Bezwzględna kwantyfikacja poziomów mikroRNA w osoczu u małp Cynomolgus przy użyciu ilościowego PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar bezwzględnych poziomów mikroRNA w osoczu za pomocą ilościowego PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym. Metoda ta może pomóc w ocenie ilości mikroRNA w osoczu, nawet jeśli ich poziom ekspresji jest niski. Główną zaletą tej techniki jest to, że zmierzone dane można porównać z innymi z różnych badań lub laboratoriów.

Implikacje tej techniki rozciągają się na próbki innych gatunków, ponieważ krzywa standardowa może być generowana przy użyciu syntetycznego RNA lub nukleotydu. Metoda ta może zapewnić wgląd w badania translacyjne w celu zbadania obiecujących biomarkerów bezpieczeństwa. Najpierw rozmrozić zamrożone próbki osocza uzyskane z żyły udowej małp Cynomolgus na lodzie.

Przenieś odczynnik do lizy w chloroformie na lodzie w celu schłodzenia przed ekstrakcją RNA. Następnie dodaj 1 000 mikrolitrów odczynnika do lizy do 200 mikrolitrów próbki. I wiruj przez minutę, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie.

Następnie dodaj do próbki pięć mikrolitrów pięciu nanomolowych syntetycznych mikroRNA Caenorhabditis elegans i 200 mikrolitrów chloroformu. Wirować próbkę przez jedną minutę, aby odpowiednio wymieszać. Następnie umieść próbkę na lodzie na dwie do trzech minut.

Następnie odwirować próbkę w temperaturze 12 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie ostrożnie przenieś 650 mikrolitrów fazy wodnej do nowej mikroprobówki. Następnie dodaj 975 mikrolitrów etanolu do fazy wodnej i kilkakrotnie odpipetuj pipetą, aby zapewnić całkowite wymieszanie.

Przenieść próbkę do odpowiedniej kolumny i adaptera, a następnie suszyć próżniowo przez trzy minuty za pomocą kolektorów próżniowych. Następnie dodaj 200 mikrolitrów etanolu do kolumny i susz próżniowo przez jedną minutę. Po wysuszeniu próżniowym dodać 800 mikrolitrów buforu RWT do kolumny i ponownie suszyć próżniowo przez dwie minuty.

Następnie dodaj 800 mikrolitrów buforu RPE do kolumny i odkurzaj do suszenia przez dwie minuty. Dwukrotnie dodaj bufor RPE, a następnie wysusz próżniowo. Następnie dodaj 300 mikrolitrów etanolu do kolumny.

Po dodaniu etanolu suszyć próżniowo przez jedną minutę. Następnie przenieś kolumnę do nowej mikroprobówki i odwiruj ją w temperaturze 12 000 G w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Po odwirowaniu przenieś kolumnę do nowej mikroprobówki i dodaj do niej 50 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz

Pozostawić kolumnę w temperaturze pokojowej na trzy minuty, a następnie odwirować w temperaturze pokojowej 8 000 G przez jedną minutę. Na koniec przechowuj eluat w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu użycia. Aby przygotować stężenie syntetycznego oligonukleotydu RNA, które odpowiada docelowemu mikroRNA, należy rozcieńczyć roztwór podstawowy 10-krotnie, aby uzyskać roztwór roboczy o najwyższym stężeniu do wykreślenia krzywych wzorcowych.

Następnie, aby utworzyć multipleksową pulę starterów odwrotnej transkrypcji, wymieszaj równe objętości starterów o sile 20 dla docelowych mikroRNA. Następnie przygotuj mieszaninę reakcji odwrotnej transkrypcji. Następnie dodaj 10 mikrolitrów mieszaniny reakcji odwrotnej transkrypcji do pięciu mikrolitrów próbki RNA.

Wymieszaj je kilkakrotnie pipetując. Następnie inkubuj mieszaninę na lodzie przez pięć minut. Po umieszczeniu próbki w termocyklerze rozpocznij cykl.

Po zakończeniu programu przechowuj odwróconą transkrypcję próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby utworzyć pulę starterów do testów multipleksowych, dodaj równe objętości pięciu mikrolitrów starterów do testów odpowiadających docelowym mikroRNA do probówki zawierającej bufor Tris-EDTA w końcowej objętości 1 000 mikrolitrów. Następnie należy utworzyć mieszaninę reakcji przed amplifikacją.

