Name: Profilowanie mikroRNA płynu mózgowo-rdzeniowego za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Poznaj metodę profilowania mikroRNA w płynie mózgowo-rdzeniowym za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym. Protokół obejmuje izolację RNA, odwrotną transkrypcję i analizę danych w oprogramowaniu Gen X.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Opisany projekt był wspierany przez Nagrodę Numer R01MH079751 (PI: F. Peruzzi) z Narodowego Instytutu Zdrowia Psychicznego. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy Narodowego Instytutu Zdrowia Psychicznego lub Narodowego Instytutu Zdrowia.

Poniższy protokół opisuje standardową procedurę izolacji RNA z płynu mózgowo-rdzeniowego i profilowania mikroRNA przy użyciu gotowych płytek PCR. Należy pamiętać, że ekstrakcja do fazy organicznej jest opcjonalna, a podczas ekstrakcji do próbki dodawany jest nośnik RNA, co zapewnia maksymalne odzysk RNA. W związku z tym nie ma potrzeby ilościowego oznaczania RNA.
Ogólnie, średnio 6-8 płytek może być przepuszczonych w ciągu jednego dnia, jeśli cDNA zostanie zsyntetyzowane dzień wcześniej (około 2 godziny). Analiza danych jest wykonywana, gdy wszystkie próbki zostały sprofilowane i załadowane do oprogramowania. W zależności od liczby próbek/grup lub ich kombinacji dla porównania, analiza danych może trwać od jednej do kilku godzin.
1. Ekstrakcja RNA
Ekstrakcja RNA została przeprowadzona z próbek płynu mózgowo-rdzeniowego, przechowywanych w stanie zamrożonym w temperaturze -80 °C w podwielokrotnościach do czasu analizy. Do tej procedury użyto zestawu do izolacji mirVana Paris, zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi całkowitej izolacji RNA. Należy pamiętać, że chociaż wzbogacenie małych gatunków RNA jest możliwe za pomocą tego zestawu, ten krok nie jest wykonywany, a procedura ekstrakcji RNA kończy się po etapie całkowitej izolacji RNA. Ponadto, mimo że zestaw do izolacji mirVana Paris (podobnie jak inne dostępne na rynku zestawy do izolacji RNA) nie wymaga ekstrakcji organicznej, protokół tej procedury można znaleźć poniżej. 
	Protokół ekstrakcji RNA składa się z dwóch etapów: 
	1.1. Ekstrakcja organiczna (niewymagana w przypadku korzystania z zestawu do ekstrakcji RNA mirVana Paris) 
	1.2.2. Całkowita izolacja RNA
1.1. Ekstrakcja organiczna
1.1.1. Przygotuj odczynniki
<ol>
	<li>Dodać 375 μl 2-merkaptoetanolu do 2x roztworu denaturującego i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
1.1.2. Przygotuj CSF
<ol>
	<li>Rozmrozić każdą porcję płynu mózgowo-rdzeniowego na lodzie przed ekstrakcją RNA. Dodać 1 μg nośnika RNA MS2 do 0,5 ml rozmrożonego płynu mózgowo-rdzeniowego i delikatnie wymieszać. Należy zauważyć, że w przypadku pominięcia ekstrakcji organicznej, nośnik MS2 zostanie dodany do próbki po wcześniejszej izolacji RNA opisanej w ppkt 1.2.2.1 poniżej.</li>
	<li>Wymieszać 0,5 ml 2x roztworu denaturującego o temperaturze pokojowej z płynem mózgowo-rdzeniowym.</li>
	<li>Dodać 1 ml kwasu-fenolu:chloroformu do płynu mózgowo-rdzeniowego plus 2x roztwór denaturujący: należy upewnić się, że pobrano dolną fazę zawierającą kwas-fenol:chloroform, a nie wodny bufor, który znajduje się na wierzchu mieszaniny. Dodatkowo należy pamiętać, że kwas-fenol:chloroform zawiera fenol, który jest trucizną i działa drażniąco, podczas pracy z tym odczynnikiem należy używać rękawic i innych środków ochrony osobistej.</li>
	<li>Wiruj przez 30-60 sekund, aby wymieszać. Dla wygody 2 ml próbki/roztworu denaturującego/mieszaniny kwasowo-fenolowo-chloroformowej dzieli się na dwie probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut z maksymalną prędkością (10 000 x g) w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć fazę wodną (górną), nie naruszając dolnej fazy lub interfazy, i przenieść ją do świeżej probówki. Zanotuj odzyskany wolumin.</li>
</ol>
1.2. Izolacja RNA
