Name: Analityczne oznaczanie funkcji mitochondrialnej wyciętych homogenatów guzów litych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Poznaj metodę analizy funkcji mitochondrialnych w homogenatach guzów litych. Protokół umożliwia szybkie oznaczanie fosforylacji oksydacyjnej i przenoszenia elektronów w świeżo pobranej tkance nowotworowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy personelowi Pennington Biomedical Research Center Comparative Biology za opiekę nad zwierzętami. Badania te były częściowo wspierane przez granty Narodowego Instytutu Zdrowia U54GM104940 (JPK) i KL2TR003097 (LGD). Wszystkie eksperymenty i procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt w Pennington Biomedical Research Center.

<ol><li>DeBerardinis, R. J., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+cancer+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of cancer metabolism.</a> Science Advances. 2 (5), 1600200(2016).</li>
<li>Bajzikova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+dihydroorotate+dehydrogenase-driven+pyrimidine+biosynthesis+restores+tumor+growth+of+respiration-deficient+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Reactivation of dihydroorotate dehydrogenase-driven pyrimidine biosynthesis restores tumor growth of respiration-deficient cancer cells.</a> Cell Metabolism. 29 (2), 399-416 (2019).</li>
<li>Martínez-Reyes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ubiquinol+oxidation+is+necessary+for+tumour+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ubiquinol oxidation is necessary for tumour growth.</a> Nature. 585 (7824), 288-292 (2020).</li>
<li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PloS One. 6 (3), 18317(2011).</li>
<li>Saks, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSaks%2C+VA+%22Bioenergetics+of+the+Cell%3A+Quantitative+Aspects%22">Bioenergetics of the Cell: Quantitative Aspects</a>. Saks, V. A., et al. , Springer US. 81-100 (1998).</li>
<li>Kaambre, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+control+analysis+of+cellular+respiration+in+situ+in+intraoperational+samples+of+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioenergetics+and+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Metabolic control analysis of cellular respiration in situ in intraoperational samples of human breast cancer.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (5), 539-558 (2012).</li>
<li>Koit, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiration+in+human+colorectal+and+breast+cancer+clinical+material+is+regulated+differently%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiration in human colorectal and breast cancer clinical material is regulated differently.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 1372640(2017).</li>
<li>Holland, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+mitochondrial+respiration+in+the+human+placenta+over+gestation%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Changes in mitochondrial respiration in the human placenta over gestation.</a> Placenta. 57, 102-112 (2017).</li>
<li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+respirometry%3A+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).</li>
<li>Makrecka-Kuka, M., Krumschnabel, G., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+respirometry+for+simultaneous+measurement+of+oxygen+and+hydrogen+peroxide+fluxes+in+permeabilized+cells%2C+tissue+homogenate+and+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">High-resolution respirometry for simultaneous measurement of oxygen and hydrogen peroxide fluxes in permeabilized cells, tissue homogenate and isolated mitochondria.</a> Biomolecules. 5 (3), 1319-1338 (2015).</li>
<li>Kondrashova, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+native+properties+of+mitochondria+in+rat+liver+homogenate%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Preservation of native properties of mitochondria in rat liver homogenate.</a> Mitochondrion. 1 (3), 249-267 (2001).</li>
<li>Pecinová, A., Drahota, Z., Nůsková, H., Pecina, P., Houštěk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+basic+mitochondrial+functions+using+rat+tissue+homogenates%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Evaluation of basic mitochondrial functions using rat tissue homogenates.</a> Mitochondrion. 11 (5), 722-728 (2011).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292 (1), 125-136 (2007).</li>
<li>Hlozková, K., Starková, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+metabolic+profile+of+primary+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (141), e58426(2018).</li>
<li>Zhang, J., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhang%2C+J+%22Cancer+Metabolism%3A+Methods+and+Protocols%22">Cancer Metabolism: Methods and Protocols</a>. Haznadar, M. , Springer. New York. 353-363 (2019).</li>
<li>Wigner, P., Zielinski, K., Labieniec-Watala, M., Marczak, A., Szwed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxorubicin-transferrin+conjugate+alters+mitochondrial+homeostasis+and+energy+metabolism+in+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Doxorubicin-transferrin conjugate alters mitochondrial homeostasis and energy metabolism in human breast cancer cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 4544(2021).</li>
<li>Schöpf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+phosphorylation+and+mitochondrial+function+differ+between+human+prostate+tissue+and+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Oxidative phosphorylation and mitochondrial function differ between human prostate tissue and cultured cells.</a> The FEBS Journal. 283 (11), 2181-2196 (2016).</li>
<li>Ye, F., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+oxidative+phosphorylation+in+human+skin+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measuring oxidative phosphorylation in human skin fibroblasts.</a> Analytical Biochemistry. 437 (1), 52-58 (2013).</li>
<li>Le Naour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EO771%2C+the+first+luminal+B+mammary+cancer+cell+line+from+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">EO771, the first luminal B mammary cancer cell line from C57BL/6 mice.</a> Cancer Cell International. 20, 328(2020).</li>
<li>Gnaiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Bioenergetics+Communications%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial physiology.</a> Bioenergetics Communications. 1, 44(2020).</li>
<li>Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respirometric+oxidative+phosphorylation+assessment+in+saponin-permeabilized+cardiac+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Respirometric oxidative phosphorylation assessment in saponin-permeabilized cardiac fibers.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2431(2011).</li>
<li>Dranka, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+bioenergetic+function+in+response+to+oxidative+stress+by+metabolic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Assessing bioenergetic function in response to oxidative stress by metabolic profiling.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51 (9), 1621-1635 (2011).</li>
<li>Munday, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+superoxide+radical%2C+hydrogen+peroxide+and+hydroxyl+radical+during+the+autoxidation+of+N%2CN%2CN%27%2CN%27-tetramethyl-p-phenylenediamine%5BTitle%5D)+AND+%22Chemico-Biological+Interactions%22%5BJournal%5D)">Generation of superoxide radical, hydrogen peroxide and hydroxyl radical during the autoxidation of N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine.</a> Chemico-Biological Interactions. 65 (2), 133-143 (1988).</li>
<li>Moser, M. D., Matsuzaki, S., Humphries, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+succinate-linked+respiration+and+complex+II+activity+by+hydrogen+peroxide%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Inhibition of succinate-linked respiration and complex II activity by hydrogen peroxide.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 488 (1), 69-75 (2009).</li>
<li>Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V., Sharov, V. G., Kapelko, V. I., Saks, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+parameters+in+cardiac+tissue%3A+a+novel+method+of+assessment+by+using+saponin-skinned+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment by using saponin-skinned fibers.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 892 (2), 191-196 (1987).</li>
<li>Gnaiger, E., et al. Mitochondria in the Cold. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGnaiger%2C+E+%22Life+in+the+Cold%22">Life in the Cold</a>. Heldmaier, G., Klingenspor, M. , Springer. Berlin, Heidelberg. 431-442 (2000).</li>
<li>Doerrier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+fluorespirometry+and+OXPHOS+protocols+for+human+cells%2C+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+muscle%2C+and+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-resolution fluorespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria.</a> Methods in Molecular Biology. 1782, 31-70 (2018).</li>
<li>Rohlenova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+disruption+of+respiratory+supercomplexes+as+a+new+strategy+to+suppress+Her2%28high%29+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Selective disruption of respiratory supercomplexes as a new strategy to suppress Her2(high) breast cancer.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 26 (2), 84-103 (2017).</li>
<li>Gnaiger, E. Mitochondrial pathways and respiratory control. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGnaiger%2C+E+%22Bioenergetics+Communications.+5th+ed%22">Bioenergetics Communications. 5th ed</a>. , (2020).</li>
<li>Barksdale, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+viability+in+mouse+and+human+postmortem+brain%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial viability in mouse and human postmortem brain.</a> FASEB Journal. 24 (9), 3590-3599 (2010).</li>
<li>Underwood, E., Redell, J. B., Zhao, J., Moore, A. N., Dash, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+assessing+tissue+respiration+in+anatomically+defined+brain+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reportys%22%5BJournal%5D)">A method for assessing tissue respiration in anatomically defined brain regions.</a> Scientific Reportys. 10 (1), 13179(2020).</li>
<li>Jorgensen, L. B., Overgaard, J., Hunter-Manseau, F., Pichaud, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatic+changes+in+mitochondrial+substrate+use+at+critically+high+temperatures%3A+a+comparative+study+using+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Dramatic changes in mitochondrial substrate use at critically high temperatures: a comparative study using Drosophila.</a> Journal of Experimental Biology. 224, Pt 6 (2021).</li>
<li>Salin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurement+of+mitochondrial+respiration+and+ATP+production+in+tissue+homogenates+and+calculation+of+effective+P%2FO+ratios%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurement of mitochondrial respiration and ATP production in tissue homogenates and calculation of effective P/O ratios.</a> Physiological Reports. 4 (20), 13007(2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konfliktu interesów związanego z tą pracą.

