Name: Eksperymentalny protokół wykrywania funkcji mitochondriów w hepatocytach narażonych na pestycydy chloroorganiczne (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Odkryj metodę oceny funkcji mitochondriów w hepatocytach HepG2 narażonych na pestycydy chloroorganiczne. Protokół obejmuje pomiar ATP, zużycia tlenu i potencjału błonowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (Grant nr 81573174, 81570574); Wybitny Fundusz Młodzieżowy Prowincji Jiangsu (SBK2014010296); Projekt Badawczy chińskiego Ministerstwa Edukacji (213015A); Priorytetowy Program Akademicki Rozwoju Instytucji Szkolnictwa Wyższego w Jiangsu (PAPD), sztandarowy główny rozwój instytucji szkolnictwa wyższego w Jiangsu; oraz Program Projektów Otwartych Państwowego Laboratorium Kluczowego Laboratorium Środowiska Chemia i ekotoksykologia (KF2015-01).

Wszystkie eksperymenty i protokoły eksperymentów zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami oraz zatwierdzone przez lokalną Komisję Etyki Uniwersytetu Medycznego w Nankinie.
1. Ultrastruktura mitochondriów według TEM
<ol>
	<li>Pobieranie komórek HepG2
	<ol>
		<li>Wysiewaj komórki HepG2 w szalkach o średnicy 100 mm. Przechowywać w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Trawić komórki z 0,25% EDTA w probówce 1,5 mLEP.</li>
		<li>Wirować przy 1000 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej (RT). Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Zbierz 4-6 x 105 komórek HepG2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 1 ml 5% aldehydu glutarowego (rozpuszczalnik: woda podwójnie destylowana) za pomocą pipet i inkubować w temperaturze 4°C przez 2 godziny.</li>
	<li>Dodać i przemyć 4 zmiany po 1 ml buforu fosforanowego (zawierającego Na2HPO4, KH2PO4, NaCl i KCl, pH 7,4) każda, po 15 minut. Odessać bufor fosforanowy za pomocą pipet.</li>
	<li>Dodać 200 μm 1% osmu (rozpuszczalnik: woda podwójnie destylowana) i inkubować w temperaturze 4 °C przez 2 godziny do czarnej próbki. 
	ostrożność: Osm jest substancją wysoce toksyczną i lotną. Należy go ostrożnie obsługiwać w szafce na leki.</li>
	<li>Dodać i przemyć 2 zmiany po 1 ml buforu fosforanowego, każda po 5 minut. Odessać bufor fosforanowy.</li>
	<li>Barwienie w 2% roztworze octanu uranylu (rozpuszczalnik: podwójnie destylowana woda i kwas octowy) w probówce EP o pojemności 1,5 ml przez 2 godziny.</li>
	<li>Odwodnić i zanurzyć w 50% acetonie, 70% acetonie, 90% acetonie (rozpuszczalnik: woda podwójnie destylowana), 2 przemiany acetonu bezwzględnego, po 15 minut każda.</li>
	<li>Penetrować w 2 kroplach aceton (100%)/środek do zatapiania (1:1) przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej. Środek do zatapiania Epon812, przepis jest następujący: A: Epon812, 62 ml i DDSA, 100 ml; B: Epon812, 100 ml i MNA 89 ml. A:B=2:8 (v:v, zimą), A:B=1:9 (v:v, latem). Osadzanie w foremkach do zatapiania (miękka plastikowa płyta z siatką w kratkę).</li>
	<li>Inkubować sekwencyjnie w temperaturze 37 °C przez 12 godzin, w temperaturze 45 °C przez 12 godzin, a następnie w temperaturze 60 °C przez 48 godzin.</li>
	<li>Przygotowanie i obserwacja ultracienkich przekrojów (największa powierzchnia nie może przekraczać 0,5 mm × 0,3 mm) za pomocą ultracienkiej maszyny do profili i TEM (2 μm i 500 nm).</li>
</ol>
2. Wykrywanie intensywności fluorescencji mitochondrialnej
<ol>
	<li>Wysiewaj 2x 104 komórek HepG2 na płytkach 6-dołkowych. Dodaj β-HCH na 24 godziny.</li>
	<li>Dodaj bezwodny DMSO, aby sformułować końcowe stężenie 1 mM mitochondrialnej zielonej sondy fluorescencyjnej.</li>
	<li>Dodać 1 ml mitochondrialnego roztworu zielonej sondy fluorescencyjnej (końcowe stężenie: 200 nM) do każdej studzienki 6-dołkowych płytek, inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem obrazowania usunąć roztwór mitochondrialnej zielonej sondy fluorescencyjnej i dodać świeżo przygotowaną pożywkę do hodowli komórkowych (DMEM) w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Obserwuj zieloną fluorescencję mitochondriów pod mikroskopem fluorescencyjnym (10x). Maksymalna długość fali wzbudzenia w momencie wykrycia wynosi 490 nm, a maksymalna długość fali emisji wynosi 516 nm.</li>
</ol>
3. Oznaczanie komórkowych poziomów ATP
<ol>
	<li>Nasiona komórek HepG2 w płytkach 6-dołkowych. Dodaj β-HCH na 24 godziny.</li>
	<li>Dodaj 200 μl do lizy z zestawu do oznaczania ATP lucyferazy-lucyferyny do każdego dołka 6-dołkowych płytek. Wirować przy 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, zebrać supernatant za pomocą pipet do nowych probówek.</li>
	<li>Rozcieńczyć odczynnik do wykrywania ATP rozcieńczeniem ATP w stosunku 1: 5, jako bufor do wykrywania ATP.</li>
	<li>Przygotować oznaczenie krzywej wzorcowej: rozcieńczyć 0,5 mM roztworu wzorcowego ATP do 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 μM za pomocą do lizy ATP.</li>
