Eksperymentalny protokół wykrywania funkcji mitochondriów w hepatocytach narażonych na pestycydy chloroorganiczne

Jest to bałagan, który odpowiada na kluczowe pytanie, które masz również w funkcji pola, takiego jak poziom ATP i wskaźniki zużycia tlenu. Ta technika jest nowa, czy stara o jedną stronę, ponieważ jest łatwa do wykonania i jest duża do specjalnej oceny funkcji mitochondriów komórkowych. Aby rozpocząć ten eksperyment, zasiej 20 000 komórek HepG2 na szalce Petriego ze szklanym dnem.

Dodaj beta-heksachlorcykloheksan lub B-HCH w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach CO2 przez 24 godziny. Przygotuj jeden milimolowy roztwór mitochondrialnej zielonej sondy fluorescencyjnej, dodając bezwodny DMSO do pożywki do hodowli komórek DMEM. Następnie dodaj jeden mililitr tego roztworu na każdą szalkę do komórek na szklanych płytkach Petriego.

I inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 45 minut. Po inkubacji usuń mitochondrialny roztwór zielonej sondy fluorescencyjnej z komórek. Dodaj jeden mililitr na danie świeżo przygotowanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza pożywki do hodowli komórkowych DMEM.

Aby wykryć zieloną fluorescencję w mitochondriach, obserwuj komórki pod mikroskopem konfokalnym. Aby ocenić poziomy komórkowego ATP, wysiewaj do 20 000 komórek HepG2 w sześciu płytkach dołkowych. Dodaj beta-HCH i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny.

Dodaj 200 mikrolitrów buforu do lizy do komórek w każdym dołku. Wirować w temperaturze 12 000 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przystąpić do zbierania supernatantu zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dodaj 100 mikrolitrów buforu do wykrywania ATP na płytkę.

Dodać 100 mikrolitrów zebranego supernatantu komórkowego do 96-dołkowej płytki w temperaturze pokojowej i przystąpić do wykrywania komórkowego ATP za pomocą luminometru, jak opisano w protokole tekstowym. W celu oceny potencjału błony mitochondrialnej hoduj komórki HepG2 w sześciu płytkach dołkowych z dodatkiem beta-HCH, jak opisano wcześniej. Zbierz komórki, trawiąc je 0,5 mililitra 0,25% EDTA przez jedną minutę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Dodaj jeden mililitr DMEM, aby zatrzymać trawienie i przenieś strawione komórki do 1,5 mililitrowych probówek. Odwirować probówki o sile 1000 razy G przez trzy minuty, a następnie wyrzucić supernatant. Rozcieńczyć osad komórkowy 0,5 mililitra pożywki do hodowli komórkowej i 0,5 mililitra barwnika potencjału błony mitochondrialnej JC1.

I inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie odwiruj probówki o temperaturze 600 razy G przez trzy minuty w czterech stopniach Celsjusza, a następnie umyj osad komórkowy zgodnie z protokołem tekstowym. Po odwirowaniu przemytego osadu usunąć supernatant.

I ponownie zawiesić granulat w 0,5 mililitra buforu barwiącego JC1. Przeanalizuj wybarwione komórki JC1 za pomocą cytometrii przepływowej, aby wykryć zieloną i czerwoną fluorescencję. Po wykryciu monomeru JC1 ustaw światło wzbudzenia na 490 nanometrów, a światło emisyjne na 530 nanometrów.

Po wykryciu polimeru JC1 ustaw światło wzbudzenia na 525 nanometrów, a światło emisyjne na 590 nanometrów. Aby przeanalizować wskaźnik zużycia tlenu, umieść komórki HepG2 w 96-dołkowej płytce do hodowli komórkowej o gęstości 4 500 komórek na 100 mikrolitrów na studzienkę. Po 24 godzinach inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza upewnij się, że komórki w każdej studzience są pokryte podłożem.

Przed uruchomieniem oprogramowania OCR załaduj mikropłytkę z wkładem, a płytkę do hodowli komórkowej do analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego, jak opisano w protokole tekstowym. Otwórz oprogramowanie OCR i z rozwijanego menu aplikacji wybierz zestaw do testów obciążeniowych cell mito i kliknij przycisk uruchamiania aplikacji. Następnie kliknij przycisk uruchom test warunków skrajnych.

Gdy pojawi się ekran testu obciążenia komórkowego, wprowadź liczbę komórek wysiewających na studzienkę w polu numeru wysiewu komórek oraz średni OCR w polu średnia w polu OCR komórki podstawowej. Wprowadź końcowe stężenie robocze dla każdego odczynnika, a następnie wstrzyknij odczynniki. Kliknij następny przycisk.

Gdy pojawi się ekran informacji o grupie, przypisz grupę do nieprzypisanych studni, wybierając kolor i nadając nazwę. Następnie kliknij na odpowiednie dołki. Kliknij następny przycisk i na wyświetlonym ekranie układu wtrysku testu warunków skrajnych kliknij Start, aby uruchomić test warunków skrajnych na analizatorze.

Po zakończeniu przebiegu postępuj zgodnie z instrukcjami w oprogramowaniu, a następnie wyjmij i wyrzuć wkład i płytkę ogniwa. Średnia intensywność barwienia mitochondrialną zieloną fluorescencyjną zmniejszyła się w komórkach HepG2 wystawionych na działanie beta-HCH. Pokazuje to, że następuje spadek liczby mitochondriów i wzrost uszkodzonych mitochondriów zgodnie ze wzrostem stężenia pestycydów.

Co więcej, poziomy ATP w komórkach HepG2 zmniejszały się wraz ze wzrostem stężeń ekspozycji na beta-HCH, co wskazuje na zmniejszoną funkcję mitochondriów w tych komórkach. Po barwieniu JC1 pod kątem potencjału błony mitochondrialnej lub MMP, cytometr przepływowy wykazał wysoką czerwono-zieloną fluorescencję JC1 w nienaruszonych komórkach HepG2. Wynikało to z obecności czerwonych agregatów fluorescencyjnych JC1, które są oznaką wysokiego MMP.

W komórkach traktowanych beta-HCH czerwono-zielona fluorescencja JC1 zmniejszyła się z powodu obecności zielonych fluorescencyjnych monomerów JC1, co jest oznaką niskiego MMP. Wreszcie, tempo zużycia tlenu również zmniejszyło się wraz ze wzrostem stężeń ekspozycji na beta-HCH, co dodatkowo pokazuje, że ten pestycyd upośledza prawidłowe funkcje mitochondriów. No cóż, spróbuj wykonać tę procedurę, ważne jest jednak, aby pamiętać, aby zobaczyć, że komórki są odpowiednie, aby to przetestować.

Po jego opracowaniu, to zdecydowanie toruje drogę dla badań w dziedzinie podstawowych funkcji do zbadania odpowiednich organizmów w roli medycznej z nią związanej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykryć ilość lub jakość, pojemność, teraz członka lub potencjał pod funkcją arkusza spoutage.