Podejścia do oceny oddychania mitochondrialnego w nowotworach były w dużej mierze ograniczone do modeli in vitro 13,14,15,16. Osiągnięto pewne sukcesy w pomiarze oddychania mitochondrialnego w nowotworach za pomocą przepuszczalności chemicznej 6,7,17, ale nie ma jednolitego, złotego standardu podejścia, które można by uniwersalnie zastosować i porównać między typami nowotworów. Ponadto brak spójnej analizy danych i raportowania ma ograniczoną możliwość uogólnienia i odtwarzalność danych. Opisana tutaj metoda zapewnia proste, stosunkowo szybkie podejście do pomiaru oddychania mitochondrialnego18 w preparatach mitochondrialnych ze świeżo wyciętych próbek guzów litych. Guzy wyrosły z ortotopowo wszczepionych mysich komórek raka sutka Luminal B, ERα-ujemnych EO77119.
Staranność i ostrożność w obchodzeniu się z tkankami znacznie poprawi dokładność i normalizację wskaźników zużycia tlenu. Tkanka i mitochondria mogą zostać łatwo uszkodzone, jeśli próbka nie jest utrzymywana w niskiej temperaturze, nie jest stale zanurzana w pożywkach konserwujących lub jest nadmiernie traktowana, co skutkuje nieoptymalnymi wskaźnikami rutynowymi i OXPHOS. Ponadto kluczowe znaczenie ma dokładna mokra masa homogenizowanej tkanki, ponieważ jest to podstawowa metoda normalizacji. Można rozważyć inne metody normalizacji, takie jak białko całkowite lub markery specyficzne dla mitochondriów, takie jak aktywność syntazy cytrynianu20. Ponadto konieczne będzie zajęcie się kwestią niejednorodności tkanek, a decyzje dotyczące regionów nowotworu, które należy uwzględnić w eksperymentach, będą podejmowane a priori. Martwicza, zwłóknieniowa i łączna tkanka łączna może nie homogenizować i/lub dobrze oddychać i należy ich unikać, chyba że celowo bada się te obszary guza. Warto zauważyć, że guz może być bardzo lepki w zależności od rodzaju i obszaru wycięcia, co sprawia, że dokładne ważenie i przenoszenie jest trudniejsze. Liczba pociągnięć stosowanych do homogenizacji powinna być zoptymalizowana, aby zapewnić pełne przygotowanie mitochondriów, jednocześnie łagodząc uszkodzenia zewnętrznych błon mitochondrialnych.
W celu poprawy dokładności i odtwarzalności zalecamy przeprowadzanie eksperymentów optymalizacyjnych dla liczby ruchów preparatu homogenatu, stężenia tkanki oraz stężeń substratu, rozprzęgacza i inhibitora. W badaniach można porównać różną liczbę udarów i sposób, w jaki odpowiadają one odpowiedzi na dodanie cytochromu c w badaniu, a także maksymalną mitochondrialną wydolność oddechową 21. Chociaż istnieje ogólna zgoda co do tego, że mniejsza odpowiedź cytochromu c jest lepsza, ponieważ wzrost zużycia tlenu po dodaniu cytochromu c może wskazywać na uszkodzenie zewnętrznej błony mitochondrialnej, nie ma złotego standardu co do tego, jaki jest ten próg dla każdej tkanki i powinien być badany eksperymentalnie, aby upewnić się, że tkanka nie jest przepracowana lub nieprzygotowana. W tej tkance nowotworowej stwierdzono, że odpowiedź cytochromu c poniżej ~30% nie upośledzała funkcji oddechowych. Stosowanie cytochromu c staje się kluczowe dla dokładnej oceny ilościowej wydolności oddechowej, jeśli test jest pozytywny. W takim przypadku dodatek uzupełnia endogenny cytochrom c, którego wyczerpanie spowoduje niedoszacowanie częstości oddechów.
Eksperymenty z miareczkowaniem stężenia w tkankach mogą być przeprowadzane w zakresie możliwych stężeń i, w idealnym przypadku, powinny być przeprowadzane przy użyciu SUITs, które będą badane podczas badania. Pojemność oddechowa będzie się różnić w zależności od rodzaju i składu guza. Tak więc guzy gęste z mitochondriami lub dużą pojemnością oddechową będą wymagały niższych stężeń (0,5-5 mg / ml). Guzy z niewielką liczbą mitochondriów lub niską wydolnością oddechową będą wymagały wyższych stężeń (7-12 mg/ml). Dodatkowo, SUITy, które są długie lub mają mocno zużyte podłoża, mogą potrzebować mniej tkanki, aby zapobiec retlenkacji komory lub ograniczeniu ADP. Niektóre tkanki będą miały liniową zależność w zużyciu tlenu, podczas gdy inne będą wykazywać lepszą wrażliwość i maksymalne utlenianie w określonych zakresach stężeń. Wybrane stężenie w tkankach powinno być zoptymalizowane, aby zmaksymalizować strumień tlenu przy jednoczesnym ograniczeniu liczby zdarzeń reoksygenacji. Ponadto często lepiej jest przecenić potrzebę lub dążyć do wyższej granicy zakresu stężeń. Inhibitory, które są niezbędne do ilościowego określania strumieni oddechowych, są bardziej precyzyjne, gdy są stosowane w większych pulach mitochondriów.
Kolejną istotną kwestią jest stężenie leków, które są stosowane podczas protokołów. Zmiany stężenia homogenatu mogą wpływać na stężenia substratów, rozprzęgaczy i inhibitorów wymaganych do uzyskania maksymalnej odpowiedzi. W związku z tym, po wybraniu optymalnego zakresu stężeń, należy przeprowadzić eksperyment testujący dawki wymagane dla protokołu SUIT. Można dodać dodatkowy ADP, aby zapewnić, że stężenia adenylanu nie ograniczają się do strumieni oddechowych. Rozłączniki chemiczne, takie jak FCCP lub CCCP, hamują oddychanie przy wyższych stężeniach22. W związku z tym konieczne jest miareczkowanie w małych ilościach, aby ujawnić maksymalną osiągniętą szybkość. Inhibitory, takie jak rotenon i antymycyna A, najlepiej stosować po nasyceniu w pierwszym wstrzyknięciu. Podczas gdy optymalne stężenia zostały określone we wstępnych eksperymentach, zaobserwowaliśmy również związane z leczeniem różnice w odpowiedzi na inhibitory, a zatem często dodajemy jedno dodatkowe wstrzyknięcie inhibitorów, aby wykazać maksymalne hamowanie, ponieważ wynikowe wskaźniki służą jako podstawa do kwantyfikacji. Chemiczne hamowanie askorbinianu/TPMD jest niezbędne do dokładnej redukcji analitycznej, ponieważ TMPD ulega autooksydacji23. Kontrolowaliśmy autooksydację askorbinianu / TMPD / cytochromu c poprzez dodanie azydku sodu, uznanego inhibitora CIV. W przypadku badań Km dodanie rotenonu w obecności samego bursztynianu zapobiega akumulacji szczawiooctanu, który może hamować aktywność dehydrogenazy bursztynianowej w niskich stężeniach24. Objętość i stężenie ADP są w dużym stopniu zależne od wrażliwości mitochondriów na dominującą kombinację substratów. Preparaty mitochondrialne, które są bardzo wrażliwe na ADP, będą wymagały niższych stężeń początkowych. Dodatkowo, zatwierdzone chemikalia i właściwe przygotowanie leku z dbałością o pH, wrażliwość na światło, jeśli ma to zastosowanie, i temperaturę przechowywania są niezbędne do udanych eksperymentów.