Zaleca się posiadanie dedykowanego stołu, zestawu pipet i stojaków do obsługi próbek RNA. Obszar roboczy i narzędzia są odkażane za pomocą sprayu i chusteczek RNase Zap przed każdym eksperymentem.
1.2.1. Przygotuj odczynniki:
<ol>
	<li>Dodać 21 ml 100% etanolu do roztworu myjącego miRNA 1 i 40 ml 100% etanolu do roztworu myjącego 2/3. Należy pamiętać, że miRNA Wash Solution 1 zawiera tiocyjanian guanidu, który jest substancją potencjalnie niebezpieczną.</li>
</ol>
1.2.2. Całkowita izolacja RNA
<ol>
	<li>Dodać 1,25 objętości 100% etanolu o temperaturze pokojowej do fazy wodnej z ekstrakcji organicznej i dokładnie wymieszać.</li>
	<li>Umieść wkład filtra w jednej z probówek zbiorczych.</li>
	<li>Odmierzyć pipetą nie więcej niż 700 μl mieszaniny lizatu i etanolu na wkład filtra.</li>
	<li>Wirować przez 30 sekund z maksymalną prędkością. Mieszaninę o objętości przekraczającej 700 μl należy nanosić kolejno po sobie na ten sam filtr. Wyrzuć przepływ po każdym wirowaniu i zachowaj probówkę zbiorczą na etapy mycia.</li>
	<li>Nanieść 700 μl miRNA Wash Solution 1 na wkład filtra i odwirować przez 15 sekund z maksymalną prędkością. Odrzuć przepływ z rurki zbiorczej i wymień wkład filtra na tę samą probówkę zbiorczą.</li>
	<li>Nałożyć 500 μl roztworu myjącego 2/3 i wirować przez 15 sekund z maksymalną prędkością. Odrzuć przepływ z rurki zbiorczej i wymień wkład filtra na tę samą probówkę zbiorczą. Zastosuj drugi 500 μl roztworu myjącego 2/3 i wiruj przez 15 sekund z maksymalną prędkością. Odrzuć przepływ z rurki zbiorczej i wymień wkład filtra na tę samą probówkę zbiorczą. Obracaj zespołem przez 1 minutę z maksymalną prędkością, aby usunąć resztki płynu z filtra.</li>
	<li>Przenieś wkład filtra do nowej probówki zbiorczej. Nanieść 100 μl podgrzanej (do 95 °C) wody wolnej od nukleaz na środek filtra i zamknąć korek. Wirować przez 30 sekund z maksymalną prędkością, aby odzyskać RNA.</li>
	<li>Zebrać eluat zawierający RNA i przechowywać go w temperaturze -80 °C do kolejnych zastosowań.</li>
	<li>Określ ilościowo 1 μl RNA za pomocą spektrofotometru NanoDrop 2000c. Należy pamiętać, że kwantyfikacja RNA może zostać pominięta, jeśli nośnik RNA zostanie dodany do próbki podczas ekstrakcji RNA. W takim przypadku 8 μl RNA poddaje się syntezie cDNA, jak opisano poniżej.</li>
</ol>
2. Profil miRNA: Protokół qRT-PCR
Protokół profilowania miRNA składa się z dwóch kroków:
<ol>
	<li>Synteza pierwszej nici cDNA</li>
	<li>Amplifikacja PCR w czasie rzeczywistym</li>
</ol>
2.1. Synteza pierwszej nici cDNA
2.1.1. Rozcieńczony szablon RNA
<ol>
	<li>Dostosuj każdą z próbek matrycowego RNA do stężenia 5 ng/μl przy użyciu wody wolnej od nukleaz. Jeśli RNA nie zostało określone ilościowo (patrz krok 1.2.2.9), wówczas do syntezy cDNA wykorzystuje się 8 μl RNA</li>
</ol>
2.1.2. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>Delikatnie rozmrozić 5x bufor reakcyjny i wodę wolną od nukleaz i natychmiast umieścić na lodzie.</li>
	<li>Wymieszaj przez wirowanie. Ponownie zawiesić impuls RNA, dodając do probówki 40 μl wody wolnej od nukleaz i wymieszać przez wirowanie; Pozostaw na lodzie na 15-20 minut. Bezpośrednio przed użyciem wyjmij mieszankę enzymów z zamrażarki, wymieszaj, przesuwając rurki i umieść na lodzie. Odkręć wszystkie odczynniki.</li>
</ol>
2.1.3. Ustawienie reakcji odwrotnej transkrypcji
<ol>
	<li>Przygotować wymaganą ilość roztworu roboczego RT w 1,5 ml probówki Eppendorfa lub równoważnej (w proporcjach wskazanych w tabeli 1, z wyjątkiem matrycy RNA), wymieszać przez wirowanie (1-2 sekundy z maksymalną prędkością), krótko odwirować (używamy mini wirówki Eppendorfa o stałej prędkości, 10 sekund) i umieścić na lodzie. Należy zauważyć, że impuls RNA UniSp6 jest dodawany do próbki przed reakcją RT (patrz Tabela 1).</li>
	<li>Dozować roztwór roboczy RT do probówek PCR wolnych od nukleaz.</li>
	<li>Dozować matrycę RNA do każdej probówki. 
