Analityczne oznaczanie funkcji mitochondrialnej wyciętych homogenatów guzów litych

Protokół ten opisuje prostą i szybką metodę pomiaru funkcji mitochondriów guza. Protokół ma szerokie zastosowanie w klinicznej onkologii translacyjnej i pomoże poprawić diagnostyczną i mechanistyczną interpretację roli mitochondriów w powstawaniu i progresji raka. Główną zaletą tej techniki jest zastosowanie homogenizacji tkanek w celu uproszczenia przygotowania i maksymalizacji wydajności mitochondriów przy jednoczesnym złagodzeniu ograniczeń dyfuzji.

Technika ta oferuje potencjalne zastosowania w warunkach klinicznych i diagnostycznych z ilościową oceną funkcji mitochondriów guza przy użyciu świeżo biopsji lub wyciętej tkanki nowotworowej. Zacznij od umieszczenia szklanego homogenizatora zawierającego jeden mililitr mitochondrialnej pożywki oddechowej lub MiR05 w ciasno dopasowanym szklanym tłuczku na mokrym lodzie. Umieść tkankę w jednym mililitrze roztworu konserwującego do biopsji lub BIOPS na lodowatej szalce Petriego.

Pokrój guz na małe kawałki po około 5 do 10 miligramów każdy i umieść pozostałe kawałki guza z powrotem w 10 mililitrach BIOPS trzymanych na lodzie. Po dokładnym osuszeniu skrawków tkanki na bibule filtracyjnej, umieść je na małej plastikowej tarowanej łodzi wagowej i zapisz początkową mokrą masę. Umieść niewykorzystane kawałki z powrotem w 10-mililitrowej stożkowej tubie BIOPS w celu dalszej konserwacji.

Zanurz skrawki tkanki w lodowatym homogenizatorze zawierającym MiR05 i zapisz pozostałą masę na łodzi do ważenia. Używając szklanego tłuczka o zakresie prześwitu od 0,09 do 0,16 milimetra, delikatnie rozerwij tkankę nowotworową, wykonując od pięciu do siedmiu pociągnięć w dół i w górę. Przy każdym pociągnięciu obróć tłuczek w prawo/przeciwnie do ruchu wskazówek zegara trzy razy, popychając tłuczek w dół i dodatkowe trzy razy, ciągnąc tłuczek z powrotem do góry.

Pozwól, aby tkanka osiadła na dnie homogenizatora między pociągnięciami, ale unikaj przesuwania tłuczka całkowicie powyżej objętości płynu, aby zapobiec pienieniu. Wlej homogenat do 15-mililitrowej stożkowej rurki i umieść go na lodzie. Odpipetować od jednego do trzech mililitrów świeżego MiR05 przez tłuczek i do homogenizatora, aby umyć pozostały homogenat tkankowy.

Wlać płukanie MiR05 do stożkowej probówki zawierającej homogenat. Powtórz ten krok dwa do trzech razy, aby zapewnić całkowite przeniesienie homogenatu. Aby dokładnie obliczyć stężenie homogenatu tkankowego, należy dokładnie sprawdzić homogenizator i homogenat pod kątem pozostałego niehomogenizowanego materiału, w tym tkanki łącznej.

Aby usunąć niehomogenizowany materiał z homogenizatora, do którego nie można dotrzeć pęsetą, po dodaniu MiR05 do homogenizatora należy odessać objętość, łącznie z tkanką, za pomocą pipety i przenieść zawartość na szalkę Petriego. Usunąć z homogenatu niehomogenizowany materiał osadzony w dużych kawałkach na dnie stożkowej probówki, zasysając je pipetą, i umieścić na nasadce stożkowej probówki. Usuń tkankę z szalki Petriego lub stożkowej nasadki probówki za pomocą pęsety i osusz ją na bibule filtracyjnej.

Dodaj pozostały homogenat ze stożkowej nasadki probówki z powrotem do stożkowej probówki. Zakręć probówkę, a następnie odwróć, aby wymieszać. Ponownie sprawdź homogenizatory i homogenizuj pod kątem dodatkowego materiału niehomogenizowanego i powtórz kroki, aby usunąć materiał niehomogenizowany, jeśli to konieczne.

