Name: Wykorzystanie platformy tkankowej bariery mikroSiM (μSiM) do modelowania bariery krew-mózg (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T12:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Odkryj modelowanie bariery krew-mózg za pomocą platformy tkankowej μSiM z wykorzystaniem ludzkich komórek iPSC. Ta metoda pozwala badać wpływ sepsy na funkcje mózgu i czynniki genetyczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

J.L.M., B.E., T.R.G., M.C.M., P.K., M.T., K.C., i L.W. zostały sfinansowane przez NIH grant R33 HL154249. J.L.M. został ufundowany przez R44 GM137651. M.M. został ufundowany przez Schmidt Program Award Del Monte Institute for Neuroscience, University of Rochester. M.T. został sfinansowany przez RF1 AG079138. K.C. był finansowany przez International Foundation for Ethical Research.

Analysis of Blood-Brain Barrier Models via Immunofluorescence Staining

<ol><li>Villabona-Rueda, A., Erice, C., Pardo, C. A., Stins, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+concept+of+the+blood+brain+barrier+%28BBB%29%3A+from+a+single+static+barrier+to+a+heterogeneous+and+dynamic+relay+center%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The evolving concept of the blood brain barrier (BBB): from a single static barrier to a heterogeneous and dynamic relay center.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 405(2019).</li>
<li>Nation, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+breakdown+is+an+early+biomarker+of+human+cognitive+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier breakdown is an early biomarker of human cognitive dysfunction.</a> Nature Medicine. 25 (2), 270-276 (2019).</li>
<li>Ferrari, C. C., Tarelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+and+systemic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinsons+Disease%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease and systemic inflammation.</a> Parkinsons Disease. 116 (3), 436813(2011).</li>
<li>Koch, E. V., Ledwig, V., Bendas, S., Reichl, S., Dietzel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+barrier-on-chip%3A+a+technology+for+reproducible+practice+in+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Tissue barrier-on-chip: a technology for reproducible practice in drug testing.</a> Pharmaceutics. 14 (7), 1451(2022).</li>
<li>Nishihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+blood-brain+barrier+dysfunction+contributes+to+multiple+sclerosis+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Intrinsic blood-brain barrier dysfunction contributes to multiple sclerosis pathogenesis.</a> Brain. 145 (12), 4334-4348 (2022).</li>
<li>Ortiz, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+blood-brain+barrier+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Medical+Research%22%5BJournal%5D)">Role of the blood-brain barrier in multiple sclerosis.</a> Archives of Medical Research. 45 (8), 687-697 (2014).</li>
<li>Orhun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+inflammatory+markers+and+cognitive+outcome+in+patients+with+acute+brain+dysfunction+due+to+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Neuropsychiatry%22%5BJournal%5D)">Association between inflammatory markers and cognitive outcome in patients with acute brain dysfunction due to sepsis.</a> Archives of Neuropsychiatry. 56 (1), 63-70 (2019).</li>
<li>Chen, Y., Yang, W., Chen, F., Cui, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COVID-19+and+cognitive+impairment%3A+neuroinvasive+and+blood-brain+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">COVID-19 and cognitive impairment: neuroinvasive and blood-brain barrier dysfunction.</a> Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 222(2022).</li>
<li>Hughes, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+activation+and+blood-brain+barrier+injury+as+risk+factors+for+delirium+in+critically+ill+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial activation and blood-brain barrier injury as risk factors for delirium in critically ill patients.</a> Critical Care Medicine. 44 (9), e809-e817 (2016).</li>
<li>Saraiva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle-mediated+brain+drug+delivery%3A+Overcoming+blood-brain+barrier+to+treat+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle-mediated brain drug delivery: Overcoming blood-brain barrier to treat neurodegenerative diseases.</a> Journal of Control Release. 235 (10), 34-47 (2016).</li>
<li>Jolliet-Riant, P., Tillement, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+transfer+across+the+blood-brain+barrier+and+improvement+of+brain+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Fundamental+%26+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Drug transfer across the blood-brain barrier and improvement of brain delivery.</a> Fundamental & Clinical Pharmacology. 13 (1), 16-26 (1999).</li>
<li>Abbott, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2009).</li>
<li>Siflinger-Birnboim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+sieving+characteristics+of+the+cultured+endothelial+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular sieving characteristics of the cultured endothelial monolayer.</a> Journal of Cellular Physiology. 132 (1), 111-117 (1987).</li>
<li>Bischoff, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pitfalls+in+assessing+microvascular+endothelial+barrier+function%3A+impedance-based+devices+versus+the+classic+macromolecular+tracer+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Pitfalls in assessing microvascular endothelial barrier function: impedance-based devices versus the classic macromolecular tracer assay.</a> Scientific Reports. 6, 23671(2016).</li>
<li>van der Helm, M. W., van der Meer, A. D., Eijkel, J. C., van den Berg, A., Segerink, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organ-on-chip+technology+for+blood-brain+barrier+research%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organ-on-chip technology for blood-brain barrier research.</a> Tissue Barriers. 4 (1), e1142493(2016).</li>
<li>Osaki, T., Shin, Y., Sivathanu, V., Campisi, M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+microfluidic+models+for+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">In vitro microfluidic models for neurodegenerative disorders.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (2), (2018).</li>
<li>Girard, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+and+low+permeability+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+blood-brain+barrier+models+depend+on+epithelial+or+endothelial+features%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">High and low permeability of human pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models depend on epithelial or endothelial features.</a> FASEB Journal. 37 (2), e22770(2023).</li>
<li>Vigh, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transendothelial+electrical+resistance+measurement+across+the+blood-brain+barrier%3A+a+critical+review+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Transendothelial electrical resistance measurement across the blood-brain barrier: a critical review of methods.</a> Micromachines. 12 (6), 685(2021).</li>
<li>Lea, T., et al. Caco-2 cell line. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLea%2C+T+%22The+Impact+of+Food+Bioactives+on+Health%3A+in+vitro+and+ex+vivo+models%22">The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models</a>. Verhoeckx, K., et al. , Cham (CH): Springer. (2015).</li>
<li>Felix, K., Tobias, S., Jan, H., Nicolas, S., Michael, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+transepithelial+electrical+resistance+%28TEER%29+are+affected+by+junctional+length+in+immature+epithelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Measurements of transepithelial electrical resistance (TEER) are affected by junctional length in immature epithelial monolayers.</a> Histochemistry and Cell Biology. 156 (6), 609-616 (2021).</li>
<li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).</li>
<li>Mossu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+silicon+nanomembrane+platform+for+the+visualization+of+immune+cell+trafficking+across+the+human+blood-brain+barrier+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">A silicon nanomembrane platform for the visualization of immune cell trafficking across the human blood-brain barrier under flow.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (3), 395-410 (2019).</li>
<li>Castro Dias, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+endothelial+tricellular+junctions+as+novel+sites+for+T-cell+diapedesis+across+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Brain endothelial tricellular junctions as novel sites for T-cell diapedesis across the blood-brain barrier.</a> Journal of Cell Science. 134 (8), jcs253880(2021).</li>
<li>Hudecz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrathin+silicon+membranes+for+in+situ+optical+analysis+of+nanoparticle+translocation+across+a+human+blood-brain+barrier+model%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Ultrathin silicon membranes for in situ optical analysis of nanoparticle translocation across a human blood-brain barrier model.</a> ACS Nano. 14 (1), 1111-1122 (2020).</li>
<li>Khire, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+mimetics+for+the+study+of+lukocyte-endothelial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Microvascular mimetics for the study of lukocyte-endothelial interactions.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 13 (2), 125-139 (2020).</li>
<li>Salminen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+apicobasal+polarity+coordinates+distinct+responses+to+luminally+versus+abluminally+delivered+TNF-alpha+in+a+microvascular+mimetic%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%3A+Quantitative+Biosciences+from+Nano+to+Macro%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell apicobasal polarity coordinates distinct responses to luminally versus abluminally delivered TNF-alpha in a microvascular mimetic.</a> Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 12 (11), 275-289 (2020).</li>
<li>DesOrmeaux, J. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoporous+silicon+nitride+membranes+fabricated+from+porous+nanocrystalline+silicon+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Nanoporous silicon nitride membranes fabricated from porous nanocrystalline silicon templates.</a> Nanoscale. 6 (18), 10798-10805 (2014).</li>
<li>Hill, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+generation+nanoporous+silicon+nitride+membranes+for+high+toxin+clearance+and+small+format+hemodialysis%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Second generation nanoporous silicon nitride membranes for high toxin clearance and small format hemodialysis.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (4), e1900750(2020).</li>
<li>Salminen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrathin+dual-scale+nano-+and+microporous+membranes+for+vascular+transmigration+models%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Ultrathin dual-scale nano- and microporous membranes for vascular transmigration models.</a> Small. 15 (6), e1804111(2019).</li>
<li>Gillmer, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+the+failure+of+ultrathin+porous+membranes+in+bulge+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Thin+Solid+Films%22%5BJournal%5D)">Predicting the failure of ultrathin porous membranes in bulge tests.</a> Thin Solid Films. 631, 152-160 (2017).</li>
<li>Ishimatsu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-selective+permeability+of+ultrathin+nanopore+silicon+membrane+as+studied+using+nanofabricated+micropipet+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ion-selective permeability of ultrathin nanopore silicon membrane as studied using nanofabricated micropipet probes.</a> Analytical Chemistry. 82 (17), 7127-7134 (2010).</li>
<li>Kim, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structure-permeability+relationship+of+ultrathin+nanoporous+silicon+membrane%3A+a+comparison+with+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A structure-permeability relationship of ultrathin nanoporous silicon membrane: a comparison with the nuclear envelope.</a> Journal of American Chemical Society. 130 (13), 4230-4231 (2008).</li>
<li>Snyder, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+and+theoretical+analysis+of+molecular+separations+by+diffusion+through+ultrathin+nanoporous+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Membrane+Science%22%5BJournal%5D)">An experimental and theoretical analysis of molecular separations by diffusion through ultrathin nanoporous membranes.</a> Journal of Membrane Science. 369 (1-2), 119-129 (2011).</li>
<li>McCloskey, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+modular+%C2%B5SiM%3A+a+mass+produced%2C+rapidly+assembled%2C+and+reconfigurable+platform+for+the+study+of+barrier+tissue+models+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">The modular µSiM: a mass produced, rapidly assembled, and reconfigurable platform for the study of barrier tissue models in vitro.</a> Advanced Healthcare Materials. 11 (18), e2200804(2022).</li>
<li>Mansouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+modular+microSiM+reconfigured%3A+integration+of+microfluidic+capabilities+to+study+in+vitro+barrier+tissue+models+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">The modular microSiM reconfigured: integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow.</a> Advanced Healthcare Materials. 11 (21), e2200802(2022).</li>
<li>Su, S. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tissue+chip+with+integrated+digital+immunosensors%3A+In+situ+brain+endothelial+barrier+cytokine+secretion+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">A tissue chip with integrated digital immunosensors: In situ brain endothelial barrier cytokine secretion monitoring.</a> Biosensors and Bioelectronics. 224, 115030(2023).</li>
<li>Nishihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+brain+microvascular+endothelial+cell-like+cells+suitable+to+study+immune+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100563(2021).</li>
<li>Hudecz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrathin+silicon+membranes+for+in+situ+optical+analysis+of+nanoparticle+translocation+across+a+human+blood-brain+barrier+model%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Ultrathin silicon membranes for in situ optical analysis of nanoparticle translocation across a human blood-brain barrier model.</a> ACS Nano. 14 (1), 1111-1122 (2020).</li>
<li>Gastfriend, B. D., Stebbins, M. J., Du, F., Shusta, E. V., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+brain+pericyte-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cell-derived+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Differentiation of brain pericyte-like cells from human pluripotent stem cell-derived neural crest.</a> Current Protocols. 1 (1), e21(2021).</li>
<li>Nishihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+blood-brain+barrier+models+for+studying+immune+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Advancing human induced pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models for studying immune cell interactions.</a> FASEB Journal. 34 (12), 16693-16715 (2020).</li>
<li>Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+movers+and+shapers+in+immune+privilege+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The movers and shapers in immune privilege of the CNS.</a> Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).</li>
<li>Bechmann, I., Galea, I., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+blood-brain+barrier+%28not%29%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">What is the blood-brain barrier (not).</a> Trends in Immunology. 28 (1), 5-11 (2007).</li>
</ol>

