Zastosowanie przewlekłej stymulacji do badania adaptacji fenotypowych mięśni szkieletowych szczurów wywołanych aktywnością skurczową
25 stycznia 2018
Ten protokół opisuje wykorzystanie modelu przewlekłej aktywności skurczowej ćwiczeń do obserwacji wywołanych stymulacją adaptacji mięśni szkieletowych w tylnych kończynach szczura.
Model przewlekłej aktywności skurczowej ćwiczeń jest przydatny do badania adaptacji mięśni szkieletowych do bodźców treningowych in vivo. W szczególności model ten wywołuje adaptacje fenotypowe sześciotygodniowego protokołu treningowego w ciągu siedmiu dni. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie fizjologii mięśni, takie jak biogeneza mitochondriów, autofagia i wiele innych adaptacji komórkowych związanych z ćwiczeniami.
Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na obserwację specyficznych adaptacji mięśni w krótkim czasie siedmiu dni w porównaniu z innymi protokołami treningu fizycznego, które wymagają kilku miesięcy. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię atrofii mięśni w wieku, ponieważ wykazano, że przewlekła stymulacja mięśni ma wpływ na złagodzenie osłabienia mięśni związanego ze starzeniem się. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności z oznaczeniem punktu orientacyjnego wspólnego nerwu strzałkowego i przymocowaniem cewek elektrycznych na obu końcach, ponieważ wymagają one praktyki i precyzji.
Rozpocznij od znieczulenia szczura pod wpływem od jednego do 3% inhalacji izofluranu tlenem i potwierdź pełną sedację, sprawdzając reakcję na uszczypnięcie palca u nogi tylnej kończyny i obserwując głębokość i częstość oddechów. Nałóż lubrykant do oczu na oczy, aby uniknąć wysuszenia i umieść szczura na poduszce grzewczej na niskim lub średnim ustawieniu. Delikatnie ogol lewą tylną kończynę, a także pasek wokół tułowia od tyłu szyi za kończynami przednimi i w poprzek przedniej części klatki piersiowej.
Delikatnie przetrzyj ogolone miejsca jodem i alkoholem etylowym w celu dezynfekcji. Gdy zwierzę leży na brzuchu, użyj sterylnego skalpela z ostrzem numer 10, aby wykonać małe nacięcie o długości około 0,5 centymetra z tyłu szyi pośrodku ogolonego obszaru. Następnie przewróć zwierzę na prawy bok i wykonaj dwu- lub trzycentymetrowe nacięcie w skórze lewej tylnej kończyny między dołeczkiem stawu kolanowego i blisko początku ogona.
Za pomocą zakrzywionych nożyczek chirurgicznych z końcówką wypreparuj obszar podskórny na około 3,5 do czterech centymetrów, oddzielając skórę od leżącego pod nią mięśnia, aby utworzyć kieszeń między otwartą skórą a leżącym pod nią mięśniem. Następnie użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać małe nacięcie mniejsze niż 0,5 centymetra na mięśniu dwugłowym uda, upewniając się, że końcówki nożyczek przecinają bezpośrednio mięsień. Następnie delikatnie otwórz obszar cięcia, aż pojawią się wewnętrzne grupy mięśni i wspólny nerw strzałkowy.
Zachowaj szczególną ostrożność, aby uniknąć przecięcia lub uszkodzenia nerwu. Następnie przygotuj od 50 do 60 centymetrów cienkiego drutu ze stali nierdzewnej pokrytego PTFE i złóż go na pół. Zaczep złożoną część drutu w szczelinie 30-centymetrowego pręta ze stali nierdzewnej.
Użyj pręta, aby przeciągnąć drut przez otwartą kieszeń tylnej kończyny w górę nogi i wzdłuż środka pleców w kształcie litery L, aby dotrzeć do małego obszaru nacięcia z tyłu szyi. Zamocuj okno, otwierając je metalowymi zwijaczami, aż rozmiar okna wyniesie około 1,5 centymetra kwadratowego, a nerw strzałkowy będzie leżał pośrodku okna. Za pomocą skalpela ostrożnie zdejmij końce drutu o 1,5 centymetra.
Owiń odizolowane końce drutu wokół igły o rozmiarze 21 pięć razy, aby utworzyć cewkę. Gdy cewki są już prawidłowo wykonane, zwolnij z nich igłę. Zrób węzeł na samym końcu cewki i zszyj go po lewej stronie nerwu, upewniając się, że cewka znajduje się w odległości od 1,5 do 2,5 milimetra od nerwu.
Aby zabezpieczyć cewkę, załóż dwa lub trzy dodatkowe szwy wzdłuż cewki. Ten krok wymaga znacznej praktyki i cierpliwości, aby uniknąć uszkodzenia nerwu i leżącego poniżej mięśnia oraz osiągnąć wszystkie spójne warunki stymulacji u wszystkich zwierząt. Najlepiej, aby jeden wykwalifikowany badacz wykonał wszystkie zabiegi chirurgiczne podczas badania.
