Name: Obrazowanie C. elegans w wysokiej rozdzielczości we wszystkich stadiach larwalnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-23T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Poznaj mikroprzepływową metodę obrazowania C. elegans we wszystkich stadiach larwalnych. Technika ta umożliwia długotrwałe obserwacje procesów rozwojowych in vivo przy zachowaniu żywotności zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Pragniemy podziękować członkom laboratorium Hajnal za krytyczną dyskusję i komentarze na temat manuskryptu. Jesteśmy również wdzięczni Centrum Genetyki C. elegans CGC, finansowanemu przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej NIH (P40 OD010440). Ponadto pragniemy podziękować członkom laboratorium Galli (Instytut Hubrechta), laboratorium Conradta (University College London) i laboratorium van den Heuvel (Uniwersytet w Utrechcie) za cenny wkład w przedstawiony protokół. Praca ta została wsparta grantami ze Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki nr 31003A-166580 dla AH, Szwajcarskiej Ligi Walki z Rakiem nr 4377-02-2018 dla AH oraz finansowaniem przez ETH Zürich dla AdM.

Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Produkcja urządzeń
UWAGA: Wszystkie urządzenia zostały wyprodukowane przy użyciu poniższego protokołu, jednak urządzenia są bezpośrednio dostępne u autorów. Dla każdego typu urządzenia wytwarzany jest oddzielny wafel, przy czym każdy wafel urządzenia jest wytwarzany z dwóch warstw SU8 o różnych wysokościach (tj. warstwy żywności i warstwy pułapki). Płytka zaworu jest wytwarzana na oddzielnej płytce o pojedynczej wysokości SU-8, z pominięciem kroków 1,3-1,6. Silany są toksyczne i uwalniają opary. Dlatego ten krok należy wykonać w dygestorium. Szczegółowe informacje na temat procedury wytwarzania można znaleźć w Berger et al.18.
<ol>
	<li>Oczyść wafle za pomocą plazmy powietrznej.</li>
	<li>Pierwszą warstwę SU8 należy obtoczyć w wirowaniu, a następnie wypiekać na miękko w temperaturze 95 °C.</li>
	<li>Odsłoić pierwszą warstwę, a następnie upiec w temperaturze 95 °C i wywołać.</li>
	<li>Ponownie wykonaj czyszczenie plazmowe po wywołaniu i wysuszeniu wafla</li>.
	<li>Drugą warstwę SU8 obtoczyć w wirówce, a następnie wypiekać na miękko w temperaturze 95 °C (w razie potrzeby przeprowadzić wstępne pieczenie w temperaturze 65 °C).</li>
	<li>Wyrównaj drugą maskę do istniejących obiektów za pomocą znaczników wyrównania po obu stronach płytki, a następnie odświetl drugą warstwę.</li>
	<li>Po upieczeniu i rozwinięciu wafla, a następnie wykonaj twardy pieczenie w temperaturze 200 °C.</li>
	<li>Traktuj wafel chlorotrimetylosilanem przez co najmniej 2 godziny.</li>
	<li>Przygotować partię 20 g prepolimeru PDMS (część A) i dokładnie wymieszać ją z 1 g środka sieciującego (stosunek 20:1, część B) (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Odgazowuje przez 10 minut lub do momentu, gdy wszystkie bąbelki znikną.</li>
	<li>Usunąć 2 ml mieszaniny PDMS i odłożyć na krok 1.13.</li>
	<li>Do pozostałej mieszaniny PDMS dodać kolejne 3 g środka sieciującego i dokładnie wymieszać (końcowe proporcje ok. 5:1).</li>
	<li>Korzystając z wsadu PDMS 20:1, wiruj płytkę urządzenia z prędkością 750 obr./min przez 30 s.</li>
	<li>Umieść płytkę zaworu w aluminiowym naczyniu i odlej na nią PDMS 5:1. Odgazuj płytkę urządzenia przez około 10 minut. Po odgazowaniu usuń wszelkie pozostałe pęcherzyki za pomocą pipety.</li>
	<li>Piecz zarówno warstwę zaworu, jak i urządzenia w temperaturze 70 °C odpowiednio przez około 15/20 minut.</li>
	<li>Oceń utwardzenie warstwy urządzenia i zaworu, delikatnie sondując je końcówką pipety lub pęsetą. Warstwa zaworu powinna być solidna, podczas gdy warstwa urządzenia powinna pozostać lekko lepka.</li>
	<li>Odłącz warstwę zaworu i przytnij ją do wymaganego rozmiaru za pomocą skalpela lub żyletki.</li>
	<li>Wybij otwór dostępowy w kanale zaworu (manometr 20).</li>
	<li>Umieść płytkę urządzenia pod mikroskopem stereoskopowym wyposażonym w górne oświetlenie.</li>
	<li>Ostrożnie umieść element PDMS zawierający warstwę zaworu na płytce urządzenia.</li>
	<li>Precyzyjnie wyrównaj funkcje zaworu i urządzenia, zapewniając usunięcie całego powietrza uwięzionego między warstwami.</li>
	<li>Zmontowane urządzenie przełożyć do piekarnika i piec przez noc w temperaturze 70 °C.</li>
	<li>Odłącz urządzenie od płytki.</li>
	<li>Przebij wszystkie pozostałe otwory dostępowe (grubość 20).</li>
	<li>Przymocuj PDMS do szkła nakrywkowego za pomocą plazmy powietrznej, a następnie umieść połączone urządzenie w piecu w temperaturze 70 °C na kilka godzin.</li>
</ol>
2. Przygotowanie robaka
UWAGA: Ta sekcja opisuje przygotowanie robaków przez bielenie, co pozwala na generowanie dużych liczb (setek) zwierząt. Inne metody synchronizacji, takie jak pobieranie ręczne, są możliwe, ale są zazwyczaj bardziej czasochłonne i pracochłonne. Wszystkie robaki użyte w protokole są utrzymywane zgodnie ze standardowymi protokołami w temperaturze 20 °C i na płytkach NGM wysianych E. coli OP50.
<ol>
	<li>Począwszy od talerzy z wieloma ciężarnymi zwierzętami.</li>
	<li>Zmyj zwierzęta z talerza za pomocą bufora M9.</li>
	<li>Dodać 5% NaClO i 5 M NaOH do zawiesiny robaka (200 μL/100 μL na każdy 1 ml zawiesiny robaka).</li>
	<li>Delikatnie potrząśnij mieszanką wybielającą, aż zwierzęta zaczną się rozpadać (~10 min).</li>
	<li>Odwirować mieszaninę wybielającą w temperaturze pokojowej, 1300 x g przez 1 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant za pomocą pipety i dodać równą ilość świeżego buforu M9.</li>
	<li>Ponownie odwirować w temperaturze pokojowej, 1300 x g przez 1 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant i przenieść granulowane robaki do probówki o pojemności 15 ml z 5 ml świeżego buforu M9.</li>
	<li>Wstrząsnąć przez noc w temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Przepuścić zawiesinę robaka przez sitko o wielkości 10 μm.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę ślimakową o stężeniu 1300 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić robaki w równej objętości buforu M9.</li>
	<li>Ponownie odwirować mieszaninę robaków w temperaturze 1300 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć supernatant i przenieść robaki na płytki NGM. Jeśli potrzebne są larwy L1, należy je natychmiast zużyć.</li>
	<li>Gdy robaki osiągną pożądany etap rozwoju, zmyj je z płytki za pomocą świeżego buforu S-Basal przefiltrowanego przez filtr 0,2 μm.</li>
	<li>Pozostawić robaki do osadzania się grawitacyjnie lub granulować je przez odwirowanie w temperaturze 750 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i dodać równą objętość świeżego buforu S-Basal.</li>
	<li>Powtórzyć etapy sedymentacji lub wirowania (kroki 2.16 i 2.17)</li>
	<li>Usunąć supernatant i dodać równą objętość świeżego buforu S-Basal.</li>
	<li>Wykonaj etapy sedymentacji lub wirowania po raz ostatni.</li>
	<li>Usunąć większość supernatantu.</li>
	<li>Trzymaj robaki w tubie, aż rozpocznie się eksperyment.</li>
</ol>
3. Przygotowanie bakterii
UWAGA: Na chipie można stosować różne szczepy bakterii (np. OP50, NA22, HT114, itp.). Dostosuj proporcję pożywki o gradiencie gęstości dodawanej do mieszanki spożywczej, aby skompensować różnice w gęstości. Wszystkie są przepuszczane przez filtr 0,2 μm w celu usunięcia cząstek stałych.
<ol>
	<li>Przygotować 40 ml LBroth w 2 x 20 ml w probówkach wirówkowych, sterylnych kolbach Erlenmeyera itp.</li>
	<li>Zaszczep LB bakteriami pobranymi z talerza podstawowego.</li>
	<li>Hoduj bakterie, wstrząsając przez noc w temperaturze 37 °C (~16 h) (OD600 = 1,9).</li>
	<li>Odwirować bakterie przy 3000 x g przez 10 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant i dodać 2 ml świeżego buforu S-Basal do każdej probówki. Połącz wszystkie rurki.</li>
	<li>Mechanicznie zawiesić bakterie za pomocą pipety.</li>
	<li>Odwirować bakterie w stężeniu 3000 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie dodać 2 ml świeżego buforu S-Basal.</li>
	<li>Mechanicznie zawiesić bakterie za pomocą pipety.</li>
	<li>Odwirować bakterie w stężeniu 3000 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Usuń jak najwięcej supernatantu i dodaj 1 ml świeżego buforu S-Basal przed mechanicznym ponownym zawieszeniem wszystkich bakterii.</li>
	<li>Połącz 0,60 ml pożywki o gradiencie gęstości, 0,38 ml S-Basal + 1% wagowo Pluronic F-127 (niejonowy kopolimer triblokowy, reprezentowany tutaj jako PF) z 1 ml zawiesiny bakterii OP50 lub 0,65 ml pożywki o gradiencie gęstości, 0,33 ml S-Basal + 1% wagowo PF z 1 ml zawiesiny bakterii NA22 lub HT114.</li>
	<li>Dokładnie wymieszaj przygotowane potrawy za pomocą miksera wirowego.</li>
	<li>Przefiltruj żywność przez sitko o wielkości 5 μm lub 10 μm. Mniejsze sitko jest szczególnie zalecane w przypadku korzystania z mniejszych urządzeń, np. urządzeń L1. 
	UWAGA: Żywność można przechowywać w temperaturze pokojowej do 2 dni.</li>
</ol>
4. Przygotowanie żetonów
UWAGA: Zapoznaj się z Rysunek 2, aby zapoznać się ze schematem urządzenia, przewodów i połączeń. Wszystkie są przepuszczane przez filtr 0,2 μm w celu usunięcia kurzu. Stalowy kołek wspomniany w poniższych krokach odnosi się do krótkiej, pustej rury, która służy do łączenia większej rurki o średnicy zewnętrznej (1/16") z otworami o małej średnicy wykonanymi w urządzeniu PDMS. Te stalowe kołki są po prostu wkładane w wewnętrzną średnicę rurki, a następnie wciskane w materiał PDMS, skutecznie łącząc te dwa.
<ol>
	<li>Zacznij od napełnienia strzykawki wodą dejonizowaną (DI).</li>
