokarmiań (Rysunek 3A). Debris te mogą zakłócać obrazowanie, utrudniać obserwację i kwantyfikację indukowanej infekcją śmierci komórkowej oraz mogą dostarczać asymetrycznych sygnałów do sąsiedniego organoidu, co mogłoby wpłynąć na różnicowanie. Jeśli technika dyspersji zostanie przeprowadzona prawidłowo, zjawisko to powinno zostać ograniczone (Rysunek 3B-C, 3D-E).
Zaleca się wykonanie kriosekcji lub obrazowania arkuszem światła (lightsheet imaging) w celu zbadania struktury korowej tworzącej się wewnątrz organoidów. W organoidach z 25. dnia uprawy struktury rozetkowe i strefy komorowe są wyraźnie widoczne w barwieniu DAPI (Rycina 4A) oraz fosfo-wimentyną (Rycina 4B). Obecność TBR2 (Rycina 4C) wskazuje na tworzenie się progenitorów pośrednich o morfologii sugerującej migrację na zewnątrz. Neurony MAP2+ (Rycina 4D) zasiedlają zewnętrzne obszary każdej rozety. Na podstawie tych białek można zwizualizować strefę komorową (VZ), strefę podkomorową (SVZ), strefę pośrednią (IZ) oraz blaszkę korową (CP) w obrębie każdej rozety (Rycina 4E,4E'). Można kontynuować hodowlę tych organoidów, aby obserwować późniejsze etapy rozwoju. Choć warstwowanie korowe nie jest w tym typie organoidów tak wyraźne, następuje naturalne przejście do gliogenezy, podobnie jak ma to miejsce in vivo. Można to zaobserwować w organoidach z 108. dnia, w których znaczna część komórek wykazuje ekspresję MAP2 lub GFAP (Rycina 4F-I).
Użytkownicy mogą spodziewać się różnic w wielkości organoidów około 3 dni po infekcji ZIKV, w zależności od zastosowanej wielokrotności zakażenia (MOI) wirusa (Rycina 5A-B). Po upływie tych 3 dni w studniach z zainfekowanymi organoidami pojawi się również więcej debris komórkowego w porównaniu do studni kontrolnych. Różnica w wielkości organoidów będzie narastać w ciągu kolejnego tygodnia, aż do momentu, gdy zainfekowane organoidy zaczną się rozpadać (Rycina 5C-D). Na tym etapie można zastosować różne analizy w celu zbadania mechanizmów infekcji, w tym ekstrakcję viralnego RNA oraz kriosekcjonowanie (zalecane przeciwciała wymieniono w tabeli materiałów). Po kriosekcjonowaniu użytkownicy zaobserwują znaczną obecność wirusa w regionie apikalnym struktur neuroepitelialnych, co sugeruje podatność komórek progenitorowych neuronów (NPCs) na infekcję ZIKV (Rycina 6). Immunofluorescencja sekcji organoidów wykaże również wzrost ekspresji kaspazy-3 w formie rozszczepionej w zainfekowanych organoidach (Rycina 7).
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56404/56404fig1.jpg" /> 
Rycina 1: Morfologia kolonii komórek macierzystych przed formowaniem organoidów. 
W momencie dysocjacji kolonie powinny osiągnąć konfluencję na poziomie 50%-70%, aby uzyskać dużą liczbę jednolitych organoidów. (A) Rzadkie, niedawno wysiane hodowle nie osiągnęły jeszcze fazy logarytmicznego wzrostu i nie wytworzą wielu organoidów. (B) Po osiągnięciu odpowiedniej konfluencji komórki są gotowe do dysocjacji. Ważne jest również sprawdzenie tych kolonii w celu upewnienia się, że nie zachodzi w nich różnicowanie. (C) Kolonie, które rozrosły się zbyt mocno, osiągną nadmierną konfluencję i nie są zalecane do formowania organoidów. Hodowle w tym stanie z większym prawdopodobieństwem zawierają komórki różnicujące się. (D) Krawędzie kolonii powinny być wyraźne, z jednolitym obrazem morfologicznym: zaokrąglone komórki w centrum i lekko wydłużone komórki w kierunku krawędzi. (E) W hodowlach powinno występować minimalne różnicowanie. Jeśli w centrach lub na krawędziach kolonii zaobserwowano większe, spłaszczone komórki (białe groty strzałek), które stanowią więcej niż około 1% hodowli, zaleca się ich usunięcie metodą pick-to-remove lub przeprowadzenie dodatkowych pasażowań w celu uzyskania jednorodnej populacji komórek macierzystych.&#160;<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56404/56404fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56404/56404fig2.jpg" /> 
