Name: Bezwzględna kwantyfikacja poziomów mikroRNA w osoczu u małp Cynomolgus przy użyciu ilościowego PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Poznaj metodę bezwzględnej kwantyfikacji mikroRNA w osoczu u małp Cynomolgus przy użyciu ilościowego PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym. Technika ta umożliwia wykrywanie niskich poziomów ekspresji i porównywanie wyników między laboratoriami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie nie otrzymało żadnego konkretnego grantu od agencji finansujących w sektorze publicznym, komercyjnym lub non-profit.

Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Daiichi Sankyo Co., Ltd.
1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Pobrać krew (co najmniej 0,5 ml) z żyły udowej małp cynomolgus do probówek zawierających EDTA 2K. 
	UWAGA: Cytrynian i heparyna są niedopuszczalne, ponieważ te antykoagulanty hamują późniejsze PCR14,15.</li>
	<li>Pobrane próbki należy natychmiast umieścić na lodzie i poddać izolacji plazmowej w ciągu 2 godzin od pobrania.</li>
	<li>Odwirować próbki przy 10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Przenieść supernatant do mikroprobówki o pojemności 2 ml, a następnie odwirować przy 16 000 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut w celu usunięcia resztek komórek i resztek płytek krwi. 
	UWAGA: Na kwantyfikację miRNA może mieć znaczący wpływ zanieczyszczenie płytek krwi16.</li>
	<li>Umieścić 200 μl podwielokrotności supernatantu w świeżych mikroprobówkach o pojemności 2 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia. 
	UWAGA: Do ekstrakcji RNA wykorzystuje się ustaloną objętość każdej próbki; W związku z tym objętość podwielokrotności musi być dokładna.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja RNA
<ol>
	<li>Zamrożone próbki rozmrozić na lodzie (od kroku 1.5).
	<ol>
		<li>Utrzymuj próbkę w chłodzie na lodzie podczas ekstrakcji RNA. Przed użyciem schłodzić odczynnik do lizy i chloroform na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 5 objętości (1000 μl) odczynnika do lizy, zawierającego jednofazowy roztwór fenolu i izotiocyjanianu guanidyny, do próbki (200 μl) i energicznie mieszać przez wirowanie przez 1 min.</li>
	<li>Dodać 5 μl syntetycznego miRNA Caenorhabditis elegans o długości 5 nM (Syn-cel-miR-238-3p).</li>
	<li>Dodać 1 objętość (200 μl) chloroformu i energicznie mieszać przez wirowanie przez 1 minutę.</li>
	<li>Przechowywać na lodzie przez 2 do 3 minut, a następnie odwirować próbki w temperaturze 12 000 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Ostrożnie przenieść fazę wodną do nowej mikroprobówki. 
	UWAGA: Nie przenosić żadnej fazy organicznej (czerwonej) ani międzyfazowej (białej). Objętość pobranej fazy wodnej powinna być jednolita, aby uniknąć niespójności obchodzenia się z wodą, która skutkuje zwiększoną zmiennością techniczną. Zwykła ilość przenoszonej fazy wodnej w tym protokole wynosiła 650 μL.</li>
	<li>Dodać 1,5 objętości (975 μl) etanolu i dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Przenieść próbkę do odpowiedniej kolumny i adaptera, a następnie suszyć próżniowo przez 3 minuty za pomocą kolektorów próżniowych. Jeśli objętość próbki jest większa niż 700 μl, powtórz ten krok, aby przetworzyć pozostały roztwór. 
	UWAGA: Izolacja RNA oparta na kolumnach jest kompatybilna z metodą próżniową i wirowania.</li>
	<li>Dodać 200 μl etanolu do kolumny, a następnie suszyć próżniowo przez 1 minutę.</li>
	<li>Dodać 800 μl buforu RWT do kolumny, a następnie suszyć próżniowo przez 2 minuty.</li>
	<li>Dodać 800 μl buforu RPE do kolumny, a następnie suszyć próżniowo przez 2 minuty.</li>
	<li>Powtórz krok 2.11.</li>
	<li>Dodać 300 μl etanolu do kolumny, a następnie suszyć próżniowo przez 1 min.</li>
	<li>Umieścić kolumnę na nowej mikroprobówce i odwirować przy 12 000 x g w temperaturze pokojowej (15 do 25 °C) przez 1 minutę.</li>
	<li>Przenieś kolumnę do nowej mikroprobówki i dodaj 50 μl wody wolnej od nukleaz.</li>
	<li>Odstawić w temperaturze pokojowej (15 do 25 °C) na 3 minuty i odwirować przy 8 000 × g w temperaturze pokojowej (15 do 25 °C) przez 1 minutę.</li>
	<li>Ponownie nanieść eluat na kolumnę.</li>
	<li>Powtórzyć krok 2.16 i przechowywać eluat w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
3. Synteza cDNA
<ol>
	<li>Rozmrozić zamrożone próbki (od kroku 2.18).</li>
	<li>Przygotuj znane stężenie syntetycznych oligonukleotydów RNA, które odpowiadają docelowym miRNA.
	<ol>
		<li>Użyj syntetycznego oligonukleotydu RNA do wygenerowania krzywej wzorcowej w qPCR. Do celów przechowywania przygotowuje się roztwór podstawowy o stężeniu 1 x 108 kopii/μl.</li>
		<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy 10-krotnie, aby otrzymać roztwór roboczy 1 x 107 kopii/μl (próbki nie amplifikowane) lub 1 x 105 kopii/μl (próbki wstępnie amplifikowane) jako najwyższe stężenie do skonstruowania krzywej wzorcowej. Ogólnie rzecz biorąc, sugerowany zakres stężeń krzywej wzorcowej wynosi 1 x 107 do 1 x 102 kopii/μl (próbki nie amplifikowane) lub 1 x 105 do 1 x 100 kopii/μl (próbki wstępnie amplifikowane).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj pulę starterów multipleksu RT, mieszając równe objętości 20 starterów RT dla docelowych miRNA. 
	UWAGA: Jak pokazano w Rysunek 2, pulę zawierającą do 4 docelowych miRNA można utworzyć przez zmieszanie 20x starterów RT każdego z miRNA w puli. Cel-miR-238 (kontrola zewnętrzna) musi być włączony jako jeden z docelowych miRNA w każdej probówce. W przypadku mniej niż 4 docelowych miRNA należy dodać równe objętości buforu 1/10 TE zamiast 20x startera RT.</li>