Zważyć i zapisać masę niehomogenizowanego materiału odzyskanego z homogenizatora. Sprawdzić, czy w preparacie homogenatu nie ma przeniesionych tkanek w stanie nienaruszonym, usunąć niehomogenizowane kawałki i zważyć w razie potrzeby. Odjąć masę tkanki odzyskanej z łodzi wagowej, homogenizatora i homogenatu od początkowej mokrej masy, aby obliczyć końcową masę próbki.

Używając końcowej masy próbki, dodaj dodatkowy MiR05, aby doprowadzić homogenat do pożądanego stężenia. Po zważeniu i przygotowaniu homogenatu należy jak najszybciej przystąpić do oznaczania. Próbkę należy przechowywać na mokrym lodzie do czasu jej przeniesienia do przyrządu.

Po skalibrowaniu przyrządu i przygotowaniu próbki, należy usunąć korki ruchem obrotowym i zassać MiR05 z komór, unikając membrany odsłoniętej wewnątrz komory. Dobrze wymieszaj homogenat i dodaj 2,25 mililitra homogenatu do komory. Załóżmy, że jeden homogenat jest dodawany do wielu komór, pipetuj po jednym mililitrze homogenatu do każdej komory, mieszając homogenat, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie w tkankach.

Kliknij F4, aby nazwać i oznaczyć czas zdarzenia, a następnie kliknij przycisk W porządku. Napełnij 50-mililitrową strzykawkę tlenem ze zbiornika tlenu z reduktorem i rurką gazową za pomocą igły o rozmiarze 18. Wstrzyknij tlen bezpośrednio do komór, aby przetlenić je do około 500 mikromolowych tlenu.

Luźno włóż korki i poczekaj na zamknięcie, aż tlen osiągnie około 480 mikromolów. Ruchem skręcającym powoli zamknij komorę i pozwól, aby oddech się zrównoważył przez około 15 do 20 minut. W razie potrzeby napełnić centralną kapilarnę korka MiR05.

Użyj dedykowanych mikrostrzykawek do wstrzykiwania substratów, rozprzęgaczy i inhibitorów do całkowicie zamkniętych komór, aby nazwać i oznaczyć zdarzenia dla każdej komory w czasie rzeczywistym. Wybierz F6, aby dostosować stężenie tlenu i ujemne skale nachylenia tlenu zgodnie z potrzebami. Po każdym wstrzyknięciu należy umyć strzykawkę w wodzie w przypadku związków rozpuszczalnych w wodzie i w 70% etanolu w przypadku związków rozpuszczonych w etanolu.

Dodać pięć mikrolitrów jabłczanu 0,8-molowego i natychmiast przejść do następnego wstrzyknięcia. Umyć strzykawkę do wstrzykiwań trzy razy w wodzie. Natychmiast dodaj pięć mikrolitrów 1-molowego pirogronianu i poczekaj, aż oddech się ustabilizuje.

Po umyciu strzykawki dodać 10 mikrolitrów 0,5-molowego ADP i poczekać, aż odpowiedź ADP się ustabilizuje. Umyj strzykawkę i dodaj pięć mikrolitrów 2-molowego glutaminianu i poczekaj, aż oddech się ustabilizuje. Umyj strzykawkę, a następnie dodaj pięć mikrolitrów 4-milimolowego cytochromu C i poczekaj, aż oddech się ustabilizuje.

Po umyciu strzykawki dodać 20 mikrolitrów 1-molowego bursztynianu i poczekać, aż oddech się ustabilizuje. Miareczkować z przyrostami od 0,5 do 1 mikrolitra 1-milimolowego FCCP i poczekać, aż oddech się ustabilizuje po każdym wstrzyknięciu. Kontynuuj, aż nie nastąpi dodatkowe zwiększenie oddychania.