Rycina 2: Wzrost organoidów mózgu w czasie.&#160; 
(A) Schemat produkcji organoidów mózgu z 2D PSCs hodowanych w medium wolnym od komponentów pochodzenia zwierzęcego (xeno-free) i bez użycia komórek karmionek (feeder-free). (B) Przez pierwsze 8 dni organoidy pozostaną w większości sferyczne z niewielką liczbą wykrywalnych cech. Średnica organoidu będzie wynosić od około 300 µm do 500 µm. (C-E) W 10. dniu wokół obwodu organoidów zaczną być widoczne wyraźniejsze obszary, a one same utracą sferyczny kształt. Będą nadal zwiększać swoje rozmiary do średnicy około 1 mm, co zależy w dużej mierze od linii komórkowej użytej do produkcji organoidów. (F) Po około 20 dniach różnicowania w przejrzystych obszarach obwodowych większości organoidów zaobserwuje się formowanie struktur neuroepitelialnych (czarne groty strzałek). Mają one morfologię pierścieniowatą, ze strukturami apikalnymi i bazalnymi naśladującymi te występujące w rozwijającej się korze mózgowej. (G) Struktury neuroepitelialne te będą nadal rosnąć i zwiększać swoje rozmiary przez około 20-30 dni.&#160;<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56404/56404fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56404/56404fig3.jpg" /> 
Rysunek 3: Usuwanie szczątków komórkowych za pomocą techniki karmienia z dyspersją. 
Podczas wzrostu organoidów spodziewana jest znaczna liczba obumarłych komórek, co może prowadzić do gromadzenia się szczątków komórkowych wokół podstawy organoidu. (A) Przedstawiona technika dyspersji pozwala badaczom na usunięcie większości tych szczątków podczas każdego karmienia. Aby to osiągnąć, należy za pomocą wielokanałowej pipety P200 powoli wciągnąć zużytą pożywkę, a następnie szybko ją wypuścić, aby unieść organoid i szczątki komórkowe w zawiesinie. Organoid szybko opadnie na dno dołka, po czym można przeprowadzić standardowe karmienie. Przykłady organoidu w 6. dniu przed (B) i po (C) karmieniu z dyspersją wykazują znaczną redukcję szczątków. Procedura ta jest kontynuowana przez kilka tygodni, co obrazuje organoid w 18. dniu przed (D) i po (E) karmieniu z dyspersją.&#160;<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56404/56404fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56404/56404fig4.jpg" /> 
Rycina 4: Charakterystyka organoidów mózgowych za pomocą immunohistochemii. 
Przedstawiono obrazy organoidów mózgowych wykonane za pomocą mikroskopii arkuszowej (lightsheet), stanowiące przykład powstałej architektury komórkowej. W 25. dniu DAPI (A) oraz fosfo-wimentyna (B) wskazują odpowiednio poszczególne rozety oraz strefy komórkowe. (C) TBR2 znakuje pośrednie komórki progenitorowe migrujące na zewnątrz, a MAP2 (D) znakuje neurony, które powstały w blaszce korowej. (E,E') Połączenie tych białek wyraźnie pokazuje odtworzenie rozwoju kory w modelach organoidów mózgowych. (F-I) Do 108. dnia nastąpiła gliogeneza, a znaczną część organoidu zasiedlają mieszane populacje komórek GFAP+ i MAP2+. VZ = strefa komórkowa, SVZ = strefa podkomórkowa, IZ = strefa pośrednia, CP = blaszka korowa.&#160;<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56404/56404fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56404/56404fig5.jpg" /> 