		Uwaga: należy pamiętać o obliczeniu 10% nadmiaru objętości każdego odczynnika do pipetowania i/lub objętości martwej robota.
		<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
			<tbody>
				<tr>
					<td>Odczynnik</td>
					<td>Panel I Objętość (μl)</td>
					<td>Objętość panelu I + II (μl)</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>5x bufor reakcyjny</td>
					<td>4.4</td>
					<td>8,8</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>Woda wolna od nukleaz</td>
					<td>Pytanie 9,9</td>
					<td>Pytanie 19,8</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>Mieszanka enzymatyczna</td>
					<td>2.2</td>
					<td>4.4</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>Matryca UniSp6 RNA Spike-in</td>
					<td>1.1</td>
					<td>2.2</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>Całkowita matryca RNA (5 ng/μl)</td>
					<td>4.4</td>
					<td>8,8</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>Całkowita objętość</td>
					<td>22 Rozdział 22</td>
					<td>Rozdział 44</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		 
		Tabela 1. Konfiguracja reakcji odwrotnej transkrypcji.</li>
</ol>
2.1.4. Mieszanie i wirowanie odczynników
<ol>
	<li>Wymieszaj reakcję przez delikatne (1-2 sekundy) wirowanie, aby upewnić się, że wszystkie odczynniki są dokładnie wymieszane. Po wymieszaniu odwirować w dół (mini wirówka Eppendorf o stałej prędkości, 10 sekund).</li>
</ol>
2.1.5. Inkubacja i ciepło dezaktywowane
<ol>
	<li>Zaprogramuj maszynę do PCR w następujący sposób:</li>
	<li>Inkubować przez 60 minut w temperaturze 42 °C</li>
	<li>Inaktywować odwrotną transkryptazę termicznie przez 5 minut w temperaturze 95 °C</li>
	<li>Natychmiast schłodzić do temperatury 4 °C</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze 4 °C lub zamrażać 
		Uwaga: na tym etapie protokół może zostać przerwany. Nierozcieńczony cDNA można przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 5 tygodni (opcjonalnie przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 4 dni).</li>
</ol>
2.2. Wzmocnienie PCR w czasie rzeczywistym
2.2.1. Przygotowanie odczynników do PCR w czasie rzeczywistym
<ol>
	<li>Umieść cDNA (z kroku 2.1.5) na lodzie.</li>
	<li>Rozmrozić wodę wolną od nukleaz i wymieszać PCR Master na lodzie. Chronić fiolki z mieszanką PCR Master przed światłem, przykrywając je folią aluminiową. Bezpośrednio przed użyciem wymieszaj mieszankę PCR Master, wirując przez 1-2 sekundy w mini wirówce i odwirowując w momencie 1 500 x g przez 1 minutę.</li>
</ol>
2.2.2. Połącz SYBR Green master mix, wodę i cDNA i dodaj do płytek PCR
Zalecana jest następująca procedura, aby uniknąć przywierania niskich stężeń cDNA do powierzchni probówki:
<ol>
	<li>Przed zdjęciem uszczelki płyty należy na krótko odwirować płytkę (płytki) w wirówce z chłodzeniem przy 1 500 x g przez 1 minutę.</li>
	<li>W stożkowej probówce o pojemności 15 ml wymieszaj 2x mieszankę PCR Master i wodę. Panel I: 2 000 μl 2x mieszanka główna i 1 980 μl wody; Panel I+II: 4.000 μl 2x master mix i 3.960 μl wody.</li>
	<li>Dodać 20 μl cDNA (panel I) lub 40 μl cDNA (panel I+II) i wymieszać.</li>
	<li>Delikatnie mieszać przez wirowanie przez 1-2 sekundy i wirować w wirówce z chłodzeniem przy 1 500 x g przez 1 minutę.</li>
	<li>Umieść mieszaninę PCR Master/mieszaninę cDNA w wielokanałowym zbiorniku pipety. Może być konieczne zidentyfikowanie zbiornika o długości pipety wielokanałowej. Dzięki temu poziom głośności jest wystarczająco wysoki, co pozwala na równe porcje głośności w całym wielokanałowym. Ma to kluczowe znaczenie w przypadku kilku ostatnich podwielokrotności.</li>
	<li>Dozować 10 μl PCR Master mix/cDNA mix do każdego dołka płytki 384-dołkowej za pomocą 16-kanałowej pipety.</li>
	<li>Uszczelnij płytkę za pomocą uszczelnienia optycznego.</li>
	<li>Krótko odwirować płytkę w wirówce z chłodzeniem (1 500 x g przez 1 min), aby wymieszać roztwory i usunąć pęcherzyki powietrza. 
		 