	<li>Przymocuj igłę 23 G i długi kawałek rurki 1/16", z wydrążonym stalowym kołkiem (wygiętym pod kątem 90°) na końcu. Rurka powinna być wystarczająco długa, aby rozciągać się od elektrozaworu do stolika mikroskopu.</li>
	<li>Napełnij rurkę wodą DI ze strzykawki i podłącz ją do wlotu zaworu, wkładając stalowy kołek do wybitego otworu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A,J).</li>
	<li>Wyjmij strzykawkę i igłę, a następnie przymocuj rurkę do elektrozaworu poza chipem (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A, J).</li>
	<li>Korzystając z oprogramowania do obrazowania, włącz elektrozawór i zwiększ ciśnienie w urządzeniu przez kilka minut, aby usunąć całe powietrze z zaworu. Sprawdź zakończenie, wizualnie sprawdzając interfejs powietrze-woda na chipie, który powinien być ciemny i zniknąć w materiale PDMS (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Wyłącz elektrozawór (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
	<li>Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml przefiltrowanym roztworem bakterii (wystarczy ~0,5 ml jedzenia).</li>
	<li>Przymocuj igłę 30 G i długi kawałek rurki 1/32" do igły.</li>
	<li>Nacisnąć tłok, aby napełnić zarówno igłę, jak i dołączoną rurkę, upewniając się, że w strzykawce lub rurce nie pozostało powietrze.</li>
	<li>Włóż rurkę 1/32" bezpośrednio do wlotu żywności urządzenia mikroprzepływowego, używając pęsety, aby zapobiec uszkodzeniu rurki (zalecana jest pęseta SMD) (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D,K).</li>
	<li>Umieścić strzykawkę na pompie strzykawkowej (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2D).</li>
	<li>Naciśnij tłok strzykawki za pomocą skrzydełkowej z tyłu, aby napełnić urządzenie płynem. Kropla płynu powinna pojawić się przy każdym otwartym połączeniu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D, strzałka).</li>
	<li>Zablokuj zarówno wlot, jak i wylot ślimaka za pomocą uszczelnionego stalowego kołka (stalowy kołek z krótkim kawałkiem rurki 1/16" przymocowany i uszczelniony przez spalenie) (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2E,L).</li>
	<li>Zastosuj dodatkowy nacisk za pomocą skrzydełkowej, aby usunąć resztki powietrza z urządzenia (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E, strzałka).</li>
	<li>Wyjmij zablokowany kołek na wylocie i przymocuj pojemnik na odpady (wykonany z probówki kriowialnej lub mikrowirówki, z dwoma stalowymi kołkami wbitymi w pokrywę i zabezpieczonymi klejem). Pojemnik na odpady jest połączony za pomocą krótkiego odcinka rurki 1/16", przy czym jeden koniec jest przymocowany do pojemnika, a drugi koniec jest połączony z wydrążonym stalowym kołkiem (wygiętym pod kątem 90°) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2F,G,M).</li>
	<li>Naciskać strzykawkę, aby upewnić się, że pojemnik na odpady jest prawidłowo podłączony i że w systemie nie ma żadnych zatorów. W tym celu przepchnij niewielką ilość płynu przez system (przekręć skrzydełkową na pompie strzykawki), aż płyn przepłynie przez rurkę odpływową (<silna klasa="xfig">Rysunek 2G, strzałka).</li>
	<li>Usuń drugi zablokowany stalowy kołek.</li>
	<li>Wciskać strzykawkę, aż na wlocie ślimaka pojawi się mała kropla płynu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2H,N).</li>
	<li>Podłącz dłuższy kawałek rurki 1/16" (15-20 cm) do strzykawki o pojemności 1 ml wypełnionej buforem S-Basal, używając igły 23 G (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2H, N).</li>
	<li>Przymocuj prosty stalowy kołek 23 G do drugiego końca rurki.</li>
	<li>Napełnić igłę i rurkę buforem ze strzykawki, upewniając się, że w strzykawce lub drengu nie pozostało powietrze.</li>
	<li>Włóż stalowy kołek na końcu rurki do rurki zawierającej ślimaki.</li>
	<li>Przeciśnij niewielką ilość płynu przez rurkę, upewniając się, że nie pozostało powietrze.</li>
	<li>Wciągnąć robaki do rurki, ale nie należy ich wciągać do strzykawki.</li>
	<li>Wciśnij strzykawkę podłączoną do ślimaków, aż na stalowym kołku pojawi się mała kropla płynu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2H).</li>
	<li>Włóż stalowy kołek do wlotu ślimaka (<silna klasa="xfig">Rysunek 2I). 
	UWAGA: Przygotowanie urządzenia można przeprowadzić przed ostatecznym przygotowaniem robaków i pozostawić pod mikroskopem, aż robaki będą gotowe.</li>
</ol>
5. Wczytywanie i obrazowanie robaków
<ol>
	<li>Umieść urządzenie na mikroskopie w małym powiększeniu (5x lub 10x) lub na mikroskopie preparacyjnym.</li>
	<li>Zidentyfikuj aktualnie używaną jednostkę urządzenia i znajdź wlot ślimaka za pomocą oświetlenia w jasnym polu.</li>
	<li>Ustawić urządzenie w taki sposób, aby wlot był widoczny po jednej stronie pola widzenia, a tył wlotu kanału syfonu był widoczny po drugiej stronie.</li>
	<li>Delikatnie nacisnąć tłok strzykawki ślimakowej. Ciecz będzie zauważalnie przepływać od wlotu przez układ kanałów w kierunku wylotu. Obecność bakterii i różnica w współczynniku załamania światła spowodowana dodatkiem ośrodka gradientu gęstości sprawiają, że przepływ cieczy jest widoczny.</li>
	<li>Upewnij się, że robaki pojawiają się z wlotu i płyną w kierunku tylnej części układu kanałów.</li>
	<li>Delikatnie popchnij zwierzęta w kierunku układu kanałów. Gdy zwierzę stanie twarzą do kanału, wepchnij je do kanału i powtórz dla kolejnych zwierząt. 
	UWAGA: Zwierzęta muszą być skierowane głowami w stronę wylotu, aby mieć łatwy dostęp do pożywienia. Można je zorientować poprzez pchanie i ciągnięcie za tłok oraz pływanie.</li>
	<li>Po schwytaniu wystarczającej liczby zwierząt należy umieścić strzykawkę, nadal przymocowaną do wlotu robaka, na stoliku mikroskopu, gdzie pozostanie przez cały czas trwania eksperymentu. Krótkie odłączenie rurki ślimakowej od strzykawki może być konieczne w celu uwolnienia nagromadzonego ciśnienia, a następnie ostrożne ponowne przymocowanie jej do igły.</li>
	<li>Jeśli obciążenie zostało wykonane na mikroskopie preparacyjnym, przenieś urządzenie do mikroskopu obrazowego. Rurka może pozostać przymocowana do chipa, a strzykawka jest podłączona do pompy.</li>
	<li>Włączyć pompę strzykawkową i uruchomić ją z zadaną szybkością 1 μL/h dla 0,5 μL, zwiększyć szybkość o 100 μL/h dla 0,5 μL i zmniejszyć ją z powrotem do 1 μL/h. Cykl ten jest automatycznie powtarzany dla całego eksperymentu. Informacje na temat programowania pompy można znaleźć w instrukcji obsługi urządzenia.</li>
	<li>Umieść urządzenie na stoliku mikroskopu i upewnij się, że jest mocno trzymane (sugestie dotyczące mechanizmów montażowych można znaleźć w Rysunek 3A).</li>
	<li>Jeśli ładowanie nie zostało wykonane na mikroskopie obrazowym, zidentyfikuj jednostkę zainteresowania urządzenia przy małym powiększeniu.</li>
	<li>Przełącz na żądane powiększenie obrazu. 
	UWAGA: Urządzenia są kompatybilne ze wszystkimi typami obiektywów.</li>
	<li>Zidentyfikuj zwierzęta i obszary zainteresowania w układzie kanałów pułapki i ustaw żądane warunki obrazowania.</li>
	<li>Obraz w żądanych warunkach obrazowania, z wbudowanym zaworem uruchamianym przez elektromagnes 10 s przed akwizycją obrazu, dzięki czemu zwierzęta są utrzymywane w miejscu. 
	UWAGA: Uruchomienie zaworu na chipie spowoduje wydłużenie i spłaszczenie zwierząt, co może wymagać regulacji obszaru obrazowania (ROI).</li>
</ol>
6. Przygotowanie do konfiguracji
UWAGA: Ta sekcja odnosi się do wstępnego przygotowania mechanizmu kontroli urządzenia i nie musi być powtarzana przed każdym eksperymentem. Patrz Rysunek 3B,C. Ponieważ wiele elektrozaworów wymaga wyższego napięcia, elektromagnes najprawdopodobniej nie będzie podłączony bezpośrednio do mikrokontrolera, ale za pomocą przekaźnika lub tranzystora MOSFET (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 3C).
<ol>
	<li>Zidentyfikuj źródło sprężonego powietrza (np. instalację naścienną lub butlę z gazem).</li>
	<li>Podłącz źródło ciśnienia do odpowiedniego regulatora ciśnienia (zakres ciśnienia 0-2 bar) za pomocą rurki 6 mm (źródło ścienne) lub bezpośrednio podłącz odpowiedni reduktor do butli z gazem.</li>
	<li>Podłącz regulator ciśnienia do wejścia zaworu elektromagnetycznego (rurka 6 mm, patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 3B).</li>
	<li>Umieść elektrozawór jak najbliżej stolika mikroskopu (sugerowane jest ~0.5-1 m od stolika, chociaż w razie potrzeby możliwe są większe odległości).</li>
	<li>Podłączyć elektrozawór elektronicznie do wybranego sterownika. Dostępne są różne opcje, takie jak sterowanie nim za pomocą oddzielnej płytki mikrokontrolera (np. Arduino) lub istniejącej karty DAq.</li>
</ol>
7. Czyszczenie i przechowywanie
<ol>
	<li>Po zakończeniu eksperymentu wyjmij urządzenie z mikroskopu.</li>
	<li>Usuń płyn zanurzeniowy. Olejek immersyjny można usunąć za pomocą rozpuszczalników organicznych (np. acetonu, metanolu itp.).</li>
	<li>Umieść urządzenie na płaskiej powierzchni i odłącz wszystkie rurki z wyjątkiem rurki zaworu. Aby bezpiecznie odłączyć każdą rurkę, naciśnij znajdujący się w pobliżu PDMS i delikatnie pociągnij. Nie podnoś i nie zginaj urządzenia, ponieważ może to spowodować pęknięcie szkła nakrywkowego.</li>
	<li>Oczyść powierzchnię PDMS 70% etanolem.</li>
	<li>Przechowuj urządzenie w temperaturze pokojowej z dołączoną rurką zaworu. 
	UWAGA: Urządzenie może być ponownie użyte, dopóki wszystkie jednostki nie zostaną użyte, prawdopodobnie bez konieczności ponownego napełniania rurki zaworu. Jednak woda w rurkach zaworu wyparuje przez dłuższy czas i może ostatecznie wymagać ponownego napełnienia.</li>
</ol>