J.L.M. jest współzałożycielem SiMPore i posiada udziały w spółce. SiMPore komercjalizuje ultracienkie technologie oparte na krzemie, w tym membrany wykorzystane w tym badaniu.

Chociaż wióry membranowe zostały zaprojektowane z myślą o stabilności, mogą pękać lub pękać, jeśli są nieprawidłowo obsługiwane podczas montażu. Dlatego tak ważne jest, aby chwycić chip w nacięciach pęsety do wiórów i delikatnie umieścić go w uchwycie. Podczas ogólnego obchodzenia się z urządzeniami należy podjąć dodatkowe środki ostrożności, aby nie uderzyć ani nie upuścić urządzeń. Podczas łączenia chipa membranowego z uchwytem A1, chip musi być ułożony płasko i wyśrodkowany na filarze uchwytu A1, aby uniknąć pękania membrany podczas łączenia z elementem 1. Ponadto po zdjęciu masek ochronnych należy unikać jakiegokolwiek kontaktu z odsłoniętymi warstwami PSA. Podczas obchodzenia się z komponentem 2 po zdjęciu masek ochronnych zaleca się trzymanie go wzdłuż krawędzi elementu i użycie pęsety w celu złapania trójkątnego rogu, który jest wolny od PSA.
Podczas gdy opisano protokoły hodowli komórkowych dla możliwych modeli BBB, opisany tutaj model kohodowli BMEC/perycytów BBB może być wystarczający lub niewystarczający w zależności od kontekstu fizjologicznego i interesujących pytań. Na przykład transport komórek odpornościowych zachodzi głównie w żyłkach pozakapilarnych mózgu41,42. W tych regionach przestrzeń okołonaczyniowa oddziela barierę BMEC/perycytów od granic glejowych ustanowionych przez astrocyty. Tak więc w żyłkach pozakapilarnych jednostka nerwowo-naczyniowa (NVU) składa się z dwóch fizycznie oddzielonych barier połączonych szeregowo, a astrocyty stopy końcowe nie stykają się bezpośrednio z barierą krwi BMEC / perycytów, która jest dobrze reprezentowana przez obecny model. Jeśli celem jest model NVU, który uwzględnia wpływ czynników wydzielanych przez astrocyty na barierę krwi, do urządzenia można dodać przedział astrocytów, który umożliwia wymianę rozpuszczalnych czynników przez przestrzeń okołonaczyniową. Przykład ten został zilustrowany wcześniej34 i może zostać rozszerzony o inne komórki, takie jak mikroglej i neurony, w przedziale "mózgu" 3D. Modułowa architektura platformy umożliwia wykorzystanie prostych strategii montażu w celu osiągnięcia tych rekonfiguracji, dzięki czemu platforma jest tak prosta lub złożona, jak to jest potrzebne do rozwiązania istniejących hipotez. Każda konfiguracja hodowli komórkowej; Musi być jednak zoptymalizowany pod kątem nowych linii komórkowych i wielokultur. Na przykład, ze względu na właściwości membran z azotku krzemu, może być konieczne dostosowanie roztworów powlekających w porównaniu z płytkami do hodowli tkankowych. Włączenie fibronektyny zazwyczaj pomaga w przyczepianiu się komórek i przetrwaniu. Co więcej, użytkownicy mogą hodować komórki śródbłonka i perycyty w przeciwnych kierunkach. W takim przypadku konieczna może okazać się modyfikacja np. sposobu wykonywania i interpretacji pomiarów przepuszczalności. Przedstawienie kroków dla tego typu kultury wykracza jednak poza zakres tego artykułu.
Innym wyzwaniem, które można napotkać podczas hodowli komórkowej, jest szybkie odparowanie pożywki, ponieważ urządzenia mogą być bardziej wrażliwe na zmiany w środowisku w porównaniu ze standardowymi płytkami i kolbami do hodowli tkankowych. Jeśli zaobserwuje się nadmierne parowanie lub spowolnienie wzrostu komórek, należy zmierzyć wszystkie krytyczne parametry inkubatora, aby zapewnić dokładne ustawienia. Do nasadki tkankowej lub małej szalki Petriego umieszczonej w komorze hodowli komórkowej można dodać więcej wody lub należy częściej wymieniać pożywkę. Ponadto bąbelki mogą dostać się do dolnego kanału i utknąć w wykopie dla urządzeń do kopania. Chociaż można je usunąć, najłatwiej jest unikać dodawania bąbelków w pierwszej kolejności. W tym celu należy sprawdzić, czy na końcówce pipety nie ma pęcherzyków powietrza ani czy na końcu końcówki pipety nie ma pęcherzyków powietrza, zanim doda się media do dolnej komory. Ponadto parowanie mediów w kanale może prowadzić do powstania szczeliny między powierzchnią nośnika a górną częścią portu. Niewielka objętość nośnika może być pipetowana do jednego portu, aż nośnik dotrze do powierzchni przeciwległego portu, po czym nośnik może być wymieniany w tym przeciwległym porcie. Podczas gdy pożywki hECSR i E6 + 10% FBS nie powinny być podgrzewane w łaźni wodnej, inne media można wstępnie podgrzać, aby ograniczyć tworzenie się pęcherzyków. Jeśli pęcherzyk dostanie się do dolnej komory, można go usunąć, szybko pipetując 100 μl przez kanał. Jednak ta metoda może prowadzić do zanieczyszczenia między komorami lub mediów rozlanych po powierzchni urządzenia. Może również zaburzać warstwy komórkowe. Alternatywnie pożywkę można najpierw wyjąć z kanału, a następnie ponownie wprowadzić w objętości 50 μl. Usunięcie nośnika w pierwszej kolejności może jednak spowodować powstawanie większej ilości pęcherzyków w kanale. Jeśli pęcherzyk nie znajduje się bezpośrednio pod obszarem błony, można go pozostawić w kanale bez wpływu na hodowlę komórkową.
Przyczepianie i wzrost perycytów, jak pokazano na rycinie 2, może być trudne. Zastosowanie zoptymalizowanej gęstości wysiewu jest niezbędne do utworzenia warstwy o fizjologicznie istotnym stosunku komórek perycytów do śródbłonka. Ponadto, ponieważ perycyty są wrażliwe na ścinanie, cała wymiana pożywki w kanale powinna odbywać się bardzo powoli, aby chronić komórki. W przypadku hodowli BPLC lepsze przyleganie można uzyskać, pokrywając dolną komorę 800 μg/ml kolagenu typu IV lub 100 μg/ml fibronektyny.
Immunocytochemia w opisywanych tu urządzeniach umożliwia jakościową analizę zdrowia i funkcji komórek. Metody barwienia na płytkach do hodowli tkankowych lub innych platformach powinny być bezpośrednio przekładalne na platformę. W przypadku hodowli komórkowej tylko w górnej komorze, po utrwaleniu, PBS można dodać do dolnej komory i pozostawić na pozostałe etapy, z blokowaniem i barwieniem wykonanym tylko w górnej komorze. Minimalizuje to ryzyko pęknięcia membran lub dostania się pęcherzyków do dolnej komory. Do barwienia kokultur zalecamy stosowanie obu komór na wszystkich etapach. Ważne jest, aby pamiętać, że lepkość utrwalacza i PBS różni się od lepkości pożywki. W związku z tym dodawanie pęcherzyków powietrza do dolnej komory może być łatwiejsze i należy zachować szczególną ostrożność, aby przed pipetowaniem do dolnej komory sprawdzić, czy na końcówkach pipet znajduje się powietrze na końcu końcówki.
Protokół opisany dla testu przepuszczalności małych cząsteczek pozwala na funkcjonalną i ilościową ocenę funkcji barierowej komórek śródbłonka hodowanych w urządzeniu μSiM. Jednym z problemów, który może wystąpić podczas tego testu, jest wciąganie pęcherzyków powietrza do pipety podczas pobierania próbki z dolnego kanału na kroku protokołu 4.1.7.4. Aby uniknąć tego problemu, ważne jest, aby upewnić się, że końcówka jest uszczelniona w porcie przed rozpoczęciem pobierania próbki, a próbka nie powinna być pobierana zbyt szybko. Jeśli to nie rozwiąże problemu, rozmiar użytych końcówek może być zbyt mały lub zbyt duży, aby zmieścić się w portach; skorzystaj ze wskazówek podanych w Tabeli materiałów. W przypadku zmierzenia nieoczekiwanie wysokich wartości przepuszczalności pomimo zdrowo wyglądającej zlewającej się monowarstwy, należy sprawdzić integralność monowarstwy pod kątem zakłóceń podczas pobierania próbki. Zalecamy, aby zawsze sprawdzać monowarstwę pod mikroskopem natychmiast po pobraniu próbki. Jeśli monowarstwa nadal wydaje się nienaruszona i zdrowa, próbkę można utrwalić i ocenić biologiczne markery funkcji bariery, na przykład poprzez barwienie immunologiczne białek połączeniowych. I odwrotnie, w przypadku pomiaru nieoczekiwanie niskich wartości przepuszczalności, ważne jest, aby upewnić się, że próbka 50 μl pożywki jest pobierana z dolnego kanału bez pęcherzyków powietrza. Jeżeli pożywka wydostaje się z portu do pobierania próbek zaraz po umieszczeniu końcówki zbiornika, należy ją zebrać przed włożeniem pipety do portu do pobierania próbek, ponieważ większość małych cząsteczek fluorescencyjnych będzie obecna w początkowej objętości 10 μl pobranej z dolnego kanału. Rysowanie okręgów wokół portów za pomocą pisaka hydrofobowego lub umieszczenie taśmy hydrofobowej z otworem wokół portu zapobiega rozprzestrzenianiu się pasywnie pompowanych mediów. Jeżeli podczas pobierania próbek zostaną usunięte pęcherzyki powietrza lub nie zostanie usunięta cała próbka o objętości 50 μl, próbki nie wolno używać. Alternatywnie można określić dokładną objętość i wykorzystać ją w obliczeniach przepuszczalności; należy to jednak zrobić tylko wtedy, gdy usunięta objętość wynosi ≥40 μl, co odpowiada ~98-99% odzysku barwnika34.