	<li>Przygotuj mieszaninę reakcyjną RT: 3 μl puli starterów RT (z kroku 3.3), 0,15 μl 100 mM dNTP z dTTP, 1 μl odwrotnej transkryptazy (50 U/μL), 1,5 μl buforu 10x RT, 0,19 μl inhibitora RNazy (20 U/μL) i 4,16 μl wody wolnej od nukleaz</li>.
	<li>Zmieszać 10 μl mieszanki reakcyjnej RT z 5 μl próbki RNA (z etapu 3.1) lub oligonukleotydów (z etapu 3.2) za pomocą pipetowania i inkubować na lodzie przez 5 minut.</li>
	<li>Przeprowadzić odwrotną transkrypcję na termocyklerze: 16 °C przez 30 minut, 42 °C przez 30 minut, a następnie końcowy etap inaktywacji odwrotnej transkryptazy w temperaturze 85 °C przez 5 minut. Próbki z odwrotną transkrypcją należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia.</li>
</ol>
4. Przedwzmacniacz (opcjonalnie)
UWAGA: miRNA, które wykazują wartości Cq powyżej 35 lub więcej w kolejnych qPCR, są wstępnie amplifikowane.
<ol>
	<li>Rozmrozić zamrożone próbki (od kroku 3.6).</li>
	<li>Wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenia produktu RT z syntetycznych oligonukleotydów RNA; 1 x 105 do 1 x 100 kopii/μl w celu wygenerowania krzywej wzorcowej.</li>
	<li>Przygotować pulę starterów do testów multipleksowych, mieszając równe objętości (5 μl) 20-krotnych starterów testowych dla docelowych miRNA, przy czym końcowe stężenie każdego startera testowego rozcieńcza się 200-krotnie buforem TE w końcowej objętości 1,000 μL. 
	UWAGA: Startery testowe, których docelowe miRNA mogą być wykrywalne w kolejnych qPCR bez wstępnej amplifikacji, oraz te dla cel-miR-238 (kontrola zewnętrzna) nie są włączone do puli starterów.</li>
	<li>Przygotuj mieszaninę reakcyjną przed amplifikacją: 12,5 μl 2x gotowego do użycia odczynnika do preamplifikacji, 3,75 μl puli starterów do oznaczania (od kroku 4.3) i 6,25 μl wody wolnej od nukleaz.</li>
	<li>Zmieszać 22,5 μl mieszaniny reakcyjnej przed amplifikacją z 2,5 μl próbki z odwrotną transkrypcją (z etapu 4.1) lub oligonukleotydów (z etapu 4.2) przez pipetowanie i inkubować na lodzie przez 5 minut.</li>
	<li>Przeprowadzić reakcję na termocyklerze: 95 °C przez 10 minut, a następnie 12 cykli w temperaturze 95 °C przez 15 s i 60 °C przez 4 minuty. Przechowywać wstępnie amplifikowane próbki w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
5. Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)
<ol>
	<li>Rozmrozić zamrożone próbki (z kroku 3.6 lub kroku 4.6).</li>
	<li>Rozcieńczyć próbki 5-krotnie sterylną wodą.</li>
	<li>Przygotować 10-krotne seryjne rozcieńczenia produktu RT pochodzącego z syntetycznych oligonukleotydów RNA; 1 x 107 do 1 x 102 kopie/μl (próbki nieamplifikowane) lub 1 x 105 do 1 x 100 kopii/μl (próbki wstępnie amplifikowane) w celu wygenerowania krzywych wzorcowych.</li>
	<li>Przygotuj mieszaninę reakcyjną qPCR: 10 μl 2x gotowego do użycia odczynnika do amplifikacji, 1 μl 20x odczynnika do oznaczania, zawierającego starter do PCR do przodu/do tyłu i sondę odpowiadającą docelowemu miRNA oraz 7 μl wody wolnej od nukleaz.</li>
	<li>Przenieść 18 μl z mieszaniny reakcyjnej qPCR na szybkie optyczne 96-dołkowe płytki reakcyjne i dodać 2 μl rozcieńczonych próbek (z kroku 5.2 lub kroku 5.3) do studzienek. 
	UWAGA: Próbki i wzorce do qPCR są zestawione w dwóch egzemplarzach.</li>
	<li>Uszczelnij płytkę folią samoprzylepną i krótko odwiruj.</li>
	<li>Uruchom reakcję na termocyklerze w czasie rzeczywistym: 95 °C przez 20 s, a następnie 45 cykli po 95 °C przez 1 s i 60 °C przez 20 s.</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Oblicz nieprzetworzoną liczbę kopii każdej próbki za pomocą oprogramowania do analizy danych, które współpracuje z odpowiednim termocyklerem w czasie rzeczywistym. 
	UWAGA: Linia progowa jest ustawiana ręcznie na "1.0" we wszystkich płytkach w badaniu, aby potwierdzić odtwarzalność w porównaniu z ich wartościami Cq. Poziom odcięcia jest ustawiony na Cq >40 cykli.</li>
	<li>Obliczyć średnią liczby kopii pierwotnych każdej próbki z duplikatów.</li>
	<li>Obliczyć współczynnik korygujący, dzieląc liczbę kopii cel-miR-238 w każdej próbce przez średnią liczbę kopii cel-miR-238 ze wszystkich próbek w odpowiedniej probówce. 
	UWAGA: Jak pokazano na Rysunek 2, każda probówka zawiera do 4 docelowych miRNA, w tym cel-miR-238 (kontrola zewnętrzna). Dlatego współczynnik korekcyjny jest obliczany dla każdej rurki przy użyciu odpowiedniej wartości cel-miR-238.</li>
	<li>Obliczyć skorygowaną liczbę kopii, dzieląc uśrednioną liczbę kopii pierwotnych każdej próbki (z etapu 6.2) przez współczynnik korygujący (z kroku 6.3) dla każdej próbki.</li>
	<li>Obliczyć bezwzględną liczbę kopii, mnożąc skorygowaną liczbę kopii pierwotnych każdej próbki (z kroku 6.4) przez współczynnik rozcieńczenia dla każdej próbki. 
	UWAGA: Współczynnik rozcieńczenia wynosi "5" w tym protokole, który pochodzi z kroku 5.2.</li>
	<li>Obliczyć wydajność amplifikacji PCR na podstawie nachylenia wykresu wartości Cq dla każdego szeregowego rozcieńczenia w stosunku do logarytmicznego stężenia cDNA. 
	UWAGA: Wzór na obliczenie sprawności; E = (10(-1/nachylenie) -1) x 100 %.</li>
	<li>Obliczyć zmienność techniczną przy użyciu wartości Cq cel-miR-238 ze wszystkich próbek, korzystając ze wzoru E = (2 x skuteczność amplifikacji)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)). 
	UWAGA: Kroki 6.5 i 6.7 służą do oceny jakości procedury.</li>
</ol>

