Wykorzystanie mikroskalowych wsporników krzemowych do oceny funkcji kurczliwości komórkowej in vitro
3 października 2014
Ten protokół opisuje użycie mikroskalowych wsporników krzemowych jako giętkich powierzchni hodowlanych do pomiaru kurczliwości komórek mięśniowych in vitro. Skurcz komórkowy powoduje zginanie wspornika, które można zmierzyć, zarejestrować i przekształcić w odczyty siły, zapewniając nieinwazyjny i skalowalny system pomiaru funkcji skurczu in vitro.
Celem poniższego eksperymentu jest pomiar aktywności kurczliwej hodowanych włókien mięśniowych w odpowiedzi na stymulację w kontrolowanym środowisku in vitro. Osiąga się to poprzez posiew zdysocjowanych komórek mięśniowych na mikroskalowych krzemowych wspornikach i indukowanie fuzji tych komórek jednojądrowych w celu utworzenia włókien zwanych rurkami mięśniowymi. Te chipy wspornikowe podtrzymujące zróżnicowane komórki mięśniowe są następnie przenoszone do mikroskopu elektrofizjologicznego zmodyfikowanego w celu obsługi detektora laserowego i fotograficznego używanego do pomiaru ugięcia wspornika w odpowiedzi na skurcz mięśni po umieszczeniu chipa w platformie.
Laser jest ustawiony tak, aby skupiał się na końcówce wspornika, a fotodetektor jest również ustawiony tak, aby wyłapywał odchyloną wiązkę Uzyskuje się wyniki, które pokazują stopień ugięcia wspornika, które jest spowodowane skurczem mięśni w odpowiedzi na obróbkę elektryczną lub chemiczną, zapewniając bezpośredni pomiar profilu skurczu wysiewanych komórek w czasie rzeczywistym. Ostatecznie przemieszczenie wspornika może być przetworzone w celu zapewnienia odczytu siły. System ten jest multipleksowany, aby zapewnić potencjalne stanowisko testowe o wysokiej przepustowości do oceny zmian funkcji skurczu w odpowiedzi na leczenie farmakologiczne, chorobę, stan lub protokoły ćwiczeń.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak elektrofizjologia z klamrą krosową, jest to, że ta metoda analizy funkcjonalnej jest nieinwazyjna i łatwa do dostosowania do badań o wysokiej przepustowości. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie opracowywania leków, takie jak identyfikacja odpowiednich stężeń dawka-odpowiedź przed oceną kliniczną. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię wielu chorób mięśniowych, ponieważ zapewnia ona środki do badania funkcjonalnej wydajności komórek z różnych patologicznych fenotypów Jednak w czasie rzeczywistym metoda ta może zapewnić wgląd w patologie mięśni szkieletowych.
Może być również stosowany do innych układów tkankowych, takich jak serce i mięśnie gładkie Wysterylizowane, wcześniej przygotowane wióry wspornikowe i szkiełka nakrywkowe 13 F w 70% roztworze etanolu i pozostawione do wyschnięcia na powietrzu w okapie przepływowym. Następnie umieść pojedyncze wióry wspornikowe na 13 szkiełkach nakrywkowych F. Wewnątrz standardowej płytki 12-dołkowej pokryj wsporniki biopolimerem lub modyfikacją powierzchni zoptymalizowaną pod kątem używanego typu komórki Zgodnie ze standardowymi protokołami hodowli komórkowych, powlekanie powierzchni zajmuje 30 minut przy użyciu naszej metody przygotowania, ale może ulec zmianie w zależności od konkretnego protokołu hodowli badacza.
Reese umieścił komórki w ich specyficznym pożywce wzrostowej do pożądanego stężenia, a następnie sto mikrolitrów zawiesiny komórkowej na powierzchni chipa wspornikowego, zapewniając, że pęcherzyk pożywki całkowicie pokrywa okna wspornikowe. Przenieść płytkę zawierającą wióry do inkubatora i pozostawić komórki do przylegania przez co najmniej godzinę po upływie tego okresu posiewu. Użyj sterylnych kleszczyków, aby przenieść chip do czystej studzienki bez szkiełka nakrywkowego 13 F i dodaj do każdego mililitr pożywki wzrostowej.
Dobrze włóż płytkę z powrotem do inkubatora, utrzymuj komórki zgodnie z ich standardowym protokołem konserwacji in vitro. Na szkiełkach nakrywkowych umieścić rozgrzane naczynie hodowlane na stoliku pionowego mikroskopu elektrofizjologicznego. Dodaj trzy mililitry obecnej pożywki do karmienia komórek do podgrzanego mikroskopu.
