Obrazowanie C. elegans w wysokiej rozdzielczości we wszystkich stadiach larwalnych

W laboratorium pracujemy nad wszelkiego rodzaju pytaniami z zakresu biologii rozwojowej. Ja sam zajmuję się bardziej stroną techniczną, opracowując metody lepszego rozwiązywania tych problemów za pomocą technik obrazowania. Dziedzina C. elegans z powodzeniem przyjęła ogromną różnorodność metod, począwszy od edycji genów CRISPR, transkryptomiki i proteomiki, aż po mikroskopię superrozdzielczą. C. elegans jest niesamowitym modelem, jednak w kontekście obserwacji in vivo w wysokiej rozdzielczości wiąże się z wyzwaniami, wymagającymi unieruchomienia w celu uzyskania najlepszej rozdzielczości, co z kolei ogranicza żywotność zwierząt. Protokół przedstawia jedno z możliwych rozwiązań dla długoterminowego obrazowania C. elegans, umożliwiając naukowcom przyjęcie metody we własnym laboratorium i badanie szerokiej gamy dynamicznych procesów rozwojowych bezpośrednio in vivo. W laboratorium metoda ta pozwoliła na szczegółową obserwację powstawania narządów, na przykład w kontekście morfogenezy lub po podziałach komórek somatycznych do wieku dorosłego. Od tego czasu metoda ta została przyjęta przez wiele laboratoriów badających różnorodny zakres procesów rozwojowych.

[Prezenter] Aby rozpocząć, przymocuj urządzenie do ramy nośnej i zamontuj je na pionowym mikroskopie. Napełnij strzykawkę wodą dejonizowaną, a następnie przymocuj igłę o rozmiarze 23 i długi kawałek rurki o wymiarach jeden na 16 cali za pomocą wydrążonego wygiętego stalowego kołka. Napełnij rurkę dejonizowaną wodą ze strzykawki i włóż stalowy kołek do wybitego otworu wlotu zaworu, aby podłączyć rurkę. Wyjmij strzykawkę i igłę przed podłączeniem rurki do elektrozaworu poza chipem. Korzystając z oprogramowania do obrazowania, włącz elektrozawór i zwiększ ciśnienie w urządzeniu przez kilka minut, aby usunąć całe powietrze z zaworu. Sprawdź zakończenie, sprawdzając wzrokowo, czy interfejs powietrze-woda wydaje się ciemny i znika w materiale PDMS. Wyłącz elektrozawór za pomocą oprogramowania do obrazowania. Następnie napełnij jednomililitrową strzykawkę przefiltrowanym roztworem bakterii i przymocuj igłę o rozmiarze 30 oraz długi kawałek rurki o wymiarach 1 na 32 cale do igły. Nacisnąć tłok, aby napełnić zarówno igłę, jak i dołączoną rurkę roztworem bakterii. Następnie za pomocą pęsety włóż rurkę o średnicy 32 cali bezpośrednio do wlotu pokarmu urządzenia mikroprzepływowego i umieść strzykawkę na pompie strzykawkowej. Naciśnij tłok strzykawki za pomocą skrzydełkowej z tyłu, aby napełnić urządzenie płynem. Zablokuj zarówno wlot, jak i wylot ślimaka za pomocą uszczelnionych stalowych kołków i zastosuj dodatkowy nacisk za pomocą ustalającej, aby usunąć pozostałe powietrze z urządzenia. Następnie wyjmij zablokowany stalowy kołek na wylocie i przymocuj pojemnik na odpady do wylotu. Naciskać strzykawkę, aby upewnić się, że pojemnik na odpady jest prawidłowo podłączony i że w systemie nie ma żadnych zatorów. Wyjąć drugi zablokowany stalowy kołek z wlotu i wciskać strzykawkę, aż na wlocie ślimaka pojawi się niewielka kropla płynu. Następnie za pomocą igły o rozmiarze 23 przymocuj dłuższy kawałek