<ol><li>Schöler, N., Langer, C., Döhner, H., Buske, C., Kuchenbauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+microRNAs+as+a+novel+class+of+biomarkers%3A+a+comprehensive+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Serum microRNAs as a novel class of biomarkers: a comprehensive review of the literature.</a> Exp. Hematol. 38, 1126-1130 (2010).</li>
<li>Viereck, J., Thum, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Noncoding+RNAs+as+Biomarkers+of+Cardiovascular+Disease+and+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating Noncoding RNAs as Biomarkers of Cardiovascular Disease and Injury.</a> Circ. Res. 120 (2), 381-399 (2017).</li>
<li>D'Alessandra, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+are+new+and+sensitive+biomarkers+of+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction.</a> Eur Heart J. 31 (22), 2765-2773 (2010).</li>
<li>Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+of+quantitative+RT-PCR+array+in+miRNA+expression+profiling+and+comparison+with+microarray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis.</a> BMC Genomics. 10, 407(2009).</li>
<li>Nassirpour, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+tubular+injury+microRNA+biomarkers+in+urine%3A+comparison+of+next-generation+sequencing+and+qPCR-based+profiling+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Identification of tubular injury microRNA biomarkers in urine: comparison of next-generation sequencing and qPCR-based profiling platforms.</a> BMC Genomics. 15, 485(2014).</li>
<li>Derveaux, S., Vandesompele, J., Hellemans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+do+successful+gene+expression+analysis+using+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">How to do successful gene expression analysis using real-time PCR.</a> Methods. 50 (4), 227-230 (2010).</li>
<li>Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+the+need+for+qPCR+publication+guidelines%3F--The+case+for+MIQE%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Why the need for qPCR publication guidelines?--The case for MIQE.</a> Methods. 50 (4), 217-226 (2010).</li>
<li>Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+circulating+microRNA+biomarkers+in+plasma+and+serum+using+quantitative+reverse+transcription-PCR+%28qRT-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR).</a> Methods. 50 (4), 298-301 (2010).</li>
<li>Thompson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+Measurement+of+Cardiac+Injury-Induced+microRNAs+in+Biofluids+across+Multiple+Test+Sites%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Absolute Measurement of Cardiac Injury-Induced microRNAs in Biofluids across Multiple Test Sites.</a> Toxicol Sci. 154 (1), 115-125 (2016).</li>
<li>Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Analysis+of+Circulating+microRNA+Specific+to+the+Liver%2C+Heart%2C+and+Skeletal+Muscle+of+Cynomolgus+Monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Analysis of Circulating microRNA Specific to the Liver, Heart, and Skeletal Muscle of Cynomolgus Monkeys.</a> Int. J. Toxicol. 36 (3), 220-228 (2017).</li>
<li>Matsuzaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+novel+serum+biomarkers%2C+miR-1%2C+miR-133a%2C+and+miR-206+for+Limb-girdle+muscular+dystrophy%2C+Facioscapulohumeral+muscular+dystrophy%2C+and+Becker+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health.+Prev.+Med%22%5BJournal%5D)">Three novel serum biomarkers, miR-1, miR-133a, and miR-206 for Limb-girdle muscular dystrophy, Facioscapulohumeral muscular dystrophy, and Becker muscular dystrophy.</a> Environ. Health. Prev. Med. 19 (6), 452-458 (2014).</li>
<li>Starkey Lewis, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+as+potential+markers+of+human+drug-induced+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs as potential markers of human drug-induced liver injury.</a> Hepatology. 54 (5), 1767-1776 (2011).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%2C+potential+biomarkers+for+drug-induced+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs, potential biomarkers for drug-induced liver injury.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (11), 4402-4407 (2009).</li>
<li>Moldovan, L., Batte, K., Wang, Y., Wisler, J., Piper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+the+Circulating+MicroRNAs+in+Exosomes%2FExtracellular+Vesicles+from+Serum+or+Plasma+by+qRT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analyzing the Circulating MicroRNAs in Exosomes/Extracellular Vesicles from Serum or Plasma by qRT-PCR.</a> Methods Mol. Biol. 1024, 129-145 (2013).</li>
<li>Li, S., Chen, H., Song, J., Lee, C., Geng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoiding+heparin+inhibition+in+circulating+MicroRNAs+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Avoiding heparin inhibition in circulating MicroRNAs amplification.</a> Int. J. Cardiol. 207, 92-93 (2016).</li>
<li>Cheng, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+processing+conditions+substantially+influence+circulating+microRNA+biomarker+levels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Plasma processing conditions substantially influence circulating microRNA biomarker levels.</a> PLoS One. 8 (6), e64795(2013).</li>
<li>Serafin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+set+of+endogenous+reference+genes+for+miRNA+expression+studies+in+Parkinson%27s+disease+blood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res.+Notes%22%5BJournal%5D)">Identification of a set of endogenous reference genes for miRNA expression studies in Parkinson's disease blood samples.</a> BMC Res. Notes. 7, 715(2014).</li>
<li>Akiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+set+of+external+reference+controls%2Fprobes+that+enable+quality+assurance+between+different+microarray+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A set of external reference controls/probes that enable quality assurance between different microarray platforms.</a> Anal. Biochem. 472, 75-83 (2015).</li>
<li>Kirschner, M. B., van Zandwijk, N., Reid, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+microRNAs%3A+potential+biomarkers+in+need+of+standardized+reporting%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Cell-free microRNAs: potential biomarkers in need of standardized reporting.</a> Front Genet. 4, 56(2013).</li>
<li>Malentacchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDIA-RNA%3A+second+external+quality+assessment+for+the+pre-analytical+phase+of+blood+samples+used+for+RNA+based+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">SPIDIA-RNA: second external quality assessment for the pre-analytical phase of blood samples used for RNA based analyses.</a> PLoS One. 9 (11), e112293(2014).</li>
<li>Sourvinou, I. S., Markou, A., Lianidou, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+circulating+miRNAs+in+plasma%3A+effect+of+preanalytical+and+analytical+parameters+on+their+isolation+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Quantification of circulating miRNAs in plasma: effect of preanalytical and analytical parameters on their isolation and stability.</a> J Mol Diagn. 15 (6), 827-834 (2013).</li>
<li>Yamaura, Y., Nakajima, M., Takagi, S., Fukami, T., Tsuneyama, K., Yokoi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+microRNA+profiles+in+rat+models+of+hepatocellular+injury%2C+cholestasis%2C+and+steatosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Plasma microRNA profiles in rat models of hepatocellular injury, cholestasis, and steatosis.</a> PLoS One. 7 (2), e30250(2012).</li>
<li>Kirschner, M. B., Edelman, J. J., Kao, S. C., Vallely, M. P., van Zandwijk, N., Reid, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Impact+of+Hemolysis+on+Cell-Free+microRNA+Biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">The Impact of Hemolysis on Cell-Free microRNA Biomarkers.</a> Front Genet. 4, 94(2013).</li>
<li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+stem-loop+RT-qPCR+miRNA+expression+profiling+using+minute+amounts+of+input+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High-throughput stem-loop RT-qPCR miRNA expression profiling using minute amounts of input RNA.</a> Nucleic Acids Res. 36 (21), e143(2008).</li>
<li>Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling%3A+approaches+and+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling: approaches and considerations.</a> Nat. Rev. Genet. 13 (5), 358-369 (2012).</li>
<li>Moldovan, L., Batte, K. E., Trgovcich, J., Wisler, J., Marsh, C. B., Piper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+challenges+in+utilizing+miRNAs+as+circulating+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers.</a> J. Cell. Mol. Med. 18 (3), 371-390 (2014).</li>
<li>Mangolini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+prognostic+microRNAs+in+the+serum+of+breast+cancer+patients+measured+by+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark.+Res%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR.</a> Biomark. Res. 3, 12(2015).</li>
<li>Miotto, E., Saccenti, E., Lupini, L., Callegari, E., Negrini, M., Ferracin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+circulating+miRNAs+by+droplet+digital+PCR%3A+comparison+of+EvaGreen-+and+TaqMan-based+chemistries%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol.+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Quantification of circulating miRNAs by droplet digital PCR: comparison of EvaGreen- and TaqMan-based chemistries.</a> Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 23 (12), 2638-2642 (2014).</li>
</ol>