Elektrody ze stali nierdzewnej do montażu scenicznego po wewnętrznej stronie podgrzewanej naczynia hodowlanej w odległości 15 milimetrów. Podłącz je do generatora impulsów zdolnego do wytwarzania stymulacji polowej, impulsów o różnym natężeniu, częstotliwości i kształcie fali, aby umożliwić systemowi stymulację polową komórek, gdy jest to właściwe. Przykręć helowo-neonowy laser zamontowany na stopniach translacyjnych XY do spodu stołu mikroskopu.
Następnie wyreguluj laser tak, aby wiązka lasera była kierowana przez podstawę podgrzewanej naczynia hodowlanej pod kątem 30 stopni w stosunku do płaszczyzny wspornika. Następna śruba, kwadrantowy moduł fotodetektora zamontowany na stopniach translacyjnych XY do spodu stolika mikroskopu. Dostosuj jego położenie tak, aby odbita wiązka lasera wylądowała w środku czterech kwadrantów.
Napisz program do sterowania siłownikami liniowymi, które skanują w poprzek wsporników w odniesieniu do schematu blokowego dostarczonego w protokole tekstowym. Włącz sprzęt do analizy wspornikowej i powiązane z nim oprogramowanie. Włóż podgrzany stage do mrta do pożywki i poczekaj, aż odczyta 37 stopni Celsjusza.
Następnie włóż wiór wspornikowy do stolika z wspornikami skierowanymi w prawą stronę stolika. Włącz źródło światła mikroskopu. Ustaw ostrość mikroskop, aby wyświetlić krawędzie wsporników i użyj oprogramowania sterującego laserowym detektorem zdjęć, aby ustawić wiązkę laserową na końcówce wspornika, zakładając, że wsporniki są zorientowane po prawej stronie wspornika stolika.
Jeden to ten umieszczony w lewym górnym rogu tablicy, a liczby są sprowadzone do 16. W lewym dolnym rogu. Cantilever 17 znajduje się w prawym górnym rogu i biegnie do 32.
W prawym dolnym rogu naciśnij przycisk odtwarzania w oprogramowaniu do nagrywania. Ustaw fotodetektor tak, aby sygnał wskazywał zero zarówno w ramce x, jak i y, regulując silniki krokowe sterujące fotodetektorem. Następnie ustaw wspornik o jedną pozycję w oprogramowaniu sterującym laserowym detektorem zdjęć.
Następnie przesuń laser na końcówkę wspornika 16. Powtórz pozycjonowanie fotodetektora i ustaw pozycję wspornika 16 w oprogramowaniu sterującym laserowym detektorem zdjęć. Teraz przesuń laser na końcówkę cantilever 32.
Powtórz pozycjonowanie fotodetektora i ustaw pozycję wspornika 32 w oprogramowaniu sterującym laserowym detektorem zdjęć. Na koniec przenieś laser na końcówkę cantilever 17. Powtórz pozycjonowanie fotodetektora i ustaw pozycję wspornika 17 w oprogramowaniu sterującym laserowym detektorem zdjęć.
Wyłącz źródło światła mikroskopu, a następnie górne światło w laboratorium. Naciśnij przycisk nagrywania w oprogramowaniu do nagrywania. Ustaw sprzętowy generator impulsów na 40 milisekund i pięć impulsów woltowych, częstotliwość jednego herca.
Następnie włącz maszynę Korzystając z oprogramowania sterującego laserowym wykrywaczem zdjęć, ustaw sprzęt tak, aby skanował w poprzek 32 wsporników. Zatrzymując się na pięć sekund przy każdym z nich. Po zakończeniu skanowania 32 wsporników wyłącz stymulator.
Następnie zatrzymaj oprogramowanie nagrywające i wyświetl plik danych. Zbadaj zarejestrowaną ścieżkę z każdego wspornika. Dla dowodów na aktywność skurczową.
Skurcz jest definiowany jako szczyt. Jeśli ugięcie wynosi co najmniej 0,1 V powyżej linii podstawowej, zanotuj każdy wspornik z pozytywnymi odpowiedziami. Usuń wszystkie niereagujące wsporniki z protokołu skanowania w oprogramowaniu sterującym laserowym detektorem zdjęć.
Aktywne wsporniki mogą być następnie ponownie skanowane bez stymulacji w celu uzyskania odczytu spontanicznej aktywności skurczowej komórki. Następnie dodaj związek terapeutyczny do pożywki, aby zaobserwować jego wpływ na funkcjonalną wydajność hodowanych komórek. Po dodaniu skanów złożonych ze stymulacją elektryczną w szerokim polu lub bez niej, należy przeprowadzić ocenę zmęczenia poprzez stymulację elektryczną komórek przez dłuższy czas, a następnie skanowanie poziomów kurczliwości, aby zmierzyć, ile czasu potrzeba, aby siła szczytowa spadła poniżej określonego progu.