<ol><li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-embryonic+cell+lineages+of+the+nematode%2C+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 56 (1), 110-156 (1977).</li>
<li>Lin, R., Kipreos, E. T., Zhu, J., Khang, C. H., Kner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+three-dimensional+imaging+deep+through+multicellular+thick+samples+by+structured+illumination+microscopy+and+adaptive+optics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Subcellular three-dimensional imaging deep through multicellular thick samples by structured illumination microscopy and adaptive optics.</a> Nat Commun. 12 (1), 3148(2021).</li>
<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 100 (1), 64-119 (1983).</li>
<li>Luke, C. J., Niehaus, J. Z., O'Reilly, L. P., Watkins, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-microfluidic+methods+for+imaging+live+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Non-microfluidic methods for imaging live C. elegans.</a> Methods. 68 (3), 542-547 (2014).</li>
<li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 177-206 (2012).</li>
<li>Wolke, U., Jezuit, E. A., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-dependent+cytoplasmic+streaming+in+C.+elegans+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Actin-dependent cytoplasmic streaming in C. elegans oogenesis.</a> Development. 134 (12), 2227-2236 (2007).</li>
<li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li>
<li>Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfabricated+array+of+clamps+for+immobilizing+and+imaging%C3%82%C2%A0C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfabricated array of clamps for immobilizing and imagingÂ C. elegans.</a> Lab Chip. 7 (11), 1515-1523 (2007).</li>
<li>Rohde, C. B., Zeng, F., Gonzalez-Rubio, R., Angel, M., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for+on-chip+high-throughput+whole-animal+sorting+and+screening+at+subcellular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for on-chip high-throughput whole-animal sorting and screening at subcellular resolution.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (35), 13891-13895 (2007).</li>
<li>Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+on-chip+rapid+microscopy%2C+phenotyping+and+sorting+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans.</a> Nat Methods. 5 (7), 637-643 (2008).</li>
<li>Krajniak, J., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+high-resolution+imaging+and+culture+of+C.+elegans+in+chip-gel+hybrid+microfluidic+device+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies.</a> Lab Chip. 10 (14), 1862-1868 (2010).</li>
<li>Samara, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+in+vivo+femtosecond+laser+neurosurgery+screen+reveals+small-molecule+enhancer+of+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Large-scale in vivo femtosecond laser neurosurgery screen reveals small-molecule enhancer of regeneration.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18342-18347 (2010).</li>
<li>Stirman, J. N., Brauner, M., Gottschalk, A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+study+of+synaptic+transmission+at+the+neuromuscular+junction+enabled+by+optogenetics+and+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput study of synaptic transmission at the neuromuscular junction enabled by optogenetics and microfluidics.</a> J Neurosci Methods. 191 (1), 90-93 (2010).</li>
<li>San-Miguel, A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+as+a+tool+for%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Microfluidics as a tool for.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , (2013).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multi-channel+device+for+high-density+target-selective+stimulation+and+long-term+monitoring+of+cells+and+subcellular+features+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A multi-channel device for high-density target-selective stimulation and long-term monitoring of cells and subcellular features in C. elegans.</a> Lab Chip. 14 (23), 4513-4522 (2014).</li>
<li>Mondal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+microfluidics+providing+high-resolution+and+high-throughput+screening+of+Caenorhabditis+elegans+poly-glutamine+aggregation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model.</a> Nat Commun. 7 (1), 13023(2016).</li>
<li>Berger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+C.+elegans+immobilization+enables+high-resolution+developmental+studies+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Long-term C. elegans immobilization enables high-resolution developmental studies in vivo.</a> Lab Chip. 18 (9), 1359-1368 (2018).</li>
<li>Berger, S., Spiri, S., DeMello, A., Hajnal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic-based+imaging+of+complete+Caenorhabditis+elegans+larval+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Microfluidic-based imaging of complete Caenorhabditis elegans larval development.</a> Development. 148 (18), dev199674(2021).</li>
<li>Spiri, S., Berger, S., Mereu, L., DeMello, A., Hajnal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+EGFR+signaling+in+the+anchor+cell+ensures+precise+inter-organ+connection+during+Caenorhabditis+elegans+vulval+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Reciprocal EGFR signaling in the anchor cell ensures precise inter-organ connection during Caenorhabditis elegans vulval morphogenesis.</a> Development. 149 (1), dev199900(2022).</li>
<li>Gritti, N., Kienle, S., Filina, O., Van Zon, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+time-lapse+microscopy+of+C.+elegans+post-embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Long-term time-lapse microscopy of C. elegans post-embryonic development.</a> Nat Commun. 7 (1), 12500(2016).</li>
<li>Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+high-resolution+imaging+of+developing+C.+elegans+larvae+with+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term high-resolution imaging of developing C. elegans larvae with microfluidics.</a> Dev Cell. 40 (2), 202-214 (2017).</li>
<li>Heinze, S. D., Berger, S., Engleitner, S., Daube, M., Hajnal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonging+somatic+cell+proliferation+through+constitutive+hox+gene+expression+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Prolonging somatic cell proliferation through constitutive hox gene expression in C. elegans.</a> Nat Commun. 14 (1), 6850(2023).</li>
<li>Agarwal, P., Berger, S., Shemesh, T., Zaidel-Bar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+nuclear+positioning+and+actomyosin+contractility+maintain+leader+cell+integrity+during+gonadogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Active nuclear positioning and actomyosin contractility maintain leader cell integrity during gonadogenesis.</a> Curr Biol. 34 (11), 2373-2386 (2024).</li>
<li>Segos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-random+segregation+of+mitochondria+during+asymmetric+cell+division+contributes+to+cell+fate+divergence+in+daughter+cells%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Non-random segregation of mitochondria during asymmetric cell division contributes to cell fate divergence in daughter cells.</a> bioRxiv. , 2024-2109 (2024).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , (2006).</li>
<li>Pepin, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPepin%2C+B+%22GPU+Deconvolution+Library+with+C+and+Matlab+API+for+Nvidia+GPUs%22">GPU Deconvolution Library with C and Matlab API for Nvidia GPUs</a>. , https://github.com/bobpepin/YacuDecu (2025).</li>
<li>Podbilewicz, B., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fusions+in+the+developing+epithelia+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell fusions in the developing epithelia of C. elegans.</a> Dev Biol. 161 (2), 408-424 (1994).</li>
<li>Nusser-Stein, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cycle+regulation+of+NOTCH+signaling+during+C.+elegans+vulval+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-cycle regulation of NOTCH signaling during C. elegans vulval development.</a> Mol Syst Biol. 8 (1), 618(2012).</li>
<li>Euling, S., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochronic+genes+control+cell+cycle+progress+and+developmental+competence+of+C.+elegans+vulva+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Heterochronic genes control cell cycle progress and developmental competence of C. elegans vulva precursor cells.</a> Cell. 84 (5), 667-676 (1996).</li>
<li>Mok, D. Z., Sternberg, P. W., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologically+defined+sub-stages+of+C.+elegans+vulval+development+in+the+fourth+larval+stage%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphologically defined sub-stages of C. elegans vulval development in the fourth larval stage.</a> BMC Dev Biol. 15, 1-8 (2015).</li>
<li>Laranjeira, A. C., Berger, S., Kohlbrenner, T., Greter, N. R., Hajnal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+vitamin+B12+regulates+RAS%2FMAPK-mediated+cell+fate+decisions+through+one-carbon+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Nutritional vitamin B12 regulates RAS/MAPK-mediated cell fate decisions through one-carbon metabolism.</a> Nat Commun. 15 (1), 8178(2024).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych lub finansowych interesów.