Konfiguracja przyrządów i rutynowa pielęgnacja mają kluczowe znaczenie dla powodzenia tych eksperymentów. Odpowiednie i właściwe czyszczenie komór ma zasadnicze znaczenie dla powtarzalności i zapobiegania zanieczyszczeniom biologicznym, białkowym, inhibitorom lub rozprzęgaczom. Elektrody typu Clark i systemy O2k wykorzystują szklane komory reakcyjne, co stanowi znaczną przewagę kosztową w porównaniu z systemami opartymi na płytkach, które opierają się na materiałach eksploatacyjnych. Szklane komory muszą być jednak energicznie czyszczone i mogą być źródłem zanieczyszczenia inhibitorami w kolejnych badaniach. Inkubacja z próbkami bogatymi w mitochondria podczas procesu mycia (na przykład izolowane mitochondria serca lub wątroby) może zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia eksperymentalnego i jest zalecana jako uzupełnienie procedur rozcieńczania i mycia na bazie alkoholu. Jeśli prowadzone są kolejne badania, czyszczenie etanolem i mitochondriami minimalizuje możliwość zanieczyszczenia inhibitorami. Przed każdym eksperymentem zaleca się kalibrację czujnika tlenu w celu uzyskania dokładnych pomiarów oddychania w stosunku do panującego ciśnienia parcjalnego tlenu. Jeżeli wielokrotne kalibracje nie są możliwe, jedna kalibracja dziennie może być wystarczająca, jeśli stężenie tlenu pozostaje stabilne i stałe po procedurze prania.
Opisane powyżej procedury wykorzystują instrument Oroboros O2k do pomiaru zużycia tlenu w tkance nowotworowej w ciągu 4 godzin od wycięcia guza przy użyciu wcześniej zaprojektowanego i zoptymalizowanego roztworu konserwującego i pożywek oddechowych 25,26,27. Wiele parametrów w tym protokole może być modyfikowanych dla kolejnych aplikacji. Konfiguracja i kalibracja urządzenia, homogenizatory używane do przygotowania tkanek oraz optymalne stężenie tlenu w homogenacji i komorze mogą być dostosowane do stosowania w innych urządzeniach o potencjale monitorowania tlenu. Dla przykładu, komory były lekko przepełnione podczas dodawania homogenatu, a stąd kiedy komora jest całkowicie zamknięta, kapilara komory pozostaje pełna. Spowoduje to zużycie pewnej ilości tlenu w komorze, ale dzięki optymalizacji stężenia próbki możemy uwzględnić to zużycie przy określaniu, od jakiego poziomu tlenu zacząć. Alternatywnie, próbkę można pozostawić do zrównoważenia z tlenem w otoczeniu przed zamknięciem komory, ale często wydłuża to czas do rozpoczęcia eksperymentu i opóźnia dodawanie substratów. Chociaż homogenizatory stosowane w tym protokole są powszechnie dostępne, można zastosować inne komercyjne techniki homogenizacji, takie jak rozdrabniacz tkanek lub automatyczny homogenizator28.
Dodatkowo, procedury przygotowania tkanek i instrumentów mogą być wykorzystywane z wieloma różnymi SUIT do badania kontroli oddechu poprzez różnorodność stanów sprzężenia i kontroli szlaku29. Te protokoły SUIT zostały opracowane w celu pomiaru zdolności funkcjonalnej, a zatem udział potencjalnych substratów endogennych nie ma wpływu na pomiar pojemności. Analitycznie uwzględniamy niemitochondrialne zużycie tlenu i / lub resztkowe zużycie homogenatu poprzez odjęcie antymycyny A-rotenonu lub wskaźników niewrażliwych na azydek sodu, w zależności od potrzeb. Mitochondria mogą pozostać żywotne w BIOPS lub podobnie skonstruowanych roztworach konserwujących przez dłuższy czas (>24 h), w zależności od rodzaju tkanki i jej nienaruszalności30,31. Badania można przeprowadzić z wyprzedzeniem w celu określenia czasowych limitów przechowywania, ponieważ OXPHOS niektórych substratów może mieć różne ograniczenia. Jest to niezbędne, jeśli eksperymentu nie można przeprowadzić w ciągu kilku godzin od wycięcia tkanki/biopsji. 37°C to optymalna i fizjologiczna temperatura do oceny funkcji oddechowych w większości układów ssaków. Jeżeli jednak temperatura testu wydaje się zakłócać ocenę32, można przeprowadzić badania porównawcze w szerokim zakresie temperatur (25–40 °C), aby zapewnić odpowiednią reakcję. Ograniczenia instrumentalne mogą ograniczać możliwość prowadzenia takich badań.
Głównymi ograniczeniami wyżej opisanej metody są: 1) możliwość uszkodzenia mitochondriów przez homogenizację mechaniczną, 2) obecność ATPaz lub innych subkomórkowych substancji biochemicznych w preparatach homogenacyjnych, które mogą zakłócać jednoczesne oznaczanie ATP lub innych zmiennych będących przedmiotem zainteresowania i mogą wymagać dodatkowych metod korekcji lub zastosowania inhibitorów33oraz 3) ocena wielu próbek i/lub wielu SUIT na próbkę jest czasochłonna, ponieważ jeden instrument może pomieścić dwa eksperymenty jednocześnie i wymaga czyszczenia i ustawiania pomiędzy kolejnymi eksperymentami. Eksperymenty optymalizacyjne i konsekwentne przygotowywanie próbek mogą zminimalizować znaczne uszkodzenia mitochondriów, które przyczyniłyby się do niespójnych danych.
Znaczenie tej metody w stosunku do istniejących/alternatywnych metod polega na zwiększeniu wykonalności w porównaniu z ilością materiału wyjściowego, wyzwaniem wyizolowania mitochondriów lub wyzwaniem technicznym w przepuszczalności tkanki. Przygotowanie homogenatów jest szybsze, tlen nie jest tak ograniczony i jest mniej podatny na zmienność między personelem w porównaniu z tkanką przepuszczalną. Co ważne, prawie wszystkie typy próbek nadają się do przygotowania homogenatu, co pozwala na analizę porównawczą między tkankami. Respirometria o wysokiej rozdzielczości jest złotym standardem pomiaru mitochondriów OXPHOS i ET. Zastosowanie tej metody w przedklinicznych i klinicznych badaniach nad rakiem może rozszerzyć obecne badania in vitro na badania ex vivo . Ponadto oferuje potencjalne zastosowania w warunkach klinicznych i diagnostycznych.

