Zastosowanie przewlekłej stymulacji do badania adaptacji fenotypowych mięśni szkieletowych szczurów wywołanych aktywnością skurczową

Model przewlekłej aktywności skurczowej ćwiczeń jest przydatny do badania adaptacji mięśni szkieletowych do bodźców treningowych in vivo. W szczególności model ten wywołuje adaptacje fenotypowe sześciotygodniowego protokołu treningowego w ciągu siedmiu dni. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie fizjologii mięśni, takie jak biogeneza mitochondriów, autofagia i wiele innych adaptacji komórkowych związanych z ćwiczeniami.

Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na obserwację specyficznych adaptacji mięśni w krótkim czasie siedmiu dni w porównaniu z innymi protokołami treningu fizycznego, które wymagają kilku miesięcy. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię atrofii mięśni w wieku, ponieważ wykazano, że przewlekła stymulacja mięśni ma wpływ na złagodzenie osłabienia mięśni związanego ze starzeniem się. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności z oznaczeniem punktu orientacyjnego wspólnego nerwu strzałkowego i przymocowaniem cewek elektrycznych na obu końcach, ponieważ wymagają one praktyki i precyzji.

Rozpocznij od znieczulenia szczura pod wpływem od jednego do 3% inhalacji izofluranu tlenem i potwierdź pełną sedację, sprawdzając reakcję na uszczypnięcie palca u nogi tylnej kończyny i obserwując głębokość i częstość oddechów. Nałóż lubrykant do oczu na oczy, aby uniknąć wysuszenia i umieść szczura na poduszce grzewczej na niskim lub średnim ustawieniu. Delikatnie ogol lewą tylną kończynę, a także pasek wokół tułowia od tyłu szyi za kończynami przednimi i w poprzek przedniej części klatki piersiowej.

Delikatnie przetrzyj ogolone miejsca jodem i alkoholem etylowym w celu dezynfekcji. Gdy zwierzę leży na brzuchu, użyj sterylnego skalpela z ostrzem numer 10, aby wykonać małe nacięcie o długości około 0,5 centymetra z tyłu szyi pośrodku ogolonego obszaru. Następnie przewróć zwierzę na prawy bok i wykonaj dwu- lub trzycentymetrowe nacięcie w skórze lewej tylnej kończyny między dołeczkiem stawu kolanowego i blisko początku ogona.

Za pomocą zakrzywionych nożyczek chirurgicznych z końcówką wypreparuj obszar podskórny na około 3,5 do czterech centymetrów, oddzielając skórę od leżącego pod nią mięśnia, aby utworzyć kieszeń między otwartą skórą a leżącym pod nią mięśniem. Następnie użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać małe nacięcie mniejsze niż 0,5 centymetra na mięśniu dwugłowym uda, upewniając się, że końcówki nożyczek przecinają bezpośrednio mięsień. Następnie delikatnie otwórz obszar cięcia, aż pojawią się wewnętrzne grupy mięśni i wspólny nerw strzałkowy.

Zachowaj szczególną ostrożność, aby uniknąć przecięcia lub uszkodzenia nerwu. Następnie przygotuj od 50 do 60 centymetrów cienkiego drutu ze stali nierdzewnej pokrytego PTFE i złóż go na pół. Zaczep złożoną część drutu w szczelinie 30-centymetrowego pręta ze stali nierdzewnej.

Użyj pręta, aby przeciągnąć drut przez otwartą kieszeń tylnej kończyny w górę nogi i wzdłuż środka pleców w kształcie litery L, aby dotrzeć do małego obszaru nacięcia z tyłu szyi. Zamocuj okno, otwierając je metalowymi zwijaczami, aż rozmiar okna wyniesie około 1,5 centymetra kwadratowego, a nerw strzałkowy będzie leżał pośrodku okna. Za pomocą skalpela ostrożnie zdejmij końce drutu o 1,5 centymetra.

Owiń odizolowane końce drutu wokół igły o rozmiarze 21 pięć razy, aby utworzyć cewkę. Gdy cewki są już prawidłowo wykonane, zwolnij z nich igłę. Zrób węzeł na samym końcu cewki i zszyj go po lewej stronie nerwu, upewniając się, że cewka znajduje się w odległości od 1,5 do 2,5 milimetra od nerwu.