W artykule opisano działanie unikalnej mikroprzepływowej platformy do długoterminowego obrazowania, która nadaje się do obrazowania w wysokiej rozdzielczości i śledzenia różnych procesów rozwojowych u C. elegans podczas wszystkich czterech stadiów larwalnych do wczesnej dorosłości18. Możliwość śledzenia procesów rozwojowych w czasie in vivo, przy użyciu tej i innych metod obrazowania, stała się nieodzowna w wielu dziedzinach badań nad C. elegans i pozwoliła na znalezienie odpowiedzi na wcześniej niedostępne pytania 23,24,29.
W przeciwieństwie do tradycyjnych metod obrazowania wykorzystujących podkładki agarowe i wcześniej opublikowanych długoterminowych strategii obrazowania opartych na mikroprzepływach, podejście to zachowuje tożsamość i orientację robaka przez cały czas trwania eksperymentu, umożliwiając śledzenie złożonych procesów rozwojowych w czasie. Niezależnie od etapu rozwoju, zwierzęta są zamknięte w jednym z 41 równoległych kanałów pułapek, z których każdy jest podłączony do wbudowanego źródła pożywienia i pokryty dużym zaworem hydraulicznym. Unieruchomienie wszystkich uwięzionych robaków następuje poprzez napompowanie zaworu hydraulicznego, dociskanie ślimaków do szkła osłonowego tylko podczas akwizycji obrazu. Obrazowanie o wysokiej przepustowości jest możliwe dzięki wąsko rozmieszczonemu układowi kanałów pułapek, z wieloma zwierzętami widocznymi w jednym polu widzenia. Długoterminowe urządzenia do obrazowania są kompatybilne z większością konfiguracji mikroskopów, wymagają minimalnego dodatkowego sprzętu (mniej niż 1000 USD) i nie wymagają modyfikacji istniejącego sprzętu. Obsługa urządzeń jest celowo prosta, więc wszyscy użytkownicy powinni szybko być w stanie się jej nauczyć, postępując zgodnie z powyższym protokołem i przedstawionymi wynikami. 
Krótko mówiąc, zwierzęta mogą być obrazowane na chipie w maksymalnie 2,5 stadium larwalnym (ryc. 1C). Zwierzęta są wstępnie synchronizowane i albo bezpośrednio ładowane na chip (urządzenie L1), albo wysiewane na płytkę NGM do pożądanego etapu rozwoju (urządzenia L1-L4 i L2-A). Zwierzęta na chipie są karmione za pomocą wysoce skoncentrowanej zawiesiny bakteryjnej i unieruchamiane za pomocą wbudowanego zaworu hydraulicznego uruchamianego przez oprogramowanie do obrazowania (rysunek 1B). Zwierzęta są manewrowane do kanałów pułapki za pomocą strzykawki, ostrożnie ustawiając zwierzęta z głową w kierunku źródła pożywienia, a na koniec łapiąc zwierzęta na końcu kanału pułapki (Rysunek 1A i Rysunek 2). Należy zachować ostrożność, aby powietrze nie zostało uwięzione w strzykawkach, igłach i rurkach, ponieważ pęcherzyki powietrza łatwo zakłócą pozycję zwierzęcia. Urządzenia są kompatybilne z większością metod obrazowania 18,19,24, ponieważ materiał PDMS jest wysoce przezroczysty, niefluorescencyjny i uszczelniony na cienkim szkle nakrywkowym (Rysunek 4, Film uzupełniający 1, Film uzupełniający 2 i Film uzupełniający 3). Należy jednak zachować ostrożność przy wyborze warunków obrazowania, ponieważ długie czasy naświetlania i wysoka intensywność wzbudzenia łatwo wpływają na żywotność zwierząt i powodują fotowybielanie.
Oprócz przedstawionej wersji tej metody obrazowania, możliwe jest już kilka modyfikacji protokołu. Najprostszą modyfikacją jest zastąpienie standardowych szczepów bakterii, np. bakteriami wykazującymi ekspresję RNAi18 lub bakteriami o różnych wartościach odżywczych32. Szczepy bakteryjne można łatwo wymieniać, dostosowując zawartość Optiprep do różnic w gęstości. Podobnie, do pokarmu bakteryjnego można dodać dowolną liczbę związków, np. auksynę, składniki odżywcze lub małocząsteczkowe związki lecznicze, a ich działanie obserwuje się bezpośrednio in vivo, bez konieczności wprowadzania jakichkolwiek zmian w protokole. W szczególności opracowano urządzenie do wymiany pożywek do degradacji białek indukowanej auksyną lub wszelkich zastosowań, które wymagają czasowej lub odwracalnej ekspozycji poprzez dodanie wlotu pokarmu do układu urządzenia bez zmiany geometrii lub działania. Dodatkowy wlot umożliwia proste przełączanie między dwoma różnymi stanami, np. auksyna i brak auksyny, podłączonymi do urządzenia w taki sam sposób, jak pokazano tutaj dla jednego źródła żywności, a wynikające z tego zmiany są obserwowane bezpośrednio. Opracowano również warianty urządzeń, w których zawór hydrauliczny nie jest współdzielony przez wszystkie jednostki w urządzeniu, ale oddzielony dla każdej jednostki, tak aby można było obrazować wiele warunków w tym samym urządzeniu i eksperymentować indywidualnie, zmniejszając potencjalnie szkodliwe skutki długiego czasu uruchamiania zaworu i akwizycji. Wreszcie, poza oryginalnymi wariantami urządzenia opisanymi w Berger i wsp.18, opracowano dwa nowe warianty urządzenia, L3-A i L4-A (wprowadzone tutaj), umożliwiające obrazowanie od połowy etapu L3 lub połowy L4 do dorosłości. Celem tych modyfikacji jest opóźnienie czasu rozpoczęcia eksperymentu do późniejszego stadium larwalnego, tak aby większe zwierzęta mogły być ładowane do zastosowań, w których wcześniejsze stadia rozwojowe nie są interesujące.

