Profilowanie mikroRNA płynu mózgowo-rdzeniowego za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

Ogólnym celem tej procedury jest profilowanie mikroRNA w płynach mózgowo-rdzeniowych za pomocą ilościowego PCR i analiza danych za pomocą profesjonalnego oprogramowania Gen X. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie całkowitego RNA z próbek płynu mózgowo-rdzeniowego. Drugim krokiem jest wykonanie odwrotnej transkrypcji w celu transkrypcji RNA na CDNA.

Następnie CDNA są mieszane z mieszanką wzorcową cyber green, ładowaną do 384-dołkowych płytek zawierających startery dla 742 unikalnych sekwencji i amplifikowanych za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Ostatnim krokiem jest analiza danych pozyskanych ze wzmacniacza w czasie rzeczywistym. Ostatecznie wyniki mogą być wyrażone jako zmiana składania, wzrost lub spadek w stosunku do kontrolki i wizualizowane w różnych reprezentacjach graficznych.

Tak więc główną przewagą naszej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak macierze chipowe, jest to, że nasza metoda jest bardzo czuła i wymaga minimalnej ilości RNA. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z powodu dużej ilości generowanych danych i korzystania z oprogramowania do analizy danych. Najpierw spryskaj obszar roboczy i pipety RNA Zap.

Na początek synteza CDNA rozcieńcza próbki matrycowego RNA do stężenia pięciu nanogramów na mikrolitr wodą wolną od nukleaz. Następnie delikatnie umieść pięć x bufor reakcyjny na lodzie do rozmrożenia. Następnie dodaj 40 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do kolca RNA, aby ponownie zawiesić odczynnik, zawiruj probówkę i pozostaw ją na lodzie na 15 do 20 minut.

Następnie wyjmij enzymy z zamrażarki, przesuń rurki i umieść je na lodzie. Ponadto, gdy wszystkie odczynniki się rozmrozą, szybko je odwiruj. Przygotuj roztwór roboczy odwrotnej transkryptazy w 1,5 mililitrowej probówce eph, dodając pięć x enzymu buforu reakcyjnego.

Wymieszaj wodę wolną od nukleaz i kolec RNA w matrycy, stosując proporcje wskazane w tabeli pierwszej. Następnie wymieszaj roztwór roboczy, wirując go przez jedną do dwóch sekund z maksymalną prędkością. Krótko odwiruj roztwór przez 10 sekund, a następnie dozuj roztwór roboczy do probówek PCR bez nukleazy.

Następnie dodaj matrycę RNA bezpośrednio do probówek PCR. Delikatnie wirować reakcję przez jedną do dwóch sekund, aby upewnić się, że wszystkie odczynniki są dokładnie wymieszane i wirować w probówkach przez 10 sekund. Umieść próbkę w maszynie do PCR i wprowadź pokazane tutaj ustawienia.

Następnie uruchom program po transkrypcji retro. CDNA jest gotowy do amplifikacji PCR w czasie rzeczywistym i może być przechowywany w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez okres do pięciu tygodni. Aby rozpocząć amplifikację PCR w czasie rzeczywistym, najpierw umieść CDNA i główną mieszankę PCR na lodzie.

Aby rozmrozić, należy chronić fiolki z mieszanką wzorcową PCR przed światłem, przykrywając je folią aluminiową podczas rozmrażania. Po rozmrożeniu wiru mistrz PCR miesza się przez jedną do dwóch sekund. Następnie połącz 2000 mikrolitrów dwóch głównych mieszanek XPCR i 1 980 mikrolitrów wody w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów.

Dodaj 20 mikrolitrów CDNA do mieszaniny i delikatnie wiruj roztwory przez jedną do dwóch sekund. Następnie odwiruj roztwory w wirówce z chłodzeniem w temperaturze 1 500 razy G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie umieść mieszaninę reakcyjną PCR w wielokanałowym zbiorniku pipety.

Krótko odwirować gotowe do użycia płytki w wirówce z chłodzeniem pod ciśnieniem 1 500 razy G przed zdjęciem uszczelki płyty. Następnie dozować 10 mikrolitrów głównej mieszanki PCR zawierającej CD NA do każdego dołka na płytce 384-dołkowej. Za pomocą pipety 16-kanałowej uszczelnij płytkę optyczną folią uszczelniającą.