Autor nie ma konfliktu interesów, który mógłby ujawnić.

Nasza kompleksowa ocena dostarczyła bardziej rygorystycznej analizy statystycznej zakresu zakresu, która wyraźnie wskazała, że wielkość zmienności między poszczególnymi próbkami była skrajnie różna wśród badanych miRNA. Chociaż różnice te można przypisać ich niewielkim ilościom w płynach ustrojowych, należy zauważyć, że dane te odzwierciedlają nie tylko różnice biologiczne, ale także techniczne. Większość różnic technicznych można ocenić za pomocą wartości Cq kontroli zewnętrznej (cel-miR-238), która jest stosowana w inn...

Coraz więcej badań bada mikroRNA (miRNA) jako biomarkery do diagnozowania i prognozowania nowotworów lub monitorowania i wykrywania innych chorób w badaniach nieklinicznych i klinicznych1,2,3. Ilościowa PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (RT-qPCR) jest jedną z najczęstszych metod stosowanych do oceny poszczególnych docelowych miRNA, ponieważ technika ta jest bardziej czuła niż platformy oparte na sekwencjonowaniu mikromacierzy4 i sekwencjonowaniu RNA5. Ogólnie rzecz biorąc, ekspresję miRNA mierzy się w stosunku do próbki referencyjnej przy użyciu metody ΔCq6. Podejście to jest odpowiednie do badania fizjologicznych zmian w docelowych poziomach ekspresji genów. Jednak względna kwantyfikacja krążących miRNA ma ograniczoną użyteczność ze względu na ich małe ilości. Ponadto różnice techniczne utrudniają porównywanie wyników z różnych badań, ponieważ różne laboratoria w różny sposób dostosowują protokoły eksperymentalne RT-qPCR, co prowadzi do niespójnych lub nawet sprzecznych wyników z różnych badań7.
Ze względu na obawy wymienione powyżej, bezwzględna kwantyfikacja może być bardziej odpowiednia do oceny małych ilości miRNA w płynach ustrojowych. Metoda kwantyfikacji bezwzględnej wykorzystuje krzywą standardową wygenerowaną ze znanych stężeń syntetycznych oligonukleotydów RNA, które są identyczne w sekwencji z odpowiadającym im docelowym miRNA8. Komitet Techniczny ds. Genomiki Instytutu Zdrowia i Nauk o Środowisku (HESI) przeprowadził niedawno kompleksowe badania w celu porównania wyników bezwzględnych pomiarów miRNA w osoczu w wielu ośrodkach testowych. Wyniki pokazały, że zastosowanie standardowego protokołu do bezwzględnej kwantyfikacji miRNA dało porównywalne wyniki w wielu miejscach testowych9. Metoda testu RT-qPCR opisana w niniejszym badaniu jest prawie identyczna ze standardowym protokołem HESI, który obejmuje multipleksowaną analizę wielu celów miRNA i wstępną amplifikację w celu pomocy w wykrywaniu miRNA o niskiej ekspresji.
W tym badaniu użyto stałej objętości (200 μL) osocza EDTA przygotowanego z krwi pobranej z żyły udowej przytomnych małp cynomolgus (n = 50)10. Poniższy protokół opisuje procedurę przygotowania próbek osocza, ekstrakcji miRNA i RT-qPCR, w tym wstępnej amplifikacji. Co ważniejsze, dołączono dodatkowe informacje techniczne na temat protokołu, dzięki czemu ilość docelowych miRNA w próbkach może być zwalidowana w połączeniu z dobrze wykwalifikowanym procesem. Po pierwsze, standardowa krzywa każdego miRNA została zwalidowana dla jego indywidualnego zakresu wykrywania, przed jego kwantyfikacją w próbkach biologicznych. Po drugie, jakość obecnej metodologii została kompleksowo oceniona za pomocą wartości Cq kontroli zewnętrznej (cel-miR-238). W związku z tym platforma ta dostarcza bardziej pouczających i wiarygodnych danych do porównywania wyników z różnych badań lub laboratoriów.
Profile 8 miRNA zostały uwzględnione w tym raporcie jako reprezentatywne wyniki opisanej tutaj metody testowej. Te miRNA zostały zaproponowane jako potencjalne biomarkery bezpieczeństwa związane z uszkodzeniem tkanek wątroby (miR-122 i miR-192), serca (miR-1, miR-208a, miR-208b i miR-499a) i mięśni szkieletowych (miR-133a i miR-206) u gryzoni i ludzi3,11,12,13.

<table><tbody><tr><td>Probówka BD Microtainer (K2EDTA)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>365974</td><td>Do pobierania krwi</td></tr><tr><td>Eppendorf PCR Tubes, 0,2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030124359</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówki Eppendorf Safe-Lock&nbsp; 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówki Eppendorf Safe-Lock&nbsp; 2,0 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>Syntetyczny oligonukleotyd</td><td>Hokkaido System</td> <td>Science-Indywidualne</td> <td>miRNA (0,2 &mu; mol,klasa HPLC)</td></tr><tr><td>Bufor Tris-EDTA&nbsp; (pH 8,0)</td><td>Bufor Nippon Gene</td><td>314-90021</td><td>TE</td></tr><tr><td>Bufor RPE</td><td>QIAGEN-Zawartość</td><td></td> <td>w mini zestawie miRNeasy&nbsp;</td></tr><tr><td>Bufor RWT</td><td>QIAGEN-Zawartość</td><td></td> <td>w mini zestawie miRNeasy&nbsp;</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Woda bez nukleaz&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>129114</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do lizy QIAzol</td><td>QIAGEN-Zawartość</td><td></td> <td>w mini zestawie miRNeasy&nbsp;</td></tr><tr><td>Syn-cel-miR-238-3p miScript mimik miRNA&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>219600</td><td>ID:MSY0000293, 5 nmol</td></tr><tr><td>SC Adaptery</td><td>TAIGEN Bioscience Corporation</td><td>S0120</td><td>Do ekstrakcji RNA</td></tr><tr><td>VacEZor 36 Kompletny system</td><td>TAIGEN Bioscience Corporation</td><td>M3610</td><td>Do ekstrakcji RNA</td></tr><tr><td>7900HT Szybki system PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4351405</td><td>Szybki 96-dołkowy blokowy</td></tr><tr><td>system PCR GeneAmp 9700</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>9700</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Szybka optyczna 96-dołkowa płytka reakcyjna</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td>4346907</tr><tr><td>MicroAmp Optyczny film samoprzylepny</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td>4311971</tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td>4444557</tr><tr><td>Testy mikroRNA TaqMan (cel-miR-238-3p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>Identyfikator testu: 000248</td></tr><tr><td>Testy mikroRNA TaqMan (has-miR-122-5p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>Identyfikator testu: 002245</td></tr><tr><td>Testy mikroRNA TaqMan (has-miR-133a-3p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>Identyfikator testu: 002246</td></tr><tr><td>Testy mikroRNA TaqMan (has-miR-1-3p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>Identyfikator testu: 002222</td></tr><tr><td>Testy mikroRNA TaqMan (has-miR-192-5p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>Identyfikator testu: 000491</td></tr><tr><td>Testy mikroRNA TaqMan (has-miR-206)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>Identyfikator testu: 000510</td></tr><tr><td>Testy mikroRNA TaqMan (has-miR-208a-3p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>Identyfikator testu: 000511</td></tr><tr><td>Testy mikroRNA TaqMan (has-miR-208b-3p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>Identyfikator testu: 002290</td></tr><tr><td>Testy mikroRNA TaqMan (has-miR-499a-5p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>Identyfikator testu: 001352</td></tr><tr><td>Zestaw do transkrypcji odwróconego TaqMan</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td>4366597</tr><tr><td>TaqMan PreAmp Master Mix (2 razy;)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td>4391128</tr><tr><td>Chloroform&nbsp;</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>035-02616</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (99.5)</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>057-00456</td><td></td></tr></tbody></table>

bezwzględna kwantyfikacja poziomów mikrorna w osoczu u małp cynomolgus przy użyciu ilościowego pcr z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