W eksperymentach, w których neurony ruchowe są utrzymywane we współkulturze z tworzeniem połączeń nerwowo-mięśniowych w mięśniach poprzez traktowanie kultur kantylowych kantylowych neuronów neuro myo rurkowych za pomocą stymulantu neuronalnego lub inhibitora synaptycznego i skanowanie w poszukiwaniu wzrostów i spadków spontanicznej aktywności, przystąp do analizy danych dotyczących ugięcia kantyla, jak wyszczególniono w protokole tekstowym. Skuteczna hodowla komórek kurczliwych na wspornikach jest stosunkowo prostą procedurą przy użyciu standardowych technik hodowli komórkowych. Standardowe oprogramowanie elektrofizjologiczne może być wykorzystane do analizy surowych danych, ułatwiając obliczenie odpowiednich właściwości funkcjonalnych, takich jak czas siły szczytowej do siły szczytowej i czas do połowy relaksacji.
Rozszerzone protokoły stymulacji zapewniają środki do oceny wskaźników zmęczenia w hodowanych komórkach, poszerzając w ten sposób poziom danych fizjologicznych możliwych do uzyskania z tego systemu. System hodowli wspornikowej może być zmodyfikowany w taki sposób, aby obejmował neurony ruchowe w systemie hodowli z rurkami mięśniowymi mięśni szkieletowych, tak aby umożliwić ocenę tworzenia synaps nerwowo-mięśniowych in vitro. W takich kulturach wskaźniki spontanicznej aktywności skurczowej są porównywane ze wskaźnikami skurczu w odpowiedzi na leczenie stymulantem specyficznym dla neuronów, takim jak glutaminian.
Wszelkie zaobserwowane wzrosty szybkości skurczu wywołane glutaminianem sugerują aktywację hodowanych neuronów prowadzącą do uwolnienia acetylocholiny, a następnie aktywacji rurki mięśniowej Leczenie inhibitorami synaptycznymi, takimi jak bloker receptora acetylocholiny, dtu ryna, które prowadzą do ustania aktywności indukowanej glutaminianem, dostarcza dalszych dowodów na obecność funkcjonalnych synaps nerwowo-mięśniowych w tych kulturach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać wsporników krzemowych w mikroskali do oceny właściwości funkcjonalnych hodowanych mięśni szkieletowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje zastosowanie mikroskalowych wsporników krzemowych jako elastycznych powierzchni hodowlanych do pomiaru kurczliwości komórek mięśniowych in vitro. Skurcz komórkowy powoduje ugięcie wspornika, które można zmierzyć i przeliczyć na odczyty siły, co zapewnia nieinwazyjny system oceny funkcji skurczowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Elektrofizjologia
Wstęp
- Włókna mięśniowe mogą być hodowane in vitro do analiz eksperymentalnych.
- Mikroskalowe belki wspornikowe stanowią nowatorską metodę pomiaru skurczu mięśni.
- Pomiar aktywności kurczliwej w czasie rzeczywistym jest kluczowy dla zrozumienia fizjologii mięśni.
- Metoda ta umożliwia wysokoprzepustowe badanie funkcji mięśni.
Cel badania
- Pomiar aktywności kurczliwej hodowanych włókien mięśniowych.
- Ocena odpowiedzi komórek mięśniowych na stymulację elektryczną lub chemiczną.
- Opracowanie skalowalnego systemu do oceny kurczliwości mięśni.
Zastosowane metody
- Rozdzielone komórki mięśniowe wysiewa się na mikroskalowe wsporniki krzemowe.
- Indukuje się fuzję komórek w miotuby w celu pomiaru kurczliwości.
- Chip z wspornikami umieszcza się w mikroskopie elektrofizjologicznym z laserem i fotodetektorem.
- Ugięcie wspornika jest mierzone w odpowiedzi na skurcz mięśnia.
Główne wyniki
- Wyniki wskazują, że stopień ugięcia wspornika koreluje z kurczliwością mięśni.
- Dane w czasie rzeczywistym dostarczają informacji na temat profilu skurczu komórek mięśniowych.
- System umożliwia multipleksową ocenę funkcji skurczowej.
- Potencjalne zastosowania obejmują ocenę efektów leczenia farmakologicznego oraz protokołów ćwiczeń.
Wnioski
- Metoda ta oferuje nieinwazyjne podejście do badania kurczliwości mięśni.
- Stanowi ona platformę do wysokoprzepustowej analizy funkcji mięśni.