Wszystkie komórki są ściśle powiązane potrzebą produkcji i konsumpcji trifosforanu adenozyny (ATP), waluty energii molekularnej. Ponieważ mutacje komórkowe prowadzą do powstawania nowotworów, mitochondria zapewniają przetrwanie poprzez dywersyfikację produkcji energii, która często jest fenotypowo odróżnialna od tkanki nienowotworowej1,2,3. W związku z tym istnieje pilna potrzeba szybkiego i głębokiego profilowania funkcji mitochondrialnej układu oddechowego w celu ułatwienia klasyfikacji typu nowotworu, inicjacji nowotworu, progresji i odpowiedzi na leczenie.
Funkcje oddechowe wyciętych próbek tkanek nie mogą być oceniane w stanie nienaruszonym, ponieważ podstawowe substraty dla OXPHOS nie są przepuszczalne dla komórek. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, mitochondria można przygotować przez izolację, przenikanie chemiczne lub homogenizację mechaniczną. Izolacja mitochondrialna jest od dawna uważana za złoty standard oceny funkcji oddechowych. Wymaga jednak dużych ilości tkanki, jest czasochłonny i mało wydajny, co może powodować błąd selekcji dla niektórych frakcji mitochondriów4. Permeabilizacja polega na mechanicznym oddzieleniu i wystawieniu skrawków tkanek lub wiązek włókien na działanie łagodnego detergentu, który selektywnie degraduje błonę plazmatyczną5. Permeabilizacja jest często stosowana w tkankach prążkowanych, takich jak mięsień szkieletowy i mięsień sercowy, ponieważ poszczególne wiązki włókien mogą być rozdzielane. W porównaniu z izolacją, przepuszczalność daje więcej mitochondriów w ich naturalnym środowisku komórkowym i formie fizycznej5. Przepuszczalność została z powodzeniem zastosowana w innych tkankach, takich jak tumor6,7 i placenta8; Jednak odtwarzalność preparatów z włókien przepuszczalnych może być trudna ze względu na spójność preparacji i wymagania tlenowe w celu pokonania ograniczeń dyfuzji<klasa SUP="xref">9. Ponadto przepuszczalne włókna mogą być nieodpowiednie w niektórych typach nowotworów, które są gęsto komórkowe i silnie zwłókniałe. Homogenaty tkankowe są generowane w wyniku mechanicznego rozerwania błony plazmatycznej i są podobne do włókien przepuszczalnych pod względem wydajności i integralności mitochondriów10. Homogenaty tkankowe minimalizują również ograniczenia dyfuzji tlenu i mogą być łatwo stosowane w różnych typach tkanek poprzez optymalizację siły mechanicznej11,12.
Tutaj przedstawiamy prostą i szybką metodę ilościowego określania szybkości fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) i zdolności do przenoszenia elektronów (ET) w świeżo wyciętych homogenatach guzów litych. Protokół jest optymalnie zaprojektowany do oceny świeżych tkanek za pomocą respirometru o wysokiej rozdzielczości Oxygraph-2k (O2k), który wymaga wcześniejszej wiedzy na temat konfiguracji i kalibracji instrumentu, ale może być podobnie dostosowany za pomocą dowolnej elektrody typu Clark, analizatora Seahorse lub czytnika płytek. Protokół może być powtarzalnie stosowany u różnych gatunków i typów nowotworów, a także dostosowywany do oceny różnorodności mitochondrialnych szlaków ET.