Po zakończeniu mieszaniny reakcyjnej przenieś 22,5 mikrolitra mieszaniny reakcyjnej przed amplifikacją do dwóch pięciu mikrolitrów próbki z odwróconą transkrypcją. Następnie pipetować, aby wymieszać próbkę i dokładnie wymieszać wzorzec wstępnej amplifikacji i inkubować na lodzie przez pięć minut, a następnie pozostawić probówki PCR w termocyklerze i rozpocząć bieg. Po zakończeniu programu przenieś wszystkie próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Po rozmrożeniu wstępnie amplifikowanych lub nieamplifikowanych próbek, należy je rozcieńczyć pięciokrotnie sterylną wodą. Aby wygenerować krzywą standardową, wykonaj 10-krotne seryjne rozcieńczanie próbek pochodzących z syntetycznych oligonukleotydów RNA. Następnie należy przygotować ilościową mieszaninę reakcyjną PCR w probówce trzymanej na lodzie.

Następnie dodaj 18 mikrolitrów z ilościowej mieszaniny reakcyjnej PCR do szybkich optycznych 96-dołkowych płytek reakcyjnych. Następnie dodaj dwa mikrolitry rozcieńczonych próbek do studzienek. Po uszczelnieniu płytki folią samoprzylepną krótko odwirować próbkę o stężeniu 500 G przez 15 sekund.

Następnie uruchom program Thermocycler w czasie rzeczywistym. Użyj oprogramowania SDS w wersji 2.4, które współpracuje z odpowiednim termocyklerem w czasie rzeczywistym, aby obliczyć liczbę nieprzetworzonych kopii każdej próbki. Następnie oblicz bezwzględną liczbę kopii na podstawie liczby kopii surowej za pomocą oprogramowania Excel.

Wydajność amplifikacji miR-122, miR-192 i miR-133a analizowano poprzez wykreślanie krzywych standardowych, co wyjaśnia zależność między stężeniem logarytmicznym a cyklem kwantyfikacji dla próbek bez wstępnej amplifikacji. Krzywe wzorcowe dla miR-122, miR-192 i miR-133a pokazują liniową zależność między cyklami kwantyfikacji a stężeniem logarytmicznym próbek. Następnie przeanalizowano wydajność amplifikacji miR-1, miR-499a i miR-206 poprzez wykreślenie krzywych standardowych dla wstępnie amplifikowanych próbek.

Aby przeanalizować wydajność wzmocnienia, nachylenie obliczono za pomocą regresji liniowej. Nachylenie krzywej standardowej A pokazuje brak specyficznych amplikonów przy stężeniu 1 000 kopii na mikrolitr dla miR-499a i miR-206. Jednak niespecyficzne amplikony uzyskano w ilości 1000 kopii na mikrolitr dla miR-1.

W tym przypadku nieamplifikowane i wstępnie amplifikowane próbki miR-206 zostały użyte w duplikatach do wyprowadzenia wykresów amplifikacji. Wartości cyklu kwantyfikacji dla miR-206 bez wstępnej amplifikacji i wstępnie amplifikowanej oszacowano na 39,9, plus lub minus jeden punkt dziewiąty i 27,0, plus lub minus odpowiednio dwa punkty dwa, reprezentujące prawie podobne wartości między duplikatami, jak pokazano na wykresach. Następnie mikroRNA osocza uzyskane od małp Cynomolgus poddano profilowaniu w celu obliczenia ich wartości bezwzględnych.

Wykresy punktowe, uzyskane z profilowania mikroRNA reprezentującego ich poziomy ekspresji, pokazują, że miR-122, miR-133a i miR-192 są wykrywalne bez wstępnej amplifikacji. Natomiast miR-1, miR-206 i miR-499a będą wymagały wstępnego wzmocnienia ze względu na niskie poziomy ekspresji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć bezwzględne poziomy mikroRNA w osoczu za pomocą RT-qPCR.

I pre-amplifikacja; jest to przydatne do poprawy wykrywania małych ilości mikroRNA.