Żywe tkanki są podzielone na wyspecjalizowane komórki, które tworzą i utrzymują bariery oraz regulują, które komórki i cząsteczki są transportowane z jednego przedziału do drugiego. Niewłaściwa regulacja funkcji bariery może być źródłem zarówno ostrych chorób, jak i chorób przewlekłych. Bariera krew-mózg (BBB) jest najbardziej restrykcyjną barierą tkankową w ludzkim ciele1. Dysfunkcja bariery krew-mózg leży u podstaw wielu chorób ośrodkowego układu nerwowego (OUN), w tym choroby Alzheimera2, choroby Parkinsona3,4 i stwardnienia rozsianego5,6. Uraz bariery krew-mózg jest również związany z długotrwałym upośledzeniem funkcji poznawczych w wyniku ostrych zaburzeń, takich jak sepsa7, COVID-198 i maja<czenie pooperacyjne sup class="xref">9. Opracowanie leków, które mogą potencjalnie leczyć choroby mózgu, było frustrująco trudne ze względu na wyzwanie polegające na celowym naruszeniu bariery krew-mózg w celu dostarczenia bioaktywnych cząsteczek do celów w mózgu10. Z tych powodów metody badania funkcji BBB in vitro mają ogromne znaczenie dla zrozumienia i leczenia chorób OUN.
Podstawowe metody pomiaru funkcji bariery in vitro polegają na stworzeniu monowarstwy lub kokultury na półprzepuszczalnej membranie i zmierzeniu oporu wywieranego przez komórki na dyfuzję małych cząsteczek lub małe prądy elektryczne11,12,13,14. Podczas gdy pojawienie się systemów mikrofizjologicznych (MPS) stworzyło wiele możliwości modelowania BBB w 3D15,16, różnorodność geometrii systemów utrudnia porównanie pomiarów przepuszczalności między MPS lub z ustalonymi wartościami literaturowymi. Ustalenie wiarygodnych wartości wyjściowych jest szczególnie ważne w badaniach BBB, w których, ze względu na rozległą regulację bariery przez komórki śródbłonka naczyń krwionośnych mózgu, wartości przepuszczalności in vitro są dokładnie analizowane12,17,18. Z tych powodów pomiary przepuszczalności w monowarstwach ustanowionych na membranach 2D pozostaną podstawą badań BBB w nadchodzących latach. Dotyczy to również innych barier tkankowych, w tym barier nabłonkowych, w przypadku których bezwzględne wartości przepuszczalności linii bazowej są wykorzystywane do walidacji i porównania modeli in vitro19,20,21.
Mając na celu stworzenie nowego, wartościowego narzędzia dla społeczności badawczej BBB, wprowadziliśmy22 i zaawansowane23,24,25,26 mikrourządzenie wyposażone w silicon membrane (μSiM) do wykorzystania w modelowaniu tkanek barierowych w ciągu ostatnich 5 lat. Cechą umożliwiającą platformę jest ultracienka (o grubości <100 nm) membrana z setkami milionów nanoporów27,28 lub mieszanka nanoporów i mikroporów29. Wolnostojące chipy membranowe są produkowane na krzemowym "chipie" o grubości 300 μm, który stabilizuje ultracienkie struktury30 i umożliwia ich obsługę za pomocą pęsety do montażu urządzenia. Ze względu na ich ultracienką naturę, membrany mają przepuszczalność o dwa rzędy wielkości wyższą niż w przypadku konwencjonalnych membran trawionych ścieżkowo stosowanych w komercyjnych urządzeniach do hodowli membranowej31,32. W praktyce oznacza to, że przeszkoda membrany w dyfuzji cząsteczek mniejszych niż nanopory (<60 nm) jest znikoma33. Tak więc, w przypadku barier komórkowych, tylko komórki i zdeponowane przez nie matryce będą określać szybkość transportu małych cząsteczek z przedziałów wierzchołkowych do podstawnych, które są oddzielone błoną34. Konstrukcja urządzenia i ultracienka natura membran zapewniają również wiele korzyści dla mikroskopii optycznej. Należą do nich: 1) możliwość śledzenia żywych kultur za pomocą kontrastu fazowego lub obrazowania w jasnym polu, 2) zdolność do barwienia fluorescencyjnego i obrazowania in situ bez konieczności ekstrakcji i przenoszenia membrany do szkła nakrywkowego oraz 3) fakt, że błony są cieńsze niż "plastry" konfokalne, dzięki czemu bezpośrednie kokultury mają bardziej naturalne odstępy między typami komórek niż można to osiągnąć w przypadku membran trawionych ścieżkowo o grubości 6-10 μm.
Ostatnio rozwinęliśmy platformę do formatu modułowego, aby ułatwić szybki montaż34 i dostosowywanie35,36. Wykorzystaliśmy format modułowy do dystrybucji komponentów urządzenia między naszymi laboratoriami bioinżynieryjnymi i współpracującymi laboratoriami zajmującymi się barierą mózgową. Następnie wspólnie opracowaliśmy protokoły montażu urządzeń, monokultury i kohodowli, barwienia immunofluorescencyjnego oraz przepuszczalności małych cząsteczek i wykazaliśmy, że metody te są powtarzalne między laboratoriami. Korzystając z tych protokołów, wykazaliśmy również, że modułowa platforma obsługuje zwalidowaną barierę krew-mózg opracowaną przy użyciu metody rozszerzonej hodowli śródbłonka (EECM) do tworzenia mikrokrążopodobnych komórek śródbłonka mózgu (BMEC) z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC)37. Celem niniejszego raportu jest bardziej szczegółowy przegląd tych metod i, za pomocą dołączonego filmu, ułatwienie szerszego przyjęcia platformy w społeczności BBB.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD31 Przeciwciało poliklonalne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA5-32321</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało IgG Claudin-5, 4C3C2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35-2500</td><td></td></tr><tr><td>Koza &alfa;-Mysz IgG Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Koza &alfa;-Królik IgG Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11011</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>NG2, mysz IgG2a, 9.2.27</td><td>Millipore</td><td>&nbsp; </td><td></td>MAB2029</tr><tr><td>Mysie przeciwciało IgG Occlludin, OC-3F10</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>33-1500</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR&beta;, przeciwciało IgG królika, 28E1</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>3169</td><td></td></tr><tr><td>VE-kadheryna mysz IgG2B Klon # 123413</td><td>R& D Systems</td><td>MAB9381</td><td></td></tr><tr><td>królicze przeciwciało IgG ZO-1, poliklonalne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td>Chemikalia, peptydy i białka rekombinowane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% Metanol</td><td>VWR</td><td>101443-718</td><td>Można zastąpić podobnymi produktami</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyd</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>Może