Umyć strzykawkę do wstrzykiwań trzykrotnie w 70% etanolu. Dodaj dwa mikrolitry 150-mikromolowego rotenonu i poczekaj, aż oddech się ustabilizuje. Dodaj kolejny mikrolitr rotenonu, aby upewnić się, że nie ma dalszego hamowania.

W przypadku zmniejszenia oddychania należy kontynuować dodatkowe wstrzyknięcia, aż do ustąpienia spowolnienia oddychania, a następnie umyć strzykawkę do wstrzykiwań trzy razy w 70% etanolu. Dodaj dwa mikrolitry 125-mikromolowej antymycyny A i poczekaj, aż oddech się ustabilizuje. Dodaj kolejny mikrolitr antymycyny A, aby upewnić się, że nie ma dalszego hamowania.

W przypadku zmniejszenia oddechu należy kontynuować dodatkowe wstrzyknięcia, aż do momentu, gdy nie nastąpi zmniejszenie oddychania. Umyć strzykawkę trzykrotnie 70% etanolem. Sprawdź stężenie tlenu w komorze.

Jeśli stężenie jest poniżej 125 mikromolów, należy ponownie natlenić do powietrza w pomieszczeniu lub lekko przetlenić, aby upewnić się, że tlen nie ogranicza przepływu oddechowego. Dodaj pięć mikrolitrów 0,8-molowego askorbinianu. Umyć strzykawkę trzy razy w 70% etanolu.

Natychmiast dodaj 10 mikrolitrów 0,2-molowego TMPD i poczekaj na wzrost oddychania. Po umyciu strzykawki etanolem należy dodać 25 mikrolitrów 4-molowego azydku sodu natychmiast po ustabilizowaniu się strumienia oddechowego askorbinianu TMPD. Zakończ, klikając Plik, Zapisz i rozłącz się.

Zaobserwowano, że 40 miligramów na mililitr homogenatu tkankowego powodowało szybki ubytek tlenu. Zużycie tlenu znacznie zwolniło przy 30 i 20 miligramach na mililitr homogenatu tkankowego, ale nadal gwałtownie spadało w krótkim czasie przy braku substratów lub ADP. Stężenie homogenatu tkankowego 10 miligramów na mililitr skutkowało optymalnym wskaźnikiem zużycia tlenu.

Protokół SUIT wykorzystano do oceny fosforylacji oksydacyjnej i transferu elektronów sprzężonych z NADH i bursztynianem, a także aktywności kompleksu dożylnego. Uwalnianie cytochromu C oceniano w obecności pirogronianu i jabłczanu lub bursztynianu i rotenonu, z których oba wykazały, że preparat homogenacyjny nie uszkadza mitochondriów. Stwierdzono również, że fosforylacja oksydacyjna związana z NADH była znikoma w guzach EO771.

Miareczkowanie FCCP w celu wysterowania maksymalnego przepływu elektronów ujawniło, że w guzach EO771 fosforylacja, a nie utlenianie, ograniczała się do oddychania. Profile oddechowe homogenatu guza były podobne do tych z nieimplantowanych, przepuszczalnych digitoniną komórek EO771, z wyjątkiem zmniejszonego maksymalnego transferu elektronów wspieranego przez substraty sprzężone z N i S w guzie. Kinetykę oddechową bursztynianu oceniano następnie poprzez stopniowe miareczkowanie subsaturującego ADP, aż do osiągnięcia maksymalnej szybkości.

Połowa maksymalnego stężenia ADP w obecności bursztynianu i rotenonu wynosiła 37,5 mikromola, podczas gdy maksymalna szybkość wynosiła około 10,5 pikomoli na sekundę na miligram. Instrumenty zainstalowane w rutynowej opiece, a także obchodzenie się z tkankami, mają kluczowe znaczenie dla powodzenia tych eksperymentów. Zgodnie z tymi procedurami, można zastosować inne podejścia do normalizacji stopy specyficzne dla masy lub markerów w oparciu o pytanie będące przedmiotem zainteresowania.

Typowe miary obejmują całkowitą kwantyfikację białka i aktywność enzymatyczną syntazy cytrynianu, ale różnią się w zależności od systemu modelowego, projektu statystycznego i pytania badawczego.