		Uwaga: w tym momencie eksperyment można wstrzymać. Przechowywać reakcje chronione przed światłem w temperaturze 4 °C przez okres do 24 godzin.</li>
</ol>
2.2.3. PCR w czasie rzeczywistym
Wykonaj amplifikację PCR w czasie rzeczywistym i analizę krzywej topnienia zgodnie z parametrami wyszczególnionymi w Tabeli 2.
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Krok procesu</td>
			<td>Ustawienia, Roche LC480</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aktywacja/denaturacja polimerazy</td>
			<td>95 °C, 10 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wzmocnienie</td>
			<td>45 cykli amplifikacji przy 
				95 °C, 10 sek 
				60 °C, 1 min 
				Szybkość narastania 
				1.6 °C/sek 
				Odczyt optyczny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analiza krzywej topnienia</td>
			<td>tak</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Warunki cyklu PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu Roche LightCycler 480.
2.3. Analiza danych PCR w czasie rzeczywistym
Analiza danych PCR w czasie rzeczywistym odbywa się za pomocą Exiqon GenEx Professional 5.0, postępując zgodnie z zalecanymi instrukcjami. Instrukcję GenEx krok po kroku można pobrać pod adresem <a href="http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf">http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf</a> 
	Analiza danych składa się z trzech kroków:
<ol>
	<li>Import danych</li>
	<li>Wstępne przetwarzanie danych</li>
	<li>analiza statystyczna</li>
</ol>
2.3.1. Import danych
<ol>
	<li>W Roche LightCycler 480 wybierz 2. metodę analizy pochodnej i oblicz wartości Cq. Dane są eksportowane jako tabela i zapisywane jako pliki tekstowe.</li>
	<li>Aby zaimportować dane, otwórz GenEx i kliknij przycisk kreatora importu Exiqon, a następnie kliknij "Start". Postępuj zgodnie z instrukcjami, aby wybrać plik(i) formatu, instrumentu i układu płyty. Zwróć uwagę, że pliki układu płyt (pliki Excel) są pobierane ze strony internetowej Exiqon (<a href="http://www.exiqon.com/plate-layout-files">http://www.exiqon.com/plate-layout-files</a>).</li>
	<li>Importuj panele I i II i kliknij "Dalej".</li>
	<li>Tabela wygenerowana po zaimportowaniu pliku zawiera predefiniowane kolumny. Na tym etapie można edytować nazwy próbek, a kolumny klasyfikacji można dodawać lub usuwać. Kliknij "Dalej", gdy skończysz.</li>
	<li>Zapisz dane i załaduj je do Edytora danych.</li>
</ol>
2.3.2. Wstępne przetwarzanie danych
<ol>
	<li>Zgodnie z zaleceniami firm Exiqon i GenEx, podczas porównywania wielu płyt pierwszą rzeczą do zrobienia jest skalibrowanie danych między płytami poprzez wybranie kalibracji między płytami z menu przetwarzania wstępnego.</li>
	<li>Zaleca się uruchamianie macierzy miRNA w trzech seriach. Jeśli miRNA nie jest obecne w co najmniej dwóch z trzech replik, zostanie ustawione jako nieulegające ekspresji.</li>
	<li>W następnym kroku przetwarzania wstępnego ustaw wartość odcięcia. Zdefiniowanie wartości odcięcia oznacza, że dane o cyklu progowym (Ct) wyższym niż ta wartość są odrzucane. W obecnych eksperymentach z użyciem próbki płynu mózgowo-rdzeniowego wartość odcięcia ustalono na 39. W związku z tym wszystkie próbki o Ct wyższym niż 39 w trzech replikach zostaną odrzucone. Jeśli miRNA ma Ct > 39 dla jednej sondy (jedna replika z trzech), odczyt ten zostanie zastąpiony średnią Ct dla pozostałych dwóch sond, pod warunkiem, że obie są poniżej 39.</li>
	<li>Zdefiniuj geny referencyjne. GenEx Professional ma możliwość wykorzystania geNorm i/lub NormFinder do identyfikacji genów referencyjnych. Wybierz listę miRNA, które mają podobne wartości Cq we wszystkich próbkach i uruchom geNorm i/lub NormFinder. Zgodnie z tą analizą, w podanym tutaj przykładzie, miR-622 i miR-1266 miały najbardziej jednolite wartości we wszystkich próbkach i zostały wybrane jako geny referencyjne (Figura 1).</li>
	<li>Następnie dane są normalizowane za pomocą genów referencyjnych, a uzyskane wartości odpowiadają ΔCt</li>
	<li>Jeśli reakcje syntezy cDNA przeprowadzono w trzech egzemplarzach, w tym momencie wartości należy uśrednić.</li>
	<li>Sprawdź poprawność arkusza, aby usunąć puste i prawie puste kolumny. W oknie przetwarzania wstępnego wybierz opcję "Sprawdź poprawność arkusza", a następnie zastosuj w wierszu Usuń puste kolumny. W poniższym wierszu wybierz żądany procent prawidłowych danych i kliknij przycisk Zastosuj. Na przykład wybierz 100%, jeśli chcesz porównać tylko miRNA wspólne dla wszystkich próbek.</li>
	<li>Obsługa brakujących danych. 
		Wybierz "Brakujące dane" z menu Przetwarzanie wstępne i wybierz jedną z opcji obsługi brakujących danych. Ten krok jest wymagany. Pamiętaj, że GenEx wyświetli błąd, jeśli spróbujesz załadować pliki, które zawierają nieobsłużone brakujące dane.</li>
	<li>Określ względną kwantyfikację między grupami próbek (tj. eksperyment w porównaniu z kontrolą). Względną kwantyfikację między grupami oblicza się przy użyciu metody ΔΔ Ct. W GenEx kliknij kartę przetwarzania wstępnego i wybierz względną kwantyfikację. W oknie wybierz grupę referencyjną i naciśnij Zastosuj. Należy zauważyć, że w przypadku reprezentacji graficznych i/lub dalszych analiz statystycznych dane wyrażeń powinny być konwertowane na skalę logarytmiczną. W menu przetwarzania wstępnego wybierz pozycję Log2.</li>
</ol>
2.3.3. Analiza statystyczna
Oprogramowanie GenEx pozwala na szeroki zakres analiz statystycznych, w tym test T i ANOVA.
<ol>
	<li>Załaduj końcowy plik mdf do GenEx i otwórz menedżera danych. Bardzo ważne jest, aby wybrać właściwe próby lub grupy próbek, dla których przeprowadzana jest analiza statystyczna.</li>
	<li>Wybierz "Statystyki" i wybierz ikonę odpowiadającą żądanemu testowi.</li>
	<li>Kliknij "Uruchom" w oknie panelu sterowania. Zapisz wyniki jako pliki Excela lub MDF.</li>
</ol>
2.3.4. Profilowanie wyrażeń
MikroRNA i próbki mogą być klasyfikowane, grupowane i wizualizowane na mapach cieplnych i dendrogramach, w następujący sposób
<ol>
	<li>Załaduj końcowy plik mdf do GenEx i otwórz menedżera danych. Użyj tego okna, aby wybrać i utworzyć grupy próbek lub miRNA. Kliknij "Zastosuj", gdy skończysz.</li>
	<li>W lewym górnym rogu wybierz klaster i kliknij ikonę mapy cieplnej</li>
	<li>W oknie panelu sterowania kliknij "Uruchom". Mapę cieplną można zapisać w różnych formatach, takich jak tiff lub bmp; Można go również kopiować i modyfikować w razie potrzeby.</li>
</ol>