RT-qPCR jest jedną z najczęstszych metod oceny indywidualnych docelowych miRNA. Poziomy MiRNA są zwykle mierzone w stosunku do próbki referencyjnej. Podejście to jest odpowiednie do badania fizjologicznych zmian w docelowych poziomach ekspresji genów. Jednak bezwzględna kwantyfikacja przy użyciu lepszej analizy statystycznej jest preferowana w celu kompleksowej oceny poziomów ekspresji genów. Kwantyfikacja bezwzględna nadal nie jest powszechnie stosowana. W niniejszym raporcie opisano protokół pomiaru bezwzględnych poziomów miRNA w osoczu przy użyciu RT-qPCR z lub bez wstępnej amplifikacji.
Stała objętość (200 μL) osocza EDTA została przygotowana z krwi pobranej z żyły udowej przytomnych małp cynomolgus (n = 50). Całkowite RNA wyekstrahowano przy użyciu komercyjnie dostępnego systemu. MiRNA w osoczu oznaczono ilościowo za pomocą testów RT-qPCR opartych na sondzie, które zawierają specyficzny dla miRNA starter do przodu/wstecznego PCR i sondę. Standardowe krzywe do bezwzględnej kwantyfikacji zostały wygenerowane przy użyciu dostępnych na rynku syntetycznych oligonukleotydów RNA. Syntetyczny cel-miR-238 został użyty jako zewnętrzna kontrola do normalizacji i oceny jakości. MiRNA, które wykazywały wartości cyklu kwantyfikacji (Cq) powyżej 35, zostały wstępnie amplifikowane przed etapem qPCR.
Spośród 8 badanych miRNA, miR-122, miR-133a i miR-192 były wykrywalne bez wstępnej amplifikacji, podczas gdy miR-1, miR-206 i miR-499a wymagały wstępnej amplifikacji ze względu na ich niski poziom ekspresji. MiR-208a i miR-208b nie były wykrywalne nawet po wstępnym wzmocnieniu. Wydajność przetwarzania próbki oceniano na podstawie wartości Cq wzbogaconego cel-miR-238. W tej metodzie testowej oszacowano, że zmienność techniczna jest mniejsza niż 3-krotnie, a dolna granica oznaczalności (LLOQ) wynosiła 10,2 kopii/μl, dla większości badanych miRNA.
Ten protokół zapewnia lepsze oszacowanie ilości miRNA w osoczu i pozwala na ocenę jakości odpowiednich danych z różnych badań. Biorąc pod uwagę niską liczbę miRNA w płynach ustrojowych, wstępna amplifikacja jest przydatna w celu poprawy wykrywania słabo wyrażonych miRNA.

Przebieg analizy miRNA metodą RT-qPCR i ocena jakościt 
Rycina 1 przedstawia schemat analizy miRNA z próbek krwi z wykorzystaniem qPCR10Jakość eksperymentów można zweryfikować, wprowadzając cel-miR-238 jako kontrolę zewnętrzną. Pozwoli to na wykrycie zmienności technicznej w procesie ekstrakcji RNA oraz w późniejszych etapach RT-qPCR. W niniejszym badaniu średnia ± SD wartości Cq obliczonych z 50 próbek wyn...

Ten raport opisuje protokół pomiaru bezwzględnych poziomów miRNA w osoczu, przy użyciu ilościowego PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym z lub bez wstępnej amplifikacji. Protokół ten pozwala lepiej zrozumieć ilość miRNA w osoczu i umożliwia jakościową ocenę odpowiednich danych z różnych badań lub laboratoriów.