Rycina 5: Degradacja zainfekowanych organoidów.&#160; 
(A) Obrazy w polu jasnym organoidów mózgowych w grupie Mock oraz zainfekowanych ZIKV przy MOI = 0.1 i 10. Obrazy wykonano bezpośrednio po infekcji (Dzień 0), a także 3 i 6 dni po infekcji. (B-C) Obrazy w polu jasnym detrytusu komórkowego otaczającego (B) organoidy z grupy mock oraz (C) organoidy zainfekowane ZIKV przy MOI = 10, 3 dni po infekcji.&#160;<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56404/56404fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56404/56404fig6.jpg" /> 
Rycina 6: Krioprzecięcia i immunofluorescencja zainfekowanych organoidów. 
Organoidy w 24. dniu zostały poddane działaniu ZIKV przy MOI = 0.1, a następnie po 6 dniach wykonano ich krioprzecięcia. Na tym etapie widoczna jest wyraźna obecność wirusa w strefach komorowej, podkomorowej i pośredniej organoidu, gdzie znajdują się komórki progenitorowe neuronów i glia radialna. (A) Dzięki barwieniu jąder regiony neuroepithelialne są wyraźnie widoczne (białe strzałki) ze względu na wysoką gęstość jąder tworzących struktury pierścieniowate wokół powierzchni apikalnej. (B) Poprzez barwienie koperty wirusowej można zaobserwować stosunkowo wysoką obecność wirusa w obrębie tych struktur rozetkowych (białe groty strzałek). Należy zauważyć, że niewielka ilość wirusa występuje w różnych niezidentyfikowanych komórkach obwodowych. (C-D) Barwienie MAP2 lub inne barwienia specyficzne dla neuronów wykazują obecność w kulturach neuronów, które – po nałożeniu na barwienie wirusowe – nie wydają się być zainfekowane przez wirusa.&#160;<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56404/56404fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56404/56404fig7.jpg" /> 
Rycina 7: Immunofluorescencja kaspazy-3 w formie rozszczepionej w zainfekowanym organoidzie. 
Po infekcji można zastosować wskaźniki apoptozy, aby zbadać mechanizmy śmierci komórkowej występujące w organoidach. W tym przykładzie organoidy w 24. dniu były eksponowane na ZIKV przy MOI=0,1, a następnie poddano je kriosekcjonowaniu po 6 dniach. (A) Niezinfekowane organoidy nie wykazują obecności otoczki wirusowej (białko 4G2) oraz minimalnej ilości rozszczepionej kaspazy-3 wynikającej z homeostatycznej apoptozy zachodzącej w tkance. (B) Zainfekowane rozetki zaczynają wykazywać zwiększone poziomy apoptozy. (C) Rozetki wykazujące ciężką infekcję w barwieniu 4G2 mają również tendencję do wysokich poziomów rozszczepionej kaspazy-3 w tych obszarach. Istnieje bezpośrednia korelacja między stopniem nasilenia infekcji a ekspresją rozszczepionej kaspazy-3 w zainfekowanych rozetkach.&#160;<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56404/56404fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół opisuje technikę używaną do modelowania infekcji wirusem Zika rozwijającego się ludzkiego mózgu. Korzystając z linii komórek macierzystych typu dzikiego lub zmodyfikowanych, naukowcy mogą wykorzystać tę technikę do odkrycia różnych mechanizmów lub metod leczenia, które mogą wpływać na wczesną infekcję mózgu i wynikającą z niej małogłowie w zarodkach zakażonych wirusem Zika.