<ol><li>Pacifici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+miRNA+profile+in+HIV-encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid miRNA profile in HIV-encephalitis.</a> J. Cell. Physiol. 10, (2012).</li>
<li>Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+widespread+regulation+of+microRNA+biogenesis%2C+function+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet.%22%5BJournal%5D)">The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay.</a> Nat. Rev. Genet.. 11, 597-610 (2010).</li>
<li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+signatures+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNA signatures in human cancers.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 857-866 (2006).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+microRNAs+in+serum%3A+a+novel+class+of+biomarkers+for+diagnosis+of+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.</a> Cell Res. 18, 997-1006 (2008).</li>
<li>De Smaele, E., Ferretti, E., Gulino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+as+biomarkers+for+CNS+cancer+and+other+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs as biomarkers for CNS cancer and other disorders.</a> Brain Res. 1338, 100-111 (2010).</li>
<li>Heneghan, H. M., Miller, N., Kerin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRNAs+as+biomarkers+and+therapeutic+targets+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">MiRNAs as biomarkers and therapeutic targets in cancer.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 10, 543-550 (2010).</li>
<li>Kosaka, N., Iguchi, H., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNA+in+body+fluid%3A+a+new+potential+biomarker+for+cancer+diagnosis+and+prognosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNA in body fluid: a new potential biomarker for cancer diagnosis and prognosis.</a> Cancer Sci. 101, 2087-2092 (2010).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435, 834-838 (2005).</li>
<li>Shah, A. A., Leidinger, P., Blin, N., Meese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA%3A+small+molecules+as+potential+novel+biomarkers+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">miRNA: small molecules as potential novel biomarkers in cancer.</a> Curr. Med. Chem. 17, 4427-4432 (2010).</li>
<li>Blondal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+sample+and+miRNA+profile+quality+in+serum+and+plasma+or+other+biofluids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Assessing sample and miRNA profile quality in serum and plasma or other biofluids.</a> Methods. 59, 1-6 (2013).</li>
<li>Jensen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+two+commercial+global+miRNA+expression+profiling+platforms+for+detection+of+less+abundant+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of two commercial global miRNA expression profiling platforms for detection of less abundant miRNAs.</a> BMC Genomics. 12, 435 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