Po dodaniu mieszanki wzorcowej krótko obrócić płytkę w wirówce z chłodzeniem pod ciśnieniem 1 500 razy G, aby wyciągnąć roztwór na dno studzienek. Wymieszaj próbki i usuń pęcherzyki powietrza, aby wstrzymać eksperyment. W tym momencie przechowuj reakcje w miejscu chronionym przed światłem w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez maksymalnie 24 godziny.

Następnie wykonaj amplifikację PCR w czasie rzeczywistym i analizę krzywej topnienia zgodnie z parametrami wyszczególnionymi w tabeli drugiej. Aby rozpocząć analizę, wybierz drugą metodę analizy pochodnej w fotocyklerze Roche. Następnie oblicz cykl kwantyfikacji lub wartości CQ.

Wyeksportuj dane jako tabelę i zapisz je jako plik tekstowy. Następnie zaimportuj dane do Gen X, klikając najpierw przycisk kreatora importu gon, a następnie klikając start w następnym oknie, wybierz format pliku instrumentu i układu płyty. Pliki Excel z układem płyty można pobrać ze strony internetowej GON.

Następnie zaimportuj pierwszy panel i kliknij Dalej. Tabela wygenerowana po zaimportowaniu pliku zawiera wstępnie zdefiniowane kolumny, edytuj nazwy próbek oraz dodaj lub usuń kolumny klasyfikacji na tym etapie. Kliknij Dalej, gdy skończysz i zapisz dane.

Następnie załaduj go do edytora danych Najpierw skalibruj dane między płytami, wybierając kalibrację INTERPLATE z menu przetwarzania wstępnego, aby upewnić się, że wszystkie płyty są obliczane przy użyciu tych samych parametrów. Następnie zdefiniuj wartość odcięcia, która spowoduje odrzucenie danych wyższych niż cykl progowy lub ct. Jeśli mikro RNA ma CT, który jest większy dla jednej repliki na trzy, odczyt ten zostanie zastąpiony średnią CT z dwóch pozostałych sond.

Zdefiniuj geny referencyjne, wybierając listę mikroRNA, które mają podobne wartości CQ we wszystkich próbkach i uruchom normę genową. Następnie znormalizuj dane za pomocą uzyskanych genów referencyjnych. Uzyskane wartości będą odpowiadać delta ct.

Usuń puste i prawie puste kolumny, otwierając okno przetwarzania wstępnego i wybierając pozycję Sprawdź poprawność arkusza, a następnie wybierając pozycję Zastosuj w wierszu usuwania pustych kolumn w poniższym wierszu. Wybierz żądany procent prawidłowych danych i kliknij przycisk Zastosuj. Wybierz 100%, jeśli chcesz porównać tylko mikroRNA wspólne dla wszystkich próbek.

Załaduj końcowy plik MDF do Gen X i otwórz menedżera danych, aby sklasyfikować, klastrować i wizualizować mikroRNA i próbki na mapach cieplnych i dendrogramach. Następnie wybierz i utwórz grupy próbek, a po zakończeniu kliknij przycisk Zastosuj. Następnie w oknie panelu sterowania kliknij uruchom.

Zapisz mapę skupień w żądanym formacie, takim jak TIFF lub mapa bitowa, a następnie skopiuj i zmodyfikuj mapę skupień zgodnie z potrzebami. Ten pasek graficzny został uzyskany z aplikacji normy G w pokoleniu X w celu przeanalizowania 10 możliwych genów referencyjnych mikro RNA. Wyniki te wskazują, że MIR 622 i MI 1, 266 są najbardziej stabilnie eksprymowanymi mikroRNA.

Przedstawiony tutaj wykres pudełkowy przedstawia rozkład danych dla każdego z 11 statystycznie istotnych mikroRNA w grupach HIVE i HIV plus bez zapalenia mózgu. W każdej kolumnie wykres przedstawia medianę oraz pierwszy i trzeci kwartyl wraz z wartościami maksymalnymi i minimalnymi. Po tej procedurze można przeprowadzić profilowanie mineralne na dowolnych płynach ustrojowych, próbkach tkanek i hodowanych komórkach.