Modelowanie zakażenia rozwijającego się ludzkiego mózgu wirusem Zika in vitro przy użyciu organoidów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Ogólnym celem tej procedury jest modelowanie zakażenia wirusem zika w rozwijającym się ludzkim mózgu przy użyciu organoidów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii, takie jak, które komórki są zdolne do zakażenia i które białka są zaangażowane w szlak infekcji. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że naśladuje wczesną infekcję u ludzi, może być wykorzystywana w testach o wysokiej przepustowości i może być łączona z technikami genetyki fokucyjnej, takimi jak CRISPR.Ta metoda może dostarczyć informacji na temat mechanizmu infekcji wirusem zika. Może być również stosowany w innych systemach, takich jak badania przesiewowe leków i pseudotypowanie wirusów. Stosując regularne metody konserwacji komórek macierzystych, doprowadź hodowle do zbieżności od 50% do 70%.Sprawdź kultury za pomocą mikroskopii jasnego pola przy powiększeniu od 10 do 20 razy i upewnij się, że kolonia ma zdrową morfologię bez wykrywalnego różnicowania. Doprowadź pożywkę do konserwacji komórek macierzystych wolnych od ksenotypów do 37 stopni Celsjusza w gorącej kąpieli wodnej i rozmrozić dwa mililitry enzymatycznego odczynnika odrywającego i 50 mikrolitrów fiolki inhibitora skał podstawowych w temperaturze pokojowej. Następnie przygotuj 96-dołkową płytkę z dnem U o bardzo niskim nasadce, wielokanałową pipetę p200 i 25-mililitrowy zbiornik na odczynnik.Następnie podnieś 45 mililitrów pożywki do 50-mililitrowej stożkowej probówki. Dodaj 45 mikrolitrów inhibitora skalnego i dokładnie wymieszaj inhibitor, triterując mieszaninę, a następnie od dwóch do czterech w wersjach. Odessać próżniowo dwie studzienki sześciodołkowej płytki zawierającej komórki macierzyste i szybko dodać jeden mililitr odczynnika oddzielającego bez enzymów do każdej studzienki, a następnie inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery minuty.Następnie odessać próżniowo poddane działaniu studzienek i dodać jeden mililitr odczynnika enzymatycznego do oddzielania do każdej studzienki. Po pięciu minutach inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza wyjąć płytkę z inkubatora. Delikatnie postukaj w płytkę, aby rozbić zagregowane komórki.Następnie sprawdź komórki pod mikroskopem. Jeśli duże skupiska komórek są nadal widoczne, inkubuj płytkę przez dodatkowe dwie minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Powtarzaj ten krok, aż klastry przestaną być widoczne gołym okiem.Gdy komórki zostaną prawidłowo zdysocjowane, dodaj jeden mililitr pożywki podtrzymującej komórki macierzyste wolne od ksenotypu do każdej studzienki, aby dezaktywować enzymy dysocjacyjne. Przeciągnij zawiesinę komórek do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów i weź małą porcję do zliczania komórek. Podczas wirowania policz komórki i określ objętość reprodukcji zawiesiny potrzebną do osiągnięcia 60 000 komórek na mililitr zawiesiny.Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w ilości 60 000 komórek na mililitr w pożywce zawierającej inhibitor skały. Za pomocą pipety o pojemności pięciu mililitrów delikatnie wymieszaj komórki od pięciu do 10 razy, aby zapewnić jednolitą zawiesinę komórek. Natychmiast dodaj zawiesinę komórek do zbiornika na odczynnik i użyj wielokanałowej pipety p200, aby przenieść 150 mikrolitrów do każdej studzienki z bardzo niskim nasadką na dolnej 96-dołkowej płytce.Następnie odwirować płytkę o sile 150 x G przez jedną minutę, a następnie umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Nie naruszaj płytki przez 48 godzin. Począwszy od drugiego dnia, przygotuj 17 mililitrów pożywki zawierającej 17 mikrolitrów podstawowego inhibitora skały w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów.Podgrzej mieszaninę do 37 stopni Celsjusza w gorącej kąpieli wodnej. Wyjmij płytkę organoidową z inkubatora i za pomocą wielokanałowej pipety p200 powoli nabierz 75 mikrolitrów pożywki z krawędzi studzienek w pierwszym rzędzie. Następnie szybko wyrzuć go z powrotem do studni, aby usunąć luźne komórki i organoidy.Powtórz ten proces dyspersji dla każdego rzędu. Odczekaj 15 sekund, aby upewnić się, że organoidy opadły na dno każdej studzienki, a następnie powoli i ostrożnie odessać 75 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki za pomocą wielokanałowej pipety p200 i dozować ją do zbiornika na odpady. Następnie przenieś pożywkę zawierającą inhibitor skały do zbiornika odczynnika, dozuj 150 mikrolitrów pożywki do każdej studni organoidowej, a następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Podgrzej 17 mililitrów świeżej pożywki hodowlanej do 37 stopni Celsjusza, tym razem bez inhibitora skał. Używając wielokanałowej pipety p200 ustawionej na 100 mikrolitrów, powtórz pokazany wcześniej proces dyspersji i odczekaj 15 sekund, aby upewnić się, że organoidy opadły na dno swoich studzienek. Następnie ostrożnie odessać 125 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki i zastąpić 150 mikrolitrami podgrzanej pożywki.Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przygotuj pożywkę zgodnie z przepisem pokazanym tutaj, a następnie sterylnie przefiltruj zmieszany roztwór w filtrze o pojemności 500 mililitrów. Od czwartego dnia do momentu zakażenia komórek około 24 dnia należy przeprowadzać regularną konserwację co drugi dzień za pomocą pożywki do indukcji neuronów.Po przefiltrowaniu podgrzej 17 mililitrów pożywki do indukcji neuronów do 37 stopni Celsjusza, a resztę przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą wielokanałowej pipety p200, ustawionej na 100 mikrolitrów, rozprowadź wszystkie dołki płytki organoidowej, jak pokazano wcześniej. Odczekaj 15 sekund, aby upewnić się, że organoidy opadły na dno swoich studni.Ostrożnie odessać 125 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki i zastąpić ją 125 mikrolitrami świeżej pożywki do indukcji neuronalnej. Powtarzaj ten wyczyn indukcji neralnej co drugi dzień, aż organoidy będą gotowe na zakażenie wirusem zika. Przynieś 1x zbilansowany roztwór soli Earle'a, 1x PBS i pożywkę do indukcji neuronów do 37 stopni Celsjusza w gorącej kąpieli wodnej.Następnie rozcieńczyć wirusa zika o znanym stężeniu w 1x roztworze Earle'a do docelowej wielokrotności infekcji, która zwykle wynosi od 0,1 do 10. Za pomocą pipety p200 ostrożnie usuń całe podłoże z każdej studni organoidowej. Następnie szybko umyj organoidy 200 mikrolitrami podgrzanego 1x PBS.Podczas wyjmowania pożywki z każdej studzienki bardzo ważne jest, aby nie dotykać organoidu ani nie zasysać go do pipety. Może to spowodować nieodwracalne uszkodzenie organoidu. W takim przypadku najlepiej wyrzucić organoid.Następnie ostrożnie usuń cały pozostały płyn z każdej studni organoidowej za pomocą jednokanałowej pipety p200. Następnie szybko dodaj 50 mikrolitrów 1x roztworu Earle'a do udawanej infekcji lub roztworu wirusa Zika do każdej studzienki. Upewnij się, że każdy organoid jest całkowicie zanurzony po zakończeniu, umieść płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwie godziny.Po zakończeniu ekspozycji na wirusa umyj każdą studzienkę organoidów 200 mikrolitrami PBS. Pozwól organoidom osiąść przez 15 sekund, a następnie wyjmij PBS za pomocą jednokanałowej pipety p200. Na koniec dodaj 200 mikrolitrów świeżej pożywki do indukcji neuronów do każdej studzienki i umieść płytkę z powrotem w inkubatorze.Barwienie za pomocą DAPI, fosfo-wimentyny, TBR2 i MAP2 można połączyć, aby pokazać struktury korowe tworzące się w organoidach. Struktury te obejmują strefę komorową, strefę podkomorową, strefę pośrednią i płytkę korową w każdej rozecie. Hodowla organoidów do 108 dnia pozwala obserwować późniejsze etapy rozwoju.Chociaż warstwy korowe nie są tak widoczne w tego typu organoidach, naturalne przejście do glejogenezy zachodzi podobnie jak in vivo. Trzy dni po zakażeniu wirusem zika widoczna staje się różnica w wielkości organoidu. Skala tej różnicy zależy od mnogości infekcji wirusowych, które są stosowane do organoidów.Ta różnica w wielkości organoidów będzie się zwiększać w ciągu następnego tygodnia, aż do momentu, gdy zainfekowane organoidy zaczną się rozpadać. Po trzech dniach nastąpi również wzrost ilości szczątków komórkowych w zainfekowanych studniach w porównaniu ze studniami pozorowanymi. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby przestrzegać bezpiecznych praktyk laboratoryjnych, ponieważ używane są żywe materiały zakaźne.Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak immunohistochemia lub RNAC, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące biologii zaangażowanej w zakażenie wirusem zika związanym z rozwojem neuronalnym.