MikroRNA to małe niekodujące RNA, które regulują ekspresję genów poprzez hamowanie translacji i/lub promowanie degradacji mRNA2. Ze względu na ich wysoką stabilność w warunkach bezkomórkowych, mikroRNA zostały wykryte w wielu płynach ustrojowych. Co więcej, odrębny profil ekspresji mikroRNA został skorelowany ze stopniem zaawansowania i/lub progresją w różnych nowotworach u ludzi3-9.
Dostępnych jest kilka narzędzi do profilowania mikroRNA, w tym klasyczne macierze chipowe...

MikroRNA należą do rodziny małych (21-23 nt długości) niekodujących RNA, które regulują ekspresję genów po transkrypcji. MikroRNA mogą być wydzielane w przestrzeni zewnątrzkomórkowej, gdzie wydają się być względnie stabilne. Podczas gdy określanie zmian w ekspresji miRNA może być ważnym krokiem w kierunku identyfikacji biomarkerów, wykonywanie profili miRNA i obsługa dużej ilości danych może być zastraszające.
Tutaj opisujemy protokół do określania zmian w ekspresji miRNA w płynie mózgowo-rdzeniowym (mających zastosowanie do innych płynów ustrojowych) za pomocą czułego PCR w czasie rzeczywistym. Opisujemy również wykorzystanie oprogramowania do analizy danych, w tym analizy statystycznej i graficznego przedstawiania wyników. Cała procedura jest stosunkowo łatwa i nieskomplikowana, a w zależności od liczby próbek do profilowania i liczby dostępnych maszyn do PCR w czasie rzeczywistym, również stosunkowo szybka. Część eksperymentalna wymaga dokładności w obchodzeniu się z RNA i pipetowaniu do płytek 384-dołkowych, podczas gdy sekcja analizy danych przy użyciu GenEx wymaga podstawowej wiedzy z zakresu informatyki i statystyki.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tabela 3. Lista urządzeń.</td></tr><tr><td> Pipeter wielokanałowy Finnpipette Novus </td><td>Thermo Scientific</td><td>HH05279</td><td></td></tr><tr><td> końcówki do pipet Finntip </td><td>Thermo Scientific</td><td>9400613</td><td></td></tr><tr><td> Thermal Cycler C1000 </td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0,2 ml Low Profile, Przezroczyste probówki do PCR </td><td>Biorad</td><td>TLS0801</td><td></td></tr><tr><td> Paski z płaską nakrętką </td><td>Biorad</td><td>TLS0803</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 System PCR w czasie rzeczywistym</td><td></td><td></td><td></td></tr>Roche<tr><td>LightCycler 480 Folia uszczelniająca</td><td></td>Roche<td>04 729 757 001</td><td></td></tr><tr><td> Wirówka z chłodzeniem 5804R </td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Wirnik uchylny, 4-miejscowy </td><td>Eppendorf</td><td>A-4-44</td><td></td></tr><tr><td> Mini wirówka stołowa </td><td>Fisher</td><td>05-090-100</td><td></td></tr><tr><td> Wir laboratoryjny </td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1,5 ml Probówki do mikrowirówek, sterylizowane </td><td>Fisher</td><td>02-681-5</td><td></td></tr><tr><td> Matrix Zbiornik na odczynniki, 25 ml </td><td>Thermo Scientific</td><td>8093</td><td></td></tr><tr><td> Thermomixer Confort </td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stacjonarna Sigma 1-15</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Wir laboratoryjny </td><td>Velp Scientifica</td><td>F202A0173</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 4. Lista odczynników.</td></tr><tr><td> Uniwersalny zestaw do syntezy c-DNA, 16-32 rxns </td><td>Exiqon</td><td>203300</td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green master mix, Uniwersalny RT, 25 ml </td><td>Exiqon</td><td>203400</td><td></td></tr><tr><td> Ultraczysta dnaza destylowana wody, Bez rnazy </td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td> MicroRNA Gotowe do użycia panele ludzkie PCR (I+II) V2.R </td><td>Exiqon</td><td>203608</td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA Zestaw do izolacji, 40 izolacji</td><td>Ambion</td><td>AM1556</td><td></td></tr><tr><td> MS2 nośnik RNA </td><td>Roche Applied Science</td><td> 10165948001</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-25ml</td><td></td></tr><tr><td> Etanol 100% </td><td>Carlo Erba</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td> Woda wolna od nukleaz </td><td>Qiagen</td><td>1039480</td><td></td>p</tr><tr><td><>RNAz Zap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td></td></tr></tbody></table>

profilowanie mikrorna płynu mózgowo-rdzeniowego za pomocą ilościowego pcr w czasie rzeczywistym