<table><tbody><tr><td>Hydrat kwasu 2-(N-Morfolino)etanosulfonowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa adenozyno5&prime;-difosforanu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat soli disodowej adenozyno-5'-trifosforanu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Gibco</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>Antymycyna A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Askorbinian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej, frakcja V, szok cieplny, bez kwasów tłuszczowych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3117057001</td><td>Roche</td></tr><tr><td>BD 50 mL Luer-Lok Strzykawka Fisher</td><td>Scientific</td><td>13-689-8</td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp; Vacutainer Ogólnego zastosowania Igły strzykawkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-021-020</td><td></td></tr><tr><td>Węglan wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4830</td><td></td></tr><tr><td>Cyjanek karbonylu 4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Cytochrom c z serca konia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Datlab 7.4</td><td>Oroboros Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Amresco</td><td>N182</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>D-Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5 Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>Dumoxel, autoklawowalne</td></tr><tr><td>Dumont # 7 Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11271-30</td><td>Dumoxel, autoklawowalne</td></tr><tr><td>Suwmiarka cyfrowa 150 mm/6 cali</td><td>World Precision Instruments</td><td>501601</td><td></td></tr><tr><td>ogniwa EO771</td><td>CH3 BioSystems</td><td>SKU:&nbsp; 94APV1-fiolka-prem</td><td>Patogen testowany</td></tr><tr><td>glikol etylenowy-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N&prime;,N&prime; Kwas -tetraoctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Samica myszy C57BL/6J</td><td>&nbsp; Zapas Jackson Laboratory</td><td>#000664</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56750</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>L-(&minus;)-Kwas jabłkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>Kwas laktobionowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2398</td><td></td></tr><tr><td>Jabłczan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6413</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>Corning</td><td>354248</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&middot; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Mikrostrzykawki</td><td>Hamilton</td><td>87919, 80383, 80521, 80665, 80765, 80865, 87943</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetrametylo-p-fenylenodiamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7394</td><td></td></tr><tr><td>Oxygraph-2k</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10023-03</td><td></td></tr><tr><td>Oxygraph-2k FluoRespirometer</td><td>Oroboros Instrumenty</td><td>10003-01</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Sól disodowa fosfokreatyny hydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1767</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875034</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Bursztynian (disód)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W327700</td><td></td></tr><tr><td>Tauryna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna Whatman, klasa 5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1005-090</td><td></td></tr><tr><td>Młynek do tkanek Wheaton Tenbroeck, 7 ml</td><td>Duran Wheaton Kimble</td><td>357424</td><td></td></tr><tr><td>Mikronożyczki do mikro preparacji z prostą końcówką</td><td>Roboz</td><td>RS-5914SC</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel niebezpieczny nr 11</td><td>Igła do</td> precyzyjnego ślizgu McKesson <td>1029065</td><td></td></tr><tr><td>BD 27 G x 1/2</td><td>Becton, Dickinson i spółka</td><td></td><td></td>305109</tr><tr><td>Igła do precyzyjnego ślizgu BD 18 G x 1</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka BD 1 ml</td><td>Tacke Beckton, Dickinson and Company</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex Wielorazowa szalka Petriego, 60 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>316060</td><td></td></tr><tr><td>Gryzoń Dieta o bardzo wysokiej zawartości tłuszczu, &nbsp; 60% kcal z tłuszczu, 20% kcal z białka i 20% kcal z węglowodanów</td><td>Dieta badawcza</td><td>D12492</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko do zegarka Pyrex, 100 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S34819</td><td></td></tr></tbody></table>

analityczne oznaczanie funkcji mitochondrialnej wyciętych homogenatów guzów litych