	<li>Dodać 100 μl buforu detekcyjnego ATP do 96-dołkowej płytki na 5 minut w temperaturze pokojowej i dodać 100 μl supernatantu komórki, wykrytego za pomocą luminometru (detektor chemiluminescencji). Obliczyć stężenie ATP (nmol/l) za pomocą krzywej wzorcowej.</li>
	<li>Wykrywanie stężenia białka za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA z czytnikiem wielomodowym.
	<ol>
		<li>Przygotowanie oznaczenia krzywej wzorcowej: rozcieńczyć 5 mg/ml roztworu wzorcowego białka do 0, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 i 0,5 mg/ml wodą podwójnie destylowaną.</li>
		<li>Dodać 1 μl supernatantu komórki do płytki 96-dołkowej i dodać 19 μl podwójnie destylowanej wody.</li>
		<li>Dodaj 200 μl roztworów do wykrywania BCA do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Wykrywanie wartości OD (gęstości optycznej) przez czytnik wielomodowy o długości fali 562 nm. Obliczyć stężenie białka (mg/ml) za pomocą krzywej wzorcowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skorygować zawartość ATP na mg stężenia białka (jednostka: stężenie ATP/stężenie białka, nmol/mg).</li>
</ol>
4. Ocena potencjału błony mitochondrialnej (MMP) za pomocą JC-1
<ol>
	<li>Zbierz komórki HepG2 wysiane na płytkach 6-dołkowych. Trawić komórki z 0,25% EDTA w probówce EP o pojemności 1,5 ml, wirować przy 1000 x g przez 3 minuty, odrzucić supernatant i zebrać komórki.</li>
	<li>Dodaj 50 μl JC-1 (200X) do 8 ml wody destylowanej do wiru i wymieszaj. Dodaj 2 ml buforu barwiącego JC-1 (5X) jako roztwór do wykrywania JC-1.</li>
	<li>Inkubować komórki mieszaniną 0,5 ml pożywki do hodowli komórkowych i 0,5 ml roztworu do wykrywania JC-1 przez 20 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wirować przy 600 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Przepłukać w 2 zmianach 1 ml buforu barwiącego JC-1 (1X), odwirować przy 600 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. I wyrzuć supernatant.</li>
	<li>Zawieś komórki w 0,5 ml buforu barwiącego JC-1 (1X), przeanalizuj za pomocą cytometrii przepływowej w celu wykrycia zielonej i czerwonej fluorescencji. Po wykryciu polimeru JC-1 należy ustawić światło wzbudzenia na 490 nm, a światło emisyjne na 530 nm. Po wykryciu polimeru JC-1 ustaw światło wzbudzenia na 525 nm, a światło emisyjne na 590 nm.</li>
</ol>
5. Pomiary wskaźników zużycia tlenu (OCR)
<ol>
	<li>Nasiona komórek HepG2 w mikropłytkach 96-dołkowych w hodowli komórkowej o gęstości 4500 komórek/100 μl na dołek. Upewnij się, że komórki są pokryte każdym studziennem po 24 godzinach.</li>
	<li>Dodać odpowiednią objętość przygotowanych odczynników do odpowiedniego portu iniekcyjnego, zgodnie z wcześniejszą literaturą13. Port A: 25 μL 1 μM oligomycyny (sprzęgacz ATP); Port B: 25 μL 0,75 μM FCCP (elektroniczne sterowanie przepustnicą, akcelerator ETC); Port C: 25 μL 0,5 μM antymycyny A / rotenonu (inhibitor mitochondriów A i inhibitor mitochondriów B).</li>
	<li>Przechowuj wkład w inkubatorze w temperaturze 37 °C bez CO2 do czasu, gdy będzie gotowy do użycia.</li>
	<li>Dokonaj wymiany pożywki w płytce komórkowej poprzez usunięcie bieżącego medium z każdej studzienki i dodanie do nowego DMEM. Ostateczna objętość dla każdej studzienki wynosi 180 μl.</li>
	<li>Przechowywać płytkę komórkową w inkubatorze o temperaturze 37 °C bez CO2 przez 1 godzinę przed badaniem.</li>
	<li>Nagrywaj OCR automatycznie za pomocą oprogramowania.
	<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie OCR.</li>
		<li>Wybierz Cell Mito Stress Test Kit z menu rozwijanego Aplikacje.</li>
		<li>Kliknij przycisk Uruchom aplikację.</li>
		<li>Kliknij przycisk Uruchom test warunków skrajnych. Pojawi się ekran Cell Stress Test Setup (Konfiguracja testu obciążenia ogniwa).</li>
		<li>Wykonaj następujące czynności:
		<ol>
			<li>Wprowadź liczbę komórek rozsiewanych na studzienkę w polu Umieszczanie komórek #</li>.
			<li>Wprowadź średnią wartość OCR w polu Średni podstawowy OCR.</li>
			<li>Wprowadź końcowe stężenie robocze dla każdego odczynnika i wstrzyknij odczynniki. 
			UWAGA: Średnia podstawowa wartość OCR dla komórki powinna zostać wykryta przed uruchomieniem testu optymalizacyjnego podczas optymalizacji pod kątem stężenia wysiewu komórek.</li>
			<li>Kliknij przycisk Dalej. Pojawi się ekran informacji o grupie.</li>
			<li>Przypisz grupę do nieprzypisanych studni poprzez wybór koloru i nadanie nazwy, a następnie kliknięcie na odpowiednie studnie. 
			UWAGA: Różne grupy są definiowane jako różne zabiegi przed przeprowadzeniem testu stresu Cell Mito. Wszystkie studzienki z mikropłytkami otrzymają te same zastrzyki odczynnika po przeprowadzeniu testu warunków skrajnych.</li>
			<li>Kliknij przycisk Dalej. Pojawi się ekran Stress Test Injection Layout (Układ wtrysku testu warunków skrajnych).</li>
			<li>Kliknij przycisk Start. Test warunków skrajnych jest teraz uruchamiany w analizatorze. Po zakończeniu biegu postępuj zgodnie z punktami s w oprogramowaniu, wyjmij i wyrzuć wkład i płytkę ogniwa.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Rantakokko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+organic+pollutants+and+non-alcoholic+fatty+liver+disease+in+morbidly+obese+patients%3A+a+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health%22%5BJournal%5D)">Persistent organic pollutants and non-alcoholic fatty liver disease in morbidly obese patients: a cohort study.</a> Environ Health. 14, 79(2015).</li>
<li>Mrema, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+organochlorinated+pesticides+and+mechanisms+of+their+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Persistent organochlorinated pesticides and mechanisms of their toxicity.</a> Toxicology. 307, 74-88 (2013).</li>
<li>Dirinck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+and+persistent+organic+pollutants%3A+possible+obesogenic+effect+of+organochlorine+pesticides+and+polychlorinated+biphenyls%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver+Spring%29%22%5BJournal%5D)">Obesity and persistent organic pollutants: possible obesogenic effect of organochlorine pesticides and polychlorinated biphenyls.</a> Obesity (Silver Spring). 19 (4), 709-714 (2011).</li>
<li>Genini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+induced+by+a+SH2+domain-targeting+STAT3+inhibitor+leads+to+metabolic+synthetic+lethality+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction induced by a SH2 domain-targeting STAT3 inhibitor leads to metabolic synthetic lethality in cancer cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).</li>
<li>Korovljev, D., Trivic, T., Drid, P., Ostojic, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+hydrogen+affects+body+composition%2C+metabolic+profiles%2C+and+mitochondrial+function+in+middle-aged+overweight+women%5BTitle%5D)+AND+%22Ir+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular hydrogen affects body composition, metabolic profiles, and mitochondrial function in middle-aged overweight women.</a> Ir J Med Sci. , (2017).</li>
<li>Gonzalez-Franquesa, A., Patti, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+Resistance+and+Mitochondrial+Dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Insulin Resistance and Mitochondrial Dysfunction.</a> Adv Exp Med Biol. 982, 465-520 (2017).</li>
<li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Proton+Leak+Plays+a+Critical+Role+in+Pathogenesis+of+Cardiovascular+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases.</a> Adv Exp Med Biol. 982, 359-370 (2017).</li>
<li>Cheville, N. F., Stasko, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+in+electron+microscopy+of+animal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">Techniques in electron microscopy of animal tissue.</a> Vet Pathol. 51 (1), 28-41 (2014).</li>
<li>Nazmara, Z., Salehnia, M., HosseinKhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Distribution+and+ATP+Content+of+Vitrified%2C+In+vitro+Matured+Mouse+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Avicenna+J+Med+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Distribution and ATP Content of Vitrified, In vitro Matured Mouse Oocytes.</a> Avicenna J Med Biotechnol. 6 (4), 210-217 (2014).</li>
<li>Clapier, C. R., Iwasa, J., Cairns, B. R., Peterson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+action+and+regulation+of+ATP-dependent+chromatin-remodelling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of action and regulation of ATP-dependent chromatin-remodelling complexes.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).</li>
<li>Reitman, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+isocitrate+dehydrogenase+1+%28IDH1%29+R132H+mutation+and+d-2-hydroxyglutarate+stimulate+glutamine+metabolism+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) R132H mutation and d-2-hydroxyglutarate stimulate glutamine metabolism under hypoxia.</a> J Biol Chem. 289 (34), 23318-23328 (2014).</li>
<li>Nelson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+consumption+rate+v.+rate+of+energy+utilization+of+fishes%3A+a+comparison+and+brief+history+of+the+two+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Fish+Biol%22%5BJournal%5D)">Oxygen consumption rate v. rate of energy utilization of fishes: a comparison and brief history of the two measurements.</a> J Fish Biol. 88 (1), 10-25 (2016).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organochloride+pesticides+impaired+mitochondrial+function+in+hepatocytes+and+aggravated+disorders+of+fatty+acid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Organochloride pesticides impaired mitochondrial function in hepatocytes and aggravated disorders of fatty acid metabolism.</a> Sci Rep. 7, 46339(2017).</li>
<li>Tien, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Glucose+Induces+Mitochondrial+Dysfunction+in+Retinal+Muller+Cells%3A+Implications+for+Diabetic+Retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">High Glucose Induces Mitochondrial Dysfunction in Retinal Muller Cells: Implications for Diabetic Retinopathy.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (7), 2915-2921 (2017).</li>
<li>Dussmann, H., Perez-Alvarez, S., Anilkumar, U., Papkovsky, D. B., Prehn, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+time-lapse+imaging+of+intracellular+O2+in+response+to+metabolic+inhibition+and+mitochondrial+cytochrome-c+release%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Single-cell time-lapse imaging of intracellular O2 in response to metabolic inhibition and mitochondrial cytochrome-c release.</a> Cell Death Dis. 8 (6), 2853(2017).</li>
<li>Jaiswal, M. K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5216043/">Riluzole But Not Melatonin Ameliorates Acute Motor Neuron Degeneration and Moderately Inhibits SOD1-Mediated Excitotoxicity Induced Disrupted Mitochondrial Ca2+ Signaling in Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Front Cell Neurosci. 10, 295(2016).</li>
<li>Song, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lenti-siRNA+Hsp60+promote+bax+in+mitochondria+and+induces+apoptosis+during+heat+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Lenti-siRNA Hsp60 promote bax in mitochondria and induces apoptosis during heat stress.</a> Biochem Biophys Res Commun. 481 (1-2), 125-131 (2016).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tea+tree+oil+exhibits+antifungal+activity+against+Botrytis+cinerea+by+affecting+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Tea tree oil exhibits antifungal activity against Botrytis cinerea by affecting mitochondria.</a> Food Chem. 234, 62-67 (2017).</li>
<li>Grunig, D., Felser, A., Bouitbir, J., Krahenbuhl, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+catechol-O-methyltransferase+inhibitors+tolcapone+and+entacapone+uncouple+and+inhibit+the+mitochondrial+respiratory+chain+in+HepaRG+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">The catechol-O-methyltransferase inhibitors tolcapone and entacapone uncouple and inhibit the mitochondrial respiratory chain in HepaRG cells.</a> Toxicol In Vitro. 42, 337-347 (2017).</li>
<li>Mayor, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptor+kinase+2+%28GRK2%29+as+an+integrative+signalling+node+in+the+regulation+of+cardiovascular+function+and+metabolic+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) as an integrative signalling node in the regulation of cardiovascular function and metabolic homeostasis.</a> Cell Signal. , (2017).</li>
<li>Clark, A., Mach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Crosstalk+between+the+Gut+Microbiota+and+Mitochondria+during+Exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Crosstalk between the Gut Microbiota and Mitochondria during Exercise.</a> Front Physiol. 8, 319(2017).</li>
<li>Robicsek, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+Mitochondria+Transfer+Improves+Neuronal+Differentiation+of+Schizophrenia-Derived+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+and+Rescues+Deficits+in+a+Rat+Model+of+the+Disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophr+Bull%22%5BJournal%5D)">Isolated Mitochondria Transfer Improves Neuronal Differentiation of Schizophrenia-Derived Induced Pluripotent Stem Cells and Rescues Deficits in a Rat Model of the Disorder.</a> Schizophr Bull. , (2017).</li>
<li>Akinrotimi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shp+deletion+prevents+hepatic+steatosis+and+when+combined+with+Fxr+loss+protects+against+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Shp deletion prevents hepatic steatosis and when combined with Fxr loss protects against type 2 diabetes.</a> Hepatology. , (2017).</li>
<li>Rosa, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+into+the+antioxidant+role+of+tauroursodeoxycholic+acid+in+experimental+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Novel insights into the antioxidant role of tauroursodeoxycholic acid in experimental models of Parkinson's disease.</a> Biochim Biophys Acta. , (2017).</li>
<li>Matondo, A., Kim, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted-Mitochondria+Antioxidants+Therapeutic+Implications+in+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Drug+Target%22%5BJournal%5D)">Targeted-Mitochondria Antioxidants Therapeutic Implications in Inflammatory Bowel Disease.</a> J Drug Target. , 1-30 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kluczowe znaczenie dla powodzenia protokołu wykrywania ma zastosowanie różnorodnych metod eksperymentalnych, które zostały uwzględnione w badaniu od fenotypu do mechanizmu. W tym badaniu komórki HepG2 hodowano w DMEM z penicyliną i streptomycyną oraz 10% płodową surowicą bydlęcą. Gdy komórki osiągnęły 40-50% konfluencji, dodano β-HCH (0, 10, 100 ng / ml) i inkubowano przez 24 godziny. Po raz pierwszy użyliśmy TEM, który wykazał zmiany ultrastrukturalne w hepatocytach wywołane przez reprezentatywne OCP, β-HCH, wykazujące ...

Wpływ pestycydów chloroorganicznych (OCP) na zdrowie, np. zakłócenia reprodukcyjne, toksyczność immunologiczna, zmiany metaboliczne były wcześniej badane1,2,3. Metody wykrywania metabolizmu komórkowego i wykrywania dysfunkcji mitochondriów umożliwiły naukowcom zrozumienie roli funkcji mitochondriów (tj. poziomów mitochondriów STAT3, mleczanu, pirogronianu, stosunku mleczanu do pirogronianu, koenzymu Q10, mitochondrialnego wycieku protonów, bioenergetyki, biogenezy i dynamiki) w obszarach takich jak starzenie się, otyłość, cukrzyca, funkcjonowanie układu sercowo-naczyniowego, rak i toksyczność bezpieczeństwa4,5,6,7. W artykule opisano metody oceny dysfunkcji mitochondriów wywołanej przez OCP.
Wystawiliśmy komórki HepG2 na działanie β-heksachlorocykloheksanu (β-HCH), jednego reprezentatywnego OCP, przez 24 godziny w dawce równoważnej wewnętrznej ekspozycji człowieka. Po pierwsze, TEM zastosowano do obserwacji ultrastruktury hepatocytów, takich jak jądra, mitochondria i retikulum endoplazmatyczne8. W porównaniu ze zwykłymi mikroskopami, TEM umożliwia badanie ultrastruktury 2D i 3D komórek i składników komórkowych (linii komórkowych lub tkanek), morfologii, składu chemicznego, a także funkcji materiałów naturalnych lub sztucznych, które odgrywają kluczową rolę we współczesnej nauce i technologii. Funkcję mitochondriów oceniano następnie na podstawie intensywności fluorescencji mitochondriów, poziomu adenozyno-5'-trifosforanu (ATP), wskaźnika zużycia tlenu (OCR) i potencjału błony mitochondrialnej (MMP) w komórkach HepG2 inkubowanych z β-HCH. Mito-tracker green to mitochondrialna zielona sonda fluorescencyjna, która może być używana do barwienia fluorescencyjnego specyficznego dla mitochondriów żywych komórek. Mitochondria w hepatocytach wybarwiono zielonym roztworem mito-tracker, a intensywność, liczbę i wzór fluorescencji mitochondriów obserwowano za pomocą mikroskopii konfokalnej9. Mitochondrialna zielona sonda fluorescencyjna może być używana do barwienia żywych komórek. W porównaniu z rodaminą 123 lub JC-1, mitochondrialna zielona sonda fluorescencyjna nie zależy od potencjału błony mitochondrialnej do barwienia mitochondriów. Poziomy ATP oznaczono za pomocą zestawu lucyferaza-lucyferyna i znormalizowano przez stężenie białka. Zestaw do oznaczania ATP może być używany do wykrywania poziomów ATP w popularnych roztworach, komórkach lub tkankach. Ten zestaw jest oparty na lucyferazie świetlika katalizowanej przez fluoresceinę w celu wytworzenia fluorescencji, gdy ATP jest wymagane do dostarczenia energii. Gdy lucyferazy świetlika i fluoresceiny jest nadmiernie, w pewnym zakresie stężeń, wytwarzanie fluorescencji jest proporcjonalne do stężenia ATP. Ponadto zestaw ten został specjalnie zaprojektowany w celu optymalizacji chemiluminescencji ATP. ATP, jako najważniejsza cząsteczka energetyczna, odgrywa ważną rolę w różnych procesach fizjologicznych lub patologicznych komórek. Zmiany poziomu ATP mogą odzwierciedlać defekty w funkcjonowaniu komórek, zwłaszcza w produkcji energii mitochondrialnej. Zwykle pod wpływem apoptozy, martwicy lub w stanie toksycznym, poziomy ATP w komórkach zmniejszyły się 10. Zestaw testowy MMP z JC-1 to zestaw, który wykorzystuje JC-1 jako sondę fluorescencyjną do szybkiego i czułego wykrywania komórek, tkanek lub oczyszczonych MMP. Może być stosowany do wczesnego wykrywania apoptozy. Barwnik kationowy JC-1 jest sondą fluorescencyjną służącą do wykrywania MMP, który może być analizowany w cytometrii przepływowej wskazywanej przez zmiany stosunku fluorescencji zielonej i czerwonej. Gdy MMP jest wysoki, JC-1 jest agregowany w macierzy mitochondriów, tworząc polimer (agregaty J), który wytwarza czerwoną fluorescencję. Gdy MMP jest niskie, JC-1 nie może się akumulować i tworzy monomer, który wytwarza zieloną fluorescencję11. Tak więc stosunek czerwonej i zielonej fluorescencji może odzwierciedlać poziom MMP. OCR komórek jest kluczowym wskaźnikiem prawidłowego funkcjonowania komórek12. Jest uważany za parametr do badania funkcji mitochondriów. Zestaw do testów wysiłkowych mito komórek zapewnia stabilną metodę analizy kluczowych parametrów funkcji mitochondriów. Zestaw zapewnia odczynniki do kontroli jakości i predykcji, a także standardową metodę wykonywania testu wysiłkowego mitochondriów komórkowych. Może być stosowany do wykrywania wszystkich typów komórek, w tym komórek pierwotnych, linii komórkowych, komórek zawieszonych, a także wysepek, nicieni, drożdży i izolowanych mitochondriów.
Pomiar OCR może dostarczyć cennych informacji na temat stanu fizjologicznego lub zmian w komórkach. Określono go za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego w celu wykrycia linii podstawowej oddychania, wycieku protonów, maksymalnego oddychania, obrotu ATP i pojemności rezerwowej. Krótko mówiąc, po podstawowych pomiarach OCR, OCR wykryto po sekwencyjnym dodaniu do oligomycyny (ATP Coupler), FCCP (mitochondrialnego rozprzęgacza fosforylacji oksydacyjnej) i antymycyny A / rotenonu (inhibitora zużycia tlenu) na studzienkę.
Aby ułatwić opracowanie bardziej szczegółowego protokołu wykrywania funkcji mitochondriów w hepatocytach in vitro, prezentujemy tutaj eksperymenty TEM, mikroskopii konfokalnej, luminometru, cytometrii przepływowej i analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego z przyszłym zastosowaniem w badaniu niekorzystnych skutków związanych z uszkodzeniem mitochondriów.

<table><tbody><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy&nbsp;</td><td>FEI</td><td>Tecnai G2 Spirit Bio TWIN</td><td>Obrazowanie o wysokim kontraście, wysoka rozdzielczość, Obserwacja i obrazowanie przy niskich dawkach, Obserwacja w niskiej temperaturze, Znakomita wydajność analityczna, Automatyzacja dla wygody i wydajności</td></tr><tr><td>Mito-Tracker Green</td><td>Beyotime</td><td>C1048</td><td>Mito-Tracker Green to mitochondrialna zielona sonda fluorescencyjna, która może być używana do barwienia fluorescencyjnego specyficznego dla mitochondriów żywych komórek.</td></tr><tr><td>Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td>700B</td><td>Konstrukcja jest kompaktowa, stabilna, ścieżka światła jest najkrótsza, wysoka precyzja światła, kreatywna technologia i wyrafinowana technologia skanowania razem, aby uzyskać doskonały trójwymiarowy obraz próbki.</td></tr><tr><td>Ulepszony zestaw do oznaczania ATP</td><td>Beyotime</td><td>S0027</td><td>Ulepszony zestaw do oznaczania ATP może być używany do wykrywania poziomów ATP (adenozyno-5'-trifosforanu) w popularnych roztworach, komórkach lub tkankach. Komórki i próbki tkanek można podzielić, aby zakończyć przygotowanie próbki, czułość wykrywania do 0,1 nmol / l, chemiluminescencję można utrzymać przez 30 minut.</td></tr><tr><td>Luminometr</td><td>Berthold</td><td>Centro LB 960</td><td>Luminometr jest detektorem chemiluminescencji, sama próbka testowa może być lekka, nie musi być stymulowana. Luminometr to przyrząd, który wykrywa chemiluminescencję.</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek BCA</td><td>Beyotime</td><td>P0012</td><td>Zestaw do oznaczania białek BCA jest jedną z najczęściej stosowanych metod wykrywania stężeń białek.</td></tr><tr><td>Czytnik wielomodowy</td><td>TECAN</td><td>InfiniteM200</td><td>Czytnik wielomodowy może być używany do wykrywania zgody białek.</td></tr></tbody></table>

eksperymentalny protokół wykrywania funkcji mitochondriów w hepatocytach narażonych na pestycydy chloroorganiczne

Experimental Protocol for Detecting Mitochondrial Function in Hepatocytes Exposed to Organochlorine Pesticides

Ten artykuł przedstawia szczegółowe metody wykrywania funkcji mitochondriów wątroby dla lepszego zrozumienia przyczyny zaburzeń metabolicznych spowodowanych przez środowiskowe pestycydy chloroorganiczne (OCP) w hepatocytach. Komórki HepG2 poddano działaniu β-heksachlorocykloheksanu (β-HCH) przez 24 godziny przy równoważnej dawce ekspozycji wewnętrznej w populacji ogólnej. Ultrastrukturę hepatocytów zbadano za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) w celu wykazania uszkodzeń mitochondriów. Funkcję mitochondriów oceniano następnie na podstawie intensywności fluorescencji mitochondriów, poziomu adenozyno-5'-trifosforanu (ATP), wskaźnika zużycia tlenu (OCR) i potencjału błony mitochondrialnej (MMP) w komórkach HepG2 inkubowanych z β-HCH. Intensywność fluorescencji mitochondriów po wybarwieniu mitochondrialną zieloną sondą fluorescencyjną obserwowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Do określenia poziomów ATP wykorzystano reakcję lucyferyna-lucyferazy. MMP wykryto za pomocą barwnika kationowego JC-1 i przeanalizowano w cytometrii przepływowej. OCR mierzono za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. Podsumowując, protokoły te wykorzystano do wykrywania funkcji mitochondriów w hepatocytach w celu zbadania uszkodzeń mitochondriów.

Grzebienie mitochondriów w komórkach HepG2 eksponowanych na β-HCH były wyraźnie uszkodzone. Rozproszone mitochondria były lekko do wyraźnie powiększone, miały nieregularny kształt, a grzebienie mitochondrialne zanikły, co prowadziło do względnie nieprawidłowej architektury mitochondriów (Rysunek 1).
Średnia intensywność zielonej fluorescencji mitochondrialnej, reprezentująca mitochondria, spadła w k...

Zrozumienie wpływu środowiskowych pestycydów chloroorganicznych (OCP) na funkcję mitochondriów w hepatocytach jest ważne dla zbadania mechanizmu OCP powodującego zaburzenia metaboliczne. W pracy przedstawiono szczegółowe metody wykrywania funkcji mitochondriów wątroby.

Eksperymentalny protokół wykrywania funkcji mitochondriów w hepatocytach narażonych na pestycydy chloroorganiczne

This paper presents detailed methods on detecting hepatic mitochondrial function for a better understanding the cause of metabolic disorders caused by ...

Jest to bałagan, który odpowiada na kluczowe pytanie, które masz również w funkcji pola, takiego jak poziom ATP i wskaźniki zużycia tlenu. Ta technika jest nowa, czy stara o jedną stronę, ponieważ jest łatwa do wykonania i jest duża do specjalnej oceny funkcji mitochondriów komórkowych. Aby rozpocząć ten eksperyment, zasiej 20 000 komórek HepG2 na szalce Petriego ze szklanym dnem.Dodaj beta-heksachlorcykloheksan lub B-HCH w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach CO2 przez 24 godziny. Przygotuj jeden milimolowy roztwór mitochondrialnej zielonej sondy fluorescencyjnej, dodając bezwodny DMSO do pożywki do hodowli komórek DMEM. Następnie dodaj jeden mililitr tego roztworu na każdą szalkę do komórek na szklanych płytkach Petriego.I inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 45 minut. Po inkubacji usuń mitochondrialny roztwór zielonej sondy fluorescencyjnej z komórek. Dodaj jeden mililitr na danie świeżo przygotowanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza pożywki do hodowli komórkowych DMEM.Aby wykryć zieloną fluorescencję w mitochondriach, obserwuj komórki pod mikroskopem konfokalnym. Aby ocenić poziomy komórkowego ATP, wysiewaj do 20 000 komórek HepG2 w

experimental-protocol-for-detecting-mitochondrial-function

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Porównanie potencjału błony mitochondrialnej między próbkami dostarcza cennych informacji o stanie komórek. Opisano szczegółowe etapy izolacji mitochondriów i oceny odpowiedzi na inhibitory i rozprzęgacze za pomocą fluorescencji. Metoda i użyteczność tego protokołu są zilustrowane przez zastosowanie hodowli komórkowej i zwierzęcego modelu stresu komórkowego.