Bezwzględna kwantyfikacja poziomów mikroRNA w osoczu u małp Cynomolgus przy użyciu ilościowego PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar bezwzględnych poziomów mikroRNA w osoczu za pomocą ilościowego PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym. Metoda ta może pomóc w ocenie ilości mikroRNA w osoczu, nawet jeśli ich poziom ekspresji jest niski. Główną zaletą tej techniki jest to, że zmierzone dane można porównać z innymi z różnych badań lub laboratoriów.Implikacje tej techniki rozciągają się na próbki innych gatunków, ponieważ krzywa standardowa może być generowana przy użyciu syntetycznego RNA lub nukleotydu. Metoda ta może zapewnić wgląd w badania translacyjne w celu zbadania obiecujących biomarkerów bezpieczeństwa. Najpierw rozmrozić zamrożone próbki osocza uzyskane z żyły udowej małp Cynomolgus na lodzie.Przenieś odczynnik do lizy w chloroformie na lodzie w celu schłodzenia przed ekstrakcją RNA. Następnie dodaj 1 000 mikrolitrów odczynnika do lizy do 200 mikrolitrów próbki. I wiruj przez minutę, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie.Następnie dodaj do próbki pięć mikrolitrów pięciu nanomolowych syntetycznych mikroRNA Caenorhabditis elegans i 200 mikrolitrów chloroformu. Wirować próbkę przez jedną minutę, aby odpowiednio wymieszać. Następnie umieść próbkę na lodzie na dwie do trzech minut.Następnie odwirować próbkę w temperaturze 12 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie ostrożnie przenieś 650 mikrolitrów fazy wodnej do nowej mikroprobówki. Następnie dodaj 975 mikrolitrów etanolu do fazy wodnej i kilkakrotnie odpipetuj pipetą, aby zapewnić całkowite wymieszanie.Przenieść próbkę do odpowiedniej kolumny i adaptera, a następnie suszyć próżniowo przez trzy minuty za pomocą kolektorów próżniowych. Następnie dodaj 200 mikrolitrów etanolu do kolumny i susz próżniowo przez jedną minutę. Po wysuszeniu próżniowym dodać 800 mikrolitrów buforu RWT do kolumny i ponownie suszyć próżniowo przez dwie minuty.Następnie dodaj 800 mikrolitrów buforu RPE do kolumny i odkurzaj do suszenia przez dwie minuty. Dwukrotnie dodaj bufor RPE, a następnie wysusz próżniowo. Następnie dodaj 300 mikrolitrów etanolu do kolumny.Po dodaniu etanolu suszyć próżniowo przez jedną minutę. Następnie przenieś kolumnę do nowej mikroprobówki i odwiruj ją w temperaturze 12 000 G w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Po odwirowaniu przenieś kolumnę do nowej mikroprobówki i dodaj do niej 50 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz.Pozostawić kolumnę w temperaturze pokojowej na trzy minuty, a następnie odwirować w temperaturze pokojowej 8 000 G przez jedną minutę. Na koniec przechowuj eluat w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu użycia. Aby przygotować stężenie syntetycznego oligonukleotydu RNA, które odpowiada docelowemu mikroRNA, należy rozcieńczyć roztwór podstawowy 10-krotnie, aby uzyskać roztwór roboczy o najwyższym stężeniu do wykreślenia krzywych wzorcowych.Następnie, aby utworzyć multipleksową pulę starterów odwrotnej transkrypcji, wymieszaj równe objętości starterów o sile 20 dla docelowych mikroRNA. Następnie przygotuj mieszaninę reakcji odwrotnej transkrypcji. Następnie dodaj 10 mikrolitrów mieszaniny reakcji odwrotnej transkrypcji do pięciu mikrolitrów próbki RNA.Wymieszaj je kilkakrotnie pipetując. Następnie inkubuj mieszaninę na lodzie przez pięć minut. Po umieszczeniu próbki w termocyklerze rozpocznij cykl.Po zakończeniu programu przechowuj odwróconą transkrypcję próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby utworzyć pulę starterów do testów multipleksowych, dodaj równe objętości pięciu mikrolitrów starterów do testów odpowiadających docelowym mikroRNA do probówki zawierającej bufor Tris-EDTA w końcowej objętości 1 000 mikrolitrów. Następnie należy utworzyć mieszaninę reakcji przed amplifikacją.Po zakończeniu mieszaniny reakcyjnej przenieś 22,5 mikrolitra mieszaniny reakcyjnej przed amplifikacją do dwóch pięciu mikrolitrów próbki z odwróconą transkrypcją. Następnie pipetować, aby wymieszać próbkę i dokładnie wymieszać wzorzec wstępnej amplifikacji i inkubować na lodzie przez pięć minut, a następnie pozostawić probówki PCR w termocyklerze i rozpocząć bieg. Po zakończeniu programu przenieś wszystkie próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Po rozmrożeniu wstępnie amplifikowanych lub nieamplifikowanych próbek, należy je rozcieńczyć pięciokrotnie sterylną wodą. Aby wygenerować krzywą standardową, wykonaj 10-krotne seryjne rozcieńczanie próbek pochodzących z syntetycznych oligonukleotydów RNA. Następnie należy przygotować ilościową mieszaninę reakcyjną PCR w probówce trzymanej na lodzie.Następnie dodaj 18 mikrolitrów z ilościowej mieszaniny reakcyjnej PCR do szybkich optycznych 96-dołkowych płytek reakcyjnych. Następnie dodaj dwa mikrolitry rozcieńczonych próbek do studzienek. Po uszczelnieniu płytki folią samoprzylepną krótko odwirować próbkę o stężeniu 500 G przez 15 sekund.Następnie uruchom program Thermocycler w czasie rzeczywistym. Użyj oprogramowania SDS w wersji 2.4, które współpracuje z odpowiednim termocyklerem w czasie rzeczywistym, aby obliczyć liczbę nieprzetworzonych kopii każdej próbki. Następnie oblicz bezwzględną liczbę kopii na podstawie liczby kopii surowej za pomocą oprogramowania Excel.Wydajność amplifikacji miR-122, miR-192 i miR-133a analizowano poprzez wykreślanie krzywych standardowych, co wyjaśnia zależność między stężeniem logarytmicznym a cyklem kwantyfikacji dla próbek bez wstępnej amplifikacji. Krzywe wzorcowe dla miR-122, miR-192 i miR-133a pokazują liniową zależność między cyklami kwantyfikacji a stężeniem logarytmicznym próbek. Następnie przeanalizowano wydajność amplifikacji miR-1, miR-499a i miR-206 poprzez wykreślenie krzywych standardowych dla wstępnie amplifikowanych próbek.Aby przeanalizować wydajność wzmocnienia, nachylenie obliczono za pomocą regresji liniowej. Nachylenie krzywej standardowej A pokazuje brak specyficznych amplikonów przy stężeniu 1 000 kopii na mikrolitr dla miR-499a i miR-206. Jednak niespecyficzne amplikony uzyskano w ilości 1000 kopii na mikrolitr dla miR-1.W tym przypadku nieamplifikowane i wstępnie amplifikowane próbki miR-206 zostały użyte w duplikatach do wyprowadzenia wykresów amplifikacji. Wartości cyklu kwantyfikacji dla miR-206 bez wstępnej amplifikacji i wstępnie amplifikowanej oszacowano na 39,9, plus lub minus jeden punkt dziewiąty i 27,0, plus lub minus odpowiednio dwa punkty dwa, reprezentujące prawie podobne wartości między duplikatami, jak pokazano na wykresach. Następnie mikroRNA osocza uzyskane od małp Cynomolgus poddano profilowaniu w celu obliczenia ich wartości bezwzględnych.Wykresy punktowe, uzyskane z profilowania mikroRNA reprezentującego ich poziomy ekspresji, pokazują, że miR-122, miR-133a i miR-192 są wykrywalne bez wstępnej amplifikacji. Natomiast miR-1, miR-206 i miR-499a będą wymagały wstępnego wzmocnienia ze względu na niskie poziomy ekspresji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć bezwzględne poziomy mikroRNA w osoczu za pomocą RT-qPCR.I pre-amplifikacja; jest to przydatne do poprawy wykrywania małych ilości mikroRNA.

absolute-quantification-plasma-microrna-levels-cynomolgus-monkeys

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zaprezentujemy konfigurację i analizę tablic 96-dołkowych pre-microRNA do QPCR, przeprowadzonych zarówno przy użyciu robota, jak i ręcznie za pomocą wielokanałowej pipety Thermo Scientific Matrix.

Profilowanie pre-microRNA i microRNA z wykorzystaniem matryc ilościowej PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany protokół multipleksowej ilościowej reakcji polimerazy w odwrotnej transkrypcji (qRT-PCR) w połączeniu z platformą mikroprzepływową, stanowiący efektywne pod względem kosztów i czasu narzędzie do wysokoprzepustowego przesiewowania poziomów ekspresji mikroRNA (miRNA), szczególnie w przypadku pracy z ograniczoną ilością materiału próbnego.

Wysokoprzepustowe profilowanie mikroRNA: zoptymalizowana wielokanałowa qRT-PCR w skali nanolitrowej na IFC Fluidigm Dynamic ArrayTM

Mikroglią są rezydentne makrofagi, które stanowią pierwszą linię obrony i nadzoru immunologicznego ośrodkowego układu nerwowego. MikroRNA to cząsteczki regulacyjne, które odgrywają istotną rolę w wielu procesach fizjologicznych, w tym w aktywacji i różnicowaniu makrofagów. W niniejszym artykule opisujemy metodę pomiaru mikroRNA w mikroglii.

Wykrywanie mikroRNA w mikrogleju za pomocą PCR w czasie rzeczywistym w prawidłowym OUN oraz podczas neurostanu zapalnego

Opisujemy protokół PCR w czasie rzeczywistym do profilowania mikroRNA w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF). Z wyjątkiem protokołów ekstrakcji RNA, procedura może zostać rozszerzona na RNA wyekstrahowane z innych płynów ustrojowych, hodowanych komórek lub próbek tkanek.

Profilowanie mikroRNA płynu mózgowo-rdzeniowego za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

Krążące mikroRNA pojawiły się ostatnio jako obiecujące i nowe biomarkery dla różnych nowotworów i innych chorób. Celem tego artykułu jest omówienie trzech różnych platform i metod PCR w czasie rzeczywistym opartych na sondach, które są dostępne do ilościowego określania i określania obfitości krążących mikroRNA.

Oparte na sondzie podejścia PCR w czasie rzeczywistym do ilościowego pomiaru mikroRNA

Opisana jest czuła i dokładna metoda kwantyfikacji mikroRNA bez komórek przy użyciu chemii opartej na barwniku i technologii kropelkowej cyfrowego PCR.

Kwantyfikacja krążącego mikroRNA przy użyciu chemii barwnika wiążącego DNA i kropelkowego cyfrowego PCR

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania ekspresji mikroRNA w błonie otrzewnowej szczura za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym. Metoda ta nadaje się do badania profilu ekspresji mikroRNA w błonie otrzewnowej szczura w kilku stanach patologicznych.

Wykrywanie ekspresji mikroRNA w błonie otrzewnowej szczurów za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół przyjęty w badaniu przesiewowym BioMILD w celu przeprowadzenia testu klasyfikatora sygnatury krążącego mikroRNA do wczesnego wykrywania raka płuc.

Płynna biopsja na bazie mikroRNA: doświadczenia z klasyfikatorem sygnatury miRNA w osoczu (MSC) do badań przesiewowych w kierunku raka płuc

Opisana jest metodologia ilościowego oznaczania ekspresji 96 genów i 18 białek powierzchniowych przez pojedyncze komórki ex vivo, pozwalająca na identyfikację genów i białek o zróżnicowanej ekspresji w komórkach zakażonych wirusem w stosunku do komórek niezainfekowanych. Stosujemy podejście do badania limfocytów T CD4 + zakażonych SIV wyizolowanych od makaków rezusów.

Kwantyfikacja mRNA i ekspresji białek powierzchniowych w pojedynczych komórkach w limfocytach T CD4 + zakażonych małpim wirusem niedoboru odporności wyizolowanych od makaków rezusów

Krążące mikroRNA okazały się obiecujące jako biomarkery chorób sercowo-naczyniowych i ostrych zawałów mięśnia sercowego. W tym badaniu opisujemy protokół ekstrakcji miRNA, odwrotnej transkrypcji i cyfrowego PCR w celu bezwzględnej kwantyfikacji miRNA w surowicy pacjentów z chorobami sercowo-naczyniowymi.

Cyfrowy PCR do ilościowego oznaczania krążących mikroRNA w ostrym zawale mięśnia sercowego i chorobach sercowo-naczyniowych

Przedstawiamy protokół do oceny poziomów ekspresji krążących mikroRNA (miRNA) w próbkach osocza od pacjentów z rakiem. W szczególności wykorzystaliśmy dostępny na rynku zestaw do cyrkulacji ekstrakcji miRNA i odwrotnej transkrypcji. Na koniec przeanalizowaliśmy panel 24 wybranych miRNA przy użyciu niestandardowych płytek sondy wstępnie wykrytej w czasie rzeczywistym.

Wykrywanie niestandardowego panelu krążącego mikroRNA u pacjentów z przerzutowym rakiem jelita grubego

Poznaj metodę bezwzględnej kwantyfikacji mikroRNA w osoczu u małp Cynomolgus przy użyciu ilościowego PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym. Technika ta umożliwia wykrywanie niskich poziomów ekspresji i porównywanie wyników między laboratoriami.

Bezwzględna kwantyfikacja poziomów mikroRNA w osoczu u małp Cynomolgus przy użyciu ilościowego PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (Wideo) | JoVE Journal

Bezwzględna kwantyfikacja poziomów mikroRNA w osoczu u małp Cynomolgus przy użyciu ilościowego PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym

Przeglądaj więcej filmów