być zastąpiony podobnymi produktami</td></tr><tr><td>: Accutase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>suplement B27</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen IV z ludzkiego łożyska</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen, roztwór typu I z ogona szczura</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3867-1VL</td><td>Można zastąpić podobnymi produktami</td></tr><tr><td>DMEM/Szynka" s F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 Podłoże do wzrostu komórek śródbłonka-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Essential 6 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1516401</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Szczytowa surowica</td><td>PS-FB1</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna z osocza bydlęcego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna białko ludzkie, osocze</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>33016015</td><td>Można zastąpić podobnymi produktami</td></tr><tr><td>hESFM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11111044</td><td></td></tr><tr><td>Lucifer Yellow CH sól dilitowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861502</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>500627</td><td>Może być zastąpiony podobnymi produktami</td></tr><tr><td>PBS bez wapń, magnez</td><td>Cytiva</td><td>SH30256.01</td><td>Może być zastąpiony podobnymi produktami</td></tr><tr><td>Pericyte Medium</td><td>ScienCell</td><td>1201</td><td>Użyj kompletnego zestawu (zawiera suplementy)</td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna, 10 mg/ml</td><td>ScienCell</td><td>0413</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>JT Baker</td><td>X198-05</td><td>Może być zastąpiony podobnymi produktami</td></tr><tr><td>UltraPure Woda destylowana wolna od DNaz/RNaz</td><td>Invitrogen&handel;</td><td>10977015</td><td>Może być zastąpiony podobnymi produktami</td></tr><tr><td><silny>Modele eksperymentalne: Linie komórkowe< / silna></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>bariera krew-mózg linia komórkowa hCMEC/D3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCC066</td><td></td></tr><tr><td>Perycyty naczyniowe ludzkiego mózgu</td><td>ScienCell</td><td>1200</td><td></td></tr><tr><td>iPS(IMR90)-4 ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste</td><td>WiCell</td><td>RRID:CVCL_C437</td><td></td></tr><tr><td><mocne>Wyroby szklane i plastikowe</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>150 mm Naczynie do hodowli komórkowych z siatką 20 mm</td><td>Falcon</td><td>353025</td> Clamps VWR MFLX06832-10 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli tkankowych Corning (6-dołkowe)</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Płaskie 96-dołkowe niewiążące mikropłytki</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655900</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na szkiełko mikroskopowe</td><td>&nbsp; SiMPore</td><td>USIM-SB</td><td>Wymiary kompatybilne z uchwytami do szkiełek mikroskopowych</td></tr><tr><td>Nunc 15 mL Stożkowe sterylne polipropylenowe probówki wirówkowe</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 50 mL Stożkowe sterylne polipropylenowe probówki</td><td>wirówkowe Thermo Fischer Scientific</td><td>339653</td><td>Nasadki do probówek można napełnić wodą do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet P20-200</td><td>VWR</td><td>76322-516</td><td>Alternatywne marki mogą nie uszczelniać tak skutecznie</td></tr><tr><td>portów Filtry Transwell (12 dołków, 12 mm, 0,4 i mu; m wielkość porów, PC)</td><td>CoStar</td><td>3401</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X Obiektyw (dla Andor)</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>MRD00105</td><td>Powietrze; szerokość szer.: 4 mm; Obiektyw NA 0.45</td></tr><tr><td>10X (dla Nikona)</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>MRP40102</td><td>Powietrze; szerokość szerokość: 6,2 mm; NA 0.25</td></tr><tr><td>Obiektyw 40X (LWD) (dla Andor)</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>MRD77410</td><td>Zanurzenie w wodzie; Szerokość szerokość: 590-610 mm; NA 1.15</td></tr><tr><td>Andor Mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem</td><td>Oxford Instruments, Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ts2 Mikroskop z kontrastem fazowym</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td>Może być zastąpiony podobnymi produktami</td></tr><tr><td>TECAN Infinite M200</td><td>TECAN</td><td></td><td>Może być zastąpiony podobnymi produktami</td></tr><tr><td>Inne</td>Advanced PAP Pen Zalecana końcówka Millipore Sigma Z672548 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>2 mm</td></tr><tr><td>Zestaw montażowy z uchwytami</td><td>SiMPore</td><td>USIM-JIGSET</td><td>W tym mocowanie A1, A2, B1 i B2</td></tr><tr><td>Adapter do aparatu fotograficznego do mikroskopów:</td><td>AmScope</td>, <td>CA-CAN-SLR, Canon SLR / D-SLR</td><td>&Phi; 23.2 - &Phi; Adapter 30 pasuje do Nikon Eclipse Ts2</td></tr><tr><td>Canon EOS Rebel SL3 DSLR Camera</td><td>Canon</td><td>EOS 250D, BH #CAEDRSL3B, MFR #3453C001</td><td>Można zastąpić podobnymi produktami</td></tr><tr><td>Sitko do komórek, 40 i mikro; m</td><td>Millipore Sigma (Corning)</td><td>CLS431750</td><td></td></tr><tr><td>Składnik 1</td><td>SiMPore</td><td>USIM-C1</td><td></td></tr><tr><td>Składnik 2</td><td>SiMPore</td><td>USIM-C2</td><td></td></tr><tr><td>Chipy membranowe</td><td>SiMPore</td><td>NPSN100-1L</td><td>Dostępne są inne formaty chipów</td></tr><tr><td>Pęseta do obsługi SMD pod podwójnym kątem</td><td>Techni-Tool</td><td>758TW003</td><td>"Pęseta do wiórów"</td></tr><tr><td>Nierdzewny stalowa precyzyjna pęseta GG</td><td>Techni-Tool</td><td>758TW534</td><td>"Pęseta prosta"</td></tr><tr><td><mocna>Oprogramowanie</mocna></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Do przetwarzania obrazu</td></tr><tr><td>Fusion</td><td>Oxford Instruments, Andor</td><td></td><td>Instrukcje dla wersji 2.3.0.44</td></tr><tr><td>i-control</td><td>TECAN</td><td></td><td>Instrukcje dla wersji 2.0</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>Do przetwarzania obrazu. Instrukcje dla wersji 9.9.0</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie platformy tkankowej bariery mikrosim (μsim) do modelowania bariery krew-mózg