Analytical Determination of Mitochondrial Function of Excised Solid Tumor Homogenates

Mitochondria są niezbędne do powstania i rozwoju raka poprzez produkcję energii, reaktywną regulację form tlenu i syntezę makromolekuł. Genetyczne i funkcjonalne adaptacje mitochondriów do środowiska guza napędzają potencjał proliferacyjny i przerzutowy. Pojawienie się sekwencjonowania DNA i RNA usunęło krytyczne bariery w ocenie genetycznych mediatorów nowotworzenia. Jednak do tej pory podejścia metodologiczne do oceny funkcji mitochondriów guza pozostają nieuchwytne i wymagają biegłości technicznej ograniczającej wykonalność, ostatecznie zmniejszając wartość diagnostyczną i prognostyczną, zarówno w warunkach eksperymentalnych, jak i klinicznych. W tym miejscu przedstawiamy prostą i szybką metodę ilościowego określania szybkości fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) i zdolności przenoszenia elektronów (ET) w świeżo wyciętych homogenatach guzów litych przy użyciu respirometrii o wysokiej rozdzielczości. Protokół może być powtarzalnie stosowany u różnych gatunków i typów nowotworów, a także dostosowywany do oceny różnorodności mitochondrialnych szlaków ET. Korzystając z tego protokołu, wykazaliśmy, że myszy z luminalnym rakiem sutka B wykazują wadliwe oddychanie związane z dinukleotydem nikotynamidoadeninowym i zależność od bursztynianu w celu wytworzenia trifosforanu adenozyny za pośrednictwem OXPHOS.

Wstępne badania wykazały, że guzy EO771 charakteryzują się niskim poziomem utleniania i dlatego wymagają wysokich stężeń homogenatów do odpowiedniej oceny strumienia O2. Przeprowadzono eksperymenty optymalizacyjne w celu ustalenia optymalnego zakresu stężenia homogenatu tkankowego dla badania. Homogenaty guzów przygotowywano początkowo w stężeniu 40 mg/mL, a następnie rozcieńczano liniowo. Strumień O2 znormalizowany do masy tkanki był spójny w różnych stężeniach (Ryc. 1A–D). Zaobserwowano, że stężenie 40 mg/mL prowadzi do szybkiego wyczerpania tlenu i nie nadaje się do eksperymentów (Ryc. 1A). Zużycie tlenu znacząco spowolniło przy stężeniach 30 mg/mL i 20 mg/mL, jednak nadal szybko malało w krótkim czasie w przypadku braku substratów lub ADP (Ryc. 1B,C). Stężenie 10 mg/mL dało optymalny wskaźnik zużycia tlenu (Ryc. 1D), umożliwiający dłuższy protokół SUIT trwający 90 minut.
Zastosowano protokół SUIT w celu oceny OXPHOS i ET sprzężonych z NADH i bursztynianem, a także aktywności CIV (Rycina 2A). Dodano pirogronian i malonian do homogenatu tkankowego w warunkach braku ADP, aby wywołać wyciek (L) przez NADH. Następnie dodano nasycające ilości ADP, aby osiągnąć maksymalne OXPHOS sprzężone z NADH (P), po czym dodano glutaminian. Dodano następnie cytochrom c, aby potwierdzić integralność zewnętrznej błony mitochondrialnej; wzrost szybkości oddychania był mniejszy niż 20% we wszystkich próbkach (Rycina 2B). Ze względu na bardzo słabe odpowiedzi na substraty sprzężone z NADH, uwalnianie cytochromu c oceniono również w obecności bursztynianu i rotenu, obserwując minimalną stymulację cytochromu c (Rycina 2B). Ciekawym spostrzeżeniem jest zaniedbywalne OXPHOS sprzężone z NADH w guzach EO771 (Rycina 2C). Następnie dodano bursztynian w obecności pirogronianu, malonianu i glutaminianu, aby zainicjować przepływ elektronów przez dehydrogenazę bursztynianową. Następnie miareczkowano FCCP w celu osiągnięcia maksymalnego przepływu elektronów (E), co ujawniło, że w guzach EO771 to fosforylacja, a nie utlenianie, ogranicza oddychanie (Rycina 2C). Następnie miareczkowano rotenu i antymycynę A, aby odpowiednio zahamować kompleks I i kompleks III. Następnie dodano askorbinian i TMPD, aby zainicjować maksymalny przepływ elektronów przez CIV, który następnie hamowany jest przez azotek sodu. Tabela 1 przedstawia równania analitycznego przeliczenia danych surowych (Tabela 2) na wartości ilościowe parametrów oddychania przedstawionych na Rycina 2C. Ogólnie profile oddychania homogenatów guzów (Rycina 2C) są podobne do tych z niezaimplantowanych, prześwietlonych digitoniną komórek EO771 (Rycina 2D), z wyjątkiem zmniejszonego maksymalnego transferu elektronów wspieranego przez substraty N- i S-sprzężone w guzach.
Ponieważ oddychanie związane z NADH było zaniedbywalne, kinetykę oddychania bursztynianu oceniano dalej poprzez stopniowe dodawanie niedomiarowych ilości ADP aż do osiągnięcia maksymalnej szybkości (VMAX) (Rysunek 3A,3B). Połowa stężenia maksymalnego (KM) ADP w obecności bursztynianu i rotenu wynosiła 37,5 µM, natomiast VMAX wynosiła około 10,5 pmol/s/mg (Rysunek 3C). Tak więc, pomimo stosunkowo niskich szybkości utleniania, guzy EO771 charakteryzowały się dużą wrażliwością na ADP i utrzymywały syntezę ATP przy stosunkowo niskich stężeniach ADP.
Wybór odpowiednich obszarów danych surowych do ekstrakcji ma kluczowe znaczenie dla powtarzalności eksperymentów i dokładnej kwantyfikacji. W przypadku cytochromu c należy wybrać punkt odpowiadający stanowi ustalonymu bezpośrednio przed iniekcją (Rycina 4A, znacznik 1). Często występuje początkowy artefakt iniekcji, po którym następuje okres (około 5–10 min), w którym strumień O2 nie jest stały. Ocena sprawności cytochromu c odbywa się poprzez dodatkowy wybór po ustabilizowaniu się strumienia O2 (Rycina 4A, znacznik 2). Wybory po dodaniu substratów, ADP lub większości inhibitorów wykonywane są również po upływie artefaktu iniekcji i po ustabilizowaniu się strumienia O2 (Rycina 4B). Punkt wyboru służący określeniu maksymalnego oddychania rozsprzężonego wykonywany jest w momencie szczytowego wzrostu osiągniętego podczas tytracji FCCP, który często nie odpowiada ostatniej iniekcji (Rycina 4C). Wybór dla TMPD dokonywany jest po dodaniu zarówno askorbinianu, jak i TMPD oraz w momencie szczytowego wzrostu oddychania (Rycina 4D, znacznik 1). Tuż po tym szczycie dodawany jest inhibitor, azotek sodu, który szybko obniża intensywność oddychania, ale często powoduje również artefakt iniekcji niższy niż zahamowana szybkość oddychania (Rycina 4D). Znacznik inhibitora umieszczany jest bezpośrednio po artefakcie iniekcji (Rycina 4D, znacznik 2). Strumień O2 zazwyczaj nie ustabilizuje się i dalej maleje.
Tabela 1: Oznaczenia używane w fizjologii oddechowej i wyprowadzenie analityczne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/TABLE%201.docx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Charakterystyka próbek i cechy oddechowe homogenatów guzów piersi typu luminal B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/TABLE%202.docx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
<img alt="Wykres strumienia O₂ w funkcji stężenia, analiza zużycia O₂ w różnym stężeniu w czasie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 1"> 
Rycina 1: Optymalizacja stężenia homogenatu guza. Strumień O2 (czerwony) i stężenie O2 (niebieski) w homogenatach guza sutka przygotowanych w stężeniach (A) 40 mg/mL, (B) 30 mg/mL, (C) 20 mg/mL oraz (D) 10 mg/mL. Thom: Oddychanie homogenatu tkankowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza strumienia tlenu; wykresy strumienia/flow O₂; uwalnianie cytochromu c; porównanie eksperymentalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 2"> 
Rycina 2: Ocena pojemności OXPHOS i ET za pomocą wysokorozdzielczej respiracji w świeżo pobranych homogenatach guza. (A) Przykładowy wykres zużycia tlenu (czerwony) i stężeń (niebieski) w trakcie protokołu z substratami, inhibitorami i rozprzęgaczami. PM: Pirogronian + Malonian, D: ADP, G: Glutaminian, c: Cytochrom c, S: Bursztynian, F: FCCP, Rot: Rotenon, Ama: Antymycyna A, Asc/TMPD: Ascorbinian/Tetrametylo-p-fenylenodiamina. (B) Procentowy wzrost strumienia O2 po dodaniu cytochromu c. (C-D) Oddychanie wspierane przez malonian, pirogronian, glutaminian i bursztynian w obecności ADP, FCCP oraz ascorbinianu/TMPD odpowiednio w (C) homogenatach guza pochodzących z EO771 oraz (D) niezaimplantowanych komórkach EO771 przepuszczalnych dla digitoniny. Thom: Oddychanie homogenatu tkankowego; PM: Pirogronian + Malonian; PMG: Pirogronian + Malonian + Glutaminian; PMGS: Pirogronian + Malonian + Glutaminian + Bursztynian; CIV: Kompleks IV; -L: Stan wycieku; -P: Stan fosforylacji oksydacyjnej; -E: Stan transferu elektronów; N-linked: Strumień O2 wspierany przez określone kombinacje substratów generujących NADH; NS-linked: Strumień O2 wspierany przez zbieżność określonych kombinacji substratów generujących NADH i bursztynianu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres oddychania mitochondrialnego, strumień O2 w funkcji ADP; wykres kinetyczny i histogram; dane badawcze." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 3"> 
Rycina 3: Guzy sutka EO771 wykazywały wysoką wrażliwość na ADP (adenozyno-5′-difosforan). (A) Przykładowy wykres zużycia tlenu (czerwony) i stężeń tlenu (niebieski) w trakcie protokołu miareczkowania ADP z użyciem wiązania S. Thom: oddychanie homogenatu tkankowego; S/Rot: bursztynian/rotanona; D: ADP. (B) Oddychanie wspierane przez bursztynian w obecności rotanony i rosnących stężeń ADP (0 µM ADP = S/Rot-L). (C) Maksymalna szybkość (VMAX) i półmaksymalne stężenie (KM) ADP w obecności bursztynianu + rotanony. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres strumienia O₂ w funkcji stężenia; badanie zużycia tlenu; analiza zmian czasowych, dane doświadczalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 4"> 
Rycina 4: Przykładowy zapis ilustrujący wybór znaczników dla surowych strumieni O2 w celu ekstrakcji danych. (A) Wybór cytochromu c: wybór numer 1 przed wstrzyknięciem cytochromu c oraz wybór numer 2 po wstrzyknięciu, gdy strumień O2 osiągnął stan równowagi. c – cytochrom c. (B) Wybór substratu, ADP i inhibitora: wybór numer 1 po wstrzyknięciu (w tej reprezentatywnej krzywej – bursztynian), gdy strumień O2 osiągnął stan równowagi. S – bursztynian. (C) Wybór rozprzęgacza: wybór numer 1 w punkcie maksymalnego wzrostu oddychania podczas kalibracji rozprzęgacza. Na tej reprezentatywnej krzywej kalibracji FCCP trzecie wstrzyknięcie nieznacznie obniża oddychanie, dlatego nie jest brane pod uwagę przy wyborze. F – FCCP. (D) Wybór TMPD: wybór numer 1 w punkcie maksymalnego wzrostu oddychania po wstrzyknięciu askorbinianu i TMPD. Wybór azotku sodowego: wybór numer 2 po wystąpieniu ostrej artefaktycznej zmiany po wstrzyknięciu, gdy oddychanie początkowo maleje. As/Tm – askorbinian/TMPD; Azd – azotek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Opracowaliśmy praktyczny protokół i analityczne podejście do oceny mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej i zdolności przenoszenia elektronów w świeżych homogenatach guza. Protokół ten można łatwo dostosować do badania różnych funkcji mitochondriów, które przyczyniają się do inicjacji, progresji i odpowiedzi na leczenie.