- Uzyskane wyniki mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia fizjologii i patologii mięśni.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Mikroskalowe systemy krzemowych belek wspornikowych umożliwiają nieinwazyjny pomiar funkcji skurczowej komórek w czasie rzeczywistym, stanowiąc predykcyjną platformę in vitro do oceny skuteczności i toksyczności leków w tkankach mięśniowych. Podejście to wspiera wczesną walidację celów terapeutycznych oraz identyfikację związków wiodących poprzez dostarczanie ilościowych, powtarzalnych danych na temat reakcji skurczowych na zaburzenia farmakologiczne lub genetyczne. Projekt macierzy z multipleksowaniem ułatwia przesiewy o średniej i wysokiej przepustowości, co usprawnia selekcję portfolio i zmniejsza ryzyko biologiczne na późnych etapach opracowywania terapii w obszarze mięśni nerwowo-mięśniowych, sercowych i gładkich.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez pomiar bezpośrednich wyników funkcjonalnych komórek mięśni szkieletowych, serca i mięśni gładkich w odpowiedzi na stymulację.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki precyzyjnej, bezznakowej kwantyfikacji aktywności skurczowej jako odczytu fenotypowego zaangażowania celu.
- Wartość prognostyczna: Generuje dane dotyczące zależności dawka-odpowiedź oraz kinetyki, które stanowią podstawę optymalizacji związków wiodących i przedklinicznych decyzji go/no-go.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Zapewnia ustandaryzowane i powtarzalne pomiary kurczliwości w multipleksowych macierzach wsporników, co pozwala na spójną ocenę związków.
- Skalowalność: Umożliwia stosowanie protokołów o średniej i wysokiej przepustowości do oceny zmian w funkcji kurczliwej wywołanych przez leki, co zwiększa efektywność kampanii przesiewowych.
- Jakość danych: Dostarcza odczyty siły w czasie rzeczywistym, oparte na ugięciu, co redukuje zmienność i zwiększa pewność w określaniu zależności struktura-aktywność.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Modelowanie chorób: umożliwia ocenę dysfunkcji skurczowej w komórkach o fenotypach patologicznych, wspierając przesiew fenotypowy w kierunku chorób nerwowo-mięśniowych i innych schorzeń mięśni.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: ułatwia ocenę tworzenia połączeń nerwowo-mięśniowych oraz komunikacji neuron-mięsień w systemach kokultur, dostarczając danych do walidacji mechanizmu celu.
- Ciągłość translacyjna: łączy etap odkrywania z walidacją przedkliniczną poprzez umożliwienie podłużnej oceny wydajności skurczowej w warunkach zmęczenia, stymulacji lub ekspozycji na związki chemiczne.
Integracja potoków i przepływów pracy
System wspornikowy integruje się z procesem odkrywania leków, od wczesnej walidacji celu, przez identyfikację związków wiodących, aż po ocenę przedkliniczną, oferując funkcjonalną platformę fenotypową, która uzupełnia biochemiczne i genetyczne podejścia przesiewowe.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez powiązanie zaburzeń genetycznych lub farmakologicznych z mierzalnymi zmianami w kurczliwości komórkowej.
- Przesiewanie: Umożliwia standaryzację i powtarzalność testów dzięki multipleksowym pomiarom ugięcia, co wspiera niezawodne przesiewanie bibliotek związków.
- Analityka: Dostarcza danych ilościowych, w tym siłę szczytową, czas do osiągnięcia szczytu oraz kinetykę relaksacji, co pomaga w porównywaniu skuteczności związków i ich mechanizmu działania.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość przedkliniczną poprzez modelowanie fenotypów kurczliwych istotnych dla danej choroby oraz ocenę skuteczności terapeutycznej w modelach opartych na mięśniach.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi wielokrotnego użytku, adaptowalną metodę applicable dla różnych typów komórek mięśniowych i modeli chorób, co ogranicza redundantny rozwój testów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celu poprzez pomiar funkcjonalnych, fizjologicznych punktów końcowych zamiast markerów zastępczych.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację dzięki zautomatyzowanej detekcji ugięcia laserowego oraz formatom macierzy multipleksowych.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną funkcjonalną selekcję związków, co zmniejsza inwestycje w wyniki fałszywie dodatnie.
- Wpływ na portfolio: Wspiera decyzje o dalszym rozwoju skorygowane o ryzyko, dostarczając wglądu mechanistycznego w kwestie wydolności skurczowej lub skuteczności przed badaniami in vivo.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórkowej, różnicowaniu mięśni oraz mikroskopii kompatybilnej z elektrofizjologią.
- Zależność od aparatury laserowej i fotodetektorów, stołów translacyjnych XY oraz sprzętowych generatorów impulsów do stymulacji i pomiarów.
- Konieczność międzyzespołowej standaryzacji wysiewu komórek, powlekania powierzchni i protokołów stymulacji w celu uzyskania powtarzalnych wyników w różnych ośrodkach.
- Adaptacja do różnych typów mięśni (szkieletowych, sercowych, gładkich) może wymagać optymalizacji powłok powierzchniowych i warunków hodowli.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność precyzyjnego ustawienia komponentów optycznych oraz potencjalny dryft sygnału podczas długotrwałych zapisów, zgodnie z treścią protokołu.