Nałóż dwie lub trzy krople roztworu antybiotyku, a następnie ostrożnie zszyj okienko jedwabiem w rozmiarze 5-0. Luźno nawiń pozostały luz drutu i wepchnij do kieszeni podskórnej nad zszytym nacięciem mięśnia dwugłowego uda nad biodrem. Nałóż dwie do trzech kropli roztworu antybiotyku i zamknij otwartą skórę przez zszycie.
Następnie przesuń zwierzę do pozycji mostkowej i przetnij drucianą pętlę wychodzącą z nacięcia w górnej części szyi, aby utworzyć dwa końce drutu. Za pomocą skalpela oderwij końce drutów o 0,5 centymetra. Odetnij wszelkie postrzępione przewody.
Powoli wepchnij odizolowane części przewodów do otworu w gniazdach pinowych i za pomocą lutownicy przewody do gniazd pinowych. Przełóż końcówki przewodów połączone szpilkami przez sterylną gazikę o średnicy 4.4 centymetra. Następnie przełóż przewody przez otwór w podstawie skrzynki stymulatora.
Włóż kołki do gniazd przyłączeniowych w jednostce CCA. Delikatnie włóż jednostkę CCA do komory za pomocą lepkiego przyklejenia, aby zabezpieczyć jednostkę CCA na dnie komory. Użyj taśmy sportowej lub porowatej taśmy chirurgicznej, aby przymocować komorę wokół ogolonego tułowia.
Zamknij górną część komory trzema warstwami taśmy. I zakończ, owijając taśmę wokół boków pudełka stymulatora, aby zabezpieczyć pudełko. Sprawdź, czy CCA działa, wystawiając urządzenie na pojedynczy impuls światła podczerwonego emitowanego przez przenośne światło stroboskopowe na podczerwień.
Jeśli CCA działa prawidłowo, mięśnie kończyn tylnych kurczą się w odpowiedzi na światło podczerwone. Zważ zwierzęta na krótko przed rozpoczęciem procedury CCA w celu zarejestrowania pomiaru podstawowego, który pomoże zidentyfikować wszelkie poważne stresy lub niekorzystne skutki wynikające ze zmiany masy ciała po procedurze CCA. W dniu stymulacji CCA włącz CCA, wystawiając stymulator na pojedynczy impuls światła podczerwonego za pomocą przenośnego światła stroboskopowego na podczerwień i zastosuj trzy lub sześć godzin stymulacji CCA o częstotliwości 10 Hz.
Sprawdzaj stymulację i zwierzę co 30 do 60 minut. Po upływie żądanego okresu CCA wyłącz jednostkę CCA poprzez ekspozycję na światło podczerwone. Szczury poddane siedmiodniowej terapii CCA przez sześć godzin dziennie wykazują zwiększoną biogenezę mitochondriów w stymulowanym mięśniu w porównaniu z niestymulowaną przeciwległą kończyną tylną.
Na ten wzrost biogenezy mitochondriów wskazuje zwiększona ekspresja białka PGC-1 alfa. Badanie przepuszczalnych włókien mięśniowych w celu pomiaru mitochondrialnej wydolności oddechowej ujawnia, że CCA spowodowało wzrost maksymalnej pojemności oddechowej mięśni w stosunku do mięśni kontrolnych. Zarówno populacje mitochondriów podsarkolemmalnych, jak i międzymiofibrylarnych zwiększyły się po siedmiu dniach CCA w porównaniu z kontrolnymi mięśniami niestymulowanymi.
Adaptacje do systemów autofagii i lizosomów mogą być również spowodowane przez CCA. Wzrost obfitości białka czynnika transkrypcyjnego EB, głównego regulatora biogenezy lizosomalnej, obserwuje się po CCA we wszystkich punktach czasowych. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak ogólne wstrzyknięcia podskórne lub dootrzewnowe, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak oszacowanie strumienia autofagii z leczeniem kolchicyną.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zastosować obecny model przewlekłej aktywności skurczowej w celu zbadania zmian fenotypowych mięśni po treningu wytrzymałościowym.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje wykorzystanie modelu przewlekłej czynności skurczowej aktywności związanej z ćwiczeniami w celu obserwacji adaptacji szkieletowych mięśni indukowanych stymulacją u szczura w tylnej kończynie. Model ten pozwala badaczom na badanie adaptacji fenotypowych szkieletowych mięśni w krótkim okresie czasu, dostarczając wgląd w fizjologię mięśni.
Kluczowe elementy badania
Dział obszaru nauki
- Fizjologia mięśni
- Nauka o ćwiczeniach
- Adaptacje do treningu
Tło
- Model przewlekłej czynności skurczowej jest skuteczny w badaniach in vivo.