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MikroRNA (miRNA) stanowią potężną warstwę regulacji genów, kierując RISC do docelowych miejsc zlokalizowanych na mRNA, a w konsekwencji poprzez modulowanie ich translacyjnej represji. Wykazano, że zmiany w ekspresji miRNA są zaangażowane w rozwój wszystkich głównych złożonych chorób. Co więcej, ostatnie odkrycia wykazały, że miRNA mogą być wydzielane do środowiska zewnątrzkomórkowego i przedostawać się do krwiobiegu i innych płynów ustrojowych, gdzie mogą krążyć z dużą stabilnością. Funkcja takich krążących miRNA pozostaje w dużej mierze nieuchwytna, ale systematyczne podejścia o wysokiej przepustowości, takie jak matryce profilowania miRNA, doprowadziły do identyfikacji sygnatur miRNA w kilku stanach patologicznych, w tym zaburzeniach neurodegeneracyjnych i kilku rodzajach nowotworów. W tym kontekście, identyfikacja profilu ekspresji miRNA w płynie mózgowo-rdzeniowym, jak opisano w naszym ostatnim badaniu, sprawia, że miRNA są atrakcyjnymi kandydatami do analizy biomarkerów.
Dostępnych jest kilka narzędzi do profilowania mikroRNA, takich jak mikromacierze, ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) i głębokie sekwencjonowanie. W tym miejscu opisujemy czułą metodę profilowania mikroRNA w płynach mózgowo-rdzeniowych za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym. Użyliśmy gotowych do użycia ludzkich paneli PCR MicroRNA Exiqon I i II V2. R, który pozwala na wykrycie 742 unikalnych ludzkich mikroRNA. Wykonaliśmy tablice w trzech seriach, a dane przetwarzaliśmy i analizowaliśmy za pomocą oprogramowania GenEx Professional 5.
Korzystając z tego protokołu, udało nam się profilować mikroRNA w różnych typach linii komórkowych i komórek pierwotnych, płynu mózgowo-rdzeniowego, osocza i tkanek zatopionych w parafinie utrwalonym w formalinie.

Wyniki niniejszego badania zostały wcześniej opublikowane1. Rysunek 1 przedstawia wyniki analizy kandydujących referencyjnych mikroRNA z zastosowaniem aplikacji geNorm. W konsekwencji dwa mikroRNA, miR-622 oraz miR-1266, zostały zidentyfikowane jako geny referencyjne i wykorzystane do normalizacji wartości miRNA.
W badaniu płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) zastosowano trzy grupy próbek: HIV- (n=10), HIVE (n=4) oraz HIV+ bez zapalenia mózgu (HIV+, <em...

Opisujemy protokół PCR w czasie rzeczywistym do profilowania mikroRNA w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF). Z wyjątkiem protokołów ekstrakcji RNA, procedura może zostać rozszerzona na RNA wyekstrahowane z innych płynów ustrojowych, hodowanych komórek lub próbek tkanek.

Profilowanie mikroRNA płynu mózgowo-rdzeniowego za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest profilowanie mikroRNA w płynie mózgowo-rdzeniowym za pomocą ilościowej PCR oraz analiza danych przy użyciu profesjonalnego oprogramowania Gen X. Cel ten zostaje osiągnięty poprzez wstępną izolację całkowitego RNA z próbek płynu mózgowo-rdzeniowego. Drugim krokiem jest przeprowadzenie odwrotnej transkrypcji w celu transkrypcji RNA do cDNA.Następnie cDNA miesza się z master mixem Cyber Green naniesionym na płytki 384-dołkowe zawierające primery dla 742 unikalnych sekwencji i amplifikuje za pomocą techniki real-time PCR. Ostatnim krokiem jest analiza danych uzyskanych z amplifikacji w czasie rzeczywistym. Ostatecznie wyniki mogą zostać przedstawione jako krotność zmiany (fold change), wzrost lub spadek w stosunku do próby kontrolnej, i zwizualizowane za pomocą różnych reprezentacji graficznych.Główną zaletą naszej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak macierze chipowe, jest jej wysoka czułość oraz wymagana minimalna ilość RNA. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności ze względu na ogromną ilość generowanych danych oraz konieczność obsługi oprogramowania do ich analizy. W pierwszej kolejności na

cerebrospinal-fluid-microrna-profiling-using-quantitative-real-time

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opracowanie profilu microRNA płynu mózgowo-rdzeniowego z wykorzystaniem ilościowej qPCR

Zaprezentujemy konfigurację i analizę tablic 96-dołkowych pre-microRNA do QPCR, przeprowadzonych zarówno przy użyciu robota, jak i ręcznie za pomocą wielokanałowej pipety Thermo Scientific Matrix.