Use of the MicroSiM (&#181;SiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier

MikroSiM (μSiM) to oparta na błonie platforma hodowlana do modelowania bariery krew-mózg (BBB). W przeciwieństwie do konwencjonalnych platform opartych na membranach, μSiM zapewnia eksperymentatorom nowe możliwości, w tym obrazowanie żywych komórek, niezakłóconą sygnalizację parakrynną między komorami "krwi" i "mózgu" oraz możliwość bezpośredniego obrazowania immunofluorescencji bez konieczności ekstrakcji/ponownego montażu błon. W tym miejscu pokazujemy podstawowe zastosowanie platformy do tworzenia modeli monokulturowych (komórki śródbłonka) i kokulturowych (komórki śródbłonka i perycyty) bariery krew-mózg przy użyciu ultracienkich nanoporowatych membran z azotku krzemu. Wykazujemy zgodność zarówno z pierwotnymi hodowlami komórkowymi, jak i hodowlami indukowanych przez ludzi pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC). Dostarczamy metody analizy jakościowej modeli BBB za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego i demonstrujemy użycie μSiM do ilościowej oceny funkcji bariery w teście przepuszczalności małych cząsteczek. Przedstawione metody powinny umożliwić użytkownikom stworzenie własnych modeli barierowych na platformie, co przyczyni się do postępu w wykorzystaniu technologii chipów tkankowych do badania tkanek ludzkich.