- Model ten może ujawnić adaptacje w krótkim okresie czasu, wynoszącym siedem dni.
- Odpowiada na kluczowe pytania dotyczące biogenezy mitochondrialnej i autofagii.
- Przewlekła stymulacja mięśni może pomóc złagodzić osłabienie mięśni związane z wiekiem.
Cel badania
- Obserwacja adaptacji szkieletowych mięśni do bodźców treningowych.
- Badanie wpływu sześ tygodniowego protokołu treningowego w skróconym czasie.
- Poszerzenie wiedzy na temat adaptacji komórkowych związanych z ćwiczeniami.
Wykorzystane metody
- Model przewlekłej czynności skurczowej do stymulacji mięśni.
- Obserwacja adaptacji specyficznych dla mięśni.
- Techniki stymulacji elektrycznej obejmujące nerw piszczelowy wspólny.
- Ocena odpowiedzi mitochondrialnych i autofagicznych.
Główne wyniki
- Obserwowano istotne adaptacje szkieletowych mięśni w ciągu siedmiu dni.
- Stwierdzono wzmożoną biogenezę mitochondrialną w odpowiedzi na stymulację.
- Potwierdzono dowody zmian komórkowych związanych z autofagią.
- Potencjalne implikacje terapeutyczne dla zaniku mięśni związanej z wiekiem.
Wnioski
- Model przewlekłej czynności skurczowej jest cennym narzędziem do badania adaptacji mięśni.
- Krótkotrwałe obserwacje mogą dostarczyć istotnych informacji na temat fizjologii mięśni.
- Dalsze badania mogą zbadać zastosowania terapeutyczne dla osłabienia mięśni.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
The chronic contractile activity model enables rapid assessment of skeletal muscle phenotypic adaptations, providing a compressed timeline for evaluating exercise-induced molecular changes. This approach supports target validation in muscle physiology by isolating contraction-specific effects from systemic confounders, enhancing predictive confidence in preclinical studies of metabolic and atrophy-related pathways. The model’s utility in studying mitochondrial biogenesis and autophagy positions it as a mechanistic de-risking tool for early discovery programs focused on muscle health and aging.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by inducing muscle-specific adaptations independent of humoral or neurological factors.
- Operational Value: Achieves phenotypic changes typically requiring six weeks of training within seven days, accelerating target engagement studies.
- Translational Value: Supports functional validation of targets involved in mitochondrial biogenesis and autophagy pathways relevant to metabolic disease and sarcopenia.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantifiable biological systems with enhanced mitochondrial respiratory capacity and PGC-1α expression for downstream compound screening.
- Reproducibility: Standardized stimulation parameters (10 Hz, 3–6 hours/day) enable consistent induction of subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondrial adaptations.
- Scalability: Surgical implantation of chronic stimulation coils allows for longitudinal monitoring and repeated tissue sampling across study cohorts.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models endurance training adaptations applicable to preclinical evaluation of interventions for muscle atrophy and aging-related weakness.
- Mechanistic De-risking: Permits assessment of autophagy flux and lysosomal biogenesis via TFEB upregulation, supporting target modulation studies.
- Predictive Confidence: Links acute stimulation protocols to chronic adaptive phenotypes, improving translation of exercise-mimetic candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation to preclinical efficacy testing, particularly for programs investigating exercise-mimetic compounds or muscle-specific regulators.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on contraction-induced signaling pathways by isolating direct muscle responses to chronic stimulation.
- Screening: Produces standardized, stimulated muscle tissue suitable for ex vivo assays measuring respiratory capacity and protein markers of adaptation.
- Analytics: Enables quantitative assessment of mitochondrial biogenesis (via PGC-1α) and autophagy (via TFEB) as pharmacodynamic readouts.
- Translational Research: Bridges acute stimulation responses to chronic adaptive states, supporting dose-response modeling in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable surgical and stimulation platform for iterative testing of multiple compounds or genetic manipulations across studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by distinguishing cell-autonomous muscle adaptations from systemic exercise effects.
- Operational Value: Delivers reproducible, time-efficient induction of mitochondrial and lysosomal adaptations, minimizing animal use and study duration.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, contraction-specific phenotypic data before investing in long-term efficacy studies.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates targeting muscle metabolic pathways through rapid validation of target modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent microsurgery, particularly for precise identification and handling of the common peroneal nerve.
- Dependent on specialized instrumentation including stimulator units, infrared activation systems, and soldered wire-electrode interfaces.
- Necessitates cross-team standardization of surgical protocols, stimulation parameters, and tissue harvest timing to ensure inter-animal consistency.
- Involves adaptation considerations when translating the model to different muscle groups or species due to nerve accessibility and coil placement variability.
- Limited by the technical learning curve associated with coil suturing and nerve-proximal electrode placement, which demands consistent operator skill to maintain stimulation fidelity.