Analityczne oznaczanie funkcji mitochondrialnej wyciętych homogenatów guzów litych

Mitochondria are essential to the onset and progression of cancer through energy production, reactive oxygen species regulation, and macromolecule ...

Protokół ten opisuje prostą i szybką metodę pomiaru funkcji mitochondriów guza. Protokół ma szerokie zastosowanie w klinicznej onkologii translacyjnej i pomoże poprawić diagnostyczną i mechanistyczną interpretację roli mitochondriów w powstawaniu i progresji raka. Główną zaletą tej techniki jest zastosowanie homogenizacji tkanek w celu uproszczenia przygotowania i maksymalizacji wydajności mitochondriów przy jednoczesnym złagodzeniu ograniczeń dyfuzji.Technika ta oferuje potencjalne zastosowania w warunkach klinicznych i diagnostycznych z ilościową oceną funkcji mitochondriów guza przy użyciu świeżo biopsji lub wyciętej tkanki nowotworowej. Zacznij od umieszczenia szklanego homogenizatora zawierającego jeden mililitr mitochondrialnej pożywki oddechowej lub MiR05 w ciasno dopasowanym szklanym tłuczku na mokrym lodzie. Umieść tkankę w jednym mililitrze roztworu konserwującego do biopsji lub BIOPS na lodowatej szalce Petriego.Pokrój guz na małe kawałki po około 5 do 10 miligramów każdy i umieść pozostałe kawałki guza z powrotem w 10 mililitrach BIOPS trzymanych na lodzie. Po dokładnym osuszeniu skrawków tkanki na bibule filtracyjnej, umieść je na małej plastikowej tarowanej łodzi wagowej i zapisz początkową mokrą masę. Umieść niewykorzystane kawałki z powrotem w 10-mililitrowej stożkowej tubie BIOPS w celu dalszej konserwacji.Zanurz skrawki tkanki w lodowatym homogenizatorze zawierającym MiR05 i zapisz pozostałą masę na łodzi do ważenia. Używając szklanego tłuczka o zakresie prześwitu od 0,09 do 0,16 milimetra, delikatnie rozerwij tkankę nowotworową, wykonując od pięciu do siedmiu pociągnięć w dół i w górę. Przy każdym pociągnięciu obróć tłuczek w prawo/przeciwnie do ruchu wskazówek zegara trzy razy, popychając tłuczek w dół i dodatkowe trzy razy, ciągnąc tłuczek z powrotem do góry.Pozwól, aby tkanka osiadła na dnie homogenizatora między pociągnięciami, ale unikaj przesuwania tłuczka całkowicie powyżej objętości płynu, aby zapobiec pienieniu. Wlej homogenat do 15-mililitrowej stożkowej rurki i umieść go na lodzie. Odpipetować od jednego do trzech mililitrów świeżego MiR05 przez tłuczek i do homogenizatora, aby umyć pozostały homogenat tkankowy.Wlać płukanie MiR05 do stożkowej probówki zawierającej homogenat. Powtórz ten krok dwa do trzech razy, aby zapewnić całkowite przeniesienie homogenatu. Aby dokładnie obliczyć stężenie homogenatu tkankowego, należy dokładnie sprawdzić homogenizator i homogenat pod kątem pozostałego niehomogenizowanego materiału, w tym tkanki łącznej.Aby usunąć niehomogenizowany materiał z homogenizatora, do którego nie można dotrzeć pęsetą, po dodaniu MiR05 do homogenizatora należy odessać objętość, łącznie z tkanką, za pomocą pipety i przenieść zawartość na szalkę Petriego. Usunąć z homogenatu niehomogenizowany materiał osadzony w dużych kawałkach na dnie stożkowej probówki, zasysając je pipetą, i umieścić na nasadce stożkowej probówki. Usuń tkankę z szalki Petriego lub stożkowej nasadki probówki za pomocą pęsety i osusz ją na bibule filtracyjnej.Dodaj pozostały homogenat ze stożkowej nasadki probówki z powrotem do stożkowej probówki. Zakręć probówkę, a następnie odwróć, aby wymieszać. Ponownie sprawdź homogenizatory i homogenizuj pod kątem dodatkowego materiału niehomogenizowanego i powtórz kroki, aby usunąć materiał niehomogenizowany, jeśli to konieczne.Zważyć i zapisać masę niehomogenizowanego materiału odzyskanego z homogenizatora. Sprawdzić, czy w preparacie homogenatu nie ma przeniesionych tkanek w stanie nienaruszonym, usunąć niehomogenizowane kawałki i zważyć w razie potrzeby. Odjąć masę tkanki odzyskanej z łodzi wagowej, homogenizatora i homogenatu od początkowej mokrej masy, aby obliczyć końcową masę próbki.Używając końcowej masy próbki, dodaj dodatkowy MiR05, aby doprowadzić homogenat do pożądanego stężenia. Po zważeniu i przygotowaniu homogenatu należy jak najszybciej przystąpić do oznaczania. Próbkę należy przechowywać na mokrym lodzie do czasu jej przeniesienia do przyrządu.Po skalibrowaniu przyrządu i przygotowaniu próbki, należy usunąć korki ruchem obrotowym i zassać MiR05 z komór, unikając membrany odsłoniętej wewnątrz komory. Dobrze wymieszaj homogenat i dodaj 2,25 mililitra homogenatu do komory. Załóżmy, że jeden homogenat jest dodawany do wielu komór, pipetuj po jednym mililitrze homogenatu do każdej komory, mieszając homogenat, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie w tkankach.Kliknij F4, aby nazwać i oznaczyć czas zdarzenia, a następnie kliknij przycisk W porządku. Napełnij 50-mililitrową strzykawkę tlenem ze zbiornika tlenu z reduktorem i rurką gazową za pomocą igły o rozmiarze 18. Wstrzyknij tlen bezpośrednio do komór, aby przetlenić je do około 500 mikromolowych tlenu.Luźno włóż korki i poczekaj na zamknięcie, aż tlen osiągnie około 480 mikromolów. Ruchem skręcającym powoli zamknij komorę i pozwól, aby oddech się zrównoważył przez około 15 do 20 minut. W razie potrzeby napełnić centralną kapilarnę korka MiR05.Użyj dedykowanych mikrostrzykawek do wstrzykiwania substratów, rozprzęgaczy i inhibitorów do całkowicie zamkniętych komór, aby nazwać i oznaczyć zdarzenia dla każdej komory w czasie rzeczywistym. Wybierz F6, aby dostosować stężenie tlenu i ujemne skale nachylenia tlenu zgodnie z potrzebami. Po każdym wstrzyknięciu należy umyć strzykawkę w wodzie w przypadku związków rozpuszczalnych w wodzie i w 70% etanolu w przypadku związków rozpuszczonych w etanolu.Dodać pięć mikrolitrów jabłczanu 0,8-molowego i natychmiast przejść do następnego wstrzyknięcia. Umyć strzykawkę do wstrzykiwań trzy razy w wodzie. Natychmiast dodaj pięć mikrolitrów 1-molowego pirogronianu i poczekaj, aż oddech się ustabilizuje.Po umyciu strzykawki dodać 10 mikrolitrów 0,5-molowego ADP i poczekać, aż odpowiedź ADP się ustabilizuje. Umyj strzykawkę i dodaj pięć mikrolitrów 2-molowego glutaminianu i poczekaj, aż oddech się ustabilizuje. Umyj strzykawkę, a następnie dodaj pięć mikrolitrów 4-milimolowego cytochromu C i poczekaj, aż oddech się ustabilizuje.Po umyciu strzykawki dodać 20 mikrolitrów 1-molowego bursztynianu i poczekać, aż oddech się ustabilizuje. Miareczkować z przyrostami od 0,5 do 1 mikrolitra 1-milimolowego FCCP i poczekać, aż oddech się ustabilizuje po każdym wstrzyknięciu. Kontynuuj, aż nie nastąpi dodatkowe zwiększenie oddychania.Umyć strzykawkę do wstrzykiwań trzykrotnie w 70% etanolu. Dodaj dwa mikrolitry 150-mikromolowego rotenonu i poczekaj, aż oddech się ustabilizuje. Dodaj kolejny mikrolitr rotenonu, aby upewnić się, że nie ma dalszego hamowania.W przypadku zmniejszenia oddychania należy kontynuować dodatkowe wstrzyknięcia, aż do ustąpienia spowolnienia oddychania, a następnie umyć strzykawkę do wstrzykiwań trzy razy w 70% etanolu. Dodaj dwa mikrolitry 125-mikromolowej antymycyny A i poczekaj, aż oddech się ustabilizuje. Dodaj kolejny mikrolitr antymycyny A, aby upewnić się, że nie ma dalszego hamowania.W przypadku zmniejszenia oddechu należy kontynuować dodatkowe wstrzyknięcia, aż do momentu, gdy nie nastąpi zmniejszenie oddychania. Umyć strzykawkę trzykrotnie 70% etanolem. Sprawdź stężenie tlenu w komorze.Jeśli stężenie jest poniżej 125 mikromolów, należy ponownie natlenić do powietrza w pomieszczeniu lub lekko przetlenić, aby upewnić się, że tlen nie ogranicza przepływu oddechowego. Dodaj pięć mikrolitrów 0,8-molowego askorbinianu. Umyć strzykawkę trzy razy w 70% etanolu.Natychmiast dodaj 10 mikrolitrów 0,2-molowego TMPD i poczekaj na wzrost oddychania. Po umyciu strzykawki etanolem należy dodać 25 mikrolitrów 4-molowego azydku sodu natychmiast po ustabilizowaniu się strumienia oddechowego askorbinianu TMPD. Zakończ, klikając Plik, Zapisz i rozłącz się.Zaobserwowano, że 40 miligramów na mililitr homogenatu tkankowego powodowało szybki ubytek tlenu. Zużycie tlenu znacznie zwolniło przy 30 i 20 miligramach na mililitr homogenatu tkankowego, ale nadal gwałtownie spadało w krótkim czasie przy braku substratów lub ADP. Stężenie homogenatu tkankowego 10 miligramów na mililitr skutkowało optymalnym wskaźnikiem zużycia tlenu.Protokół SUIT wykorzystano do oceny fosforylacji oksydacyjnej i transferu elektronów sprzężonych z NADH i bursztynianem, a także aktywności kompleksu dożylnego. Uwalnianie cytochromu C oceniano w obecności pirogronianu i jabłczanu lub bursztynianu i rotenonu, z których oba wykazały, że preparat homogenacyjny nie uszkadza mitochondriów. Stwierdzono również, że fosforylacja oksydacyjna związana z NADH była znikoma w guzach EO771.Miareczkowanie FCCP w celu wysterowania maksymalnego przepływu elektronów ujawniło, że w guzach EO771 fosforylacja, a nie utlenianie, ograniczała się do oddychania. Profile oddechowe homogenatu guza były podobne do tych z nieimplantowanych, przepuszczalnych digitoniną komórek EO771, z wyjątkiem zmniejszonego maksymalnego transferu elektronów wspieranego przez substraty sprzężone z N i S w guzie. Kinetykę oddechową bursztynianu oceniano następnie poprzez stopniowe miareczkowanie subsaturującego ADP, aż do osiągnięcia maksymalnej szybkości.Połowa maksymalnego stężenia ADP w obecności bursztynianu i rotenonu wynosiła 37,5 mikromola, podczas gdy maksymalna szybkość wynosiła około 10,5 pikomoli na sekundę na miligram. Instrumenty zainstalowane w rutynowej opiece, a także obchodzenie się z tkankami, mają kluczowe znaczenie dla powodzenia tych eksperymentów. Zgodnie z tymi procedurami, można zastosować inne podejścia do normalizacji stopy specyficzne dla masy lub markerów w oparciu o pytanie będące przedmiotem zainteresowania.Typowe miary obejmują całkowitą kwantyfikację białka i aktywność enzymatyczną syntazy cytrynianu, ale różnią się w zależności od systemu modelowego, projektu statystycznego i pytania badawczego.