Montaż urządzenia w konfiguracji z rowkiem skierowanym w dół przedstawiono na Rysunku 1. Przyrządy pomocnicze prowadzą proces montażu komponentów oraz chipa membranowego. Komponent 1 wykonany jest głównie z akrylu z powierzchnią PSA umożliwiającą wiązanie z chipem, posiada otwór do komory dolnej oraz porty umożliwiające dostęp pipetą do komory dolnej. Komponent 2 stanowi warstwę kanałów i zawiera w prawym górnym rogu nieprzylepny obszar „trójkąta” bez PSA, służący do chwytania. Urządzenia w konfiguracji z rowkiem skierowanym w dół zapewniają płaski obszar wzrostu hodowli komórkowych w komorze górnej, podczas gdy urządzenia w konfiguracji z rowkiem skierowanym w górę mają płaską powierzchnię do hodowli komórkowych w komorze dolnej.
Przeprowadziliśmy monokultury endotelialne oraz kokultury hCMEC/D3 i HBVPs, a także hiPSC IMR90-4-pochodnych komórek EECM-BMEC-like i BPLCs; obrazy w kontraście fazowym pozyskano za pomocą mikroskopu kontrastowego Nikon Eclipse Ts2 z obiektywem 10x (Rycina 2). Przedstawiono optymalne gęstości wysiewu dla pierwotnych kultur komórkowych (obrazy wykonane 1 dzień po wysiewie), a także zbyt niską gęstość wysiewu HBVPs (Rycina 2A). Końcowe obrazy fazowe kokultur i monokultur (6 dni hodowli komórek endotelialnych) mogą być trudne do rozróżnienia (Rycina 2C), a potwierdzenie pomyślnej kokultury komórek pierwotnych może wymagać barwienia immunofluorescencyjnego (patrz sekcja 3 protokołu). Zilustrowano również niską, wysoką i optymalną gęstość wysiewu BPLC pochodzących z hiPSC (Rycina 2B). Kokultura pochodząca z hiPSC jest łatwiejsza do rozróżnienia w obrazowaniu kontrastowym w porównaniu do kokultur pierwotnych (Rycina 2D). Niski wysiew BPLC skutkuje słabym pokryciem przez perycyty i ich grudkowaniem, natomiast zbyt gęsty wysiew prowadzi do odwarstwiania się warstwy perycytów od membrany. Ponadto zbyt szybka wymiana medium w dolnej komorze może spowodować utratę perycytów, ponieważ komórki te są bardzo wrażliwe na siły ścinające. Optymalne pokrycie przez perycyty dla modelu BBB wynosi ~90%, bez przerw w warstwie endotelialnej.
Reprezentatywne obrazy immunobarwionej kokultury pochodzącej z hiPSC przedstawiono na Rysunku 3 (6 dni hodowli komórek śródbłonka). Pochodne z IMR90-4 komórki BPLC zabarwiono na marker perycytów PDGFRβ, a pochodne z IMR90-4 komórki EECM-BMEC-like zabarwiono na marker połączeń przylegających VE-cadherin. Do barwienia jąder komórkowych użyto Hoechst. Obrazy pozyskano za pomocą konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym (Spinning Disc), stosując obiektyw 40x LWD z grubością warstwy optycznej 0,2 µm, a następnie przetworzono w programie Imaris. Obie warstwy komórek są widoczne, mimo że cienka nanomembrana nie jest dostrzegalna.
Przeprowadziliśmy pomiar przepuszczalności małych cząsteczek oparty na pobieraniu próbek, stosując te same warunki eksperymentalne w dwóch fizycznie oddalonych od siebie laboratoriach na Uniwersytecie w Bernie w Szwajcarii oraz Uniwersytecie w Rochester w stanie Nowy Jork w USA, aby wykazać międzylaboratoryjną powtarzalność wyników (Rysunek 4)34. Komórki typu EECM-BMEC pochodzące z hiPSC IMR90-4 hodowano w urządzeniu µSiM przez 2, 4 lub 6 dni oraz na filtrach transwell przez 6 dni. W obu laboratoriach test przeprowadzono przy użyciu 150 µg/mL Lucifer Yellow (457 Da). Wysoka zmienność przepuszczalności komórek śródbłonka hodowanych w urządzeniu przez 2 dni wskazuje, że 2 dni hodowli były niewystarczające do dojrzewania bariery. Po dojrzewaniu bariery – od 4. dnia – nie stwierdzono istotnych różnic w przepuszczalności między laboratoriami. Wykazaliśmy również, że przepuszczalność komórek śródbłonka hodowanych w µSiM oraz na filtrach transwell przez 6 dni była zgodna z wynikami opublikowanymi wcześniej40.
<img alt="Schemat montażu urządzenia mikrofluidycznego: warstwy akrylowe, klej naciskowy, port pipety, konfiguracja rowka." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Etapy montażu µSiM. (A) Przygotowanie chipa poprzez umieszczenie go w uchwycie A1. Chip należy ułożyć rowkiem do góry, aby otrzymać urządzenie z rowkiem skierowanym w dół, lub rowkiem do dołu, aby otrzymać urządzenie z rowkiem skierowanym do góry. (B) Połączenie komponentu 1 z chipem poprzez usunięcie masek ochronnych z komponentu 1 i umieszczenie go stroną aktywną do dołu w FA1. Połączenie następuje poprzez wywarcie nacisku za pomocą uchwytu A2. (C) Połączenie komponentu 2 z komponentem 1 poprzez oddzielenie komponentu 2 od arkusza i odarcie górnych warstw ochronnych. Należy umieścić kanał skierowany do góry w uchwycie B1, a następnie położyć komponent 1 na komponentcie 2 stroną aktywną do góry. Połączenie następuje poprzez wywarcie nacisku za pomocą uchwytu B2. Skróty: FAn = uchwyt An; FBn = uchwyt Bn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat hodowli komórek mózgu; obrazy gęstości wysiewu; analiza współhodowli komórek śródbłonka i perycytów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Schemat współhodowli oraz reprezentatywne obrazy w kontraście fazowym hodowli komórkowych w urządzeniach. (A) Lokalizacja wysiewu perycytów i komórek śródbłonka. (B) Schemat widoku z boku przedstawiający rozmieszczenie komórek w poprzek rowka chipa membranowego. (C) Reprezentatywne obrazy niskiej i optymalnej gęstości wysiewu dla pierwotnych HBVP oraz linii komórkowej śródbłonka mózgu hCMEC/D3. Obrazy pozyskano 1 dzień po wysiewie (HBVP) i 2 h po wysiewie (hCMEC/D3). (D) Reprezentatywne obrazy niskiej, wysokiej i optymalnej gęstości wysiewu dla komórek podobnych do perycytów mózgu pochodzących z hiPSC. Obrazy pozyskano 1 dzień po wysiewie. (E) Reprezentatywne obrazy końcowej współhodowli HBVP i hCMEC/D3 oraz monokultury hCMEC/D3. Obrazy pozyskano 8 dni po wysiewie HBVP i 7 dni po wysiewie hCMEC/D3. (F) Reprezentatywne obrazy nieudanej i udanej współhodowli komórek BPLC i komórek podobnych do EECM-BMEC oraz monokultury komórek podobnych do EECM-BMEC. Obrazy pozyskano 7 dni po wysiewie BPLC i 6 dni po wysiewie EECM-BMEC. Niedostatecznie wysiane hodowle BPLC nie wykazują wystarczającego pokrycia, natomiast zbyt gęsto wysiane hodowle BPLC stają się nadmiernie konfluentne i zaczynają tworzyć skupiska lub obumierać. Paski skali = 100 µm (C-F). Skróty: HBVPs = ludzkie perycyty naczyniowe mózgu; hiPSC = ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste; BPLCs = komórki podobne do perycytów mózgu pochodzące z hiPSC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej nanomembrany przedstawiający komórki barwione na VE-cadherin, PDGFRβ oraz Hoechst." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Reprezentatywne obrazy immunobarwionej kokultury komórek pochodzących z hiPSC w urządzeniach. Komórki zostały zabarwione na marker komórek śródbłonka VE-cadherin (zielony), marker perycytów PDGFRβ (czerwony) oraz barwnik jądrowy (niebieski). Widoczne są dwie warstwy komórek w bliskim sąsiedztwie, oddzielone jedynie cienką nanomembraną z azotku krzemu (biała strzałka wskazuje położenie membrany na lewym obrazie). Pasek skali = 50 µm. Skróty: hiPSC = ludzka indukowana pluripotencjalna komórka macierzysta; PDGFRβ = receptor beta czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat badania przepuszczalności; monowarstwa komórek, metoda fluorescencyjna, wykresy przepuszczalności, badanie naukowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rycina 4Analiza przepuszczalności małych cząsteczek oparta na pobieraniu próbek. (A) Schemat toku postępowania eksperymentalnego. (B) Wykazanie powtarzalności międzylaboratoryjnej pomiędzy dwoma oddalonymi od siebie laboratoriami na Uniwersytecie w Bernie (UniBe), Szwajcaria, oraz Uniwersytecie w Rochester (UR), Nowy Jork, USA: komórki śródbłonka pochodzące z hiPSC hodowano w µSiM urządzenia przez 2, 4 lub 6 dni oraz w filtrach Transwell przez 6 dni. Test przepuszczalności przeprowadzono przy użyciu 150 µg/mL Lucifer Yellow (457 Da). Czerwony słupek wskazuje wcześniej opublikowane dane dotyczące przepuszczalności fluoresceiny sodowej (376 Da) dla tych samych komórek śródbłonka pochodzących z hiPSC, hodowanych przez 6 dni na filtrach transwell40N = 4–16 na grupę. Zastosowano dwuczynnikową analizę wariancji (ANOVA) z testem post hoc Tukeya, a porównania przedstawiono jedynie dla istotnych wartości p. &lt; 0.05. (C) Demonstracja odpowiedzi cytokinowej z wykorzystaniem komórek podobnych do BMEC, pochodzących z hiPSC i hodowanych w EECM µSiM przez 2 dni; 0,1 ng/mL TNFα + 2 IU/mL IFNγ) lub kontrolę z medium (niestymulowaną, NS) do górnej komory na 20 h przed przeprowadzeniem testu przepuszczalności przy użyciu 150 µg/mL Lucifer Yellow. N = 3 na grupę. Student’s t-test, p &lt; 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Powierzchnia wysiewu górnej komory</td>
			<td>Objętość górnej studni</td>
			<td>Powierzchnia wysiewu dolnej komory</td>
			<td>Objętość dolnego kanału</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>~37 mm2</td>
			<td>100 µL (pojemność ≥115 µL)</td>
			<td>~42 mm2</td>
			<td>10 µL (pipetować 20 µL, aby uniknąć pęcherzyków powietrza)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Krytyczna powierzchnia i objętości µSiM.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cel</td>
			<td>Utrwalacz</td>
			<td>Roztwór blokujący</td>
			<td>Rozcieńczanie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VE-kadheryna</td>
			<td>4% PFA lub 100% MeOH</td>
			<td>5% GS + 0,4% Tx-100 lub 10% GS + 0,3% Triton X-100</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>4% PFA lub 100% MeOH</td>
			<td>5% GS + 0,3–0,4% Triton X-100</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klaudyna-5</td>
			<td>100% MeOH</td>
			<td>5-10% GS + 0,3% Triton X-100</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1</td>
			<td>100% MeOH</td>
			<td>5-10% GS + 0,3% Triton X-100</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Okludyna</td>
			<td>100% MeOH</td>
			<td>5-10% GS + 0,3% Triton X-100</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFRβ</td>
			<td>4% PFA</td>
			<td>5% GS + 0,4% Triton X-100</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG2</td>
			<td>4% PFA</td>
			<td>5% GS + 0,4% Triton X-100</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kozie przeciwciała anty-mysie IgG sprzężone z Alexa Fluor 488</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kozie przeciwciała anty-mysie IgG znakowane Alexa Fluor 568</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Przeciwciała i metody barwienia zwalidowane dla immunocytochemii w kokulturze w urządzeniach µSiM. Skróty: PFA = paraformaldehyd; MeOH = metanol; GS = surowica kozia.
Plik uzupełniający 1: Szablon do obliczania wartości przepuszczalności. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258_SupplementalFile_SamplingCalcTemplate_Updated.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten raport zawiera protokoły montażu, hodowli komórek i testów na platformie μSiM do budowy modeli bariery krew-mózg.

Wykorzystanie platformy tkankowej bariery mikroSiM (μSiM) do modelowania bariery krew-mózg

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, ...

Opracowujemy model chipa tkankowego bariery krew-mózg, aby zrozumieć wpływ sepsy na mózg i udział czynników przenoszonych przez krew. Korzystając z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, planujemy ocenić wpływ czynników genetycznych na podatność niektórych populacji pacjentów. Obecnymi wyzwaniami eksperymentalnymi w społeczności zajmującej się chipami tkankowymi są odtwarzalność wyników i przyjęcie technik przez laboratoria zewnętrzne.Unikalne projekty chipów tkankowych, małe objętości w chipie tkankowym i brak standardowych testów funkcjonalnych przyczyniają się do tych wyzwań i często ograniczają użytkowników do testów opartych na fluorescencji jako ich głównym wyniku. Urządzenia microSIM oferują modułowość do wszechstronnego modelowania in vitro, powierzchnię przypominającą szkło, idealną do obrazowania w wysokiej rozdzielczości oraz ultracienką, wysoce porowatą nanomembranę o długości 100 nanometrów, zapewniając bezproblemowy przesłuch czynników rozpuszczalnych i precyzyjne testy przepuszczalności. W przypadku microSIM zaobserwowaliśmy, że określone typy komórek mają tendencję do wytwarzania większej ilości białek macierzy, które zapewniają rusztowanie podtrzymujące wokół naczyń krwionośnych mózgu.Teraz możemy zapytać, czy stan zapalny powoduje, że te same komórki wzmacniają lub rozkładają swoje matryce, zmieniając w ten sposób integralność bariery. W przyszłości dodamy kolejny przedział do modelu z zielonymi komórkami, takimi jak astrocyty i mikroglej, aby zbadać, w jaki sposób te komórki oddziałują z barierą krew-mózg w przypadkach ogólnoustrojowego stanu zapalnego, takiego jak sepsa. Planujemy również zbadać dodatkowe przyczyny ogólnoustrojowego stanu zapalnego, takie jak majaczenie pooperacyjne nakładające się na demencję.Aby rozpocząć, umieść wszystkie materiały potrzebne do montażu urządzenia microSIM w kapturze bezpieczeństwa biologicznego. Za pomocą pęsety do wiórów umieść chip membranowy na środku uchwytu A1. Płaska powierzchnia wióra jest skierowana w dół, a obszar wykopu jest skierowany do góry. Przechyl urządzenie za pomocą wióra, aby pokazać odbicie od wykopu.Odklej niebieskie warstwy ochronne po obu stronach komponentu pierwszego za pomocą prostej pęsety i umieść go w uchwycie A1 z górną komorą skierowaną w dół. Następnie delikatnie dociśnij komponent pierwszy, aż PSA dotknie chipa. Umieść uchwyt A2 na uchwycie A1 i mocno dociśnij w różnych rogach, aby zapewnić ścisłe dopasowanie chipa i komponentu.Aby przykleić element drugi do elementu pierwszego za pomocą wióra, chwyć jeden róg elementu drugiego prostą pęsetą i oderwij go od arkusza. Następnie chwyć obszar nie-PSA lub trójkąt składnika drugiego i usuń niebieskie warstwy składnika drugiego, odsłaniając powierzchnię PSA. Umieść komponent drugi w uchwycie B1 stroną PSA do góry.Następnie umieść komponent pierwszy wraz z chipem membranowym w uchwycie B1 z górną komorą skierowaną do góry. Umieść uchwyt B2 na elemencie pierwszym i mocno dociśnij w różnych rogach. Wyjmij zmontowane urządzenie z oprawy i za pomocą prostej pęsety uszczelnij krawędzie kanału.Przed użyciem urządzenia do hodowli komórek sterylizuj je światłem ultrafioletowym przez 20 minut. Aby rozpocząć, umieść zmontowane urządzenie microSIM w sterylnych zaciskach węża. Hoduj urządzenie na dużej sterylnej szalce Petriego.Aby uzyskać dodatkową wilgotność, umieść stożkową pokrywę rurki o pojemności 50 mililitrów wypełnioną sterylną wodą. Aby przygotować urządzenie do hodowli komórek, przepłucz górną komorę 100 mikrolitrami wody. Następnie przygotuj roztwór powlekający, mieszając kolagen cztery, fibronektynę bydlęcą i sterylną wodę.Usuń wodę z górnej komory i dodaj 100 mikrolitrów roztworu powlekającego. Inkubuj komorę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do czterech godzin. Po inkubacji zastąpić roztwór powlekający w górnej komorze 100 mikrolitrami hECSR o temperaturze pokojowej.Dodać 20 mikrolitrów roztworu hECSR do dolnej komory. Aby przejść przez komórki podobne do EECM-BMEC, dodaj do komórek mieszaninę enzymów odłączających komórki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do ośmiu minut. Następnie odpipetować zawiesinę komórek i dodać ją do czterokrotnej objętości śródbłonka w probówce wirówkowej.Wirować przy 200 G przez pięć minut i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze hECSR. Zasiej komórki o gęstości 40 000 komórek na centymetr kwadratowy w górnej komorze i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do czterech godzin, aby ułatwić adhezję komórek. Po inkubacji wymienić pożywkę na świeży hECSR w obu komorach.Napraw komórki, dodając 20 mikrolitrów 100% metanolu, schłodzonego w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, do dolnej komory i 50 mikrolitrów do górnej komory. Inkubuj urządzenie w temperaturze pokojowej przez dwie do 10 minut. Następnie umyj komórki, dodając 20 mikrolitrów PBS do dolnej komory i 100 mikrolitrów do górnej komory.Po każdym praniu potwierdź brak pęcherzyków w dolnej komorze. Zablokuj komórki na 30 minut, dodając 20 mikrolitrów roztworu blokującego do dolnej komory i 50 mikrolitrów do górnej komory. Po zablokowaniu zastąpić objętość w górnej komorze 50 mikrolitrami roztworu przeciwciała pierwotnego i inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej.Po przemyciu PBS dodać 50 mikrolitrów roztworu przeciwciał wtórnych do górnej komory i inkubować przez godzinę, chroniąc przed światłem. Po umyciu PBS dodać 50 mikrolitrów Hoechst do górnej komory i inkubować przez trzy minuty. Następnie dodaj 20 mikrolitrów PBS do dolnej komory i 100 mikrolitrów do górnej komory.Natychmiast zobrazuj urządzenie pod mikroskopem konfokalnym. Zlokalizuj okienko membrany za pomocą mokrego obiektywu o dużej odległości roboczej 40x i przełącz się na kanały fluorescencyjne, aby sprawdzić barwienie Hoechst i złącza. Wykazano tutaj optymalne gęstości wysiewu dla hodowli komórek hiPSC i niedosiewu BPLC.Kokultura pochodząca z hiPSC była łatwiejsza do odróżnienia w obrazowaniu z kontrastem fazowym niż w pierwotnych kokulturach. Niskie wysiewanie BPLC powoduje słabe pokrycie perycytów i zbrylanie, podczas gdy nadmierne wysiewanie prowadzi do złuszczania się warstwy perycytów z błony. W immunologicznie wybarwionej kokulturze komórkowej pochodzącej z hiPSC zaobserwowano dwie warstwy komórek znajdujące się w bliskim sąsiedztwie, oddzielone jedynie cienką nanomembraną z azotku krzemu.W teście przepuszczalności duża zmienność przepuszczalności komórek śródbłonka hodowanych przez dwa dni wskazuje, że dwa dni hodowli były niewystarczające do dojrzewania bariery. Co więcej, nie było znaczących różnic w przepuszczalności między laboratoriami po dojrzewaniu barierowym od czterech dni.