Izolacja i analiza funkcjonalna mitochondriów z hodowanych komórek i tkanek myszy

Lipogeneza de novo i utlenianie β-kwasów tłuszczowych stanowią kluczowe szlaki metaboliczne w hepatocytach, szlaki, które są zaburzone w wielu zaburzeniach metabolicznych, w tym w stłuszczeniu wątroby. Tutaj pokazujemy izolację pierwotnych hepatocytów myszy i opisujemy ilościowe oznaczanie utleniania i lipogenezy β-kwasów tłuszczowych.

Oznaczanie utleniania i lipogenezy kwasów tłuszczowych w pierwotnych hepatocytach myszy

Protokół jest opisany do wykrywania in vivo efektów inhibitorów mitochondrialnych w organizmie modelowym Caenorhabditis elegans oraz do identyfikacji potencjalnych związków wzmacniających. Protokół ten może być używany do badań przesiewowych bibliotek leków pod kątem związków modulujących funkcję mitochondriów.

Przesiewowy test in vivo dla modulatorów mitochondrialnych przy użyciu transgenicznych bioluminescencyjnych Caenorhabditis elegans

Tutaj dzielimy się metodami pomiaru zużycia tlenu w mitochondriach, definiującym pojęciem energetyki odżywczej oraz wyciekiem protonów, główną przyczyną nieefektywności w mitochondrialnym wytwarzaniu ATP. Wyniki te mogą odpowiadać za 30% energii utraconej podczas wykorzystania składników odżywczych, aby pomóc w ocenie funkcji mitochondriów.

Pomiar zużycia tlenu przez mitochondria wątroby i kinetyki wycieku protonów w celu oszacowania oddychania mitochondrialnego u bydła mlecznego rasy holsztyńskiej

Wystawiliśmy system mikrofizjologiczny (MPS) z organoidami jelitowymi i wątrobowymi na działanie paracetamolu (APAP). W artykule opisano metody produkcji organoidów oraz oceny właściwości farmakokinetycznych i toksykologicznych APAP w MPS. Opisano w nim również analizy funkcjonalności tkanek niezbędne do walidacji wyników.

Układ mikrofizjologiczny jelita/wątroby do oceny farmakokinetyki i toksykologicznej leku

Opracowaliśmy praktyczny protokół i analityczne podejście do oceny mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej i zdolności przenoszenia elektronów w świeżych homogenatach guza. Protokół ten można łatwo dostosować do badania różnych funkcji mitochondriów, które przyczyniają się do inicjacji, progresji i odpowiedzi na leczenie.

Analityczne oznaczanie funkcji mitochondrialnej wyciętych homogenatów guzów litych

W tej pracy opisujemy zmodyfikowany protokół badania strumienia mitochondrialnego substratu oddechowego za pomocą rekombinowanej perfringolizyny O w połączeniu z respirometrią opartą na mikropłytkach. Dzięki temu protokołowi pokazujemy, jak metformina wpływa na oddychanie mitochondrialne dwóch różnych linii komórek nowotworowych.

Pomiar strumienia substratu mitochondrialnego w rekombinowanych komórkach perfringolizyny O-permeabilizowanej

Tutaj prezentujemy kompilację testów do bezpośredniego pomiaru funkcji mitochondriów w komórkach ssaków, niezależnie od ich zdolności do zużywania tlenu cząsteczkowego.

Testy niezależne od tlenu do pomiaru funkcji mitochondriów u ssaków

Protokół opisuje nową metodę oceny całkowitej cytotoksyczności metabolitów triazolowych pestycydów w roślinach.

Ocena cytotoksyczności metabolitów typowych pestycydów triazolowych w roślinach

To badanie wprowadza metodologię badania wpływu ksenobiotyków na funkcję mitochondriów za pomocą testów respirometrycznych i enzymatycznych. Bada modulację łańcucha transportu elektronów u różnych gatunków, dostarczając informacji na temat ukierunkowanego opracowywania biopestycydów przeciwko chorobom przenoszonym przez owady.

Odkrywanie transportu ksenobiotyków i ich wpływu na izolowane mitochondria: wnioski z testów respirometrycznych i enzymatycznych

Odkryj metodę oceny funkcji mitochondriów w hepatocytach HepG2 narażonych na pestycydy chloroorganiczne. Protokół obejmuje pomiar ATP, zużycia tlenu i potencjału błonowego.

Eksperymentalny protokół wykrywania funkcji mitochondriów w hepatocytach narażonych na pestycydy chloroorganiczne

Przeglądaj więcej filmów