Trójwymiarowy model hodowli komórkowej do pomiaru wpływu przepływu płynu śródmiąższowego na inwazję komórek nowotworowych

Celem niniejszej procedury jest poddanie komórek hodowanych w 3D przepływowi płynu śródmiąższowego oraz ilościowe określenie efektów wywołanych tym przepływem w zakresie inwazji komórkowej. W tym celu w pierwszej kolejności przygotowuje się roztwór żelu składający się z kolagenu typu I oraz Matrigelu. W drugim kroku do roztworu żelu dodaje się określone stężenie komórek.

Następnie zawiesinę komórkową przenosi się do transwellu o średnicy 12 mm i wielkości porów 8 µm, a następnie inkubuje w temperaturze 37 °C do czasu zgęlnienia matrycy. Ostatnim krokiem w przygotowaniu testu jest dodanie odpowiednich ilości pożywki do transwelli w celu stworzenia warunków statycznych i przepływowych. Po 24 godzinach membrany transwelli są utrwalane, barwione i wizualizowane w celu ilościowego oznaczenia liczby komórek, które dokonały inwazji.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikrofluidyczne komory przepływu śródmiąższowego, jest fakt, że nie wymaga ona zastosowania pomp ani specjalistycznego sprzętu, a także pozwala badaczom na łatwe i szybkie testowanie wielu warunków lub sposobów leczenia. Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat migracji i inwazji komórkowej, może być również wykorzystana lub zastosowana do badania wpływu przepływu płynu śródmiąższowego na inne istotne zachowania komórkowe, takie jak ekspresja białek, proliferacja komórek oraz zmiany w sygnalizacji komórkowej. Prezentacja tej procedury zostanie przeprowadzona w LIMA two chaa.

Doktorant w moim laboratorium rozpoczyna tę procedurę od rozmieszczenia niewielkiej alykwooty Matrigelu na lodzie w temperaturze 4 °C. Następnie przygotowuje składniki żelu: sterylną wodę z PBS, wodorotlenek sodu, Matrigel oraz kolagen typu I z ogona szczura. Potem miesza składniki żelu na lodzie w tej samej kolejności i inkubuje końcowy roztwór przez jedną godzinę w temperaturze 4 °C.

Następnie, za pomocą sterylnej pęsety, umieść wkładki do hodowli komórkowych o średnicy 12 mm w płytce 12-dołkowej. Następnie policz komórki i resuspenduj je w medium bezsurowiczym do stężenia 5×10⁶ komórek/ml, a następnie dodaj 100 µL zawiesiny komórkowej do 900 µL roztworu żelu. Po tym czasie wymieszaj je dokładnie, delikatnie pipetując w górę i w dół.

Następnie do każdego wkładu należy dodać 150 µL końcowej mieszaniny. Potem wkłady należy przenieść do inkubatora z 5% CO2 w temperaturze 37 °C na 30 minut, aż żel spolimeryzuje. W przypadku warunków statycznych należy dodać 100 µL pożywki bezsurowiczej na wierzch żelu oraz 1 200 µL pod wkład.

Poziomy cieczy wewnątrz i na zewnątrz wkładki w dołku powinny być w przybliżeniu równe, co zminimalizuje różnicę ciśnień w obrębie żelu i zapobiegnie przepływowi śródmiąższowemu. W przypadku warunków przepływu należy dodać 100 µL medium bezzsrytkowego pod wkładkę oraz 650 µL powyżej żelu. Jednocześnie należy starać się unikać tworzenia pęcherzyków powietrza pod wkładką, ponieważ będą one uniemożliwiać migrację komórek przez membranę w tych miejscach.

Następnie należy umieścić płytkę w inkubatorze z 5% carbon dioxide w temperaturze 37 °C na 24 godziny. W tym kroku do nowej płytki 24-dołkowej należy dodać 500 µL jednokrotnego PBS do każdego dołka w celu przemycia wkładów. Następnie należy usunąć medium pozostałe w górnej części dołków flow trends.

Następnie za pomocą patyczków bawełnianych usuń żel z wkładów. Przetrzyj górną powierzchnię membrany, aby usunąć komórki inne niż VA. Następnie przemyj wkłady, umieszczając je na 15 sekund w płytce 24-dołkowej zawierającej 1× PBS.

Następnie usunąć PBS i dodać 500 µL 4% paraformaldehydu pod każdy insert. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu utrwalenia zmigrowanych komórek. Następnie usunąć PFA i przepłukać inserty raz 500 µL PBS, aby usunąć pozostałości utrwalacza.

Następnie dodaj 500 µL 0,5% roztworu Triton X 100 pod wkłady i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Aby przeprowadzić permeabilizację komórek, wytnij membrany z wkładów za pomocą żyletki. Następnie umieść je w 100 µL roztworu 2 mg/mL DPI w 1× PBS.

Należy uważać, aby dolna strona membrany była skierowana w dół. Roztwór DPI musi zostać przygotowany na kilka minut przed użyciem i przechowywany w ciemności. Teraz należy owinąć płytkę folią aluminiową.

Umieść próbkę na wytrząsarce przy 150 RPM na 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj membrany raz w 500 microliters PBS i umieść je ponownie na wytrząsarce na 10 minut. Aby usunąć wolny jy, powtórz płukanie jeszcze dwa razy.

Kolejnym krokiem jest umieszczenie membran na szkiełkach przedmiotowych tak, aby komórki, które migrowały, były skierowane do góry. Należy dodać do membran medium montażowe, a następnie przykryć je szkiełkami nakrywkowymi.

Następnie należy policzyć jądra wybarwione barwnikiem i obliczyć liczbę komórek naciekających zgodnie z towarzyszącym manuskryptem. Rysunek ten przedstawia komórki MDA MB 4 35 s, które migrowały przez membranę. Komórki naciekające zostały utrwalone po przeprowadzeniu testu inwazji w przepływie płynu śródmiąższowego i wybarwione DPI oraz koniugatem Alexa Fluor 4 88 z foidem, aby ułatwić liczenie komórek naciekających.

Jest to membrana w świetle przechodzącym, a tutaj widoczne są jądra barwione DAPI. Tutaj przedstawiono barwienie F-aktyny z użyciem Alexa Fluor 488 phalloidin. Wykres ten pokazuje, że inwazja przerzutowych komórek czerniaka MDA MB 435 była znacząco wzmocniona przez przepływ śródmiąższowy.

Po 24 godzinach wyniki są normalizowane do średniej z warunku inwazji statycznej i prezentowana jest średnia z sześciu wkładów do hodowli komórkowej. Różnica między warunkami jest istotna statystycznie przy wartości P wynoszącej 0,003. Po opanowaniu techniki, przygotowanie testu przepływu płynu śródmiąższowego zajmuje dwie godziny, po których następuje 24-godzinna inkubacja, a następnie dwie godziny na utrwalenie i barwienie membran Transwell.

Po zastosowaniu tej procedury można łatwo wyekstrahować komórki, białka lub kwasy nukleinowe w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak sposób, w jaki ekspresja genów i białek zmienia się w odpowiedzi na przepływ płynu śródmiąższowego. Od momentu opracowania metoda ta stała się niezbędnym testem dla badaczy analizujących wpływ przepływu śródmiąższowego na komórki nowotworowe.