use-microsim-sim-barrier-tissue-platform-for-modeling-blood-brain

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niniejsza metoda opisuje sposób izolacji i unieśmiertelniania mikro naczyniowych komórek śródbłonka z mózgu myszy. Przedstawiamy szczegółowy protokół, obejmujący kolejno homogenizację tkanki mózgowej, etapy trawienia, wysiew oraz unieśmiertelnianie komórek. Uzyskanie homogennej, unieśmiertelnionej linii mikro naczyniowych komórek śródbłonka zajmuje zazwyczaj około pięciu tygodni.

Generowanie unieśmiertelnionej linii komórek śródbłonka mikrokrążenia mózgu myszy jako modelu bariery krew-mózg in vitro

Stworzenie ludzkich modeli bariery krew-mózg (BBB) może przynieść korzyści badaniom nad chorobami mózgu związanymi z niewydolnością bariery krew-mózg. Opisujemy tutaj ulepszoną technikę przygotowania kontaktowego modelu BBB, która umożliwia kokulturację ludzkich astrocytów i komórek śródbłonka mózgu po przeciwnych stronach porowatej błony.

Ulepszona metoda przygotowania opartego na komórkach ludzkich, kontaktowego modelu bariery krew-mózg

Tutaj opisujemy mysi model bariery krew-mózg in vitro, który wykorzystuje impedancję spektroskopii komórek, koncentrując się na konsekwencjach dla integralności i przepuszczalności komórek śródbłonka po interakcji z aktywowanymi limfocytami T.

Model in vitro bariery krew-mózg przy użyciu spektroskopii impedancyjnej: skupienie się na interakcji limfocytów T z komórkami śródbłonka

Celem protokołu jest przedstawienie zoptymalizowanej procedury tworzenia modelu bariery krew-mózg (BBB) in vitro opartego na pierwotnych komórkach śródbłonka mózgu świni (pBECs). Model wykazuje wysoką odtwarzalność, wysoką szczelność i nadaje się do badań nad transportem i transportem wewnątrzkomórkowym w odkrywaniu leków.

Ulepszona metoda tworzenia modelu bariery krew-mózg in vitro na podstawie komórek śródbłonka mózgu świni

Tutaj prezentujemy protokół opisujący ustawienie systemu hodowli z porowatej membrany poliestrowej BBB (bariera krew-mózg) w celulonowym systemie hodowli w celu oceny transportu biomolekuł lub czynników zakaźnych przez ludzki BBB i ich fizjologicznego wpływu na sąsiednie komórki mózgowe.

Model interfejsu krew-mózg człowieka do badania przekraczania barier przez patogeny lub leki oraz ich interakcji z mózgiem

Bariera krew-mózg (BBB) to wielokomórkowa jednostka nerwowo-naczyniowa ściśle regulująca homeostazę mózgu. Łącząc ludzkie iPSC i technologie narządów na chipie, stworzyliśmy spersonalizowany chip BBB, odpowiedni do modelowania chorób i przewidywania penetracji leków do OUN. Opisano szczegółowy protokół generowania i działania chipa BBB.

Generacja ludzkiego chipa bariery krew-mózg opartego na iPSC

Ten protokół opisuje metodę tworzenia ludzkiej bariery krew-mózg (BBB) w modelu in vitro. Komórki śródbłonka i perycyty są wysiewane po obu stronach wkładki filtracyjnej (przedział krwi), a astrocyty są wysiewane w dolnej studzience (przedział mózgowy). Scharakteryzowany model wykorzystano w eksperymentach z transportem nanocząstek.

System potrójnej hodowli komórkowej modelujący ludzką barierę krew-mózg

Bariera krew-mózg (BBB) odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu stabilnego i zdrowego środowiska mózgu. Dysfunkcja bariery krew-mózg jest związana z wieloma chorobami neurologicznymi. Opracowaliśmy trójwymiarowy model bariery krew-mózg pochodzący z komórek macierzystych, aby zbadać patologię naczyń mózgowych, integralność bariery krew-mózg oraz sposób, w jaki bariera krew-mózg jest zmieniona przez genetykę i chorobę.

Rekonstrukcja bariery krew-mózg in vitro w celu modelowania i terapeutycznego ukierunkowania choroby neurologicznej

Ten protokół opisuje rekonfigurowalną platformę hodowli komórkowych opartą na membranie, która integruje format otwartej studni z możliwościami przepływu płynów. Platforma ta jest kompatybilna ze standardowymi protokołami i umożliwia odwracalne przejścia między trybem hodowli w studni otwartej a mikroprzepływowym, dostosowując się do potrzeb zarówno laboratoriów inżynieryjnych, jak i biologicznych.

Przekształcanie statycznych modeli tkanek barierowych w dynamiczne systemy mikrofizjologiczne

Przedstawiamy podejście mikrofluidyczne do ekspresji macierzy białkowych. Urządzenie składa się z tysięcy komór reakcyjnych sterowanych za pomocą mikromechanicznych zaworów. Urządzenie mikrofluidyczne jest połączone z biblioteką genów naniesioną w formie mikromacierzy. Geny te są następnie transkrybowane i translacyjne bezpośrednio na chipie, co pozwala na otrzymanie macierzy białkowej gotowej do zastosowań eksperymentalnych.

Generator wysokoprzepustowej ekspresji białek z wykorzystaniem platformy mikroprzepływowej

Odkryj modelowanie bariery krew-mózg za pomocą platformy tkankowej μSiM z wykorzystaniem ludzkich komórek iPSC. Ta metoda pozwala badać wpływ sepsy na funkcje mózgu i czynniki genetyczne.

Wykorzystanie platformy tkankowej bariery mikroSiM (μSiM) do modelowania bariery krew-mózg

Przeglądaj więcej filmów