modelling-zika-virus-infection-developing-human-brain-vitro-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje stworzenie modelu in vitro infekcji wirusem Zika w rozwijającym się mózgu. Ludzkie organoidy mózgowe zawierające rozety komórek macierzystych, neuronalne komórki progenitorowe (NPC) i neurony są zakażone wirusem Zika. Wirus infekuje NPC i wywołuje apoptozę, zakłócając rozwój organoidów.

Opracowanie modelu in vitro zakażenia wirusem Zika w organoidach mózgowych

Film demonstruje domózgowe wstrzyknięcie zawiesiny wirusa Zika dorosłej myszy w celu wywołania neurodegeneracji. Znieczuloną mysz umieszcza się w stereotaktycznej ramie, a w odsłoniętej czaszce wierci się otwór do wstrzyknięcia. Zawiesina wirusa Zika jest wstrzykiwana do tkanki mózgowej. Infekcja wirusowa powoduje stan zapalny, prowadzący do neurodegeneracji.

Opracowanie modelu neurodegeneracji wywołanej wirusem Zika u dorosłej myszy

Ten film pokazuje procedurę zakażenia ludzkich płodowych nerwowych komórek macierzystych wirusem Zika. Zainfekowane komórki mogą być wykorzystane do dalszych badań.

Zakażenie płodowymi neuronalnymi komórkami macierzystymi wirusem Zika

Wirus Zika (ZIKV), nowy patogen, jest powiązany z nieprawidłowościami rozwojowymi płodu i małogłowiem. Stworzenie skutecznego systemu hodowli komórek zakaźnych ma kluczowe znaczenie dla badań nad replikacją ZIKV, a także dla opracowywania szczepionek i leków. W niniejszej pracy zilustrowano i omówiono różne testy wirusologiczne dotyczące ZIKV.

System zakaźnych hodowli komórek wirusa Zika i profilaktyczne działanie interferonów in vitro

Modelowanie rozwoju ludzkiego mózgu zostało utrudnione z powodu bezprecedensowej złożoności tkanki nabłonka nerwowego. W tym artykule opisano metodę wytwarzania organoidów mózgowych w celu wyznaczenia wczesnych zdarzeń rozwoju ludzkiego mózgu i modelowania małogłowia in vitro.

Generowanie organoidów ludzkiego mózgu pochodzących z iPSC w celu modelowania wczesnych zaburzeń neurorozwojowych

Tutaj opisujemy metodę tworzenia modelu mikrocefalii wywołanej wirusem Zika u myszy. Protokół ten obejmuje metody inokulacji śródmózgowej wirusa Zika w stadium embrionalnym, noworodkowym i dorosłym.

Tworzenie mysich modeli zaburzeń neurologicznych wywołanych wirusem Zika przy użyciu strategii iniekcji domózgowych: embrionalnej, noworodkowej i dorosłej

Ten artykuł szczegółowo opisuje metody, które są używane do rozbudowy ludzkich komórek macierzystych mózgu płodu w hodowli, a także jak różnicować je na różne podtypy neuronów i astrocyty, z naciskiem na wykorzystanie nerwowych komórek macierzystych do badania infekcji wirusem Zika.

Zakażenie wirusem Zika hodowanych komórek macierzystych neuronalnego mózgu ludzkiego płodu do analizy immunocytochemicznej

Tutaj opisujemy protokół generowania organoidów mózgowych z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Aby uzyskać organoidy mózgowe w dużych ilościach i wysokiej jakości, używamy domowych mini bioreaktorów.

Wytwarzanie organoidów mózgowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w domowych mini bioreaktorach

Przedstawiamy protokół generowania organoidu ludzkiego mózgu z rezydującym mikroglejem poprzez włączenie do rozwoju organoidów komórek progenitorowych pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) do rozwoju organoidów.

Wyprowadzenie organoidu ludzkiego mózgu z rozwojem mikrogleju

Niniejszy film prezentuje metodę wykorzystującą połączenie elektroporacji i mikroskopii konfokalnej do obrazowania na żywo pojedynczych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego. W ten sposób można przeprowadzić analizę in vivo rozwoju komórek progenitorowych neuronów przedmózgowia na poziomie klonalnym.

Obrazowanie live w trybie time-lapse klonalnie powiązanych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego

Poznaj modelowanie zakażenia wirusem Zika w rozwijającym się ludzkim mózgu przy użyciu organoidów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych. Ta metoda umożliwia badanie mechanizmów infekcji i potencjalnych terapii.

Modelowanie zakażenia rozwijającego się ludzkiego mózgu wirusem Zika in vitro przy użyciu organoidów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal

Modelowanie zakażenia rozwijającego się ludzkiego mózgu wirusem Zika in vitro przy użyciu organoidów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów