Profilowanie mikroRNA płynu mózgowo-rdzeniowego za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym
January 22nd, 2014
Opisujemy protokół PCR w czasie rzeczywistym do profilowania mikroRNA w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF). Z wyjątkiem protokołów ekstrakcji RNA, procedura może zostać rozszerzona na RNA wyekstrahowane z innych płynów ustrojowych, hodowanych komórek lub próbek tkanek.
Ogólnym celem tej procedury jest profilowanie mikroRNA w płynach mózgowo-rdzeniowych za pomocą ilościowego PCR i analiza danych za pomocą profesjonalnego oprogramowania Gen X. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie całkowitego RNA z próbek płynu mózgowo-rdzeniowego. Drugim krokiem jest wykonanie odwrotnej transkrypcji w celu transkrypcji RNA na CDNA.
Następnie CDNA są mieszane z mieszanką wzorcową cyber green, ładowaną do 384-dołkowych płytek zawierających startery dla 742 unikalnych sekwencji i amplifikowanych za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Ostatnim krokiem jest analiza danych pozyskanych ze wzmacniacza w czasie rzeczywistym. Ostatecznie wyniki mogą być wyrażone jako zmiana składania, wzrost lub spadek w stosunku do kontrolki i wizualizowane w różnych reprezentacjach graficznych.
Tak więc główną przewagą naszej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak macierze chipowe, jest to, że nasza metoda jest bardzo czuła i wymaga minimalnej ilości RNA. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z powodu dużej ilości generowanych danych i korzystania z oprogramowania do analizy danych. Najpierw spryskaj obszar roboczy i pipety RNA Zap.
Na początek synteza CDNA rozcieńcza próbki matrycowego RNA do stężenia pięciu nanogramów na mikrolitr wodą wolną od nukleaz. Następnie delikatnie umieść pięć x bufor reakcyjny na lodzie do rozmrożenia. Następnie dodaj 40 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do kolca RNA, aby ponownie zawiesić odczynnik, zawiruj probówkę i pozostaw ją na lodzie na 15 do 20 minut.
Następnie wyjmij enzymy z zamrażarki, przesuń rurki i umieść je na lodzie. Ponadto, gdy wszystkie odczynniki się rozmrozą, szybko je odwiruj. Przygotuj roztwór roboczy odwrotnej transkryptazy w 1,5 mililitrowej probówce eph, dodając pięć x enzymu buforu reakcyjnego.
Wymieszaj wodę wolną od nukleaz i kolec RNA w matrycy, stosując proporcje wskazane w tabeli pierwszej. Następnie wymieszaj roztwór roboczy, wirując go przez jedną do dwóch sekund z maksymalną prędkością. Krótko odwiruj roztwór przez 10 sekund, a następnie dozuj roztwór roboczy do probówek PCR bez nukleazy.
Następnie dodaj matrycę RNA bezpośrednio do probówek PCR. Delikatnie wirować reakcję przez jedną do dwóch sekund, aby upewnić się, że wszystkie odczynniki są dokładnie wymieszane i wirować w probówkach przez 10 sekund. Umieść próbkę w maszynie do PCR i wprowadź pokazane tutaj ustawienia.
Następnie uruchom program po transkrypcji retro. CDNA jest gotowy do amplifikacji PCR w czasie rzeczywistym i może być przechowywany w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez okres do pięciu tygodni. Aby rozpocząć amplifikację PCR w czasie rzeczywistym, najpierw umieść CDNA i główną mieszankę PCR na lodzie.
Aby rozmrozić, należy chronić fiolki z mieszanką wzorcową PCR przed światłem, przykrywając je folią aluminiową podczas rozmrażania. Po rozmrożeniu wiru mistrz PCR miesza się przez jedną do dwóch sekund. Następnie połącz 2000 mikrolitrów dwóch głównych mieszanek XPCR i 1 980 mikrolitrów wody w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów.
Dodaj 20 mikrolitrów CDNA do mieszaniny i delikatnie wiruj roztwory przez jedną do dwóch sekund. Następnie odwiruj roztwory w wirówce z chłodzeniem w temperaturze 1 500 razy G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie umieść mieszaninę reakcyjną PCR w wielokanałowym zbiorniku pipety.
Krótko odwirować gotowe do użycia płytki w wirówce z chłodzeniem pod ciśnieniem 1 500 razy G przed zdjęciem uszczelki płyty. Następnie dozować 10 mikrolitrów głównej mieszanki PCR zawierającej CD NA do każdego dołka na płytce 384-dołkowej. Za pomocą pipety 16-kanałowej uszczelnij płytkę optyczną folią uszczelniającą.
Po dodaniu mieszanki wzorcowej krótko obrócić płytkę w wirówce z chłodzeniem pod ciśnieniem 1 500 razy G, aby wyciągnąć roztwór na dno studzienek. Wymieszaj próbki i usuń pęcherzyki powietrza, aby wstrzymać eksperyment. W tym momencie przechowuj reakcje w miejscu chronionym przed światłem w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez maksymalnie 24 godziny.
Następnie wykonaj amplifikację PCR w czasie rzeczywistym i analizę krzywej topnienia zgodnie z parametrami wyszczególnionymi w tabeli drugiej. Aby rozpocząć analizę, wybierz drugą metodę analizy pochodnej w fotocyklerze Roche. Następnie oblicz cykl kwantyfikacji lub wartości CQ.
Wyeksportuj dane jako tabelę i zapisz je jako plik tekstowy. Następnie zaimportuj dane do Gen X, klikając najpierw przycisk kreatora importu gon, a następnie klikając start w następnym oknie, wybierz format pliku instrumentu i układu płyty. Pliki Excel z układem płyty można pobrać ze strony internetowej GON.
Następnie zaimportuj pierwszy panel i kliknij Dalej. Tabela wygenerowana po zaimportowaniu pliku zawiera wstępnie zdefiniowane kolumny, edytuj nazwy próbek oraz dodaj lub usuń kolumny klasyfikacji na tym etapie. Kliknij Dalej, gdy skończysz i zapisz dane.
Następnie załaduj go do edytora danych Najpierw skalibruj dane między płytami, wybierając kalibrację INTERPLATE z menu przetwarzania wstępnego, aby upewnić się, że wszystkie płyty są obliczane przy użyciu tych samych parametrów. Następnie zdefiniuj wartość odcięcia, która spowoduje odrzucenie danych wyższych niż cykl progowy lub ct. Jeśli mikro RNA ma CT, który jest większy dla jednej repliki na trzy, odczyt ten zostanie zastąpiony średnią CT z dwóch pozostałych sond.
Zdefiniuj geny referencyjne, wybierając listę mikroRNA, które mają podobne wartości CQ we wszystkich próbkach i uruchom normę genową. Następnie znormalizuj dane za pomocą uzyskanych genów referencyjnych. Uzyskane wartości będą odpowiadać delta ct.
Usuń puste i prawie puste kolumny, otwierając okno przetwarzania wstępnego i wybierając pozycję Sprawdź poprawność arkusza, a następnie wybierając pozycję Zastosuj w wierszu usuwania pustych kolumn w poniższym wierszu. Wybierz żądany procent prawidłowych danych i kliknij przycisk Zastosuj. Wybierz 100%, jeśli chcesz porównać tylko mikroRNA wspólne dla wszystkich próbek.
Załaduj końcowy plik MDF do Gen X i otwórz menedżera danych, aby sklasyfikować, klastrować i wizualizować mikroRNA i próbki na mapach cieplnych i dendrogramach. Następnie wybierz i utwórz grupy próbek, a po zakończeniu kliknij przycisk Zastosuj. Następnie w oknie panelu sterowania kliknij uruchom.
Zapisz mapę skupień w żądanym formacie, takim jak TIFF lub mapa bitowa, a następnie skopiuj i zmodyfikuj mapę skupień zgodnie z potrzebami. Ten pasek graficzny został uzyskany z aplikacji normy G w pokoleniu X w celu przeanalizowania 10 możliwych genów referencyjnych mikro RNA. Wyniki te wskazują, że MIR 622 i MI 1, 266 są najbardziej stabilnie eksprymowanymi mikroRNA.
Przedstawiony tutaj wykres pudełkowy przedstawia rozkład danych dla każdego z 11 statystycznie istotnych mikroRNA w grupach HIVE i HIV plus bez zapalenia mózgu. W każdej kolumnie wykres przedstawia medianę oraz pierwszy i trzeci kwartyl wraz z wartościami maksymalnymi i minimalnymi. Po tej procedurze można przeprowadzić profilowanie mineralne na dowolnych płynach ustrojowych, próbkach tkanek i hodowanych komórkach.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje zastosowanie techniki real-time PCR do profilowania mikroRNA w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF). Metoda ta może być również zaadaptowana dla RNA wyodrębnionych z innych płynów ustrojowych, hodowli komórek lub próbek tkankowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia molekularna
- Genomika
Tło
- MikroRNA odgrywają kluczową rolę w regulacji ekspresji genów.
- Płyn mózgowo-rdzeniowy jest cenny dla badań procesów neurobiologicznych.
- Real-time PCR umożliwia ilościową analizę RNA.
- Rozumienie profili mikroRNA może pomóc w diagnozowaniu chorób neurologicznych.
Cel badania
- Profilowanie mikroRNA w CSF za pomocą ilościowej PCR.
- Dostarczenie niezawodnej metody dla analizy RNA w różnych próbkach biologicznych.
- Ułatwienie analizy danych przy użyciu profesjonalnego oprogramowania Gen X.
Zastosowane metody
- Izolacja całkowitego RNA z próbek CSF.
- Odwrotna transkrypcja w celu konwersji RNA na cDNA.
- Amplifikacja cDNA za pomocą cyber green master mix w 384-dołkowych płytkach.
- Analiza danych wyników real-time PCR w celu określenia zmian ilorazowych.
Główne wyniki
- Skuteczna analiza 742 unikalnych sekwencji mikroRNA.
- Ilościowe wyniki wyrażone jako zmiany ilościowe względem kontroli.
- Wizualizacje danych zapewniają różne przedstawienia graficzne.
- Metoda wykazała się przystosowaniem do innych typów próbek.
Konkluzje
- Protokół jest skuteczny w profilowaniu mikroRNA w CSF.
- Real-time PCR może być stosowany do innych próbek biologicznych.
- Wyniki mogą poprawić zrozumienie mechanizmów neurobiologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative real-time PCR profiling of cerebrospinal fluid microRNAs enables sensitive detection of disease-associated molecular signatures, supporting early-stage biomarker discovery in neurodegenerative and complex disorders. This workflow enhances predictive confidence in translational research by providing robust, quantitative data on extracellular miRNA expression. Integration of high-throughput miRNA profiling informs portfolio decisions at the biomarker validation and preclinical inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of miRNA-mediated regulatory pathways relevant to disease mechanisms.
- Supports functional target validation by quantifying miRNA expression changes in disease versus control CSF samples.
- Facilitates biological de-risking through identification of stable reference miRNAs for normalization.
- Provides quantitative evidence to prioritize candidate biomarkers for further validation.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible miRNA quantification across 742 unique targets using validated PCR panels.
- Generates high-content, quantitative outputs suitable for downstream screening and comparative analyses.
- Enables assay scalability and platform reuse across diverse sample types, including CSF, plasma, and tissue.
- Supports robust compound evaluation by ensuring sensitive detection of low-abundance miRNAs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns miRNA profiling with disease-relevant biomarker discovery in neurological and oncological indications.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by enabling cross-sample and cross-cohort comparisons.
- Provides risk-adjusted data to inform advancement of biomarker candidates into translational studies.
- Strengthens predictive de-risking by quantifying miRNA signatures associated with disease phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
This quantitative PCR-based miRNA profiling method fits within the biomarker discovery and validation continuum, bridging early discovery, assay development, and translational research workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying miRNA expression changes in CSF.
- Screening: Provides reproducible, high-throughput assay readiness for large-scale miRNA profiling.
- Analytics: Delivers quantitative fold-change data and statistical outputs for robust condition comparisons.
- Translational Research: Enables biomarker alignment and continuity across preclinical and clinical sample types.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for miRNA profiling in multiple biological matrices.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in biomarker discovery.
- Operational Value: Standardizes miRNA quantification with high sensitivity and minimal RNA input requirements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust, quantitative biomarker evaluation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of biomarker candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling, qPCR setup, and data analysis using specialized software.
- Demands access to high-throughput qPCR instrumentation and validated primer panels.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for data normalization and reference gene selection.
- Adaptable to various sample types but may require optimization for low-abundance or degraded RNA.
- Data analysis complexity and software proficiency are critical for accurate interpretation and visualization.