Profilowanie pre-microRNA i microRNA z wykorzystaniem matryc ilościowej PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany protokół multipleksowej ilościowej reakcji polimerazy w odwrotnej transkrypcji (qRT-PCR) w połączeniu z platformą mikroprzepływową, stanowiący efektywne pod względem kosztów i czasu narzędzie do wysokoprzepustowego przesiewowania poziomów ekspresji mikroRNA (miRNA), szczególnie w przypadku pracy z ograniczoną ilością materiału próbnego.

Wysokoprzepustowe profilowanie mikroRNA: zoptymalizowana wielokanałowa qRT-PCR w skali nanolitrowej na IFC Fluidigm Dynamic ArrayTM

Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR) jest szybką i czułą metodą badania poziomów ekspresji różnych cząsteczek mikroRNA (miRNA) w próbkach nowotworowych. Zastosowanie tej metody pozwala na amplifikację, kwantyfikację i analizę ekspresji setek różnych cząsteczek miRNA z tej samej matrycy cDNA.

Wykrywanie mikroRNA w guzach prostaty za pomocą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

Mikroglią są rezydentne makrofagi, które stanowią pierwszą linię obrony i nadzoru immunologicznego ośrodkowego układu nerwowego. MikroRNA to cząsteczki regulacyjne, które odgrywają istotną rolę w wielu procesach fizjologicznych, w tym w aktywacji i różnicowaniu makrofagów. W niniejszym artykule opisujemy metodę pomiaru mikroRNA w mikroglii.

Wykrywanie mikroRNA w mikrogleju za pomocą PCR w czasie rzeczywistym w prawidłowym OUN oraz podczas neurostanu zapalnego

Sygnalizacja molekularna zarówno przez estrogen, jak i mikroRNA jest kluczowa dla rozwoju i wzrostu raka piersi. Estrogen aktywuje receptory estrogenowe, które są czynnikami transkrypcyjnymi. Wiele czynników transkrypcyjnych może regulować ekspresję mikroRNA, a mikroRNA regulowane estrogenem można profilować przy użyciu różnych technik na dużą skalę.

Profilowanie regulowanych estrogenem mikroRNA w komórkach raka piersi

Z zamiarem scharakteryzowania zmian w miRNA na zróżnicowanych ludzkich nerwowych komórkach macierzystych (hNSC) opisujemy różnicowanie hNSC w systemie trójwymiarowym, ocenę zmian w ekspresji mikroRNA za pomocą macierzy miRNA PCR oraz analizę obliczeniową do przewidywania celu miRNA i jego walidacji za pomocą testu podwójnej lucyferazy.

Różnicowanie ludzkiej linii nerwowych komórek macierzystych w hodowlach trójwymiarowych, analiza mikroRNA i przypuszczalnych genów docelowych

Krążące mikroRNA pojawiły się ostatnio jako obiecujące i nowe biomarkery dla różnych nowotworów i innych chorób. Celem tego artykułu jest omówienie trzech różnych platform i metod PCR w czasie rzeczywistym opartych na sondach, które są dostępne do ilościowego określania i określania obfitości krążących mikroRNA.

Oparte na sondzie podejścia PCR w czasie rzeczywistym do ilościowego pomiaru mikroRNA

Opisana jest czuła i dokładna metoda kwantyfikacji mikroRNA bez komórek przy użyciu chemii opartej na barwniku i technologii kropelkowej cyfrowego PCR.

Kwantyfikacja krążącego mikroRNA przy użyciu chemii barwnika wiążącego DNA i kropelkowego cyfrowego PCR

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania ekspresji mikroRNA w błonie otrzewnowej szczura za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym. Metoda ta nadaje się do badania profilu ekspresji mikroRNA w błonie otrzewnowej szczura w kilku stanach patologicznych.

Wykrywanie ekspresji mikroRNA w błonie otrzewnowej szczurów za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

Ten raport opisuje protokół pomiaru bezwzględnych poziomów miRNA w osoczu, przy użyciu ilościowego PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym z lub bez wstępnej amplifikacji. Protokół ten pozwala lepiej zrozumieć ilość miRNA w osoczu i umożliwia jakościową ocenę odpowiednich danych z różnych badań lub laboratoriów.

Bezwzględna kwantyfikacja poziomów mikroRNA w osoczu u małp Cynomolgus przy użyciu ilościowego PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym

Poznaj metodę profilowania mikroRNA w płynie mózgowo-rdzeniowym za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym. Protokół obejmuje izolację RNA, odwrotną transkrypcję i analizę danych w oprogramowaniu Gen X.

Profilowanie mikroRNA płynu mózgowo-rdzeniowego za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

Przeglądaj więcej filmów