C. elegans można przeprowadzić na kilka sposobów, w zależności od zastosowania, pożądanej przepustowości i rozdzielczości. Gdy wymagana jest wysoka rozdzielczość, standardowa metoda wykorzystuje podkładki agarowe1,2,3, prostą konstrukcję ze szkła podstawowego, agarozy i szkła nakrywkowego. Zwierzęta na tych szkiełkach są unieruchomione przez nacisk wywierany przez szkło nakrywkowe. Unieruchomienie można dodatkowo poprawić poprzez dodanie środków znieczulających, np. lewamizolu lub azydku sodu1,2, tak aby zwierzęta na podkładkach agarowych były idealnie nieruchome i mogły być obrazowane w wysokiej rozdzielczości, w tym różne metody superrozdzielczości2. Niestety, wiadomo, że podkładki agarowe wpływają na postęp rozwoju, a połączenie wysokich ciśnień i środków znieczulających opóźnia rozwój lub powoduje całkowite zatrzymanie rozwoju4,5.
Oprócz tych standardowych metod, w ostatnich latach pojawiło się kilka metodologii mikroprzepływowych, z których każda ma swoje zalety i wady lub specjalistyczne przypadki użycia6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Na przykład Gritti et al.20 wprowadzili metodę, w której robaki są zamykane w dużych komorach. Zarodki umieszczone w tych komorach rozwijają się i poruszają swobodnie, pozostając jednocześnie w wyznaczonym obszarze zainteresowania pod mikroskopem. Chociaż podejście to jest ogólnie skuteczne, ogranicza się do stosowania jasnych markerów fluorescencyjnych. Niedawno Keil et al.21 zaproponowali zmodyfikowaną wersję tej metody, zawierającą wbudowany zawór hydrauliczny do krępowania zwierząt podczas akwizycji obrazu, rozwiązując w ten sposób pewne ograniczenia pierwotnego podejścia. Ponieważ jednak obie metody wykorzystują większe komory niż te używane do uwięzionych robaków, zwierzęta nadal poruszają się i obracają przez cały czas trwania eksperymentu. W rezultacie śledzenie procesów rozwojowych staje się wyzwaniem i wymaga obszernego przetwarzania obrazu w celu skorygowania ruchu zwierząt.
Aby rozwiązać te ograniczenia, dostosowano podejście wprowadzone przez Berger et al.18 (Rysunek 1), gdzie zwierzęta nie są trzymane w dużej komorze, ale w kanale pułapki zaprojektowanym tak, aby zmieścić zwierzęta w krótszym oknie rozwojowym (do 2,5 stadium larwalnego). W przeciwieństwie do istniejących metod mikroprzepływowych, podejście to pozwala zachować orientację i tożsamość zwierzęcia przez cały czas trwania eksperymentu i umożliwia uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości wielu robaków równolegle i w wielu stadiach larwalnych w jednym urządzeniu.
Zwierzęta są uwięzione za pomocą wyspecjalizowanej geometrii kanału, gdzie wysokość kanału jest zbliżona do grubości zwierzęcia na początku eksperymentu, co zapobiega rotacji. Szerokości i długości kanałów są dobierane tak, aby zwierzęta mogły się poruszać i rosnąć w czasie, ułatwiając linienie i przejście z jednego stadium larwalnego do drugiego. Zrównoleglenie osiąga się po prostu poprzez umieszczenie wielu kanałów pułapek obok siebie, tak aby wiele zwierząt było widocznych w jednym polu widzenia (FOV, <silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A'), a do 41 zwierząt może być obrazowanych w jednej jednostce urządzenia (<silna klasa = "xfig"> Rysunek 1A). Zwierzęta na chipie są stale zaopatrywane w wysoce skoncentrowaną bakteryjną zawiesinę pokarmową przez kanał o niskiej wysokości, który jednocześnie pomaga uwięzić zwierzęta na końcu układu kanału pułapki (krok wysokości, <silna klasa="xfig">Rysunek 1A, czerwony). Podobnie jak w przypadku podejścia przyjętego przez Keila i in.21, zaimplementowano duży hydrauliczny zawór na chipie, który można napompować podczas akwizycji obrazu, dociskając zwierzęta do szkła nakrywkowego, poprawiając w ten sposób unieruchomienie zwierzęcia (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Ograniczenie uruchamiania zaworu hydraulicznego tylko do okresu akwizycji obrazu minimalizuje niekorzystny wpływ na rozwój zwierząt, zapewniając niezawodny rozwój we wszystkich stadiach larwalnych. W przeciwieństwie do metod opisanych przez Gritti et al.20 i Keil et al.21, zwierzęta nie mogą być obrazowane w całym rozwoju postembrionalnym w ramach tego samego urządzenia. Zamiast tego wprowadzono pięć odrębnych urządzeń, oznaczonych odpowiednio jako L1, L1-4, L2-A, L3-A i L4-A, obejmujących cały etap L1 i wczesny etap L2, średni późny etap L1 do połowy etapu L4, środkowy późny L2 aż do młodej dorosłości, środkowy koniec L3 do młodej dorosłości i późny L4 do młodej dorosłości (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C), które umożliwiają nieprzerwane obrazowanie dużych części rozwoju postembrionalnego. Takie podejście jest przyjmowane ze względu na duży wzrost wielkości zwierząt od L1 do dorosłości, tak że kanał odpowiedni dla zwierząt L1 byłby o wiele za mały dla dorosłych, co spowodowałoby zatrzymanie rozwoju, a kanał pasujący do dorosłych byłby o wiele za duży dla L1, co spowodowałoby nadmierny ruch, rotację i ucieczkę zwierząt z kanałów pułapek.
Korzystając z tego podejścia, osiąga się niezawodny postęp rozwojowy dla różnych tkanek18, np. postembrionalny rozwój tkanki podskórnej (etap L1 do L4), indukcja losów komórek sromu (etap L2 i L3), morfogeneza sromu (L3 do dorosłości19) i inwazja komórek kotwicznych. Od momentu ich wprowadzenia, te długoterminowe urządzenia do obrazowania były używane do badania różnych procesów22,23, przy czym platforma została nawet połączona z technikami takimi jak mikroskopia superrozdzielcza AiryScan24, umożliwiając liczne odkrycia, które wcześniej były niemożliwe.
Poniżej przedstawiono krok po kroku aspekty operacyjne tych urządzeń do długoterminowego obrazowania, podkreślając oczekiwane wyniki i niektóre potencjalne wyzwania podczas konfiguracji systemu.