rurki o wymiarach 1 na 16 cali do około 15 do 20 centymetrów do jednomililitrowej strzykawki wypełnionej buforem S-basel. Przymocuj prosty stalowy kołek o rozmiarze 23 do drugiego końca rurki. Napełnić igłę i rurkę buforem S-basel ze strzykawki. Teraz włóż stalowy kołek na końcu rurki do rurki zawierającej ślimaki i przepchnij niewielką ilość płynu przez rurkę, aby upewnić się, że nie pozostało powietrze. Wciągnąć robaki do rurki bez wciągania ich do strzykawki. Następnie wciśnij strzykawkę podłączoną do ślimaków, aż na stalowym kołku pojawi się niewielka kropla płynu i włóż stalową strzykawkę do wlotu ślimaka urządzenia mikroprzepływowego. Umieść urządzenie na mikroskopie przy małym powiększeniu, 5x lub 10x, lub na mikroskopie preparacyjnym. Ustawić urządzenie w taki sposób, aby wlot był widoczny po jednej stronie pola widzenia, a tył wlotu kanału syfonu był widoczny po drugiej stronie. Delikatnie nacisnąć tłok strzykawki ślimakowej. Następnie popchnij zwierzęta w kierunku układu kanałów. Gdy zwierzę stanie twarzą do kanału, wepchnij je do kanału i powtórz dla kolejnych zwierząt. Po schwytaniu wystarczającej liczby zwierząt umieść strzykawkę, nadal przymocowaną do wlotu robaka, na stoliku mikroskopu, gdzie pozostanie przez cały czas trwania eksperymentu. Jeśli obciążenie zostało wykonane na mikroskopie preparacyjnym, przenieś urządzenie do mikroskopu obrazowego. Teraz włącz pompę strzykawkową i uruchom ją z ustaloną szybkością jednego mikrolitra na godzinę dla 0,5 mikrolitra. Zaprogramuj pompę strzykawkową tak, aby pracowała z prędkością jednego mikrolitra na godzinę przez 0,5 mikrolitra, po czym natężenie przepływu zwiększa się o 100 mikrolitrów na godzinę dla 0,5 mikrolitra, a wzór przepływu powtarza się przez cały eksperyment. Umieść urządzenie na stoliku mikroskopu i upewnij się, że jest mocno trzymane. Przełącz na żądane powiększenie obrazu. Zidentyfikuj zwierzęta i obszary zainteresowania w układzie kanałów pułapki i ustaw żądane warunki obrazowania. Obraz w żądanych warunkach obrazowania, uruchamiając zawór w układzie scalonym przez elektrozawór na 10 sekund przed akwizycją obrazu, aby zwierzęta były utrzymywane w miejscu. Urządzenie mikroprzepływowe utrzymało wysoką jakość obrazowania w różnych modalnościach mikroskopii, w tym w jasnym polu, epifluorescencji, konfokale wirującego dysku i metodach super rozdzielczości, dzięki zastosowaniu szkła osłonowego o grubości 170 mikrometrów. Rozwój komórek nabłonkowych Caenorhabditis elegans uwidoczniony od wczesnego stadium larwalnego L1 do połowy L2. Indukcja pierwotnych wyblakłych komórek prekursorowych sromu i ich późniejsze podziały od późnego stadium L1 do wczesnego stadium larwalnego L4 były oczywiste. Etapy tworzenia sromu od wczesnego L3 do dorosłości. Uzyskane obrazy zostały ulepszone poprzez dekonwolucję i rejestrację obrazu, co poprawiło przejrzystość wizualną Obserwowane podziały komórek wystąpiły w sposób spójny i terminowy u wszystkich zwierząt, przy czym wszystkie podziały zostały zakończone w typowym czasie trwania stadium larwalnego. Długość gonad wzrastała stale w fazach L2 i L3, a spójne pomiary były możliwe dzięki prostej orientacji zwierząt.