analytical-determination-mitochondrial-function-excised-solid-tumor

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisano metodę szybkiej izolacji mitochondriów z biopsji tkanek ssaków. Preparaty wątroby szczura lub mięśni szkieletowych homogenizowano za pomocą komercyjnego dysocjatora tkanek, a mitochondria izolowano przez filtrację różnicową przez filtry z siatki nylonowej. Czas izolacji mitochondriów wynosi &lt;30 min w porównaniu do 60 - 100 min przy użyciu metod alternatywnych.

Szybka izolacja i oczyszczanie mitochondriów do przeszczepu przez dysocjację tkanek i filtrację różnicową

Porównanie potencjału błony mitochondrialnej między próbkami dostarcza cennych informacji o stanie komórek. Opisano szczegółowe etapy izolacji mitochondriów i oceny odpowiedzi na inhibitory i rozprzęgacze za pomocą fluorescencji. Metoda i użyteczność tego protokołu są zilustrowane przez zastosowanie hodowli komórkowej i zwierzęcego modelu stresu komórkowego.

Izolacja i analiza funkcjonalna mitochondriów z hodowanych komórek i tkanek myszy

Opisano metody biopsji mięśnia obszernego bocznego, przygotowania oczyszczonych mitochondriów i profilowania respirometrycznego. Wykorzystanie małej objętości mięśniowej sprawia, że technika ta nadaje się do zastosowań w badaniach klinicznych.

Przygotowanie i ocena respirometryczna mitochondriów wyizolowanych z tkanki mięśni szkieletowych uzyskana metodą przezskórnej biopsji igłowej

Naszym celem było opracowanie praktycznego protokołu do oceny dysfunkcji mitochondriów związanych ze zmęczeniem u pacjentów z rakiem. Ten innowacyjny protokół jest zoptymalizowany do użytku klinicznego, obejmującego tylko standardową flebotomię i podstawowe procedury laboratoryjne.

Ocena roli funkcji mitochondriów w zmęczeniu związanym z rakiem

Ten artykuł przedstawia protokół wirowania o różnicowej prędkości w połączeniu z wirowaniem gradientu gęstości w celu oddzielenia mitochondriów od tkanek ludzkiego raka jajnika i kontroli tkanek jajnika do ilościowej analizy proteomicznej, co skutkuje wysokiej jakości próbką mitochondrialną oraz wysokoprzepustową i wysoce odtwarzalną ilościową analizą proteomiczną ludzkiego raka jajnika.

Przygotowanie mitochondriów z tkanek raka jajnika i tkanek jajnika kontrolnego do ilościowej analizy proteomicznej

Przygotowanie wzbogaconych o mitochondria próbek z wcześniej zamrożonych zarchiwizowanych tkanek stałych pozwoliło badaczom na przeprowadzenie zarówno funkcjonalnych, jak i analitycznych ocen mitochondriów w różnych eksperymentalnych modalnościach. Badanie to pokazuje, jak przygotować preparaty wzbogacone w mitochondria z zamrożonej tkanki serca i przeprowadzić ocenę analityczną mitochondriów.

Pomiar mitochondrialnych kompleksów przenoszenia elektronów w wcześniej zamrożonej tkance serca od potomstwa lochy: model do oceny zmian bioenergetyki mitochondrialnej wywołanych wysiłkiem fizycznym

Tutaj opisujemy szczegółową metodę izolacji mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy i późniejszą analizę oddychania za pomocą wskaźnika zużycia tlenu (OCR) za pomocą testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach. Rurociąg ten można zastosować do badania wpływu wielu interwencji środowiskowych lub genetycznych na metabolizm mitochondriów.

Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy do testów respirometrycznych

Tutaj prezentujemy kompilację testów do bezpośredniego pomiaru funkcji mitochondriów w komórkach ssaków, niezależnie od ich zdolności do zużywania tlenu cząsteczkowego.

Testy niezależne od tlenu do pomiaru funkcji mitochondriów u ssaków

Ten protokół opisuje technikę analizy superkompleksów oddechowych, gdy dostępne są tylko małe ilości próbek.

Izolacja mitochondriów do analizy superkompleksów mitochondrialnych z próbek małych tkanek i kultur komórkowych

W tym badaniu opisujemy krok po kroku protokół i kładziemy nacisk na kluczowe szczegóły dotyczące określania cech morfologicznych mitochondriów w żywych komórkach, w tym przygotowanie próbki, akwizycję obrazu i analizę danych. Ta metoda jest powszechnie stosowana do badania morfologii mitochondriów w celu badania różnych schorzeń.

Oznaczanie morfologii mitochondriów w żywych komórkach za pomocą mikroskopii konfokalnej

Poznaj metodę analizy funkcji mitochondrialnych w homogenatach guzów litych. Protokół umożliwia szybkie oznaczanie fosforylacji oksydacyjnej i przenoszenia elektronów w świeżo pobranej tkance nowotworowej.

Analityczne oznaczanie funkcji mitochondrialnej wyciętych homogenatów guzów litych

Przeglądaj więcej filmów