<table><tbody><tr><td>Zawór elektromagnetyczny 3/2&nbsp;</td><td>Distrelec</td><td>154-22-898 i 154-22-899</td><td>Alternatywa dla powyższego. Zawór elektromagnetyczny łączący regulator ciśnienia z zaworem na chipie.</td></tr><tr><td>Arduino</td><td>Distrelec</td><td>301-01-956</td><td>Opcjonalny mikrokontroler w zależności od wybranego kontrolera i interfejsu.</td></tr><tr><td>Bacto-Tryptone</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>211705</td><td>do produkcji bulionu L.</td></tr><tr><td>Drożdże bakto-drożdżowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>212750</td><td>Do produkcji bulionu L.</td></tr><tr><td>igła 23G</td><td>Gonano Dosiertechnik</td><td>GGA723050&nbsp;</td><td>igła łącząca rurkę 1/16" ze strzykawką.</td></tr><tr><td>igła 30G</td><td>Gonano Dosiertechnik</td><td>IG-TE730050</td><td>igła łącząca rurkę 1/32" ze strzykawką.</td></tr><tr><td>C. elegans Construct 1</td><td>NA</td><td></td><td>AH5786 LGI: hmr-1(cp21[hmr-1::gfp + LoxP]) Marston, D.J. et al. MRCK-1 napędza zwężenie wierzchołkowe u C. elegans, łącząc wzorce rozwojowe z generowaniem siły. Curr. Biol. 26 (16), 2079-2089. 2016.</td></tr><tr><td>C. elegans Construct 2</td><td>NA</td><td></td><td>AH1187 LGII: arIs92[egl-17::cfp] Yoo, A.S., Bais, C., Greenwald, I. Przesłuch między szlakami EGFR i LIN-12 / Notch w rozwoju sromu C. elegans. Nauka. 303 (5658), 663-666. 2004.</td></tr><tr><td>C. elegans Construct 3</td><td>NA</td><td></td><td>AH5786 LGV: qyIs50[Pcdh-3>mCherry::moeABD, unc-119(+)] Ziel, J.W., Hagedorn, E.J., Audhya, A., Sherwood, D.R. UNC-6 (netrin) orientuje inwazyjną błonę komórki kotwiczącej u C. elegans. Nat. Cell Biol., 11 (2), 183-189. 2009.</td></tr><tr><td>C. elegans Construct 4</td><td>NA</td><td>NA</td><td>ML2615 LGX: dlg-1(mc103[dlg-1::gfp]) Vuong-Brender, T.T.K., Suman, S.K., Labouesse, M. Wierzchołkowy ECM zachowuje integralność zarodka i rozkłada naprężenia mechaniczne podczas morfogenezy. Rozwój. 144 (23), 4336-4349. 2017.</td></tr> <tr><td></td><td>Distrelec</td><td>143-46-644</td><td>Potrzebny przy wyborze elektrozaworu z distrelec. Przewód łączący elektrozawór z tranzystorem MOSFET.</td></tr><tr><td>Chlorotrimetylosilan&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>386529-25ML</td><td>Silane do pasywacji wafli.</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8667</td><td>dla&nbsp; Produkcja S-Basal.</td></tr><tr><td>Dioda Flyback</td><td>Distrelec</td><td>110-52-628</td><td>Dioda Flyback chroniąca mikrokontroler.</td></tr><tr><td>Drążony trzpień stalowy</td><td>Gonano Dosiertechnik</td><td>GGA7R23050&nbsp;</td><td>Drążony stalowy trzpień 23G łączący rurkę 1/16" z urządzeniem.</td></tr><tr><td>L Rosół</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Przygotowany we własnym zakresie według standardowej receptury. 10 g Bakto-trypton, 5 g Drożdże baktologiczne, 5 g NaCl, H2O do 1 litra, pH do 7,0 przy użyciu 1 M NaOH</td></tr><tr><td>Urządzenie do obrazowania długoterminowego L1</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Urządzenie do długotrwałego obrazowania larw L1 do wczesnych/środkowych larw L2. Wykonane na miejscu, dostępne na zamówienie. Dostępny również w wariancie wymiany mediów.</td></tr><tr><td>Urządzenie do obrazowania długoterminowego L1-4</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Urządzenie do obrazowania długoterminowego dla larw od środkowego L1 do środkowego L4. Wykonane na miejscu, dostępne na zamówienie. Dostępny również w wariancie wymiany mediów.</td></tr><tr><td>Urządzenie do obrazowania długoterminowego L2-A</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Urządzenie do obrazowania długoterminowego od połowy L2 do dorosłości (ewersja). Wykonane na miejscu, dostępne na zamówienie. Dostępny również w wariancie wymiany mediów.</td></tr><tr><td>Urządzenie do obrazowania długoterminowego L3-A</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Urządzenie do obrazowania długoterminowego dla środkowego L3 do dorosłości (ewersja). Wykonane na miejscu, dostępne na zamówienie. Dostępny również w wariancie wymiany mediów.</td></tr><tr><td>Urządzenie do obrazowania długoterminowego L4-A</td><td>NA</td><td></td><td>NA Urządzenie do obrazowania długoterminowego dla połowy L4 do dorosłości (ewersja). Wykonane na miejscu, dostępne na zamówienie. Dostępny również w wariancie wymiany mediów.</td></tr><tr><td>Bufor M9</td><td>NA</td><td></td><td>NA Przygotowany we własnym zakresie według standardowej receptury.</td></tr><tr><td>MOSFET</td><td>Distrelec</td><td>303-41-391</td><td>Tranzystor polowy metalowo-tlenkowo-półprzewodnikowy, używany do przełączania 24VDC wymaganego dla elektrozaworu.</td></tr><tr><td>Talerze NGM</td><td>NA</td><td>NA Przygotowywane</td><td>we własnym zakresie według standardowej receptury.</td></tr><tr><td>Nylonowy adapter Fisher Scientific 11776048 Luer-Fitting</td><td></td><td></td><td>z rurki OD 6 mm do igły 23G.</td></tr><tr><td>Optiprep</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1556</td><td>Ciecz dopasowująca gęstość.</td></tr><tr><td>Zestaw elastomerów</td> <td>PDMS</td><td>Ameba</td><td>Elastosil RT601A/B</td> PDMS.</tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2443</td><td>Niejonowy środek powierzchniowo czynny.</td></tr><tr><td>Diwodorofosforan potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1.37039</td><td>Dla&nbsp; Produkcja S-Basal.</td></tr><tr><td>Wodorofosforan potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1.05099</td><td>Dla&nbsp; Produkcja S-Basal.</td></tr><tr><td>Zasilanie 24VDC</td><td>Distrelec</td><td>301-63-304</td><td>Zasilacz 24VDC. Wybierz zasilacz odpowiedni dla wybranego elektrozaworu.</td></tr><tr><td>Precyzyjny regulator ciśnienia</td><td>Distrelec</td><td>154-23-578</td><td>Alternatywny do wyższego. Regulator ciśnienia.</td></tr><tr><td>Manometr G1/8</td><td>Distrelec</td><td>154-23-643</td><td>Manometr mocuje się do regulatora ciśnienia.</td></tr><tr><td>Rurka PU OD 6mm</td><td>Distrelec</td><td>154-23-866</td><td>Rurka łącząca źródło ciśnienia i regulator, a także regulator i zawór elektromagnetyczny.</td></tr><tr><td>Złączka wtykowa G1/8 do 6mm</td><td>Distrelec</td><td>301-69-330</td><td>Alternatywna do wyższej. 2x Złączka wtykowa mocowana do regulatora ciśnienia i łącząca się z rurką 6 mm.</td></tr><tr><td>Złączka wtykowa M5 do 6 mm</td><td>Distrelec</td><td>301-69-459</td><td>2x Złączka wtykowa mocowana do elektrozaworu i rurki 6 mm.</td></tr><tr><td>S-Basal Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Przygotowany we własnym zakresie według standardowej receptury. 5,85 g NaCl, 1 g K2HPO4, 6 g KH2PO4, 1 ml cholesterolu (5 mg/ml w etanolu), H2O do 1 litra. Sterylizuj w autoklawie.</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9625</td><td>do produkcji bulionu L i S-Basal.</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (5M)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>567530</td><td>Wodorotlenek sodu stosowany do wybielania C. elegans (przygotować roztwór o stężeniu 5M)</td></tr><tr><td>Podchloryn sodu (5%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1.05614</td><td>Podchloryn sodu stosowany do bielenia C. elegans (przygotować roztwór o stężeniu 5%)</td></tr><tr><td>Sitko 10 i mikro; m</td><td>pluriSelect</td><td>43-10010-40</td><td>Alternatywa dla bakteryjnego przygotowywania żywności, zwłaszcza w przypadku stosowania mniejszych urządzeń.</td></tr><tr><td>Sitko 5 i mikro; m</td><td>pluriSelect</td><td>43-10005-40</td><td>Sitko służące do filtrowania larw L1 po całonocnej głodówce i bakterii po zakończonym przygotowywaniu posiłków.</td></tr><tr><td>SU-8</td><td>Gersteltec</td><td>GM1050</td><td>SU-8 dla wysokości od 1-10 &mikrom.</td></tr><tr><td>SU-8</td><td>Gersteltec</td><td>GM1060</td><td>SU-8 dla wysokości od 5-30 &mikrom.</td></tr><tr><td>SU-9</td><td>Gersteltec</td><td>GM1070</td><td>SU-8 dla wysokości od 15-200 &mikrom.</td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>11338763</td><td>strzykawka 1 ml. W przypadku stosowania innego typu należy upewnić się, że korpus strzykawki i tłok są sztywne, tak aby nie uległy deformacji przez pompę strzykawkową.</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>WPI</td><td>Al1000-220</td><td>Pompka strzykawkowa (https://www.wpiinc.com/var-2300-aladdin-single-syringe-pump.html).</td></tr><tr><td>Tubka 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-809-220</td><td>Probówka służąca do wybielania robaków i preparatu bakteryjnego.</td></tr><tr><td>Probówka 2 ml</td><td>Fisher Scientific NC1186931</td><td></td><td>Probówka służąca do preparatu robaków i bakterii.</td></tr><tr><td>Probówka 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-465-232</td><td>Probówka służąca do przygotowania i rozwoju bakterii.</td></tr><tr><td>Pęseta SMD</td><td>Br&uuml; tsch R&uuml; jajko Werkzeuge</td><td>448980</td><td>Pęseta służąca do podłączania rurki 1/32" do urządzenia.</td></tr><tr><td>Rurka Tygon 1/16"</td><td>Fisher Scientific</td><td>642002</td><td>Elastyczna rurka o średnicy zewnętrznej 1/16" łącząca większość komponentów z urządzeniem.</td></tr><tr><td>Rurka Tygon 1/32"</td><td>Fisher Scientific</td><td>641900</td><td>Elastyczna rurka o średnicy zewnętrznej 1/32" łącząca dopływ bakterii do urządzenia.</td></tr><tr><td>UV KUB-3</td><td>Kloe</td><td>NA</td><td>Nakładka na maskę i system ekspozycji UV.</td></tr><tr><td>Wafel</td><td>Siegert Wafel</td><td>4P0/>1/525&plusmn; 25/TPK/TTV< 10</td><td>Wafel krzemowy.</td></tr><tr><td>Pojemnik na odpady</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Przygotowany we własnym zakresie przy użyciu probówki o pojemności 2 ml lub fiolki kriogenicznej i wydrążonych stalowych kołków.</td></tr></tbody></table>

