Trójwymiarowy model hodowli komórkowej do pomiaru wpływu przepływu płynu śródmiąższowego na inwazję komórek nowotworowych

Przepływ płynu śródmiąższowego jest podwyższony w guzach litych i może modulować inwazję komórek nowotworowych. W tym miejscu opisujemy technikę stosowania przepływu płynu śródmiąższowego do komórek osadzonych w macierzy, a następnie mierzenia jego wpływu na inwazję komórek. Technikę tę można łatwo zaadaptować do badania innych systemów.

Celem tej procedury jest wystawienie komórek hodowanych w 3D na przepływ płynu śródmiąższowego oraz ilościowe określenie wpływu przepływu na inwazję komórki. Osiąga się to poprzez przygotowanie najpierw roztworu żelu składającego się z kolagenu typu pierwszego i matrigelu. Drugim krokiem jest dodanie określonego stężenia komórek do roztworu żelu.

Następnie zawiesinę komórkową dodaje się do transwella o średnicy 12 milimetrów, wielkości porów ośmiu mikronów i inkubuje w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż matryca się zżeluje. Ostatnim krokiem w konfiguracji testu jest dodanie określonych ilości pożywki do transwelli w celu stworzenia warunków statycznych i przepływowych. 24 godziny później membrany transwell są mocowane, barwione i wizualizowane w celu ilościowego określenia liczby zaatakowanych komórek.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak mikroprzepływowe, śródmiąższowe komory przepływowe, jest to, że nie wymaga pomp ani specjalistycznego sprzętu i pozwala naukowcom łatwo i szybko testować wiele schorzeń lub zabiegów. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w migrację i inwazję komórek, może być również używana lub stosowana do badania wpływu przepływu płynu śródmiąższowego na inne istotne zachowania komórkowe, takie jak ekspresja białek, proliferacja komórek i zmiany w sygnalizacji komórkowej. Demonstracją tej procedury będzie two chaa.

Doktorant w moim laboratorium Rozpocznij tę procedurę od wyrzucenia małej porcji żelu matri na lód w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przygotuj recepturę żelu ze sterylną wodą PBS, wodorotlenkiem sodu, matryżelem i kolagenem typu pierwszego ze szczurzego ogona. Następnie wymieszaj składniki żelu na lodzie w tej samej kolejności i inkubuj końcowy roztwór przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Teraz umieść osiem wkładek do hodowli komórek mikro po o średnicy 12 milimetrów na 12-dołkowej płytce za pomocą pary wysterylizowanych kleszczy. Następnie policz komórki i ponownie zawieś je w pożywce wolnej od surowicy pięć razy 10 do sześciu komórek na mililitr, dodaj 100 mikrolitrów zawiesiny komórek do 900 mikrolitrów roztworu żelu. Następnie dokładnie je wymieszaj, delikatnie pipetując w górę i w dół.

Następnie dodaj 150 mikrolitrów końcowej mieszanki do każdej wkładki. Następnie przenieś wkładki do inkubatora z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut, aż żel ulegnie polimeryzacji. W przypadku stanu statycznego dodaj 100 mikrolitrów pożywki wolnej od surowicy na wierzch żelu i 1 200 mikrolitrów mikrolitrów pod wkładkę.

Poziomy płynu wewnątrz i na zewnątrz wkładu w studzience powinny być w przybliżeniu równe, co skutkuje minimalną różnicą ciśnień w poprzek żelu i brakiem przepływu śródmiąższowego. Dla warunków przepływu dodaj 100 mikrolitrów pożywki wolnej od surowicy pod wkładką i 650 mikrolitrów powyżej żelu. Jednocześnie staraj się unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza pod wkładką, ponieważ zapobiegną one migracji komórek przez membranę w tych miejscach.

Następnie umieść płytkę w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 24 godziny. Na tym etapie dodaj 500 mikrolitrów jednorazowego PBS na studzienkę do nowej 24-dołkowej płytki do mycia wkładów. Następnie usuń pożywkę pozostałą w górnej części studzienek trendów przepływu.

Następnie za pomocą bawełnianych wacików usuń żel z wkładek. Wytrzyj górną część powierzchni membrany, aby usunąć ogniwa inne niż VA. Następnie umyj wkładki, umieszczając je w 24-dołkowej płytce zawierającej jeden raz PBS na 15 sekund.

Następnie wyjmij PBS i dodaj 500 mikrolitrów 4% paraformaldehydu pod każdą wkładkę. Inkubuj je przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu utrwalenia komórek transmigrowanych. Następnie usuń PFA i przepłucz je raz 500 mikrolitrami jeden razy PBS, aby usunąć resztki utrwalacza.

Następnie dodaj 500 mikrolitrów 0,5% roztworu Triton X 100 pod wkładki i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Aby przeniknąć komórki, odetnij błony z wkładu za pomocą żyletki. Następnie umieść je w 100 mikrolitrach po dwa mikrogramy na mililitr DPI w jednorazowym roztworze PBS.

Uważając, aby umieścić spód membrany skierowany w dół. Roztwór DPI należy przygotować na kilka minut przed użyciem i przechowywać w ciemności. Teraz zawiń talerz w folię aluminiową.

Umieść go na shakerze z prędkością 150 obr./min na 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj membrany w 500 mikrolitrach jednorazowo PBS i umieść je z powrotem na wytrząsarce na 10 minut. Aby usunąć wolne jy, powtórz pranie jeszcze dwa razy.

Następnym krokiem jest umieszczenie membran na szkiełkach z komórkami migrującymi trans skierowanymi do góry. Dodaj roztwór montażowy do membran. Następnie przykryj je szkiełkami nakrywkowymi.

Następnie policz dappy stainy do jąder i oblicz liczbę zaatakowanych komórek zgodnie z dołączonym rękopisem. Ten rysunek przedstawia transmigrowane komórki MDA MB 4 35 s na membranie. Zaatakowane komórki utrwalono po teście inwazji przepływu płynu śródmiąższowego i wybarwiono DPI i sprzężonym foidem Alexa Fluor 4 88, aby ułatwić liczenie zaatakowanych komórek.

To jest błona pod jasnym polem, a tutaj są dappy stainine. Pokazano tutaj Alexa Fluor 4 88 foid barwiony aktyną F. Ten wykres pokazuje, że inwazja przerzutowych komórek czerniaka MDA MB 4 35 s została znacznie wzmocniona przez przepływ śródmiąższowy.

Po 24 godzinach wyniki normalizuje się do średniej stanu inwazji statycznej i przedstawia się średnią z sześciu wkładek do hodowli komórkowych. Różnica między warunkami jest istotna statystycznie przy wartości P wynoszącej 0,003. Po opanowaniu, test przepływu płynu śródmiąższowego można skonfigurować w ciągu dwóch godzin, po czym następuje 24-godzinna inkubacja, a następnie dwie godziny na utrwalenie i zabarwienie membran transformacyjnych.

Po tej procedurze komórki, białka lub kwasy nukleinowe można łatwo wyekstrahować, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, jak zmienia się ekspresja genów i białek w odpowiedzi na przepływ płynu śródmiąższowego. Od czasu jego opracowania stał się on niezbędnym testem dla naukowców badających wpływ przepływu śródmiąższowego na komórki rakowe.