Aby zabezpieczyć cewkę, załóż dwa lub trzy dodatkowe szwy wzdłuż cewki. Ten krok wymaga znacznej praktyki i cierpliwości, aby uniknąć uszkodzenia nerwu i leżącego poniżej mięśnia oraz osiągnąć wszystkie spójne warunki stymulacji u wszystkich zwierząt. Najlepiej, aby jeden wykwalifikowany badacz wykonał wszystkie zabiegi chirurgiczne podczas badania.

Nałóż dwie lub trzy krople roztworu antybiotyku, a następnie ostrożnie zszyj okienko jedwabiem w rozmiarze 5-0. Luźno nawiń pozostały luz drutu i wepchnij do kieszeni podskórnej nad zszytym nacięciem mięśnia dwugłowego uda nad biodrem. Nałóż dwie do trzech kropli roztworu antybiotyku i zamknij otwartą skórę przez zszycie.

Następnie przesuń zwierzę do pozycji mostkowej i przetnij drucianą pętlę wychodzącą z nacięcia w górnej części szyi, aby utworzyć dwa końce drutu. Za pomocą skalpela oderwij końce drutów o 0,5 centymetra. Odetnij wszelkie postrzępione przewody.

Powoli wepchnij odizolowane części przewodów do otworu w gniazdach pinowych i za pomocą lutownicy przewody do gniazd pinowych. Przełóż końcówki przewodów połączone szpilkami przez sterylną gazikę o średnicy 4.4 centymetra. Następnie przełóż przewody przez otwór w podstawie skrzynki stymulatora.

Włóż kołki do gniazd przyłączeniowych w jednostce CCA. Delikatnie włóż jednostkę CCA do komory za pomocą lepkiego przyklejenia, aby zabezpieczyć jednostkę CCA na dnie komory. Użyj taśmy sportowej lub porowatej taśmy chirurgicznej, aby przymocować komorę wokół ogolonego tułowia.

Zamknij górną część komory trzema warstwami taśmy. I zakończ, owijając taśmę wokół boków pudełka stymulatora, aby zabezpieczyć pudełko. Sprawdź, czy CCA działa, wystawiając urządzenie na pojedynczy impuls światła podczerwonego emitowanego przez przenośne światło stroboskopowe na podczerwień.

Jeśli CCA działa prawidłowo, mięśnie kończyn tylnych kurczą się w odpowiedzi na światło podczerwone. Zważ zwierzęta na krótko przed rozpoczęciem procedury CCA w celu zarejestrowania pomiaru podstawowego, który pomoże zidentyfikować wszelkie poważne stresy lub niekorzystne skutki wynikające ze zmiany masy ciała po procedurze CCA. W dniu stymulacji CCA włącz CCA, wystawiając stymulator na pojedynczy impuls światła podczerwonego za pomocą przenośnego światła stroboskopowego na podczerwień i zastosuj trzy lub sześć godzin stymulacji CCA o częstotliwości 10 Hz.

Sprawdzaj stymulację i zwierzę co 30 do 60 minut. Po upływie żądanego okresu CCA wyłącz jednostkę CCA poprzez ekspozycję na światło podczerwone. Szczury poddane siedmiodniowej terapii CCA przez sześć godzin dziennie wykazują zwiększoną biogenezę mitochondriów w stymulowanym mięśniu w porównaniu z niestymulowaną przeciwległą kończyną tylną.

Na ten wzrost biogenezy mitochondriów wskazuje zwiększona ekspresja białka PGC-1 alfa. Badanie przepuszczalnych włókien mięśniowych w celu pomiaru mitochondrialnej wydolności oddechowej ujawnia, że CCA spowodowało wzrost maksymalnej pojemności oddechowej mięśni w stosunku do mięśni kontrolnych. Zarówno populacje mitochondriów podsarkolemmalnych, jak i międzymiofibrylarnych zwiększyły się po siedmiu dniach CCA w porównaniu z kontrolnymi mięśniami niestymulowanymi.

Adaptacje do systemów autofagii i lizosomów mogą być również spowodowane przez CCA. Wzrost obfitości białka czynnika transkrypcyjnego EB, głównego regulatora biogenezy lizosomalnej, obserwuje się po CCA we wszystkich punktach czasowych. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak ogólne wstrzyknięcia podskórne lub dootrzewnowe, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak oszacowanie strumienia autofagii z leczeniem kolchicyną.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zastosować obecny model przewlekłej aktywności skurczowej w celu zbadania zmian fenotypowych mięśni po treningu wytrzymałościowym.