obrazowanie c. elegans w wysokiej rozdzielczości we wszystkich stadiach larwalnych

High-Resolution C. elegans Imaging Across All Larval Stages

Caenorhabditis elegans stał się jednym z najlepiej zbadanych i najlepiej zrozumianych modeli zwierzęcych w biologii. Trzy cechy są kluczem do sukcesu C. elegans jako organizmu modelowego: jego niezmienna linia komórkowa, przezroczystość i podatność genetyczna. Dzięki temu idealnie nadaje się do różnorodnych badań mikroskopowych bezpośrednio in vivo. Żywe larwy i dorosłe osobniki C. elegans często muszą być unieruchomione podczas pozyskiwania obrazu. Tradycyjne metody unieruchomienia niekorzystnie wpływają na rozwój zwierząt, zwłaszcza w zastosowaniach obrazowania poklatkowego. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół konfiguracji i obsługi nowatorskiej metody obrazowania mikroprzepływowego, który odnosi się do ograniczeń związanych z tradycyjną immobilizacją opartą na agarze i innymi strategiami mikroprzepływowymi. Takie podejście umożliwia jednoczesne obrazowanie na żywo w różnych stadiach larwalnych przy jednoczesnym zachowaniu orientacji i tożsamości robaka w czasie. Aby to osiągnąć, stosuje się mikroprzepływowy układ kanałów pułapek, którego geometria jest precyzyjnie zaprojektowana tak, aby utrzymać stabilną orientację robaka, jednocześnie dostosowując się do wzrostu i linienia. Unieruchomienie jest ułatwione przez aktywny zawór hydrauliczny, który wywiera nacisk, aby zabezpieczyć ślimaki przy szkle nakrywkowym wyłącznie podczas akwizycji obrazu. Taka konstrukcja umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości przy minimalnym wpływie na żywotność robaków lub czas rozwoju.

Ten protokół opisuje obrazowanie poklatkowe C. elegans oparte na mikroprzepływach w całym rozwoju postembrionalnym.

Obrazowanie C. elegans w wysokiej rozdzielczości we wszystkich stadiach larwalnych

Caenorhabditis elegans has become one of the most widely studied and best-understood animal models in biology. Three features are key to C. elegans' ...

W laboratorium pracujemy nad wszelkiego rodzaju pytaniami z zakresu biologii rozwojowej. Ja sam zajmuję się bardziej stroną techniczną, opracowując metody lepszego rozwiązywania tych problemów za pomocą technik obrazowania. Dziedzina C. elegans z powodzeniem przyjęła ogromną różnorodność metod, począwszy od edycji genów CRISPR, transkryptomiki i proteomiki, aż po mikroskopię superrozdzielczą. C. elegans jest niesamowitym modelem, jednak w kontekście obserwacji in vivo w wysokiej rozdzielczości wiąże się z wyzwaniami, wymagającymi unieruchomienia w celu uzyskania najlepszej rozdzielczości, co z kolei ogranicza żywotność zwierząt. Protokół przedstawia jedno z możliwych rozwiązań dla długoterminowego obrazowania C. elegans, umożliwiając naukowcom przyjęcie metody we własnym laboratorium i badanie szerokiej gamy dynamicznych procesów rozwojowych bezpośrednio in vivo. W laboratorium metoda ta pozwoliła na szczegółową obserwację powstawania narządów, na przykład w kontekście morfogenezy lub po podziałach komórek somatycznych do wieku dorosłego. Od tego czasu metoda ta została przyjęta przez wiele laboratoriów badających różnorodny zakres procesów rozwojowych.[Prezenter] Aby rozpocząć, przymocuj urządzenie do ramy nośnej i zamontuj je na pionowym mikroskopie. Napełnij strzykawkę wodą dejonizowaną, a następnie przymocuj igłę o rozmiarze 23 i długi kawałek rurki o wymiarach jeden na 16 cali za pomocą wydrążonego wygiętego stalowego kołka. Napełnij rurkę dejonizowaną wodą ze strzykawki i włóż stalowy kołek do wybitego otworu wlotu zaworu, aby podłączyć rurkę. Wyjmij strzykawkę i igłę przed podłączeniem rurki do elektrozaworu poza chipem. Korzystając z oprogramowania do obrazowania, włącz elektrozawór i zwiększ ciśnienie w urządzeniu przez kilka minut, aby usunąć całe powietrze z zaworu. Sprawdź zakończenie, sprawdzając wzrokowo, czy interfejs powietrze-woda wydaje się ciemny i znika w materiale PDMS. Wyłącz elektrozawór za pomocą oprogramowania do obrazowania. Następnie napełnij jednomililitrową strzykawkę przefiltrowanym roztworem bakterii i przymocuj igłę o rozmiarze 30 oraz długi kawałek rurki o wymiarach 1 na 32 cale do igły. Nacisnąć tłok, aby napełnić zarówno igłę, jak i dołączoną rurkę roztworem bakterii. Następnie za pomocą pęsety włóż rurkę o średnicy 32 cali bezpośrednio do wlotu pokarmu urządzenia mikroprzepływowego i umieść strzykawkę na pompie strzykawkowej. Naciśnij tłok strzykawki za pomocą skrzydełkowej z tyłu, aby napełnić urządzenie płynem. Zablokuj zarówno wlot, jak i wylot ślimaka za pomocą uszczelnionych stalowych kołków i zastosuj dodatkowy nacisk za pomocą ustalającej, aby usunąć pozostałe powietrze z urządzenia. Następnie wyjmij zablokowany stalowy kołek na wylocie i przymocuj pojemnik na odpady do wylotu. Naciskać strzykawkę, aby upewnić się, że pojemnik na odpady jest prawidłowo podłączony i że w systemie nie ma żadnych zatorów. Wyjąć drugi zablokowany stalowy kołek z wlotu i wciskać strzykawkę, aż na wlocie ślimaka pojawi się niewielka kropla płynu. Następnie za pomocą igły o rozmiarze 23 przymocuj dłuższy kawałek rurki o wymiarach 1 na 16 cali do około 15 do 20 centymetrów do jednomililitrowej strzykawki wypełnionej buforem S-basel. Przymocuj prosty stalowy kołek o rozmiarze 23 do drugiego końca rurki. Napełnić igłę i rurkę buforem S-basel ze strzykawki. Teraz włóż stalowy kołek na końcu rurki do rurki zawierającej ślimaki i przepchnij niewielką ilość płynu przez rurkę, aby upewnić się, że nie pozostało powietrze. Wciągnąć robaki do rurki bez wciągania ich do strzykawki. Następnie wciśnij strzykawkę podłączoną do ślimaków, aż na stalowym kołku pojawi się niewielka kropla płynu i włóż stalową strzykawkę do wlotu ślimaka urządzenia mikroprzepływowego. Umieść urządzenie na mikroskopie przy małym powiększeniu, 5x lub 10x, lub na mikroskopie preparacyjnym. Ustawić urządzenie w taki sposób, aby wlot był widoczny po jednej stronie pola widzenia, a tył wlotu kanału syfonu był widoczny po drugiej stronie. Delikatnie nacisnąć tłok strzykawki ślimakowej. Następnie popchnij zwierzęta w kierunku układu kanałów. Gdy zwierzę stanie twarzą do kanału, wepchnij je do kanału i powtórz dla kolejnych zwierząt. Po schwytaniu wystarczającej liczby zwierząt umieść strzykawkę, nadal przymocowaną do wlotu robaka, na stoliku mikroskopu, gdzie pozostanie przez cały czas trwania eksperymentu. Jeśli obciążenie zostało wykonane na mikroskopie preparacyjnym, przenieś urządzenie do mikroskopu obrazowego. Teraz włącz pompę strzykawkową i uruchom ją z ustaloną szybkością jednego mikrolitra na godzinę dla 0,5 mikrolitra. Zaprogramuj pompę strzykawkową tak, aby pracowała z prędkością jednego mikrolitra na godzinę przez 0,5 mikrolitra, po czym natężenie przepływu zwiększa się o 100 mikrolitrów na godzinę dla 0,5 mikrolitra, a wzór przepływu powtarza się przez cały eksperyment. Umieść urządzenie na stoliku mikroskopu i upewnij się, że jest mocno trzymane. Przełącz na żądane powiększenie obrazu. Zidentyfikuj zwierzęta i obszary zainteresowania w układzie kanałów pułapki i ustaw żądane warunki obrazowania. Obraz w żądanych warunkach obrazowania, uruchamiając zawór w układzie scalonym przez elektrozawór na 10 sekund przed akwizycją obrazu, aby zwierzęta były utrzymywane w miejscu. Urządzenie mikroprzepływowe utrzymało wysoką jakość obrazowania w różnych modalnościach mikroskopii, w tym w jasnym polu, epifluorescencji, konfokale wirującego dysku i metodach super rozdzielczości, dzięki zastosowaniu szkła osłonowego o grubości 170 mikrometrów. Rozwój komórek nabłonkowych Caenorhabditis elegans uwidoczniony od wczesnego stadium larwalnego L1 do połowy L2. Indukcja pierwotnych wyblakłych komórek prekursorowych sromu i ich późniejsze podziały od późnego stadium L1 do wczesnego stadium larwalnego L4 były oczywiste. Etapy tworzenia sromu od wczesnego L3 do dorosłości. Uzyskane obrazy zostały ulepszone poprzez dekonwolucję i rejestrację obrazu, co poprawiło przejrzystość wizualną Obserwowane podziały komórek wystąpiły w sposób spójny i terminowy u wszystkich zwierząt, przy czym wszystkie podziały zostały zakończone w typowym czasie trwania stadium larwalnego. Długość gonad wzrastała stale w fazach L2 i L3, a spójne pomiary były możliwe dzięki prostej orientacji zwierząt.

high-resolution-c-elegans-imaging-across-all-larval-stages

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Zarodek C. elegans jest potężnym systemem do badania biologii komórki i rozwoju. Przedstawiamy protokół obrazowania na żywo zarodków C. elegans z wykorzystaniem optyki DIC lub fluorescencji, przy użyciu powszechnie dostępnych mikroskopów epifluorescencyjnych oraz oprogramowania otwartoźródłowego.

Obrazowanie zarodków C. elegans przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego i oprogramowania otwartoźródłowego

Niniejszy artykuł opisuje technikę wizualizacji wczesnych etapów embriogenezy u nicienia Caenorhabditis elegans.

Mikroskopia poklatkowa wczesnego embrionogenezy u Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje, jak obrazować dzielące się komórki w tkance w zarodkach Caenorhabditis elegans. Podczas gdy kilka protokołów opisuje, jak obrazować podział komórek we wczesnym zarodku, ten protokół opisuje, jak obrazować podział komórek w rozwijającej się tkance podczas środkowej późnej embriogenezy.

Wizualizacja cytokinezy neuroblastów podczas embriogenezy C. elegans

Obrazowanie zachowania i aktywności neuronalnej w długich skalach czasowych bez unieruchomienia zwierzęcia jest warunkiem wstępnym do zrozumienia zachowania. Obrazowanie komór mikroprzepływowych z agarozą (AMI) może być wykorzystywane do obrazowania aktywności i zachowania neuronów na wszystkich etapach życia Caenorhabditis elegans.

Mikrokomory agarozowe do długoterminowego obrazowania wapnia Caenorhabditis elegans

Przezroczyste jelito C. elegans może służyć jako "komora tkankowa in vivo" do badania biogenezy błony wierzchołkowej i światła na poziomie pojedynczej komórki i subkomórkowej podczas tubulingenezy wielokomórkowej. Protokół ten opisuje, w jaki sposób połączyć standardowe znakowanie, genetykę utraty funkcji/RNAi i podejścia mikroskopowe w celu przeanalizowania tych procesów na poziomie molekularnym.

Jelito C. elegans jako model morfogenezy światła międzykomórkowego i biogenezy błony spolaryzowanej in vivo na poziomie pojedynczej komórki: znakowanie przez barwienie przeciwciałami, analiza utraty funkcji RNAi i obrazowanie

Tutaj prezentujemy podejście kombinatoryczne wykorzystujące mikroskopię o wysokiej rozdzielczości, narzędzia obliczeniowe i znakowanie pojedynczych komórek w żywych zarodkach C. elegans, aby zrozumieć dynamikę pojedynczej komórki podczas rozwoju neurologicznego.

Izotropowa mikroskopia świetlna i zautomatyzowane analizy linii komórkowych w celu skatalogowania embriogenezy Caenorhabditis elegans z rozdzielczością subkomórkową

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

Protokół opisuje prosty mikroprzepływowy układ scalony i metodologię mikroprodukcji używaną do hodowli C. elegans w obecności ciągłego dostarczania pożywienia przez okres do 36 godzin. Urządzenie do wzrostu i obrazowania umożliwia również przerywane, długotrwałe obrazowanie procesów komórkowych i subkomórkowych w wysokiej rozdzielczości podczas rozwoju przez kilka dni.

Prosty chip mikroprzepływowy do długoterminowego wzrostu i obrazowania Caenorhabditis elegans

Mikroskopia superrozdzielcza może dostarczyć szczegółowych informacji na temat organizacji komponentów w kompleksie synaptonemalnym w mejozie. Tutaj demonstrujemy protokół rozwiązywania poszczególnych białek kompleksu synaptonemalnego Caenorhabditis elegans.

Mikroskopia superrozdzielcza kompleksu synaptonemalnego w obrębie linii zarodkowej Caenorhabditis elegans

Poznaj mikroprzepływową metodę obrazowania C. elegans we wszystkich stadiach larwalnych. Technika ta umożliwia długotrwałe obserwacje procesów rozwojowych in vivo przy zachowaniu żywotności zwierząt.

Obrazowanie C. elegans w wysokiej rozdzielczości we wszystkich stadiach larwalnych

Przeglądaj więcej filmów